Nuôi cấy in -vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Nuôi cấy in -vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2

DANH SÁCH CÁC BẢNG BIỂU 5

DANH SÁCH CÁC HÌNH 6

LỜI MỞ ĐẦU 7

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8

1.1 GIỚI THIỆU CÂY SÂM NGỌC LINH 8

1.1.1 Vị trí phân loại: 8

1.1.2 Đặc điểm hình thái: 9

1.1.3 Đặc điểm sinh thái: 10

1.1.4 Đặc tính dược liệu của Sâm Ngọc Linh: 12

1.2 Sơ lược kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 23

1.2.1 Cơ sở khoa học: 24

1.2.2 Các kỹ thuật nuôi cấy 26

1.2.4 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 31

1.2.5 Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 35

1.2.6 Các ứng dụng: 38

1.2.7 Các bước trong nhân giống in – vitro: 39

1.2.8 Ưu – nhược điểm của phương pháp nhân giống in – vitro: 42

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY 44

2.1 Nuôi cấy mô sẹo và rễ bất định sâm Ngọc Linh 44

2.1.1 Vật liệu: 44

2.1.1 Môi trường: 44

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ: 44

2.1.3 Hóa chất: 44

2.1.4 Qui trình thực hiện 45

2.1.5 Điều kiện nuôi cấy: 45

2.2 Nuôi cấy sinh khối và tạo vi củ sâm Ngọc Linh 46

2.2.1 Nguyên liệu: 46

2.2.2 Môi trường: 46

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ: 46

2.2.4 Hóa chất: 46

2.2.5 Qui trình thực hiện: 46

2.2.6 Điều kiện nuôi cấy: 47

2.3 Khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến nuôi cấy Sâm Ngọc Linh 48

2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của 2,4 D lên sự hình thành mô sẹo và rễ bất định của mẫu cấy 49

2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự hình thành rễ bất định in vitro của sâm Ngọc Linh trên các môi trường MS, SH và Gamborg (B5) 52

2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của IBA lên sự hình thành rễ bất định in vitro của sâm Ngọc Linh trên các môi trường MS, SH, B5 55

CHƯƠNG III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

3.1 Kết luận 57

3.2 Kiến nghị: 58

PHỤ LỤC 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

TDZ N – phenyl – 1,2,3 – thidiazol – 5 yl urea

2,4D Dichlophenolxyl acetic acid

DANH SÁCH CÁC BẢNG BIỂUBảng 1: Hàm lượng một số saponin chính trong sâm ( Đã trừ độ ẩm) Error! Bookmark not defined

Bảng 2: Hàm lượng saponin của Sâm Ngọc Linh so sánh với các loài Panax spp trồng

trọt: Error! Bookmark not defined

Bảng 3: Các saponin chính yếu trong thành phần saponin dẫn chất protopanaxatriol:

Error! Bookmark not defined Bảng 4: Acid Oleanolic: Error! Bookmark not defined Bảng 5: Ocotillol: Error! Bookmark not defined Bảng 6: Các axid béo được tìm thấy: Error! Bookmark not defined Bảng 7: Thành phần acid amin chủ yếu: Error! Bookmark not defined Bảng 8: Các nguyên tố vi lượng: Error! Bookmark not defined Bảng 9: Tác dụng dược lý của nhân sâm Ngọc Linh Error! Bookmark not defined

Bảng 10: Thời gian tối thiểu để hấp khử trùng môi trường nuôi cấy mô ở 1210C Error! Bookmark not defined

Bảng 11: Nồng độ và thời gian sử dụng 1 số chất xử lí mô cấy thực vật: Error! Bookmark not defined

Bảng 12: Ảnh hường của auxin2,4 - D lên khả năng tăng sinh mô sẹoSâm Ngọc Linh:

Error! Bookmark not defined

Bảng 13: ảnh hưởng của NAA lên sự hình thành rễ bất định invitro của Sâm Ngọc Linh

trên các môi trường MS, SH và B5 Error! Bookmark not defined

Bảng 14: ảnh hưởng của IBA lên sự hình thành rễ bất định invitro của sâm Ngọc Linh

trên các môi trường MS, SH, B5 Error! Bookmark not defined.

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1: Hình thái Sâm Ngọc Linh Error! Bookmark not defined Hình 2: cây sâm Ngọc Linh ngoài tự nhiên Error! Bookmark not defined Hình 3: Củ nhân sâm Ngọc Linh trên 50 năm tuổi Error! Bookmark not defined Hình 4: Củ nhân sâm Ngọc Linh lâu năm Error! Bookmark not defined Hình 5: Cây nhân sâm Ngọc Linh hoang dại Error! Bookmark not defined Hình 6: Nuôi cấy trong Bioreactor Error! Bookmark not defined Hình 7:Rễ sâm Ngọc Linh nuôi cấy trong Bioreactor Error! Bookmark not defined

Hình 8: Quá trình hình thành mô sẹo và rễ bất định của sâm Ngọc Linh (P.vietnamensis)

sau 2 tháng nuôi cấy Error! Bookmark not defined Hình 9: Sâm Ngọc Linh trên môi trường B5 có bổ sung 7 mg/l NAA sau 30 ngày nuôi cấy Error! Bookmark not defined Hình 10: rễ bất định hình thành sau 1 tháng nuôi cấy Error! Bookmark not defined

LỜI MỞ ĐẦU

Là một vị thuốc bổ đứng hàng đầu trong các vị thuốc bổ, từ xa xưa sâm chỉ được dùng cho các ông hoàng bà chúa, những người lắm tiền nhiều của bởi sự quý hiếm, khó trồng, lâu thu hoạch Nhưng ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học, từ một số tế bào gốc bằng công nghệ sinh khối tế bào, đã thành công trong việc nuối cấy tế bào sâm Ngọc Linh với số lượng lớn Cây sâm Ngọc Linh (có tên khoa học là Panax vietnamensis, hay sâm K5, sâm Việt Nam) được Đoàn điều tra dược liệu Khu V do Dược sĩ Đào Kim Long phát hiện lần đầu vào năm 1973 tại huyện Đăk Tô (tỉnh Kon Tum) Đây cũng là loài nhân sâm thứ 20 được tìm thấy trên thế giới Sâm Ngọc Linh trong tự nhiên phân bố chủ yếu chung quanh vùng núi Ngọc Linh (thuộc huyện Trà My, Quảng Nam và Đăk Tô, Kon Tum) ở độ cao 1.500m trở lên Loại cây này sinh trưởng chậm, phải từ 6 năm trở lên mới

có thể sử dụng Hiện nay, sâm Ngọc Linh đã được đưa vào sách đỏ Việt Nam

Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy sâm Ngọc Linh có tác dụng bổ dưỡng toàn thân, tăng sức lực Khi dùng cho bệnh nhân, phục hồi sức khỏe, bệnh nhân ăn ngon, tăng sức đề kháng đối với những yếu tố độc hại (tăng khả năng chịu các tác nhân stress vật lý, hóa học, sinh học)

Để cung cấp nguồn sâm Ngọc Linh cho ngành công nghiệp dược phẩm, bên cạnh việc đầu tư quy hoạch, trồng và bảo tồn sâm Ngọc Linh, đã có nhiều nghiên cứu cho thấy

sự ứng dụng của công nghệ sinh học được coi như là một phương pháp tối ưu giúp cải thiện việc nhân giống sâm và tạo ra nguồn vật liệu thô dùng trong y học và các lĩnh vực khác của đời sống Gần đây, đã có nhiều nghiên cứu trong nuôi trồng sâm in vitro bao

gồm nuôi cấy tế bào, mô, cơ quan, tái sinh cây và chuyển gen Phương pháp này có nhiều

ưu điểm so với phương pháp truyền thống như quá trình nuôi cấy để thu cây con và sản phẩm thứ cấp không phụ thuộc điều kiện ngoại cảnh (khí hậu, sâu bệnh,…), có thể điều chỉnh được quá trình sản xuất, sản phẩm thu được có hiệu suất cao và chất lượng ổn định hơn

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CÂY SÂM NGỌC LINH

1.1.1 Vị trí phân loại:

Việt Nam có nhiều cây thuốc được gọi là Sâm Nhưng chỉ có bốn loài Sâm thuộc

họ Nhân Sâm (Araliaceae) Chi Panax gần gũi với cây Nhân Sâm Panax gingseng C A Meyer là Sâm Ngọc Linh, Sâm Tam Thất, Sâm Nam và Sâm Vũ Diệp, đều là các cây

thuốc quý

Năm 1968, KS Vũ Đức Minh đã tìm thấy cây Sâm Ngọc Linh tại vùng núi Ngọc Linh và tạm đặt tên nó là Sâm Khu 5 Năm 1973, đoàn điều tra cây thuốc của Ban dân y

Khu 5 do DS Đào Kim Long dẫn đầu đã phát hiện một loài Panax mọc hoang thành

quần thể ở độ cao 1.800 m trên vùng núi Ngọc Linh và tạm đặt tên là Sâm Đốt Trúc với

tên khoa học Panax articulatus, họ Nhân Sâm (Araliaceae) (Nguyễn Minh Đức, 2003) Tên khoa học của cây được công nhận là Panax vietnamensis Ha et Grush., họ Nhân Sâm

Araliaceae, công bố tại Viện thực vật Kamarov (Liên Xô trước đây) nǎm 1985 do Hà Thị Dung và I V Grushvistky đặt tên

Phân loại sâm Ngọc Linh

- Giới: Plantae

- Ngành: Magnoliophyta

- Bộ: Apiales

- Họ: Cam Tùng (Araliaceae)

- Chi: Panax

- Loài: Panax

- Loài: Panax vietnamensis Ha et Grush

- Tên khác: Sâm Việt Nam, Sâm Ngọc Linh, Sâm Khu Năm, Thuốc Dấu (Xê Đăng)

- Tên nước ngoài: Vietnamese ginseng

Hình 1: Hình thái Sâm Ngọc Linh

1.1.2 Đặc điểm hình thái:

Cây thảo, sống lâu năm nhờ thân rễ, cao khoảng 40 - 80 cm, đôi khi trên 1 m

Thân rễ nạc, mọc bò ngang như củ gừng, có nhiều đốt, không phân nhánh, dài 30

- 40 cm, có thể hơn, mang nhiều rễ nhánh và củ, có nhiều vết sẹo do thân khí sinh hàng

năm để lại, mặt ngoài màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, phần cuối đuôi đôi khi có một củ

hình cầu Thân rễ còn mang nhiều rễ phụ, ở cây hoang dại, thân rễ là phần phát triển

mạnh nhất chứa chất dự trữ, hoạt chất Hình dạng rất thay đổi, rễ củ ở cây sâm hoang dại

rất phát triển có dạng con quay, hình trụ, có màu vàng nhạt mang nhiều rễ con với những

vàm ngang Đối với sâm trồng, rễ củ rất phát triển, tăng trưởng hàng năm rất rõ rệt, chúng

có ba dạng chính: dạng củ cà rốt, dạng con quay và dạng bó củ, đây là dạng rất phổ biến

Sâm Ngọc Linh trồng thường cao đến 1 m mang nhiều lá kép có khi đến 7 lá chét to hơn bình thường

Thân khí sinh mảnh, thẳng màu xanh hay hơi tím, mọc thẳng, mang 2 - 4 lá kép chân vịt mọc vòng, mỗi lá kép có 5 lá chét hình trứng ngược hoặc hình mác, dài 10 - 14

cm, rộng 3 - 5 cm, gốc hình nêm, đầu thuôn dài thành mũi nhọn, mép khía răng nhỏ

Hoa tự, cụm hoa mọc thành tán đơn ở ngọn thân, có cuống dài 10 - 20 cm có thể kèm 1 - 4 tán phụ hay một hoa riêng lẻ ở phía dưới tán chính Hoa nhiều màu lục vàng, hoa hình tán đơn mọc dưới các lá thẳng với thân Mỗi tán 60 - 100 hoa, cuống hoa ngắn 1

- 1.5 cm, lá đài 5, cánh hoa 5, vàng nhạt, nhị 5, bầu 1 ô với 1 vòi nhụy Đài có 5 răng dài, nhị 5, chỉ nhị hình sợi, bầu 1 ô với một vòi nhụy

Lá kép, chân vịt mọc vòng với 3-5 nhánh lá, cuống lá kép, mang 5 lá chét, lá chét phiến bầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn, có lông ở cả hai mặt

Quả hạch, hình trứng, khi chín có màu đỏ hay vàng nhạt, sau đen, hạt hình thận màu trắng, bề mặt hạt có nhiều chỗ lồi lõm, có vân, quả mọc tập trung ở trung tâm của tán lá, dài độ 0,8 - 1cm và rộng khoảng 0,5 - 0,6 cm, mỗi quả chứa một hạt, một số quả chứa 2 hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10 đến 30 quả

Mùa hoa: tháng 4 – tháng 6, mùa quả: tháng 7 – tháng 9

Hình 2: cây sâm Ngọc Linh ngoài tự nhiên

1.1.3 Đặc điểm sinh thái:

Sâm Ngọc Linh là loại cây thân thảo ưa ẩm và ưa bóng, sinh trưởng ở độ cao từ 1.200 – 2.100m so với mặt biển, mọc rải rác hay tập trung thành từng đám nhỏ dưới tán rừng Môi trường rừng nơi có Sâm mọc luôn ẩm ướt, thường xuyên có mây mù, nhiệt độ khoảng 15-18 0C, lượng mưa khoảng 3000 mm/ năm Đất rừng ở đây được tạo thành do

lá cây mục lâu ngày, có màu nâu đen, tơi xốp, hàm lượng mùn cao và chứa nhiều nước

Sâm Ngọc Linh sinh trưởng mạnh trong mùa xuân hè Mùa hoa quả từ tháng 5- tháng 10, cây ra hoa quả tương đối đều hàng năm Sau khi quả chín rụng xuống đất, tồn tại qua mùa đông khoảng 4 tháng và sẽ nảy mầm vào đầu mùa xuân năm sau, Sâm có khả năng tái sinh tự nhiên từ hạt khá tốt

Sâm có phần thân trên mặt đất lụi hàng năm, để lại các vết sẹo rõ Mỗi năm từ đầu mầm thân rễ (kể cả phần thân rễ phân nhánh) chỉ mọc lên một thân mang lá Căn cứ vào vết sẹo trên thân rễ để tính tuổi của Sâm

Trong số hơn mười loài và dưới loài đã biết của chi Nhân Sâm (Panax), ở Việt

Nam có ba loài mọc tự nhiên và một loài là cây nhập trồng Sâm Ngọc Linh được phát hiện sau cùng vào 1973 Đến 1985 nó mới được công bố là hoàn toàn mới đối với khoa học Đến nay Sâm Ngọc Linh chỉ mới được phát hiện duy nhất ở vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum

Ngọc Linh là dãy núi cao thứ hai của Việt Nam, có tọa độ địa lý từ 107o50’ –

108o7’ kinh tuyến Đông và từ 15o0’ – 15o10’ vĩ tuyến Bắc, đỉnh cao nhất là Ngọc Linh cao 2598 m Những điểm vốn trước đây có sâm Ngọc Linh mọc tự nhiên từ độ cao khoảng 1500 m đến 2200 m, chủ yếu tập trung ở 1800 – 2000 m, thuộc địa bàn của hai huyện Đăk Tô (tỉnh Kon Tum) và Trà My (tỉnh Quảng Nam) Về giới hạn cũng như phân

bố của loài sâm này ở núi Ngọc Linh hiện nay đã có nhiều thay đổi

1.1.4 Đặc tính dược liệu của Sâm Ngọc Linh:

1.1.4.1 Hợp chất saponin:

Tên gọi saponin hay saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật Hợp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu của cây Sâm Việt Nam

cũng như của các loài Sâm khác trên thế giới Các saponin dammaran được xem là hoạt

chất quyết định cho các tác dụng sinh học

Phần dưới mặt đất (thân rễ và rễ củ) chứa 49 hợp chất saponin, gồm 25 saponin đã biết và 24 saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vina-ginsenosid-R1-R24

Phần trên mặt đất có 19 saponin damaran đã được phân lập, gồm 11 saponin đã biết và 8 saponin có cấu trúc mới đặt tên là vinaginsenosid-L1-L8

Bảng 1: Hàm lượng một số saponin chính trong sâm ( Đã trừ độ ẩm)

Panax quinquefolius

Panax vietnamensis

( Ghi chú: 20(S)-ppd: 20(S)-protopanaxadiol; 20(S)-ppt: 20(S)-protopanaxatriol)

Bảng 3: Các saponin chính yếu trong thành phần saponin dẫn chất protopanaxatriol:

Có 7 hợp chất đã được phân lập, 5 hợp chất đã được xác định cấu trúc với panaxynol và heptadeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol là 2 polyacetylen chính yếu Hai hợp chất mới là 10 acetoxy-heptadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol và heptadeca-1,8(E),10(E)-trien-4-6-diyn-3,10-diol

1.1.4.3 Thành phần acid béo

Bảng 6: Các axid béo được tìm thấy:

Bảng 7: Thành phần acid amin chủ yếu:

STT Acid amin Acid amin (%) Acid amin thủy giải (%)

Vì cơ cấu hóa học đặc biệt của nhân sâm Ngọc Linh nên tác dụng chữa bệnh rất đa dạng

Bảng 9: Tác dụng dược lý của nhân sâm Ngọc Linh

1 Tăng thể lực, chống nhược sức Suy nhược cơ thể

2 Kích thích các hoạt động não bộ Suy nhược tinh thần

3 Tác dụng kiểu nội tiết tố sinh dục Suy nhược sinh dục

4 Tăng tạo hồng cầu, tiểu cầu Chữa thiếu máu, suy tiểu cầu

5 Đặc hiều với vi khuẩn Streptococi Chữa viêm họng hạt

6 Antistress giải lo âu và chống trầm cảm Các bệnh lý gây ra bởi stress

7 Tăng cường chức năng gan và bảo vệ tế bào gan Chống xơ gan và giải độc gan

8 Giảm cholesterol huyết, giảm lipit, tăng HDL Xơ vữa động mạch

STT Tác dụng dược lý Chủ trị

9 Giảm đường huyết hiệp lực với thuốc hạ đường huyết Bệnh tiểu đường

10 Điều hòa hoạt động tim mạch Loạn nhịp tim và hạ huyết áp

12 Phòng chống các loại ung thư Hỗ trợ thuốc chữa ung thư

13 Gia tăng sức đề kháng không đặc hiệu Suy giảm miễn dịch

Ngoài những tác dụng trên do các cơ sở khoa học tín nhiệm đã nghiên cứu và tổng kết, nhân sâm Ngọc Linh còn có những đặc tính ưu việt mà các loại nhân sâm khác không

có được đó là nó không có độc tính khi sử dụng liên tục dài ngày, có thể dùng chữa bệnh cho trẻ sơ sinh đến người già với liều dùng từ 50mg đến 200mg cho 1kg thể trọng, nghĩa

là người cân nặng 50kg có thể dùng 10gr một ngày Nếu dùng 20gr một ngày có tác gây ngủ Nếu dùng với liều 30gr đến 40gr thì có tác dụng như một thuốc giảm đau rất kỳ diệu Trong vòng hơn 30 năm theo dõi lâm sàng đối với những bệnh nhân K giai đoạn cuối, nếu dùng 30gr-40gr ngày không còn thấy đau đớn

Hình 3: Củ nhân sâm Ngọc Linh trên 50

năm tuổi

Hình 4: Củ nhân sâm Ngọc Linh lâu

năm

Những nghiên cứu về dược lý lâm sàng của nhân sâm Ngọc Linh được thực hiện tại những đơn vị dưới đây:

- Viện nghiên cứu sức khỏe người cao tuổi, Giáo sư Phạm Khuê và cộng sự

- Quân y viện 175 Thành phố Hồ Chí Minh, Giáo sư Đỗ Đình Luận và cộng sự

- Viện điều dưỡng TP Hồ Chí Minh

Chương trình theo dõi trên các bệnh nhân tình nguyện do bộ phận Dược lý Trung tâm Sâm Việt Nam thực hiện 1982 – 1986 đã kết luận:

- Bệnh nhân cảm thấy ăn ngon hơn, ngủ tốt hơn, tăng thể trọng, tăng thị lực, trí lực

và thể lực được cải thiện tốt

- Giảm mệt mỏi, chống nhược sức do lao động liên tục kéo dài

- Gia tăng sức đề kháng của cơ thể trong các bệnh nhiễm trùng, khi phối hợp với các loại kháng sinh thông dụng

- Cải thiện các chỉ số sinh hóa của cơ thể như: tăng dung tích sống, tăng chỉ số Tiffeneau, giảm cholesterol huyết Tăng tỷ số A/G, tăng số lượng hồng cầu hemogolobin

và hematocrit

- Cải thiện suy nhược thần kinh, suy nhược sinh dục

- Tăng huyết áp cho người suy nhược, huyết áp thấp

- Nâng cao thể trọng giúp hồi phục nhanh chóng sau phẫu thuật dạ dày

- Tác dụng giảm chữa và giảm đau khi viêm họng, giúp bệnh nhân dễ thở và ho có đờm trong các bệnh lý về phổi và phế quản Ngăn chặn các cơn hen tái phát

- Hiệp lực với thuốc điều trị tiểu đường

Đã 37 năm liên tục theo dõi nghiên cứu tổng kết và ứng dụng nhân sâm Ngọc Linh vào điều trị bệnh, chúng tôi thấy hiếm có vị thuốc nào trên thế giới có được tác dụng đa dạng trong phòng bệnh và chữa bệnh, hỗ trợ sức khỏe như nhân sâm Ngọc Linh, nhất là dùng trong các trường hợp bệnh nhân bị ung thư, bị các bệnh về máu, bị suy thận, viêm cầu thận mãn, bệnh co thắt phế quản, viêm họng và họng hạt…

1.1.5 Hiện trạng cây Sâm Ngọc Linh ở Việt Nam:

Cây có vùng phân bố rất hẹp và mọc rất rải rác Do là loài Sâm quí hiếm nên số lượng cá thể giảm sút nhanh chóng, hiện đang nằm trong 250 loài quí hiếm đang có nguy

cơ tuyệt chủng do bị khai thác quá mức và buôn bán bất hợp pháp, hiện Sâm Ngọc Linh

đã được đưa vào sách đỏ Việt Nam cần được bảo vệ

Để bảo vệ và phát triển cây dược liệu quí hiếm, hiện đã có những dự án để duy trì

và bảo tồn giống tại hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum:

- Năm 1979: Uỷ Ban Nhân Dân Tỉnh Quảng Nam đã cho thành lập Trại dược liệu Trà Linh Bằng cách nhân giống hữu tính và vô tính, Trại dược liệu đã có 223.000 cây con Trại đã xây dựng quy trình trồng cây Sâm Ngọc Linh và phổ biến cho nhân dân trong vùng thực hiện

- Năm 1995: Sở Khoa học, Công nghệ và Môi trường tỉnh Quảng Nam đã đầu tư nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật nhằm bảo vệ và phát triển cây Sâm Ngọc Linh.Nhằm hình thành vùng nguyên liệu Sâm Ngọc Linh và đưa cây Sâm trở thành loại cây trồng mang lại nguồn thu nhập ổn định cho người dân trong vùng dự án, Sở đã chủ trì thực hiện dự án “Ứng dụng kỹ thuật tiến bộ xây dựng mô hình phát triển vùng nguyên liệu sâm khu Năm tại xã Trà Linh”

- Năm 2003: Viện Dược liệu Hà Nội phối hợp với Sở Khoa Học Công Nghệ

và Môi Trường Kon Tum thực hiện dự án vùng trồng cây Sâm Ngọc Linh Cây Sâm đã được nhân giống trong năm 2003 và trồng tập trung ở xã Ngọc Lay, huyện Đắk Tô Năng suất hàng năm ước tính khoảng 50.000 cây Mục đích của dự án là quy hoạch vùng có điều kiện thích hợp cho cây sâm Ngọc Linh phát triển và tìm ra phương pháp canh tác thích hợp nhất nhằm bảo tồn loài cây đặc hữu của vùng và giúp xóa đói giảm nghèo ở Kon Tum

Sâm Ngọc Linh là một dược liệu quý và có giá trị kinh tế cao, cần thiết ứng dụng những kỹ thuật mới trong sản xuất để nâng cao giá trị thương mại, xây dựng thương hiệu sâm Ngọc Linh trên thị trường thế giới Trong đó bước đầu tiên là hiện đại hóa việc canh tác Trong nhiều biện pháp, nuôi cấy mô là một kỹ thuật tiên tiến có thể ứng dụng tốt cho sản xuất sản phẩm Sâm Ngọc Linh

Ngày nay, nhân sâm Ngọc Linh đang được bảo tồn và phát triển ở vùng núi Ngọc Linh Nhân dân cư trú trên núi Ngọc Linh đã quen với việc trồng bán tự nhiên, thu hái tự nhiên và kiêm việc bảo tồn nhân sâm Ngọc Linh tự nhiên Có gia đình đã có hàng chục nghìn cây nhân sâm trồng bán tự nhiên trên các độ cao trên 2000m so với mặt biển

hình 6: Cây nhân sâm Ngọc Linh hoang dại

Người ta đã nghiên cứu việc đưa cây nhân sâm Ngọc Linh về Đà Lạt, về Sapa nhưng sản phẩm cây mọc ở đây hầu như không còn đủ hoạt chất chữa bệnh Việc di thực nhân sâm Ngọc Linh đến các vùng núi lân cận có thấy cây mọc bình thường nhưng sau 2

năm theo dõi thì hầu hết không đủ hoạt chất so với mẫu đối chứng Vì vậy nơi cung cấp sâm hoang dại chủ yếu hiện nay vẫn là ở núi Ngọc Linh

Gần đây, do nhân sâm Ngọc Linh có uy tín cao trong việc hỗ trợ điều trị bệnh nên nhiều người đã tìm cách giả mạo Họ mang sâm giả mạo nhân sâm Ngọc Linh đến bán ở ngay vùng quê của Ngọc Linh nên khá nhiều người bị nhầm lẫn Nguồn gốc của nhân sâm giả này đã được báo chí đưa tin, nhưng hàng ngày thì việc giả mạo vẫn cứ diễn ra càng ngày càng tinh vi và phức tạp

1.2 Sơ lược kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng

Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống (Micropropagation) là một lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trông công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật

Bao gồm:

+ Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành

+ Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh

+ Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành

+ Nuôi cấy mô sẹo (callus)

+ Nuôi cấy tế bào đơn

+ Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trông tế bào thực vật sâu khi đã tách vỏ còn gọi là nuôi cấy tế bào trần Đây là phương pháp nhân giống hiện đại được thực hiện trong phòng thí nghiệm nên còn gọi là phương pháp nhân giống trong ống nghiệm (in

vitro) để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống nghiệm (in vivo)

Khác vối các phương pháp nhân giống truyền thống như giâm, chiết cành hoặc ghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả năng trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một số lượng cây lớn đều để phủ kín một diện tích đất nhất định mà các phương pháp nhân giống khác không thể thay thế được Ngoài ra phương pháp này không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên nên có thể tiến hành quanh năm Đây là hướng đang được ứng dụng rộng rãi Ở Việt Nam hiện nay có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, nhiều trung tâm sản xuất giống cây trồng hàng năm đã cung cấp một lượng đáng kể cây giống

có chất lượng cao cho sản xuất như chuối, dứa, khoai tây, các loại lan, cây cảnh, cây lâm nghiệp

1.2.1 Cơ sở khoa học:

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào (tissue culture) nói chung và kỹ thuật nhân giống vô tính nói riêng đều dựa vào cơ sở khoa học là tính toàn năng, sự phân hoá và phản phân hoá

Tính toàn năng của tế bào:

Haberland (1902) lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi một tế bào bất kỳ của mộtcơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào đã chuyên hoá đều chứa một lượng thông tin di truyền (bộ ADN) tương đương với lượng thông tin di truyền của một cơ thể trưởng thành Vì vậy, trong điều kiện nhất định một tế bào bất kỳ đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh Đặc tính đó của tế bào gọi là tính toàn năng của tế bào Qua đó người ta có thể biến một tế bào bất kỳ (hoặc một mẩu mô) thành một cơ thể hoàn chỉnh khi được nuôi cấy trong một môi trường thích hợp có đầy đủ các điều kiện cần thiết cho

tế bào thực hiện các quá trình phân hoá, phản phân hoá

- Tính phân hoá và phản phân hoá của tế bào

+ Tính phân hoá của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành các tế bào của các mô chuyên hoá đảm nhiệm các chực năng khác nhau Trong cơ thể thực vật có khoảng 15 loại mô khác nhau đảm nhiệm các chức năng khác nhau (mô dậu, mô dẫn, mô

bì, mô khuyết…) nhưng chúng đều có nguồn gốc từ tế bào môi sinh đã trải qua giai đoạn phân hoá tế bào để hình thành các mô riêng biệt

+ Tính phản phân hoá của tế bào: dó là các tế bào khi đã được phân hoá thành các

mô riêng biệt với các chức năng khác nhau nhưng trong điều kiện nhất định chúng vẫn có thể quay trở về trạng thái phôi sinh để phân chia tế bào Trong kỹ thuật nuôi cấy các cơ quan dinh dưỡng như lá, thân…thì giai đoạn tạo mô sẹo chính là khi tế bào quay trở về trạng thái phôi sinh có khả năng phân chia liên tục mà mất hẳn chức năng của các cơ

quan dinh dưỡng như lá, thân… trước đó

Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là quá trình hoạt hoá của gen, tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển các thể thì một số gen được hoạt hoá và một

số gen khác bị ức chế Điều này được xảy ra theo một chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc phân tử ADN Khi nằm trong một cơ thể hoàn chỉnh giữa các tế bào có sự ức chế lẫn nhau, nhưng khi được tách rời và trong những điều kiện nhất định thì các gen được hoạt hoá dễ dàng hơn nên chúng có khả năng mở tất cả các gen để hình thành một các thể mới Đó chính là cơ sở làm nền tảng cho kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

Lịch sử phát triển:

- 1665: Robert Hooke quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra khái niệm tế bào

- 1838: Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào

- 1904: Hannig nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài họ cải

- 1934: Kogl xác định vai trò của IAA

- 1951: Skoog nghiên cứu sử dụng các hoá chất điều hoà sinh trưởng và phát sinh

cơ quan

- 1952: Morel và Martin thực hiện vi ghép invitro thành công

- 1962: Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy tế bào thực vật

- 1964: Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà rốt

- 1969: Phân lập tế bào trần từ nuôi cấy tế bào dịch lỏng (huyền phù) của

Hapopappus gracilis

- 1973: Phát hiện Cytokinin có khả năng phá ngủ ở Gerberas

- 1978: Marton và cộng sự xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần

- 1983: Công ty Mitsui Petrochemicals lần đầu tiên đã sản xuất chất trao đổi thứ cấp trên quy mô công nghiệp bằng nuôi cấy tế bào dịch lỏng Lithospermum spp Mitsui 0Petrochemicals

- 1988: Klein và cộng sự tái sinh cây chuyển gen bằng phương pháp bắn gen

- 1994: Thương mại hóa giống cà chua chuyển gen FlavrSavr

1.2.2 Các kỹ thuật nuôi cấy

1.2.2.1 Nuôi cấy phôi

Phôi phát triển qua hai giai đoạn dị dưỡng và tự dưỡng Ở giai đoạn dị dưỡng cần

có các chất điều hòa sinh trưởng để phát triển

Trong nuôi cấy phôi, đường đóng vai trò rất quan trọng, đường sucrose cho nhiều kết quả tốt hơn Ngoài ra một số chất tự nhiên như nước dừa, dịch chiết malt, casein thủy phân là những chất rất cần trong nuôi cấy phôi Đối với các chất điều hòa sinh trưởng, auxin thường dùng ở nồng độ thấp, kinetin có vai trò đặc biệt cho sự phát triển của phôi

Nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi, thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ, ánh sáng thấp hơn phôi phát triển tự nhiên Nhiệt độ 25 ± 2oC thích hợp cho sinh trưởng và nảy mầm của phôi Các phôi thứ cấp rất khó sinh trưởng đã hoạt động khi chúng được tách rời và nuôi ở điều kiện chiếu sáng 4.000 lux hoặc hơn trong 4 giờ chiếu sáng suốt 4 ngày nuôi đầu tiên

 Kỹ thuật nuôi cấy phôi mang lại nhiều hiệu quả như:

- Nhân giống cây trồng

- Thử sức sống của phôi hạt

- Duy trì phôi yếu và cứu phôi lai xa

- Sản xuất hạt nhân tạo mà bản chất là tế bào phôi

1.2.2.2 Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời

Trong nuôi cấy mô và cơ quan tách rời, khâu chọn mẫu có tầm quan trọng đặc biệt, mẫu phải ở tình trạng sinh lý tốt và đang phát triển

Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây là khác nhau nhưng có một số yêu cầu chung như nguồn carbon, nguồn đường, nguyên tố đa lượng, vi lượng và các chất điều hòa sinh trưởng Muốn duy trì sinh trưởng và phát triển của cơ quan nuôi cấy cần thường xuyên cấy chuyền qua môi trường mới

Đối với nuôi cấy mô cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ dưới dạng acide amine, đường và inositol Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng hơn vì các mô tách rời không có khả năng tổng hợp các chất này

 Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời được ứng dụng trong:

- Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng đối với một bộ phận hoặc một mô của cây

- Nhân cây invitro

- Tạo mô sẹo phục vụ cho các nghiên cứu như chọn dòng tế bào, đột biến soma,…

1.2.2.3 Nuôi cấy mô phân sinh

Đặc điểm của mô phân sinh là chứa các tế bào non trẻ, phân chia mạnh, không bị virus xâm nhập, vì vậy mô phân sinh là mô duy nhất của cây sạch virus Mô phân sinh thường là các mô đỉnh chồi và cành Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ các mầm non, các chồi mới hình thành hoặc các cành non

Trong nuôi cấy sự cân bằng giữa các chất điều hòa sinh trưởng rất quan trọng Muốn tạo chồi cần bổ sung cytokinin hoặc tổ hợp cytokinin với auxin, muốn tạo rễ thì bổ sung auxin

 Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng trong:

- Tạo cây sạch virus

- Nhân giống invitro

- Tạo cây đa bội qua xử lý colchicin

- Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan

1.2.2.4 Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn

Ưu điểm của nuôi cấy bao phấn là đơn giản về thao tác kỹ thuật và môi trường nuôi cấy, nhưng có thể tạo ra cả cây lưỡng bội từ soma của thành bao phấn, do vậy sẽ khó phân biệt với cây tự lưỡng bội từ cây đơn bội

Hạt phấn nuôi cấy có thể phát triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều kiện

nuôi cấy invitro bằng con đường tạo phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tạo mô sẹo và

tạo cơ quan Phương pháp tạo cây đơn bội kép và phương pháp chọn lọc tạo giống có hiệu quả chọn lọc rất cao, đặc biệt nếu được kết hợp với các phương pháp tạo ra các biến

dị di truyền khác nhau như lai hữu tính hoặc gây đột biến nhân tạo

Thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi tùy thuộc vào kiểu gen và tuổi của bao phấn cũng như các điều kiện mà ở đó cây cho bao phấn sinh trưởng Quá trình sinh trưởng về sau của phôi hạt phấn đòi hỏi bổ sung các muối khoáng vào môi trường Tần số

phát sinh cây đơn bội và sinh trưởng của cây nói chung sẽ tốt hơn nếu chúng được nuôi trong điều kiện chiếu sáng, mặc dù cây hạt phấn của một số kiểu gen sinh trưởng trong cả hai điều kiện có chiếu sáng và trong tối

 Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn được dùng cho tạo các dòng thuần để:

- Nghiên cứu gen lặn vì chúng không biểu hiện ở cơ thể dị hợp tử

- Chọn các dòng đột biến

1.2.2.5 Nuôi cấy tế bào đơn

Tế bào đơn có thể nhận được bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý enzyme Sau

đó chúng được nuôi cấy dịch lỏng, có khuấy hoặc lắc tạo điều kiện thuận lợi cho sự trao đổi khí và tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trong môi trường đặc biệt và tăng sinh khối

Mỗi loại cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy khác nhau Yêu cầu dinh dưỡng cho nuôi cấy tế bào đơn khá phức tạp, do chúng bị mất nhiều chất cần thiết cho sinh trưởng khi tách rời khỏi quần thể tế bào

 Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng cho các mục đích:

- Chọn dòng tế bào

- Nghiên cứu cấu trúc tế bào, phát triển và phân hóa tế bào trong những điều kiện khác nhau

- Thu nhận các chất trao đổi thứ cấp

1.2.2.6 Nuôi cấy protoplast

Tế bào trần là tế bào đã được tách bỏ thành tế bào bằng phương pháp cơ học hay

sử dụng enzyme Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast có thể tái sinh thành tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh Ưu thế của kỹ thuật tách và nuôi cấy tế

bào trần là tế bào không có màng cứng, ở trạng thái đơn bào, mật độ tế bào thu được trên

1 đơn vị thể tích môi trường có thể rất cao (đạt 106 tế bào/1ml môi trường)

 Ứng dụng nuôi cấy protopast:

- Tạo ra cây lai soma

- Chuyển các bào quan và chuyển gen Quá trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài

- Quá trình sinh tổng hợp màng tế bào

1.2.3 Môi trường nuôi cấy

 Thành phần môi trường nuôi cấy gồm năm thành phần cơ bản sau:

- Muối khoáng đa lượng

- Muối khoáng vi lượng

- Vitamin

- Nguồn carbon

- Chất điều hòa sinh trưởng

- Ngoài ra có thể bổ sung các thành phần không xác định (nước dừa, dịch chiết nấm men,…) và agar

 Môi trường nuôi cấy có thể chia thành ba loại:

- Môi trường nghèo dinh dưỡng: White, Knop

- Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: Gamborg

- Môi trường giàu dinh dưỡng: MS

Cơ sở cho việc xây dựng các môi trường nuôi cấy là xem xét các thành phần cần cho sự sinh trưởng và phát triển của cây

Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm thì thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy

Tế bào mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong nuôi cấy

Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào Vì vậy cần điều chỉnh độ pH môi trường thích hợp trước khi nuôi cấy Thường sử dụng NaOH hay HCl loãng để điều chỉnh độ pH

1.2.4 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

1.2.4.1 Auxin

Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô thực vật IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực vật, còn NAA, IBA, 2,4-D là các auxin nhân tạo, thường các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn

Chúng có mặt ở các bộ phận của cây như mô phân sinh đỉnh, các bộ phận non khác của cây

 Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào:

- Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu

- Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy

- Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy

- Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh

- Đặc tính của auxin

 Vai trò của các chất thuộc nhóm auxin: