Nghiên cứu qui trình tổng hợp flavonoid được chiết tách từ cây thổ phục linh làm chất chống ung thư

MỞ ĐẦUViệt Nam là nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, ẩm ướtquanh năm; các nhà khoa học quốc tế đã xếp Việt Nam vào những nước “rừngmưa nhiệt đới”; với điều kiện thuận lợi, hệ

LỜI CẢM ƠNVới lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn Cô giáo

Lê Thị Hồng Nhung, đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện cho

em hoàn thành đề tài này

MỤC LỤC

MỞ ĐẦUViệt Nam là nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, ẩm ướtquanh năm; các nhà khoa học quốc tế đã xếp Việt Nam vào những nước “rừngmưa nhiệt đới”; với điều kiện thuận lợi, hệ thực vật Việt Nam đã phát triển rất đadạng và phong phú với 12.000 loài thực vật bậc cao, không kể đến các loại nấm,tảo và rêu; nhiều loài trong số đó đã được sử dụng trong y học cổ truyền và cácmục đích khác phục vụ đời sống của nhân dân Việt Nam trong suốt quá trình lịch

sử tồn tại và phát triển của đất nước

Tìm kiếm, phát hiện và nghiên cứu các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên

có hoạt tính sinh học cao để ứng dụng trong y dược, nông nghiệp và các nhu cầukhác của đời sống con người là một trong những nghiệm vụ quan trọng đã vàđang được các nhà khoa học trong nước và quốc tế hết sức quan tâm

Với việc phát hiện ra nhiều chất có hoạt tính sinh học quí giá từ thiênnhiên, các nhà khoa học đã có những đóng góp đáng kể trong việc tạo ra nhữngbiệt dược điều trị những bệnh nhiệt đới và các bệnh hiểm nghèo, kéo dài tuổi thọ

và nâng cao chất lượng cuộc sống của con người Thiên nhiên không chỉ lànguồn nguyên liệu cung cấp các hoạt chất quí hiếm để tạo ra các biệt dược màcòn cung cấp những chất đóng vai trò dẫn đường trong việc tổng hợp ra các loạithuốc mới có ý nghĩa khoa học, kinh tế xã hội cao…

Cây Thổ phục linh có rất nhiều ứng dụng trong thực tế, như chữa phòngthấp, đau nhức xương, ngộ độc thủy ngân….Bên cạnh đó, các nghiên cứu dược

lý đã tìm thấy khả năng sử dụng trong hóa học trị liệu của một số thành phầnhóa học của vỏ và rễ cây Thổ phục linh có nhiều tác dụng nên em quyết địnhchọn đề tài:” Nghiên cứu qui trình tổng hợp flavonoid được chiết tách từ cây Thổphục linh làm chất chống ung thư”, từ đó xác định thành phần hóa học và tìm ranguồn nguyên liệu quí cho ngành hóa dược

Phần I: TỔNG QUAN

I.Cây thổ phục linh

mảnh không gai Rễ củ vặn vẹo.

Lá mọc so le, hình trái xoan bầu

dục dài 5-12cm, rộng 1-5cm,

mang 2 tua cuốn do lá kèm biến

đổi, thường tiêu giảm thành mũi

nhọn ngắn, có khi kéo dài; cuống

lá dài 1cm; gân chính 3, hình

cung Cụm hoa ở nách lá Tán đơn

độc có 20-30 hoa Hoa màu lục

nhạt, cuống hoa dài hơn cuống

tán Hoa đực và hoa cái riêng rẽ

Quả mọng, hình cầu, gần như 3 góc, khi chín màu tím đen, chứa 3 hạt

Thổ Phục Linh là cây có biên độ sinh thái rộng: Cây ưa sáng song cũng cóthể hơi chịu bóng, ưa ẩm nhưng có khả năng chịu hạn tốt Cây thường mọc trongcác quần thể hệ thứ sinh ở đồi cây bụi, đát sau nương rẫy, hay dưới tán rộngthông mới trồng Độ cao phân bố từ vài chục mét lên tới 1000m so với mực nướcbiển Sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm, ra hoa đầu tháng năm Mùa ra quảtháng 8-12 Tuy nhiên chỉ những cây được chiếu sáng đầy đủ mới có nhiều hoa,quả Tái sinh tự nhiên tốt từ hạt hoặc các phần còn lại sau khi bị chặt phá

Nơi sống và thu hái: Loài của Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc, Ðài Loan,Lào, Campuchia, Thái Lan và Việt Nam Ở nước ta cây mọc ở vùng đồi núi,thung lũng, rừng thưa, leo lên các lùm bụi, phổ biến từ Lạng Sơn, Quảng Ninh,Bắc Thái, Vĩnh Phú, Hoà Bình, Ninh Bình, Thanh Hoá, Nghệ An tới Kon Tum,

Lâm Ðồng, Khánh Hoà, Bình Thuận Người ta thu hái thân rễ tươi quanh năm,tốt nhất là vào mùa hạ; cắt bỏ rễ con và gai, phơi hoặc sấy khô; hay có thể rửasạch, ủ mềm 3 ngày rồi thái mỏng, phơi hay sấy khô.

1.2.Thành phần hóa học

Thành phần hóa học chính là Saponin steroid Lá và ngọn non chứa theo

tỷ lệ g%: nước 83,3; protein 2,4; glucid 8,9; xơ 2,2; tro 1,2 và theo mg%: caroten1,6; vitamin C 18 Trong thân rễ có nhiều tinh bột và có sitosterol, stigmasterol,smilax saponin, tigogenin

Saponin Triterpenoids Saponin Steroids

1.2.2.1.Phần Glycone

Phần đường nối vào OH ở C-3 của aglycon Cho đến nay người ta biếtkhoảng 40 loại đường khác nhau như D-glucose, L-ramnose, D-fucose… Những đường này có các đặc tính sau: dễ bị thuỷ phân, cho phản ứng màu vớithuốc thử Kele-Kiliani, thuốc thử Xanthydrol.Mạch đường có thể là monosacarithoặc oligosacarit Người ta nhân thấy rằng glucose bao giờ cũng ở phía cuốimạch

và một vòng là hydropyran (vòng F) Hai vòng này nối với nhau bởi 1 carbonchung ở C-22 Mạch nhánh này được gọi là mạch nhánh spiroacetal

Sarsasapogenin

smilagenin

Ba chất trên là 3 đồng phân Smilagenin và tigogenin khác nhau do cấuhình ở C-5 Còn sarsasapogenin và smilagenin thì khác nhau do cấu hình ở C-25.Sarsasapogenin có nhóm methyl ở C-25 hướng axial có cấu hình tuyệt đối 25S,smilagenin thì nhóm methyl ở C-25 hướng equatorial có cấu hình tuyệt đối 25R

Các sapogenin nhóm này có nối vòng C và D trans (khác với glycosidtim) Còn vòng A và B có thể là cis như ở chất sarsasapogenin và smilageninhoặc có thể là trans như ở chất tigogenin Công thức lập thể của 3 chấtsarsasapogenin, smilagenin và tigogenin.Nhóm OH ở C3 thường hướng β, một

số hướng α ví dụ các saponin của tỳ giải

Nhóm spirostan hiện nay được chú ý nhiều vì là nguồn nguyên liệu quantrọng để bán tổng hợp các thuốc steroid Hai sapogenin quan trọng nhất làdiosgenin (có chủ yếu trong các loài Dioscorea) và hecogenin (có chủ yếu trongcác loài Agave)

Ở dạng glycosid phần đường được nối vào OH ở C-3, một số ít trường hợp

ở C1 Mạch đường thường phân nhánh và phức tạp Ví dụ digitonin là mộtsaponosid có trong cây digital, có mạch đường gồm 5 đơn vị đường và phânnhánh

spirostan Ví dụ sarsaparillosid dưới tác dụng của enzym thủy phân cắt mạchglucose ở C-26 sẽ chuyển thành parillin

Trường hợp thứ hai: vòng F là vòng 5 cạnh do sự đóng vòng 22-25 epoxy

ví dụ avenacosid có trong yến mạch (Avena L Họ Lúa - Poaceae) Avenacosid

A cũng có 2 mạch đường Khi thủy phân cắt đường glucose ở C-26 thì cũngchuyển thành dẫn chất nhóm spirostan

Sarsaparillosid và avenacosid A đều có 2 mạch đường Người ta gọi đây là cácbidesmosid (desmos = mạch)

có cấu trúc (25R) 22α còn tomatin là các saponin có trong cây cà chua thì cócấu trúc (25S) 22β

