Thu nhận enzyme cellulase thô từ chủng Bacillus spp. trong tự nhiên

Cellulase thường được sinh tổng hợp từ nấm, vi khuẩn, thực vật và động vật nhưng trong ứng dụng thường sử dụng nguồn gốc từ vi sinh.. Phương pháp và nguyên liệuChuẩn bị môi trường Môi tr

Thu nhận enzyme cellulase thô từ chủng

Bacillus spp trong tự nhiên

Mạch Trần Phương Thảo

1 Đặt vấn đề

Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulose có vai trò quan trọng trong đời sống tự nhiên Và hiện nay nhu cầu sử dụng enzyme này rất phổ biến trong đời sống hiện đại

Cellulase thường được sinh tổng hợp từ nấm, vi khuẩn, thực vật và động vật nhưng trong ứng dụng thường sử dụng nguồn gốc từ vi sinh Hệ enzyme từ nấm gồm có endoglucanese (hoặc CMCase), exoglucanases (cellobiohydrolase) và β-glucosidases (hoặc cellobiases) đóng vai trò trong glucosidases (hoặc cellobiases) đóng vai trò trong việc thủy phân hoàn toàn cellulose Loài nấm được ứng dụng để sinh

cellulase như Trichoderma viride, Aspergillus spp Đối với hệ enzyme trong

vi khuẩn thường thấy ở vi khuẩn hiếu khí như Pseudomonas và

Actinomyces, kị khí thường thấy ở Bacillus và Cellulomonas, đặc biệt là loài Clostridium.Hầu hết các chủng đều sinh endoglucanases

Cellulase được sử dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm như chế biến cà phê Nó sẽ thủy phân cellulose trong quá trình tách vỏ cà phê Ngoài

ra, cellulase còn được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp vải sợi, sản xuất giấy hay ứng dụng trong dược phẩm Hiện nay, nó còn được quan tâm rộng rãi hơn trong lên men sản xuất nhiên liệu sạch thay thế cho xăng dầu hiện nay

2 Phương pháp và nguyên liệu

Chuẩn bị môi trường

Môi trường nuôi vi khuẩn Bacillus spp.:

NA 2g

Nước 100ml

pH=6,8

Môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase

Pepton 1g

Nước 100ml

pH=6,8

2.1 Chuẩn bị mẫu

Vi khuẩn được chọn lọc từ nguồn tự nhiên trong cơm nấu để qua 24h

ở nhiệt độ phòng Trước khi đi cấy chọn vi khuẩn, mẫu được đun cách thủy

ở nhiệt độ 100oC trong 15 phút nhằm tiêu diệt các loại vi khuẩn sinh dưỡng Baccilus spp là chủng vi khuẩn có khả năng sinh bào tử và chịu được nhiệt

độ cao nên với phương pháp trên sẽ hạn chế bớt các vi khuẩn không mong muốn

2.2 Phân lập vi khuẩn

Chuẩn bị môi trường thạch dinh dưỡng NA (Nutritional agar) để cấy khuẩn Các đĩa peptri, ống nghiệm được sấy khử trùng ở nhiệt độ 160oC trong 2 giờ Môi trường được hòa tan theo định mức 2g NA pha với 100ml nước cất và hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút Vi khuẩn được cấy ria nhằm phân lập khuẩn lạc theo đúng phương pháp nhằm tránh để bị nhiễm

Các đĩa peptri cấy khuẩn được ủ trong 37oC với thời gian 24h để khuẩn lạc phát triển

Vi khuẩn được phân lập sẽ đem đi kiểm tra hình thái nhằm xác định

có phải là chủng Baccilus spp hay không Thí nghiệm sử dụng phương pháp nhuộm gram sau đó soi kính hiển vi điện tử

2.3 Giữ chủng

Sử dụng môi trường thạch dinh dưỡng NA (Nutritional agar) pha với

tỉ lệ 2g NA trong 100ml nước cất Môi trường được hấp khử trùng trong

121oC trong 30 phút sau đó cho vào từng ống nghiệm 5ml thạch Ống

nghiệm được đặt nghiêng 30o và để nguội Sau đó cấy chuyền vi khuẩn vào ống nghiệm và bảo quản ở nhiệt độ 4o rồi cách 1 tháng cấy chuyền tiếp tục một lần nhằm giữ giống

2.4 Nuôi tăng sinh

Chuẩn bị môi trường để cấy vi khuẩn sinh enzyme như trên Đối với CMC cần hòa tan trong nước nóng 70oC trước khi hòa chung các chất khác Hấp môi trường ở nhiệt độ 121oC trong 30 phút Sau đó cho ống nghiệm chứa vi khuẩn vào và tiếp tục nuôi cấy trên máy lắc trong thời gian 2ngày

Để thu nhận enzyme cellulase thô thì đưa dịch đi ly tâm lạnh với tốc

độ 3500 vòng/phút trong thời gian 10 phút ở nhiệt độ 4oC, gạn kết tủa thu dịch lọc đem đi xác định hoạt độ

2.5 Đo hiệu quả thủy phân của enzyme

Thí nghiệm được tiến hành trên đĩa thạch peptri với phương pháp đục

lỗ thạch và chấm điểm khuẩn trên bề mặt Sau đó tiến hành đo vòng phân giải và so sánh, lựa chọn chủng vi khuẩn sinh enzyme cellulase tốt nhất

3 Kết quả và đề xuất

Hình 1 Vi khuẩn Bacillus spp.

Hình 2 Cấy ria vi khuẩn trên đĩa peptri

Hình 3 Giữ chủng trên thạch nghiêng

Hình 4Tuyển chọn chủng thu nhận enzyme cellulase

Hình 5 Tuyển chọn chủng theo phương pháp đục lỗ thạch

Kết quả quá trình định lượng đường khử so với mẫu chứng không bổ sung enzyme là 0,4ml KMnO4, mẫu thử là 2,4ml, chênh lệch là 2ml Tra bảng quy đổi đường khử đạt 1,8mg Glucose cho thấy dấu hiệu khả quan khi sinh tổng

hợp enzyme cellulase từ Bacillus spp.

Qua quá trình thử nghiệm thì có thể thấy kết quả khả quan khi vi sinh vật sinh enzyme cellulase Tuy nhiên thí nghiệm khảo sát còn hạn chế về thời gian nên đề xuất thêm các phương pháp tối ưu để sinh enzyme có hoạt tính cao hơn

-glucosidases (hoặc cellobiases) đóng vai trò trong Sử dụng nhiều nguồn thu nhận Bacillus spp để lựa chọn được chủng nào sinh enzyme mạnh hơn

-glucosidases (hoặc cellobiases) đóng vai trò trong Tối ưu hóa môi trường sinh enzyme, bổ sung các chất khoáng vi lượng, đa thành phần Có thể lựa chọn môi trường lỏng hoặc môi trường bán rắn để thử nghiệm

-glucosidases (hoặc cellobiases) đóng vai trò trong Kiểm tra hoạt tính enzyme cellulase trên đĩa thạch bằng phương pháp

đổ dung dịch Lugon trên bề mặt nhằm so sánh vòng tròn thủy phân cơ chất

-glucosidases (hoặc cellobiases) đóng vai trò trong Sử dụng phương pháp Miller đo lượng đường khử để suy ra hoạt độ enzyme nhằm đưa kết quả chính xác hơn phương pháp Bertran

-glucosidases (hoặc cellobiases) đóng vai trò trong Thực hiện các thí nghiệm khảo sát các tính chất của enzyme như yếu

tố nhiệt độ tối ưu,tính bền nhiệt, pH tối ưu, ion kìm hãm, chất hoạt hóa…