Đề cương Nghiên cứu thu nhận lectin từ rong Đỏ Eucheuma denticulatum và khảo sát khả năng ứng dụng

Lectin từ rong biển lần đầu tiên được Boyd phát hiện vào năm 1966 và cho đếnnay đã có nhiều công trình nghiên cứu về sự phân bố, đặc tính hóa sinh cũng như ứngdụng của lectin từ rong biể

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Lectin là những protein hoặc glycoprotein có khả năng làm ngưng kết hồng cầu,liên kết với carbohydrate mà không gây đáp ứng miễn dịch Lectin giữ vai trò quantrọng như là một phân tử nhận dạng trong sự tương tác giữa chất nền với tế bào hoặc tếbào với tế bào vì chúng có thể phân biệt sự khác nhau trong cấu trúc cũng như khảnăng liên kết với carbohydrate trên bề mặt tế bào Những đặc tính này làm cho lectintrở thành một công cụ hữu ích cho các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau như: nghiên cứumiễn dịch học, hóa sinh, sinh học tế bào, xác định và phát hiện nhóm máu, nghiên cứu

tế bào ung thư…[77]

Lectin từ rong biển lần đầu tiên được Boyd phát hiện vào năm 1966 và cho đếnnay đã có nhiều công trình nghiên cứu về sự phân bố, đặc tính hóa sinh cũng như ứngdụng của lectin từ rong biển trong nhiều lĩnh vực khác nhau [23,24] Các nghiên cứu

về lectin từ rong biển cho thấy đặc tính của những lectin này có nhiều khác biệt so vớilectin từ thực vật bậc cao Hầu hết, các lectin từ rong biển có trọng lượng phân tử thấp,tồn tại ở dạng monomer, không có ái lực với đường đơn nhưng có ái lực vớiglycoprotein (đặc biệt là các glycoprotein từ động vật) và thuộc nhóm protein rất bềnnhiệt và hoạt tính của chúng không đòi hỏi sự có mặt của các cation hóa trị II [43] Vớinhững tính chất ưu việt trên, lectin từ rong biển đang là mục tiêu được quan tâm trongcác nghiên cứu cơ bản cũng như các ứng dụng của chúng trong tương lai

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới, có chiều dài bờ biểnkhoảng 3260km, với hơn 1000 loài rong biển đã được tìm thấy Trong đó, đã xác địnhđược 151 loài thuộc ngành rong Lục (Chlorophyta), 269 loài thuộc ngành rong Đỏ(Rhodophyta), 143 loài thuộc ngành rong Nâu (Phaeophyta) và 76 loài thuộc ngànhrong Lam (Cyanophyta) [58] Đây là nguồn vật liệu vô cùng phong phú cung cấp choviệc nghiên cứu, điều chế những hợp chất có hoạt tính sinh học cao như lectin

Với kết quả khảo sát sự có mặt của lectin ở hơn 80 loài rong biển thuộc vùngbiển Ninh Thuận và Khánh Hòa từ năm 2009 đến 2011, chúng tôi nhận thấy, hơn 90%dịch chiết từ rong được khảo sát cho thấy sự hiện diện lectin Chúng có khả năng làmngưng kết với ít nhất một trong các loại hồng cầu được thử nghiệm Trong đó, dịch

chiết từ rong Eucheuma denticulatum thuộc dòng rong Đỏ cho hoạt tính ngưng kết

hồng cầu mạnh nhất với cả hồng cầu thỏ và hồng cầu cừu [44, 45] Đồng thời, loài

rong này cũng đã và đang được trồng phổ biến ở các vùng khác nhau thuộc tỉnh KhánhHòa và Ninh Thuận

Với những kết quả khảo sát sơ bộ và cơ sở nêu trên, đề tài được thực hiện

“Nghiên cứu thu nhận lectin từ rong Đỏ Eucheuma denticulatum và khảo sát khả năng ứng dụng”.

2 Mục tiêu của đề tài

Nghiên cứu điều kiện tối ưu để thu nhận lectin từ rong Đỏ Eucheuma denticulatum.

Nội dung nghiên cứu

 Nghiên cứu xác định các điều kiện tối ưu cho quá trình thu nhận lectin

 Tinh sạch lectin bằng sắc ký lọc gel Sephadex G-75

 Đánh giá các đặc tính của lectin thu nhận được

 Đánh giá khả năng của lectin kháng một số vi khuẩn gây độc cho người

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiến của đề tài:

Đề tài "Nghiên cứu thu nhận lectin từ rong Đỏ Eucheuma denticulatum và khảo sát khả năng ứng dụng” không chỉ có ý nghĩa về mặt khoa học, nhằm khai thác một

hợp chất hoạt tính sinh học mới từ rong biển để sử dụng làm thuốc thử chẩn đoán một

số vi khuẩn gây bệnh cho người, mà còn góp phần nâng giá trị kinh tế

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN

1.1.1 Giới thiệu chung về rong biển

Rong biển là một loài thực vật sinh sống ở biển Chúng mọc trên các rạn san hô,vách đá hoặc có thể mọc dưới các tầng nước sâu với điều kiện có ánh sáng mặt trờichiếu tới để quang hợp Sự có mặt của rong biển trong thủy vực không chỉ đóng vai tròquan trọng là mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn của sinh vật biển mà còn là nguồncung cấp thức ăn cho các loài động vật ven biển khác [4]

Ở nước ta có khoảng hơn 1000 loài rong biển, phân bố chủ yếu ở vùng biển cáctỉnh phía Nam và phía Bắc Với hơn 200 loài được tìm thấy ở cả hai miền Bắc Nam.

Trong đó, có các đối tượng quan trọng là: rong Câu (Gracilaria), rong Mơ(Sargassum), rong Đông (Hypnea), rong Mứt (Porphyza), và rong Bún (Enteromorpha)[31]

1.2 TỔNG QUAN VỀ LECTIN

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu lectin

Cho đến những năm cuối thế kỷ 19, đã bắt đầu có sự tích lũy những bằng chứngđầu tiên về sự hiện diện của một loại protein có khả năng ngưng kết hồng cầu Tuynhiên, hầu hết các nghiên cứu lúc bấy giờ chủ yếu chỉ tập trung vào việc làm sáng tỏnguyên lý gây độc của các loại hạt có chứa thành phần gây độc này nhằm sử dụng chocác mục đích y tế Năm 1884, Warden và Waddel đã giải thích nguyên lý gây độc của

các hạt Aprus precatorius, cho đến năm 1887 thì Dixson đã xác định được một dịch lỏng có độc tố, được tách chiết từ hạt thầu dầu Ricinus precatorius là một protein.

Những protein như vậy, được đề cập dưới tên gọi là hemagglutinin hay agglutinin thựcvật, vì ban đầu chúng được tìm thấy ở mẫu chiết từ thực vật Tuy nhiên, tất cả các nhàkhoa học sau này đều cho rằng những mô tả đầu tiên và đầy đủ nhất về hemagglutinin

là từ luận văn tiến sĩ của Peter Hermann Stillmark thực hiện tại trường đại học Dorpat(nay là trường đại học Tartu, Estonia) vào năm 1888 Chất hemagglutinin được

Stillmark tách chiết từ hạt của cây thầu dầu Ricinus communis và được đặt tên là ricin,

một độc tố mà sau đó được xác định là có bản chất protein [34]

Năm 1995, Peuman và Van Dame đã đưa ra một số khái niệm mới về cấu trúcliên quan đến chức năng của lectin: “Lectin là protein mà cấu trúc phân tử có chứa ít

nhất một vị trí liên kết đặc hiệu đường” [47] Dựa vào cấu trúc phân tử và biểu hiệnhoạt tính sinh học, Peuman và cộng sự đã phân chia lectin thành 3 loại:

 Merolectin có khối lượng phân tử tương đối nhỏ và chỉ có một trung tâm liênkết đường, do đó không có hoạt tính ngưng kết tế bào và không gây kết tủa các hợpchất liên kết đường Thuộc về loại này là một số protein của các cây họ Lan(Orchidaceae)

 Hololectin có chứa ít nhất hai trung tâm liên kết với đường, do đó có khả nănggây ngưng kết tế bào và gây tủa, do tương tác với nhiều loại hợp chất cộng hợp đường

Đó chính là các lectin quen thuộc đã được nghiên cứu nhiều nhất và dễ được phát hiệnbởi vì khả năng gây ngưng kết tế bào của chúng và thường được gọi làhemmagglutinin

 Chimerolectin là những phân tử, trong đó có ít nhất một vị trí liên kết vớiđường và có một vùng chức năng sinh học khác (có thể là chức năng xúc tác sinh học).Thuộc về loại này là protein kìm hãm riboxom typ 2 (RIP, Type 2) có trong hạt thầu

dầu (Ricinus communis L.,) hoặc hạt cây cam thảo dây (Abrus precatorius L.).

Song song với các hướng nghiên cứu ứng dụng, các nhà khoa học vẫn đi sâuvào tìm hiểu cấu trúc cũng như tính chất của các lectin, để sử dụng chúng một cáchthiết thực và có hiệu quả hơn Hiện nay các nhà khoa học đã hiểu biết khá nhiều về bảnchất của lectin Khoa học hiện đại đã đưa ra một định nghĩa mới nhất về lectin nhưsau: “Lectin là một loại protein không gây đáp ứng miễn dịch có khả năng liên kếtthuận nghịch, phi hóa trị với carbohydrate mà không làm thay đổi cấu trúc củacarbohydrate được liên kết Lectin gắn kết với những tế bào có glycoprotein hoặcglycolipid bề mặt Sự hiện diện của hai hay nhiều vị trí gắn kết đối với mỗi phân tửlectin cho phép nó gắn kết nhiều loại tế bào và phản ứng gắn kết với hồng cầu được sửdụng rất rộng rãi để kiểm tra sự hiện diện của lectin trong dịch chiết từ các sinh vậtkhác nhau” [61]

1.2.2 Sự phân bố của lectin trong sinh giới

 Sự phân bố lectin trong giới thực vật

Lectin được phân bố rất rộng rãi ở thực vật bậc cao và được định khu khá rộngtrong các cơ quan như thân, lá và hạt Tác giả Allen và Brillantine (1969), đã tiến hànhđiều tra ở 2663 loài thực vật và kết quả cho thấy có 800 loài chứa lectin, trong đó cáccây họ Đậu (Fabaceae) chiếm trên 600 loài [9] Ngoài các cây họ Đậu có số lượng loài

lớn nhất có chứa lectin, một số thực vật khác như họ Lan (Orchidaceae), họ Trinh nữ(Mimosaceae), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) và họ Hòa thảo (Poceae) cũng có chứalectin [12].

Ở Việt Nam, một số tác giả đã tiến hành điều tra sơ bộ các loại đậu đang đượctrồng phổ biến, kết quả cho thấy có tới 60% các loài có chứa lectin [6] Lectin từ họ

Dâu tằm (Moraceae), Mít và một số loài khác như Chay (Artocarpus tonkinensis), Sakê chi Artocarpus (Artocarpus incia) đều chứa lectin có hoạt tính NKHC rất cao [2].

Không chỉ ở thực vật bậc cao, các nghiên cứu cũng cho thấy sự có mặt củalectin ở nhiều loài của thực vật bậc thấp như ở một số loài Nấm (Fungi), Địa y(Lichenes) và Rong (Algae) Báo cáo đầu tiên về lectin từ rong biển là của Boyd vàcộng sự vào năm 1966 tại vùng biển Puerto Rico của Mỹ [18], từ đó đến nay đã cóhàng loạt các báo cáo về sự có mặt của lectin trong rong biển ở nhiều quốc gia khácnhau như: Anh, Nhật, Brazil, Hàn Quốc, Việt Nam…[58]

Mặc dù còn rất nhiều loài thực vật chưa được nghiên cứu nhưng các dẫn liệukhoa học trên đây cũng đã chứng tỏ rằng lectin là protein khá phổ biến trong giới thựcvật [8]

 Sự phân bố lectin trong giới động vật

Lectin có nguồn gốc từ động vật cũng được phát hiện khá sớm Lectin trong

giới động vật được phát hiện đầu tiên từ một loài sam biển Châu Mỹ (Limulus polyphemus) Sau đó, một số loài động vật thuộc lớp Giáp xác và các loài động vật

thuộc ngành Ruột khoang cũng đã được tiến hành điều tra Ở Việt Nam, khi khảo sát

30 loài thuộc ngành Ruột khoang ở vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa xuất hiện 10loài có chứa lectin [8]

Trong khi đó ở một số loài động vật có xương sống, lectin cũng đã được điềutra cơ bản Một số loài thuộc lớp Cá xương (Osteichthye), lớp Lưỡng cư (Amphibia),lớp Bò sát (Reptila), lớp Chim (Aves) và lớp Thú (Mammalia) cũng có chứa lectin

Ngoài ra, còn có một số dạng lectin khác từ huyết tương cá chình (Anguilla rastiata) hay trứng cá vược (Perca piuviatitis)… Một kết quả nghiên cứu khá thú vị, là ở môngười như mô cơ và các cơ quan của cơ thể người như tim, phổi và các tế bào của hệmiễn dịch cũng chứa lectin Như vậy, có khá nhiều loài động vật có chứa lectin Đócũng là bằng chứng về tính phổ biến của lectin trong sinh giới [14]

 Lectin có nguồn gốc vi sinh vật

Lectin đầu tiên từ vi sinh vật được phát hiện là vào năm 1942, khi Hirst và cộng

sự đã tìm thấy virus có chứa chất làm ngưng kết tế bào hồng cầu gà [8] Sau này, một

số công trình khoa học của Bruoly (1948), Stone (1949) và Bruet (1951) cũng đã pháthiện thấy lectin ở một số loài virus khác [51]

Trên đối tượng là vi khuẩn E coli, Ofek (1987) đã cho biết: trên bề mặt của tế

bào vi khuẩn này có chứa chất có khả năng gây ngưng kết tế bào Hoạt tính này mất đikhi có mặt một số loại đường như galactoza và dẫn xuất amin của nó Đó chính làlectin bề mặt màng tế bào vi khuẩn Dạng lectin này cũng đã được phát hiện ở một sốloài vi khuẩn khác như Houssto năm 1983 hay của Smit và cộng sự năm 1984[45]

Cấu tạo của lectin từ rong biển

 Khối lượng phân tử của lectin từ rong biển

Bằng các phương pháp xác định khối lượng phân tử như: phương pháp điện ditrên gel polyacrylamide, phương pháp siêu ly tâm và phương pháp quang phổ khối ionhóa phun điện tử (electron spray ionization-mass spectrometry), khối lượng phân tửcủa khá nhiều dạng lectin đã được xác định Kết luận có thể dẫn ra ở đây là khối lượngphân tử của lectin từ rong biển cũng có sự dao động khá lớn và lectin có nguồn gốckhác nhau thì khối lượng có thể giống nhau hoặc khác nhau

Lectin có nguồn gốc từ rong biển có khối lượng phân tử nhỏ nhất là lectin của

Hypnea japonica thuộc dòng rong Đỏ, khoảng 4,2 kDa Trong khi đó lectin có khối lượng phân tử lớn nhất cũng thuộc dòng rong Đỏ, Ptilota plumose, gồm một chuỗi

polypeptide khoảng 170 kDa [50, 33]

Năm 1986, Rogers đã tinh chế lectin từ rong lục Codium fragile và đã xác định

khối lượng phân tử của nó là 60 kDa, bao gồm 4 chuỗi polypeptide có cùng khối lượng

là 15 kDa cấu tạo nên [50] Dạng lectin này có điểm đẳng điện trong khoảng từ 3,8 đến3,9 Bằng phương pháp điện di SDS-PAGE, Jong Won Han và các cộng sự (2011) đã

xác định khối lượng phân tử của Bryopsis plumosa là 11,5 kDa, lectin này ở dạng đơn

phân [33]

Cho đến nay, có khá nhiều nghiên cứu công bố về khối lượng phân tử của lectin

và đã cho thấy mức độ biến đổi khá mạnh của chúng Tuy nhiên, so với khối lượng

phân tử của lectin từ thực vật bậc cao như lectin từ hạt đậu rựa (Canavalia ensiformis L.,) là 108 kDa hay lectin từ động vật như sam biển Việt Nam (Tachpleus tridentatus)

có khối lượng phân tử lên đến trên 700 kDa thì khối lượng phân tử của lectin từ rong

biển lại khá thấp, phần lớn trong chúng dao động tập trung trong khoảng từ 15 đến 45kDa Các nhà khoa học cho rằng chưa thể tìm thấy được mối liên hệ nào giữa khốilượng phân tử lectin và hoạt tính của chính nó Khối lượng phân tử của lectin khôngmang tính đặc trưng cho loài hay cá thể và cũng không phụ thuộc vào mức độ tiến hóacủa loài hay cá thể đó [8]

 Cấu tạo phân tử lectin từ rong biển

Cũng giống như lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, khi nghiên cứu trình tựaxit amin trong phân tử lectin từ rong biển các nhà khoa học đã nhận thấy: trình tự axitamin trong phân tử lectin phản ánh mối quan hệ trong quá trình tiến hóa Khi nghiên

cứu cấu trúc bậc nhất chuỗi α của lectin ở 3 loài rong cùng chi Eucheuma là E serra,

E amakusaensis và E cottonii, Kawakubo và cộng sự đã cho biết: trình tự của 20 axit

amin đầu N của có tỷ lệ tương đồng rất cao, thành phần gốc axit amin chủ yếu giàu cácgốc Glx, Asx, Gly và Ser [35, 36]

Có khá nhiều công trình đã chỉ ra rằng hầu hết các dạng lectin từ rong biểnđược cấu tạo từ một mạch polypeptide Chỉ một số ít lectin có cấu tạo từ hai mạchpolypeptide trở lên, mỗi mạch polypeptide tạo thành một tiểu đơn vị, các tiểu đơn vịnày có khối lượng phân tử giống nhau hoặc khác nhau Ví dụ như lectin từ rong đỏ

Vidalia obtusiloba có cấu trúc dimer, trọng lượng của 2 chuỗi polypeptide lần lượt là 59,6 và 15,2 kDa [22], trong khi đó lectin từ rong xanh Codium fragile lại có cấu tạo

tetramer với khối lượng mỗi đơn phân đều là 15 kDa

Hori và cộng sự nghiên cứu cấu trúc bậc nhất của 2 đồng phân lectin hypnin

A-1 và hypnin A-2 từ rong đỏ Hypnea japonica cho thấy: chúng có cấu tạo đơn phân chỉ

do một chuỗi polypeptide gồm 90 gốc axit amin tạo thành; trong đó, có 4 gốc cystinestạo thành 2 cầu nối disulfide: cys5-cys62 và cys12-cys89; 3 loại axit amin là serine,glycine và proline chiếm đến 43% số gốc axit amin có trong chuỗi polypeptide; trình

tự axit amin của 2 lectin này chỉ khác nhau ở 3 vị trí: 19, 31 và 52, sự khác nhau củacác gốc axit amin này không ảnh hưởng đến sự giống nhau về hoạt tính ngưng kếthồng cầu cũng như khả năng liên kết với một số glycoprotein của 2 loại lectin này.Mặt khác, ngoài glycoprotein, hoạt tính ngưng kết hồng cầu của chúng còn bị ức chếbởi protein phospholipase A-2, điều này cho phép chúng ta nhận định rằng lectinhypnins không chỉ chứa vị trí liên kết với carbohydrate mà còn chứa vị trí liên kết vớiprotein Với trọng lượng phân tử chỉ xấp xỉ 9,1 kDa cùng với 2 cầu nối disulfide, đây

được xem là 2 yếu tố chính làm tăng khả năng chịu nhiệt của 2 lectin này Khôngnhững vậy, khi alkyl hóa hoặc cắt đứt cầu disulfide, Hori cũng nhận thấy hoạt tínhngưng kết hồng cầu của chúng cũng bị mất đi, từ đây có thể đưa ra giả định rằng trungtâm hoạt động của 2 lectin này có chứa cầu nối disulfide [22].

Bất kỳ một dạng lectin nào dù có cấu trúc bậc I hoặc cấu trúc không gian phứctạp đều chứa trung tâm hoạt động Đó là trung tâm liên kết carbohydrate Chính trungtâm này quyết định hoạt tính của lectin Nếu như ở enzyme, trung tâm hoạt động củachúng là các gốc axit amin hoặc phần phi protein thì ở hầu hết các lectin trung tâmhoạt động của chúng là do một số gốc axit amin như tyrozine, xerine, treonine,tryptophan… có khả năng liên kết mạnh với các gốc đường tạo nên Các dạng lectinkhác nhau thì có thành phần axit amin trong trung tâm hoạt động là khác nhau Chođến nay, vấn đề về trung tâm hoạt động của lectin vẫn còn rất phức tạp [28, 19]

1.2.3 Một số tính chất và sinh học của lectin từ rong biển

 Sự tương tác của lectin từ rong biển với các loại đường và dẫn xuất của nó

Qua các thí nghiệm về khả năng liên kết với các loại đường ở lectin được táchchiết từ rong biển, người ta nhận thấy lectin từ rong biển ít liên kết với các loại đườngđơn hay đường đa như ở thực vật bậc cao hay động vật mà ngược lại nó liên kết vớicác glycoprotein dạng N-glycan hay O-glycan như: porcine stomach mucin,lactotransferrin, asialofetuin…[39, 57]

Có thể nói rằng cơ chế của sự tương tác với đường của lectin vẫn còn khá phứctạp Mặc dù vậy, đặc tính này có ý nghĩa cực kỳ quan trọng trong các nghiên cứu sửdụng lectin Với các lectin tương tác đặc hiệu với một loại glycoprotein nào đó thì cóthể sử dụng lectin này để nghiên cứu sâu cấu trúc màng tế bào có mặt glycoprotein đó[31] Một số nhà khoa học cũng đã sử dụng lectin tương tác đặc hiệu với glycoprotein

để xác định kháng nguyên trên bề mặt màng tế bào hồng cầu Gần đây, dựa vào cácloại đường ức chế đặc hiệu hoạt độ lectin mà người ta đã sử dụng chúng để tinh chế

nhiều loại lectin bằng sắc ký ái lực và hơn nữa người ta cũng sử dụng cột ái lực lectin

để tinh chế và nghiên cứu nhiều loại glycoprotein có chức năng sinh học

 Khả năng gây ngưng kết tế bào

Loại tế bào dễ bị lectin làm ngưng kết là các tế bào hồng cầu của động vật vàngười Đây là dấu hiệu đặc trưng nhất để nhận biết lectin Số lượng lectin có khả năngngưng kết hồng cầu chỉ duy nhất của một nhóm máu là rất ít, vì chúng đồng thời có thểgây ngưng kết với nhiều loại hồng cầu như: thỏ, cừu, gà, dê hay ngựa… Theo tác giảAllen và Billantine, trong hơn 800 dạng lectin được nghiên cứu thì chỉ có 90 loài chứalectin đặc hiệu nhóm máu, 711 loài chứa lectin không đặc hiệu nhóm máu Lectin từ

rong biển Ptilota plumosa ngưng kết đặc hiệu với nhóm máu B, trong khi lectin từ rong Codium fragile chỉ ngưng kết hồng cầu máu A đã xử lý papain mà không thể

ngưng kết với các nhóm máu khác của người như O, B hay AB [50] Các lectin đặchiệu nhóm máu này có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng

Theo Sharon (1989), lectin không những gây ngưng kết tế bào hồng cầu người

và động vật mà còn có khả năng gây ngưng kết tế bào của vi sinh vật và một số dạng tếbào khác như: tế bào giao tử, tế bào khối u, tế bào ung thư hay các tế bào phôi…[55]

1.3 ỨNG DỤNG CỦA LECTIN TỪ RONG BIỂN

Lectin từ rong biển đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vựckhác nhau của đời sống Các ứng dụng đó có thể được tóm tắt như sau:

 Lectin trong huyết học

Sử dụng lectin để phân loại nhóm máu là ứng dụng sớm nhất và đến nay vẫncòn được áp dụng rộng rãi Phương pháp xác định nhóm máu bằng lectin cho kết quảnhanh, chính xác mà không cần dùng huyết thanh mẫu Tuy nhiên, phương pháp nàyđòi hỏi lectin phải tinh khiết và có tính đặc hiệu cao

Việc sử dụng lectin từ rong biển để xác định nhóm máu cũng đã được sử dụng

trong nhiều năm nay Lectin từ rong Ptilota plumose gây ngưng kết đặc hiệu với nhóm máu B, trong khi lectin từ rong Codium fragile chỉ ngưng kết với hồng cầu máu A đã

xử lý papain mà không thể ngưng kết với các nhóm máu khác như A, B, O hay AB[50]

 Lectin trong tế bào học

Lectin được sử dụng như một công cụ hữu hiệu để nghiên cứu cấu trúc màng tếbào và những biến đổi trên bề mặt màng tế bào trong quá trình biệt hóa bệnh lý thôngqua sự thay đổi thành phần carbohydrate trên bề mặt tế bào.

Năm 1988, lectin được tinh sạch từ Codium tomentosum được sử dụng như một

công cụ để phát hiện sự có mặt của nhiều loại glycoprotein khác nhau mà phần lớn làGlu-NAc

 Lectin trong thuốc bảo vệ thực vật và ngũ cốc

Lectin mà đặc biệt là lectin từ rong biển có khả năng kháng lại nhiều loại sâu bọ

và côn trùng có hại cho cây trồng vì chúng có khả năng liên kết với glycoproteinđường ruột và phá vỡ cơ chế tự phục hồi của enzyme đường ruột dẫn đến côn trùng tựchết

Bảng 1.2: Nguồn lectin từ rong biển có khả năng diệt côn trùng

Nguồn lectin Loại côn trùng Ảnh hưởng đặc hiệu Liên kết Tác giả

Gracilaria

cornea (rong

Đỏ)

Boophilus microplus

Làm côn trùngchậm pháttriển, giảmtrọng lượngtrứng và lượngtrứng nở thànhcon…

Fetuin,porcinestomachmucin

Làm côn trùngchậm pháttriển…

Fetuin,porcinestomachmucin

Dịch chiết lectin từ rong Eucheua serra và Galaxaura marginata ức chế sự phát triển của vi khuẩn biển gây hại cho cá là Vibrio pelagius và Vobrio vulnificus, 2 loại vi

khuẩn này gây bệnh ở cá [40] Lectin từ một số loài rong nâu như Fucus vesiculosus, Dictyopteris membranacea, Fucus serratus…có khả năng gây ngưng kết và ức chế sự phát triển của các chủng nấm nhầy gây bệnh như Candida guilliermondi [60]

Lectin từ một số loài rong đỏ như Eucheuma serra, Oscillatoria agardhii hay Griffithsia sp có khả năng liên kết đặc hiệu với glycoprotein dạng high manose N-

glycan ở nồng độ rất thấp, đây là những glycoprotein có mặt chủ yếu trên bề mặt củamàng tế bào HIV, do đó có thể kìm hãm hiện tượng nhiễm HIV và hạn chế được khảnăng mắc bệnh [31]

Như vậy có thể thấy, lectin đã và đang được nghiên cứu để sử dụng trong chuẩnđoán các bệnh truyền nhiễm và rối loạn trao đổi chất, trong nghiên cứu sinh học và

miễn dịch, làm mitogen trong nuôi cấy tế bào với mục đích chữa bệnh, tăng năng suất

trong trồng trọt, chăn nuôi và bảo quản lương thực [8].

 Lectin trong virus học

Gần đây, lectin từ rong biển đang được xem là nguồn sản phẩm tự nhiên phongphú, có khả năng kháng virus mạnh mẽ Ví dụ như grifftithsin (GRFT) [31],

Oscillatoria agardhii (OAA) (Sato et al, 2007) [32], Eucheuma serra (ESA-2) [53]

những lectin này đã cho thấy hoạt tính rất mạnh kháng lại virus HIV và những viruskhác Không giống như phần lớn các liệu pháp điều trị kháng virus hiện tại, nhữnglectin có khả năng hoạt động qua sự ức chế chu kỳ sống của virus, ngăn chặn sự xâmnhập vào tế bào vật chủ của virus Thêm vào đó, những lectin này thường chịu đượcnhiệt độ cao, pH thấp, không có mùi, có khả năng liên kết với nhiều loại glycoproteintrên bề mặt lớp vỏ của virus Vì vậy, lectin từ rong biển đang là mục tiêu được quantâm trong các nghiên cứu cơ bản và những ứng dụng của chúng trong tương lai

1.3 Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trong nước và nước ngoài

 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

Công trình khoa học đầu tiên về lectin từ rong biển là của Boyd và cộng sự vàonăm 1966, ông đã phát hiện rong biển cũng có khả năng gây ngưng kết tế bào hồngcầu ở người[31] Kể từ đó có rất nhiều công trình công bố sự có mặt của lectin trongrong biển:

 Năm 1988, Hori đã khảo sát hoạt tính ngưng kết hồng cầu của 31 loài rong biểntrên hồng cầu người và động vật Từ kết quả nghiên cứu đạt được ông đã cho rằng hoạttính ngưng kết hồng cầu đóng một vai trò quan trọng trong chức năng sinh lý của tếbào rong biển Và hoạt tính này có thể tồn tại ở nhiều loài rong biển khác nhau [29]

 Tại Tây Ban Nha, Fábregas được xem là một trong những người tiên phongtrong việc nghiên cứu lectin từ rong biển Từ năm 1985 đến năm 1992, ông và cộng sự

đã khảo sát sự có mặt của lectin ở hơn 90 loài rong biển thuộc 3 dòng rong: rong đỏ,rong nâu và rong lục Trong đó, hoạt tính ngưng kết hồng cầu từ rong đỏ là phổ biếnnhất [31,23]

 Những năm gần đây, nghiên cứu về lectin từ rong biển đang được khảo sát ởnhiều địa điểm khác nhau trên thế giới với quy mô ngày càng lớn hơn: từ Nam Mỹ,Châu Âu, Châu Á cho đến các vùng Nam cực Hơn thế nữa, không chỉ dừng lại ở việc

khảo sát sự có mặt của lectin trong rong biển mà những tính chất cơ bản của nó cũng

đã được chú tâm đến [25,15]

Tuy nhiên, cho đến nay số lượng lectin được tinh sạch cũng như khảo sát đặctính hóa sinh vẫn còn rất khiêm tốn, đặc biệt là khi so sánh với lectin từ thực vật bậccao [31] Hầu hết trong số đó là các lectin từ rong biển mà chủ yếu là ở một số dòng

rong đỏ như: Bryothamnion seaforthii, B triquetrum; Solieria filiformis [22]; Pterocladiella capillacea [57] ….Trong số đó, có một vài lectin từ dòng rong đỏ đã được làm sáng tỏ về cấu trúc bậc 1 như: H japonica và Vidalia obtusiloba [22].

 Tình hình nghiên cứu trong nước

Khác với lectin từ thực vật cao, cho đến nay, việc nghiên cứu lectin từ rongbiển ở Việt Nam vẫn còn rất hạn chế, chỉ có một số nghiên cứu của Viện nghiên cứu

và ứng dụng công nghệ Nha Trang Từ năm 2008 cho đến nay, các công trình nghiêncứu tại đây đã khảo sát được hơn 80 loài rong biển khác nhau Kết quả cho thấy, hầuhết các loài rong biển đều có khả năng gây ngưng kết với ít nhất một loại hồng cầu từđộng vật như thỏ, cừu, gà, ngựa và 3 nhóm máu A, B, O của người Một số tính chấthóa sinh như liên kết carbohydrate, khoảng pH hoạt động, nhiệt độ hay khả năng ứngdụng của các lectin này cũng đang được nghiên cứu [30, 31]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Rong Đỏ Eucheuma denticulatum thu ở vùng biển

Khánh Hòa – Ninh Thuận

2.2.1 Vật liệu, hóa chất

 Vật liệu

Mẫu rongEucheuma denticulatum thu ở vùng biển Khánh Hòa – Ninh Thuận.

Hồng cầu của máu thỏ, cừu, ngựa và gà lấy từ Viện Vaccine - Nha Trang Hồngcầu các nhóm máu A, B, O ở người lấy từ Bệnh viện đa khoa tỉnh Khánh Hòa

 Hóa chất

Các loại đường và glycoprotein: D-glucose, D-mannose, D-galactose, L-fucose,D-xylose, D-glucosamine, D-gluconic acid, p-nitrophenyl-D-galactoside, p-nitrophenyl-D-glucoside, p-nitrophenyl-D-mannoside, laminaran, transferrin, fetuin,porcine thyroglobulin và procine stomach mucin; Yeast mannan… (Merck-Đức)

Sephadex G-75 của (Pharmacia, Uppsala-Thụy Điển)

Hóa chất phân tích các loại

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp xác định các điều kiện tối ưu để chiết lectin từ rong E.denticulatum

Phương pháp khảo sát: khi khảo sát một yếu tố nào đó trong quá trình tách

chiết như nồng độ dung môi, nhiệt độ chiết, thời gian chiết…thì các yếu tố còn lạiđược cố định Yếu tố nào khảo sát xong thì sẽ được cố định ở giá trị tối ưu để tiếp tụckhảo sát đến các yếu tố khác

 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết

Tiến hành chiết lectin từ rong E.denticulatum bằng dung dịch đệm phosphate

(PBS 0,05M 0,85% NaCl) với các tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v): 1:2, 1:4, 1:6, 1:8,1:10, 1:12, 1:14, ở nhiệt độ 4 oC và thời gian chiết là 3 giờ Sau đó, ly tâm với tốc độ