 Ngoài những nhóm saponin steroid kể trên người ta còn gặp một số saponinsteroid có cấu trúc mạch nhánh khác ví dụ polypodosaponin và oslandin đượcJizba phân lập 1971 từ thân rễ cây Polypodium vulgare L Oslandin là một

bidesmosid có vị ngọt α-spinasterol glycosid có trong cây chè Camelia sinensis(L.) O K.tze (Thea sinensis L.)

b, Saponin triterpenoid

Phần genin của loại này có 30 cacbon cấu tạo bới 6 nhóm hemiterpen.Người ta chia làm 2 loại:

Saponin triterpenoid pentacyclic và Saponin triterpenoid tetracyclic

 Saponin triterpenoid pentacyclic

Loại này chia ra các nhóm: Olean, ursan, lupan, hopan

* Nhóm Olean: Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên thuộcnhóm này Phần aglycon thường có 5 vòng và thường là dẫn xuất của 3-βhydroxy olean 12 - ene, tức là β-amyrin Một vài aglycon làm ví dụ:

- Acid oleanolic: R1 = R2 = R4 = R5 = -CH3, R3 = -COOH

- Hederagenin: R2 = R4 = R5 = -CH3 , R1 = -CH2OH , R3 = -COOH

- Gypsogenin: R2 = R4 = R5 = -CH3 , R1 = -CHO , R3 = -COOHMạch đường có thể nối vào C-3 theo dây nối acetal, có khi mạch đườngnối vào C-28 theo dây nối ester Gần đây người ta phân lập được các saponin cóđến 10-11 đơn vị đường nếu kể cả 2 mạch, riêng một mạch có thể đến 6 đơn vịđường

* Nhóm ursan : Cấu trúc của nhóm ursan cũng tương tự như nhóm oleanchỉ khác là nhóm methyl ở C-30 không đính vào vị trí C-20 mà lại đính ở vị tríC-19 Các sapogenin nhóm ursan thường là những dẫn chất của 3-β hydroxyursan 12-ene, tức là α-amyrin Những saponin của nhóm này ít gặp hơn nhómolean Cinchona glycosid A, Cinchona glycosid B có trong cây canh-ki-na,asiaticosid có trong rau má là những saponin của nhóm này

* Nhóm lupan (III): Cấu trúc của nhóm lupan có các vòng A,B,C,D giốngnhư các nhóm trên, chỉ khác vòng E là vòng 5 cạnh, C-20 ở ngoài vòng vàthường có nối đôi ở vị trí 20-29 Lấy một ví dụ là saponin có trong rễ cây Ô rô

Acanthus iliciformis Linn.: [ α -L - arabinofuranosyl (1-4) β -D glucoropyranosid(1-3)]-3-β -hydroxy-lup-20(29) ene (IIIa)

Một số saponin có trong cây ngũ gia bì chân chim cũng thuộc nhóm này

* Nhóm hopan (IV): Cấu trúc của nhóm hopan có các vòng A,B,C,Dgiống như các nhóm trên, chỉ khác vòng E là vòng 5 cạnh, C-22 ở ngoài vòng vànhóm methyl góc đính ở C-18 thay vì ở C-17 Saponin đầu tiên được biết là chấtmollugocin A có trong cỏ thảm Mollugo hirta L

 Saponin triterpenoid tetracyclic

Có 3 nhóm chính: dammaran*, lanostan*, cucurbitan

* Nhóm dammaran (V): Ðại diện là các saponin của nhân sâm Phầnaglycon gồm 4 vòng và một mạch nhánh Khi tác dụng bởi acid thì mạch nhánhđóng vòng tạo thành vòng tetrahydropyran Bằng các phương pháp đặc biệt đểcắt phần đường, người ta đã thu được các genin thật Hai genin chính là:protopanaxadiol và protopanaxatriol

Phần đường nối vào OH ở cabon số 3 hoặc có khi thêm 1 mạch nữa nối vào OH

* Nhóm cucurbitan (VII) Phần lớn các saponin nhóm cucurbitan gặptrong họ Cucurbitaceae Ở đây nhóm CH3 góc thay vì ở vị trí C10 lại đính ở C9

Saponin khó bị thẩm tích, người ta dựa vào tính chất này để tinh chếsaponin trong quá trình chiết xuất

Phần genin tức là sapogenin và dẫn chất acetyl sapogenin thường dễ kết tinh hơnsaponin

Saponin triterpenoid thì có loại trung tính và loại acid, saponin steroid thì có loạitrung tính và loại kiềm

- Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng

- Ðộc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nênlàm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân mềmnhư giun, sán, ốc sên

- Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu;liều cao gây nôn mửa, đi lỏng

- Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-b-hydroxysteroidkhác

- Một số dược liệu chứa saponin có tác dụng thông tiểu như rau má, tỳgiải, thiên môn, mạch môn,

- Saponin có mặt trong một số vị thuốc bổ như nhân sâm, tam thất và một

số cây thuộc họ nhân sâm khác

- Saponin làm tăng sự thấm của tế bào; sự có mặt của saponin sẽ làm chocác hoạt chất khác dễ hoà tan và hấp thu, ví dụ trường hợp digitonin trong láDigital

- Một số saponin có tác dụng chống viêm Một số có tác dụng kháng khuẩn,kháng nấm, ức chế virus

- Một số có tác dụng chống ung thư trên thực nghiệm

- Nhiều saponin có tác dụng diệt các loài thân mềm (nhuyễn thể)

- Sapogenin steroid dùng làm nguyên liệu để bán tổng hợp các thuốc steroid

- Digitonin dùng để định lượng cholesterol

- Một số nguyên liệu chứa saponin dùng để pha nước gội đầu, giặt len dạ, tơ lụa Tuy vậy một vài tính chất trên không thể hiện ở một vài saponin.Ví dụ:sarsaparillosid thì không có tính phá huyết cũng như tính tạo phức vớicholesterol

Saponin đa số có vị đắng trừ một số như glycyrrhizin có trong cam thảo bắc,abrusosid trong cam thảo dây, oslandin trong cây Polypodium vulgare có vị ngọt.Saponin tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether, hexan do đó người tadùng 3 dung môi này để tủa saponin Saponin có thể bị tủa bởi chì acetat, barihydroxyd, ammoni sulfat

1.4 Tình hình nghiên cứu

 Theo Đông Y, Thổ Phục Linh có vị ngọt, nhạt, tính bình Rễ củ được thuhái làm thuốc

Một số đơn thuốc đã được áp dụng trong Đông Y:

- Phong thấp, gân xương đau nhức, tê buốt: Thổ phục linh 20 g, dây đau xương 20 g, thiên niên kiện, đương quy đều 8 g, bạch chỉ 6 g, cốt toái bổ 10 g Sắc uống ngày một thang

- Viêm bàng quang: Thổ phục linh 30 g, mã đề 20 g, râu ngô Sắc uống ngày một thang

- Ung thư bàng quang: Thổ phục linh 30 g, trà thụ căn 20 g, tề thái 20 g Sắc lấy nước pha với nước đường để uống Hoặc thổ phục linh tươi 60 g, bẹ móc(tông lư) 30 g Sắc uống ngày một thang

- Ung thư đường tiêu hóa: Thổ phục linh 30 g, nấm hương 10 g, bạch truật

20 g Sắc uống ngày một thang

- Ung thư hạch: Thổ phục linh 100 g, tán bột mịn để sắc nước uống hoặc thêm gạo nấu cháo ăn hằng ngày

- Ngộ độc thủy ngân: Thổ phục linh 30 g, cam thảo bắc 10 g, đậu xanh (lục đậu) 20 g Sắc uống ngày một thang

- Viêm da mủ: Thổ phục linh 30 g, bồ công anh, kim ngân hoa, bèo cái mỗi thứ 20 g, cam thảo nam 10 g, vỏ núc nác 15 g Sắc uống ngày một thang

 Theo Tây y dùng làm thuốc tẩy máu, làm ra mồ hôi, chữa giang mai…Viện Quân y 108 đã dùng thổ phục linh và hạ khô thảo điều trị vảy nến và

vó kết quả, để tài nghiên cứu khoa học được báo cáo cấp quốc gia

 Tại Việt Nam, tên gọi của cây này được xác minh và đối chiếu từ năm

2005,2006 và kinh nghiệm sử dụng của gia đình cụ Âm Kông, của đồng bào vùng Ea Sol, EaH’leo…

Ngày 30/4/2005, cụ Ama Kông đã truyền thụ bài thuốc và các nội dung cần kế thừa cho bác sĩ Hồ Việt Sang – Phó chủ tịch thường trực Hội Đông y tỉnh Đăl Lăk, kể cả việc vào rừng hái thuốc, chỉ dẫn cụ thể từng cây thuốc, cách sử dụng, trồng…

Hội Đông Y Đăk Lawk, Sở Khoa học công nghệ, Khoa dược Đại học y dược TP.Hồ Chí Minh, các viện Hóa học, Sinh học…được chính thức vào cuộc

từ giữa năm 2005 và cho đến nay đã có những kết quả bước đầu trong Nghiên cứu khoa học

 Hiện nay,ở Mỹ và Mexico, Brazil cũng đã dùng cây Thổ phục linh để chế nước giải khát, giải độc cơ thể giúp tiêu hóa

Gần đây, một số cơ sở nghiên cứu Y học cổ truyền của Trung Quốc đã có những bài thuốc dùng Thổ phục linh là chính để chữa nhiều bệnh đạt hiệu quả tốt Ví dụ như:

- Thổ phục linh chữa viên tĩnh mạch nông huyết khối: Thổ phục linh 30g, Thương truật 15g, Tiểu hồi hương 10g, Đương qui 10g, Xuyên khung 10g, Ngũ linh chi 10g, Xích thược 10g, Một dược 10g, ích mẫu thảo 15g, sắc nước uống trước kỳ kinh 3 ngày, uống liên tiếp 7 thang Thường sau 4 kỳ kinh thì khỏi

- Thổ phục linh chữa đau bụng kinh nguyệt: Thổ phục linh 30g, Hoàng bá 15g, Hạ khô thảo 15g, Bào sơn xuyên giáp 10g, Hải tảo 15g, Mẫu lệ 30g, Hươngphụ 15g, Đương qui 15g, Đan sâm 15g, Trạch tả 190g, Ngưu tất 10g Sắc nước uống, mỗi ngày 1 thang chia làm 2 lần

- Thổ phục linh chữa u nang buồng trứng: Lấy 30g Thổ phục linh, sắc lấy nước, để ấm, lấy khăn sạch thấm nước thuốc bôi lên chỗ rôm, mỗi ngày 3 - 5 lần

Lại lấy lượng nước thuốc vừa đủ, thêm vào nước uống mà tắm, mỗi ngày một lần, liên tục 3 - 5 ngày.

- Thổ phục linh chữa Eczema: Nghiền Thổ phục linh thành bột mịn, đắp lên chỗ đau, mỗi ngày 3-5 lần, liên tục 5 ngày

II Cây ban tràn

 Nguồn gốc

Cũng giống như Vitamin C, các flavonoid được khám phá bởi một trong những nhà sinh hóa nối tiếng nhất của thế kỷ 20: Albert Szent-Gyorgi (1893-1986)

Ông nhận giải Nobel năm 1937 với những khám phá quan trọng về các đặc tính của Vitamin C và flvonoid.

1.2 Đặc điểm

Flavonoid là hợp chất polyphenolic bao gồm 2 vòng benzen liên kết vớinhau bởi 1 chuỗi 3 nguyên tử cacbon Bộ khung có thể được biểu diễn như sau:

C6 –C3 – C6

Trong đa số các trường hợp mạch 3C đóng với vòng A và tạo nên dị vòng

C có chứa O Theo cấu tạo của vong C có các gốc sau:

Benzo dihydro γ-pyron Benzopyrilium

Cấu trúc của flavonoid được dựa trên cơ sở là một khung 15C với một Chromane vòng thơm B thứ hai ở vị trí 2,3 hay 4

Flavonoid gồm 2 vòng thơm và một vòng pyran

Vòng thơm bên trái gọi là vòng A

Vòng thơm bên phải gọi là vòng B

Vòng trung gian chứa nguyên tử O gọi là vòng pyran

Flavan-diol

Anthocyanidin là sắc tố phổ biến trong thực vật, phát hiện > 300 chấttrong chủ yếu ở ngành hạt kín

- Chalcon và Auron: Màu vàng đậm đến đỏ cam

- Anthocyanidin: Màu thay đổi tùy theo pH

Tính chất của khung cấu tạo: Tính oxy hóa và tính khử

 Phản ứng với kiềm loãng

- Hơ tờ giấy có nhỏ dịch chiết trên miệng lọ amoniac:

+ Flavon, flavonol: Màu vàng sáng+ Anthocianidin: Màu xanh dương+ Chalcon, auron: Màu đỏ cam

- Với dung dịch kiềm loãng:

+ Flavan-3-ol (bị oxy hóa): Màu vàng+ Flavanon (bị isomer hóa): Màu vàng đậm đến đỏ

 Phản ứng với dung dịch muối kim loại

Tạo phức với kim loại nặng, các muối phức thường có dạng: