tóm tắt luận án tiến sĩ Nghiên cứu tạo que thử để phát hiện nhanh các độc tố ruột của tụ cầu khuẩn trong thực phẩm

Các phương pháp phân tích độc tố ruột tụ cầu Staphylococcus Enterotoxin – SE trong thực phẩm hiện nay còn nhiều bất cập do tính phức tạp trong sử dụng, giá thành cũng như yêu cầu về tran

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Trần Thị Sao Mai

NGHIÊN CỨU TẠO QUE THỬ ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH

CÁC ĐỘC TỐ RUỘT CỦA TỤ CẦU KHUẨN

Công trình được hoàn thành tại:

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS NGUYỄN THỊ KHÁNH TRÂM

2 TS LÊ QUANG HÒA

Phản biện : Phản biện : Phản biện :

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm Luận án Tiến sĩ họp tại vào hồi giờ ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm thông tin Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

1

MỞ ĐẦU

Tính cấp thiết của đề tài

Ngộ độc thực phẩm đã có từ lâu và hiện vẫn xảy ra ở nhiều nơi trên thế giới cũng như ở Việt Nam làm ảnh hưởng lớn đến sức khỏe con người và kinh tế xã hội Theo cơ quan Quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA), hiện tại mỗi năm trên thế giới vẫn có khoảng 76 triệu ca ngộ độc thực phẩm (NĐTP) với 325 nghìn người phải nhập viện và khoảng 5 nghìn người chết vì NĐTP Nguyên nhân gây ra NĐTP có thể từ hóa chất, vi sinh vật, độc tố tự nhiên hoặc không rõ nguyên nhân nhưng ghi nhận từ thực tế các vụ NĐTP đã xảy ra cho thấy nguyên nhân chính là do thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật Trong số các tác nhân từ vi sinh vật gây NĐTP thì

Staphylococcus aureus (S.areus) là một trong những vi khuẩn gây ngộ độc phổ biến nhất S aureus là vi khuẩn hình cầu, Gram dương, phân bố rải rác

trong tự nhiên nhưng chủ yếu được phân lập từ da, tóc, màng nhày, mũi của người và gia súc Ngộ độc thực phẩm do tụ cầu được định nghĩa là sự tiêu thụ các độc tố đường ruột, vốn đã tồn tại sẵn trong thực phẩm, do các chủng

tụ cầu có coagulase dương tính, đặc biệt là S aureus tổng hợp nên

Các phương pháp phân tích độc tố ruột tụ cầu (Staphylococcus Enterotoxin – SE) trong thực phẩm hiện nay còn nhiều bất cập do tính phức tạp trong sử dụng, giá thành cũng như yêu cầu về trang thiết bị Phương pháp tiêu chuẩn để phát hiện SE trong thực phẩm hiện nay là phương pháp ELISA Trên thị trường thế giới hiện nay có nhiều bộ sinh phẩm để phát hiện các SE trong thực phẩm như TRANSIA, RIDASCREEN, TECRA và VIDAS Nguyên tắc của các bộ sinh phẩm này đều dựa trên kỹ thuật ELISA kẹp đôi Toàn bộ quy trình phân tích này thường kéo dài từ 90 phút đến 4 giờ Ngưỡng phát hiện của các bộ sinh phẩm này thường dao động từ 0,1-5 ng/g hoặc ml mẫu tùy thuộc vào loại thực phẩm phân tích Tuy nhiên, một trong những nhược điểm cơ bản của các bộ sinh phẩm này là cần một máy đọc ELISA chuyên dụng để phân tích kết quả Yêu cầu này hạn chế đáng kể khả năng phân tích hiện trường của các bộ sinh phẩm Mặt khác, giá thành của các bộ sinh phẩm nhập ngoại rất đắt, quy trình phân tích khá phức tạp

Xu hướng trên thế giới hiện nay là phát triển các phương pháp phân tích

2

nhanh, dễ sử dụng để phân tích sàng lọc một số lượng lớn mẫu ngay tại hiện trường Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới đã thành công trong việc phát triển que thử phát hiện SE dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch nhằm đơn giản hóa và rút gọn thời gian phân tích xuống còn 30 phút Hơn nữa, tại Việt Nam việc kiểm định an toàn thực phẩm phần lớn mới chỉ dừng lại ở việc phát hiện vi khuẩn tụ cầu mà chưa phân tích tới SE, nguyên nhân chính gây

NĐTP do tụ cầu Từ thực tế trên, tôi thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu

tạo que thử để phát hiện nhanh các độc tố ruột của tụ cầu khuẩn trong thực phẩm”

Mục tiêu của đề tài

Mục tiêu của đề tài luận án là phát triển một bộ sinh phẩm dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch để phát hiện nhanh các SE từ SEA đến SEE trong thực phẩm

Nội dung nghiên cứu của đề tài

- Sản xuất và tinh sạch SE tái tổ hợp SEA, SEC1 và ứng dụng để phát triển que thử;

- Sản xuất và tinh sạch kháng thể lòng đỏ trứng: IgY kháng BSA và IgY kháng các SE (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE), ứng dụng để tạo que thử ;

- Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình cố định kháng thể lên que thử;

- Nghiên cứu xác định độ nhạy của que thử

Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài

Đến nay, ở nước ta việc đánh giá rủi ro vi sinh vật đối với S aureus

chỉ dựa vào việc xác định và định lượng tụ cầu có phản ứng coagulase dương tính được phân lập trong các sản phẩm thực phẩm, phương pháp này cần nuôi cấy vi khuẩn trong phòng thí nghiệm và thời gian để trả lời kết quả khoảng 1 tuần Tuy vậy, kết quả phân tích chỉ cho thấy trong mẫu thực phẩm

có vi khuẩn tụ cầu vàng hay không mà không tìm ra có độc tố do vi khuẩn tiết ra, là nguyên nhân thực sự gây NĐTP do tụ cầu Kết quả nghiên cứu của

đề tài luận án đã giải quyết hạn chế này Việc tạo ra que thử đã phát hiện được các SE với thời gian phân tích ngắn, đơn giản, dễ sử dụng, thích hợp với các phân tích hiện trường không cần các thiết bị phức tạp, đắt tiền Các nguyên liệu chính để sản suất que thử (các kháng nguyên và kháng thể) đều

3

được chúng tôi chủ động tạo ra Kết quả của đề tài luận án góp phần vào việc kiểm soát tốt hơn các độc tố ruột tụ cầu, qua đó giảm thiểu các vụ NĐTP và

số người bị NĐTP do tụ cầu vàng gây ra, nâng cao sức khỏe cộng đồng

Điểm mới của luận án

Kết quả nghiên cứu nổi bật của đề tài luận án là đã tạo ra que thử phát hiện được các SE từ SEA đến SEE qua việc sản xuất được kháng nguyên tái

tổ hợp SEA, SEC1 và việc sản xuất, tinh sạch được kháng thể lòng đỏ trứng

gà (IgY) kháng BSA, kháng thể IgY kháng các được tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED, SEE)

Cấu trúc của luận án

Ngoài phần mở đầu và kết luận, kiến nghị, luận án gồm 3 chương:

- Chương 1: Tổng quan tài liệu nghiên cứu

- Chương 2: Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu

- Chương 3: Kết quả nghiên cứu và bàn luận

- Phần phụ lục: Một số kết quả và hình ảnh nghiên cứu

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỤ CẦU KHUẨN

1.1.1 Đặc điểm sinh học của tụ cầu khuẩn

Tụ cầu khuẩn còn gọi là tụ cầu vàng - Staphylococcus aureus là những

cầu khuẩn có đường kính từ 0,8-1,0 μm và xếp lại với nhau thành hình chùm nho, bắt màu Gram dương, coagulase và catalase dương tính, không có lông,

không có vỏ, không sinh nha bào [1]

1.1.2 Những yếu tố ảnh hưởng tới sản sinh độc tố ruột của tụ cầu vàng

Ở các điều kiện thông thường, tụ cầu vàng phát triển đạt số lượng khoảng

106 cfu/g là đã có thể tạo ra độc tố Tụ cầu cần có những axit amin khác nhau cho quá trình sinh trưởng và sản sinh độc tố [82] Nhiệt độ tối thiểu cho sản sinh độc tố ruột tụ cầu là 100

C và nhiệt độ tối đa là 480C, khoảng tối ưu là từ

4

1.2 ĐỘC TỐ RUỘT CỦA TỤ CẦU VÀNG

1.2.1 Đặc điểm sinh hóa, lý hóa và di truyền của độc tố ruột của tụ cầu

Cho đến nay, người ta đã thống kê được ít nhất có 21 loại SE, có bản chất là những chuỗi protein đơn có khối lượng phân tử thấp (khoảng từ 22 đến 29 kDa), mỗi chuỗi có những vị trí kháng nguyên chuyên biệt Các độc

tố này dễ tan trong nước và trong các dung dịch muối Đặc biệt, các SE được

mô tả hầu hết là có tính ổn định cao, chúng có tính chịu nhiệt và không bị protease thông thường như pepsin, trypsin, chymotrypsin, papain, … thủy phân vì thế chúng giữ nguyên được cấu trúc trong đường tiêu hóa của người [82]

1.2.2 Hoạt tính sinh học của các độc tố ruột tụ cầu

Hoạt tính sinh học của SE bao gồm hoạt tính siêu kháng nguyên (superantigen) và hoạt tính gây nôn Hoạt tính siêu kháng nguyên: gây sốt, kích hoạt hệ miễn dịch và tăng nhanh số lượng tế bào T không chuyên biệt 1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU

1.3.1 Phép thử sinh học

Nguyên tắc của các phép thử sinh học dựa trên việc phân tích khả năng gây các triệu chứng điển hình như nôn, tiêu chảy trên các động vật thí nghiệm hoặc hoạt động siêu kháng nguyên trong nuôi cấy tế bào Liều lượng

SE tối thiểu cần sử dụng là khoảng 200 ng [80]

1.3.2 Phương pháp sinh học phân tử

Các phản ứng PCR thường dùng là uniplex và multiplex PCR và gần đây là real-time PCR [24, 40, 85]

1.3.3 Phương pháp miễn dịch

Phương pháp thường được sử dụng nhất hiện nay để phát hiện SE trong thực phẩm là các phương pháp miễn dịch Những phương pháp này bao gồm: phương pháp khuếch tán trên gel, phương pháp ngưng kết hạt latex – RPLA sử dụng các bộ kit RPLA và phương pháp ELISA [40]

1.4 KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH VÀ ỨNG DỤNG

5

1.4.1 Cấu trúc và phân loại của hệ thống sắc ký miễn dịch

Cấu trúc của hệ thống sắc ký miễn dịch (HTSKMD) thường gồm các hợp phần được biểu diễn trong Hình 1.1 dưới đây [69]:

Hình 1.1 Các hợp phần trong hệ thống sắc ký miễn dịch

Kỹ thuật sắc ký miễn dịch thường được chia làm hai loại chính là sắc

ký miễn dịch kẹp đôi và sắc ký miễn dịch cạnh tranh

- Sắc ký miễn dịch kẹp đôi: tại vị trí vạch thử nghiệm một kháng thể thứ hai (khác với kháng thể cộng hợp có màu) có khả năng bắt cặp với kháng nguyên cần phân tích được cố định Nếu các độc tố có mặt trong mẫu phân tích, chúng sẽ tương tác với kháng thể cộng hợp tạo thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể cộng hợp có màu Dưới tác dụng của lực mao quản, dung dịch sẽ chuyển động lên trên que thử đi về phía vùng chứa các kháng thể và kháng nguyên cố định Phức hợp kháng nguyên-kháng thể cộng hợp khi chuyển động đến vị trí vạch thử nghiệm sẽ bị giữ lại nhờ liên kết của kháng thể vạch thử nghiệm với kháng nguyên Sự xuất hiện của vạch thử nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu thử chứa độc tố ruột tụ cầu Như vậy, trong trường hợp dương tính (có độc tố trong mẫu phân tích) sẽ xuất hiện hai vạch màu Ngược lại trường hợp âm tính chỉ có một vạch màu Ưu điểm của sắc ký miễn dịch kẹp đôi là độ nhạy và độ đặc hiệu cao do sử dụng tới hai kháng thể có khả năng bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên ở những vị trí khác nhau

mà không gây cản trở về mặt không gian Nhược điểm của nó là khó có khả năng phát hiện được cả 5 loại độc tố tụ cầu phổ biến hiện nay: SEA, SEB,

đã bị bão hòa bởi kháng nguyên trong mẫu phân tích Do đó, sự không xuất hiện của vạch thử nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu thử chứa độc tố đường ruột tụ cầu Như vậy, trong trường hợp dương tính, có độc tố trong mẫu phân tích, thì sẽ xuất hiện một vạch màu ở vị trí vạch kiểm chứng Ngược lại, mẫu

âm tính sẽ có hai vạch màu ở cả vị trí vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng

+ Dạng 2: Tại vị trí vạch thử nghiệm một kháng thể có khả năng bắt cặp với kháng nguyên cần phân tích được cố định Trong trường hợp này, cộng hợp sẽ là kháng nguyên gắn với hạt nano vàng hoặc nano carbon Nếu độc tố không có mặt trong mẫu phân tích thì khi dung dịch chuyển động lên trên que thử đi về phía vùng chứa các kháng thể cố định, kháng nguyên cộng hợp sẽ tương tác với kháng thể tạo thành phức hợp kháng thể - kháng nguyên cộng hợp có màu ở vị trí vạch thử nghiệm Sự xuất hiện vạch thử nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu thử không chứa độc tố ruột của tụ cầu Ngược lại, nếu trong mẫu phân tích có độc tố ruột tụ cầu thì chúng cạnh tranh với kháng nguyên cộng hợp về việc bị giữ lại ở vị trí vạch thử nghiệm Chính vì vậy, sự không xuất hiện vạch màu đồng nghĩa với việc mẫu thử có chứa độc tố ruột tụ cầu

Trong luận án này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp sắc ký miễn dịch cạnh tranh dạng 2 để ứng dụng sản xuất que thử phát hiện 5 loại độc tố (SEA-SEE) trong thực phẩm Các ưu điểm của phương pháp sắc ký miễn

7

dịch cạnh tranh để phát hiện 5 loại độc tố SEA, SEB, SEC1, SED, SEE bao gồm: đơn giản hóa quy trình phát triển que thử do chỉ cần sử dụng một kháng thể

1.4.2 Một số nghiên cứu chế tạo que thử để phát hiện độc tố ruột tụ cầu trong thực phẩm

Năm 2009, trong nghiên cứu của Boyle và các cộng sự tạo que thử phát hiện SEB trong sữa với ngưỡng phát hiện nằm trong khoảng từ 500 ng/ml đến 5 µg/ml [19] Khi sử dụng máy đo từ để phát hiện tín hiệu, que thử có thể phát hiện được nồng độ độc tố SEB trong các sản phẩm sữa thấp

từ 5 đến 0,25 ng/ml Năm 2013, Keiko Yamada tạo que thử phát hiện SEA với độ nhạy cao, phát hiện được nồng độ thấp đến 0,2 ng/ml [83]

1.5 CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG (IgY) VÀ ỨNG DỤNG CỦA IgY

Kháng thể lòng đỏ trứng IgY được sản xuất bằng phương pháp gây miễn dịch cho gà mái để thu kháng thể đặc hiệu từ trứng gà

Hiện nay, một số phương pháp tách chiết và tinh chế IgY gà đã được

mô tả và có thể được chia thành hai nhóm chính: Phương pháp kết tủa: liên quan đến amoni, natri sulfat, natriclorua [65, 71], polyetylenglycol (PEG), axit caprylic và caragenean [71]; Phương pháp sắc ký: sắc ký ái lực, sắc ký trao đổi ion, sắc ký tương tác kỵ nước, sắc ký tương tác thiophylic, và sắc ký gel lọc [71]

1.6 SẢN XUẤT VÀ TINH CHẾ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU

1.6.1 Sản xuất độc tố ruột tụ cầu từ S aureus và từ phương pháp tái tổ

hợp

Việc sản xuất độc tố tái tổ hợp biểu hiện trên E Coli các độc tố ruột tụ

cầu ở dạng dung hợp với đuôi His hoặc đuôi GST nên có thể giúp đơn giản hóa quy trình tinh sạch Năm 2012, nhóm nghiên cứu của chúng tôi cũng đã sản xuất thành công độc tố SEA tái tổ hợp với đuôi GST Vector được sử

dụng là pGEX-6P-1 và chủng E Coli BL21 để biểu hiện protein Sau khi

8

tinh sạch bằng bộ kit GST SpinTrap, protein tương ứng có kích thước 53 kDa ở dạng dung hợp với GST đã được kiểm tra bằng phương pháp điện di SDS-PAGE [3]

1.6.2 Phương pháp tinh sạch độc tố ruột tụ cầu

Đã có nhiều phương pháp được sử dụng trong việc tinh sạch SE nuôi trực tiếp từ tụ cầu vàng: tinh sạch bằng trao đổi ion, lọc gel, sắc ký, điện phân, sắc ký Dye ligand, HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao) và FPLC (sắc

ký lỏng nhanh protein) Phương pháp sắc ký ái lực có thể cho phép thu protein đích bằng một bước duy nhất, với độ tinh sạch lên tới hơn 90% Đuôi His có ái lực cao với Ni2+ do có vòng thơm imidazole, vì thế protein dung hợp với đuôi His được giữ lại trên cột sắc ký chứa các hạt resin có gắn Ni2+,

còn những protein không mong muốn sẽ ra khỏi cột này

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Các SE (SEA, SEB, SEC, SED và SEE) của Toxin Technology, Mỹ

- Gà Leghorn trắng, 1 ngày tuổi, cân nặng 35-40g, có nguồn gốc từ Công ty cổ phần giống gia cầm Ba Vì

- Kháng thể lòng đỏ trứng IgY thu được từ trứng gà Leghorn trắng tự nuôi và được gây miễn dịch bằng các độc tố ruột tụ cầu và BSA

2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.2.1 Vi sinh vật và plasmid

- Tế bào S.aureus mang gen sec1 được cung cấp bởi phòng Vi sinh,

Viện Dinh dưỡng Quốc gia

- Tế bào vi khuẩn E coli khả biến BL21 mua của Biolab

- Plasmid pGEX-6P-1-sea, mang gen mã hóa SEA ở dạng dung hợp với đuôi GST (glutathione-S-transferase) được cung cấp bởi phòng công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội

9

- Plasmid pGS-21a (Genescript), dùng làm vector biểu hiện cho nhân dòng và biểu hiện gen sec1

2.2.2 Hóa chất và sinh phẩm

Các môi trường, sinh phẩm, các hóa chất, dung môi, các dụng cụ, vật

tư tiêu hao chuyên biệt của phòng thí nghiệm vi sinh và sinh học phân tử như các môi trường nuôi cấy, các kháng thể đơn dòng, các hóa chất nhập khẩu từ nước ngoài, màng lọc, các dãy giếng ELISA,…

2.2.3 Máy, thiết bị:

Các máy và thiết bị chuyên dụng như máy ly tâm, tủ ổn nhiệt, bộ điện di,… có ngồn gốc từ Mỹ, Đức và Trung Quốc

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn S.aureus

Sử dụng các chất tẩy rửa (SDS, CTAB) và chloroform làm biến tính

thành tế bào, protein dạng Histon và polysaccharide của S aureus Sau đó bổ

sung lysozyme, protease K phá vỡ thành tế bào và liên kết peptid Bổ sung EDTA ức chế hoạt động của Dnase và nồng độ muối CH3COONa cao hỗ trợ cho việc kết tủa DNA Sau khi ly tâm, hút lớp dung môi phân cực phía trên chứa DNA và thêm ethanol 1000, 1 giờ, nhiệt độ phòng DNA kết tủa thu được sau khi ly tâm tiếp tục được rửa trong ethanol 700

trước khi hòa tan trong đệm TE (Tris-EDTA)

2.3.2 Kỹ thuật PCR

Gen sec1 được khuếch đại bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc

hiệu (SEC-F và SEC-R) có gắn vị trí cắt của 2 enzyme giới hạn BamHI và HindIII Trong đó, các thành phần của phản ứng PCR đã được chuẩn hóa với

tổng thể tích là 50 µl và chu trình nhiệt như sau: biến tính ở 950

C, 4 phút và quá trình nhân bản với 35 chu kỳ, kéo dài thêm ở 720C, 5 phút và bảo quản

ở 100

C Mỗi chu kỳ gồm ba bước: biến tính ở 950C, 30 giây, gắn mồi ở 550C,

30 giây và kéo dài chuỗi ở 720C, 1 phút Sản phẩm PCR sau khi tổng hợp được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose

2.3.3 Thu nhận DNA từ gel agarose

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit tinh sạch GeneJET Gel Extraction Kit (Fermentas) theo phương pháp của nhà sản xuất

10

2.3.4 Phương pháp cắt DNA bằng enzyme giới hạn và nối với vector tạo dòng

Gen sec1 (sản phẩm PCR sau khi tinh sạch) được cắt bằng enzyme

giới hạn là BamHI và HindIII và kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel

2.3.6 Phương pháp nuôi cấy tế bào E coli và chuẩn bị dịch protein thô

Các dòng tế bào chuyển gen được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng

có bổ sung thêm 100 mg/L ampicillin Canh trường được nuôi ở 370C trong điều kiện lắc 150 vòng/phút cho đến khi OD600nm đạt khoảng 0,8 thì bổ sung chất cảm ứng IPTG và tiếp tục nuôi cấy ở các điều kiện thí nghiệm về nhiệt

độ (160

C, 300, 370), thời gian (từ 2h, 5h, 7h, 8h) và chất cảm ứng từ 0,05 đến 1mM IPTG

2.3.7 Phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực GST

Trong nghiên cứu này, bộ kit GST SpinTrap (GE Healthcare) đã được

sử dụng để tinh sạch SEA ở dạng dung hợp với GST

2.3.8 Phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực His

Tiến hành tinh sạch protein theo kit His Mag SepharoseTM Ni để thu được protein tinh sạch cho độ tinh khiết cao theo hướng dẫn của nhà sản xuất

2.3.9 Phương pháp điện di biến tính protein (SDS-PAGE)

Điện di biến tính protein bằng SDS-PAGE (12,5%) được tiến hành theo các phương pháp của Laemmli

2.3.10 Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)

Để đánh giá lượng SEA trong dịch chiết protein thô, phương pháp ELISA kẹp đôi đã được sử dụng

2.3.11 Phương pháp định lượng protein bằng OD

11

Nguyên tắc của phương pháp này là các protein hấp thụ tia cực tím cực đại ở bước sóng 280nm

2.3.12 Phương pháp gây miễn dịch cho gà

Gây miễn dịch cho gà để sản xuất kháng thể IgY kháng BSA và kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED, SEE) theo quy trình sản xuất kháng thể IgY đặc hiệu của Agro-Bio 2011

2.3.13 Phương pháp tinh sạch kháng thể IgY gây kết tủa phân đoạn

bằng PEG

Tinh sạch kháng thể bằng phương pháp gây kết tủa phân đoạn bằng PEG 6000 theo mô tả của Polson 1980

2.3.14 Phương pháp tinh sạch IgY bằng pha loãng trong nước, chỉnh

pH và gây kết tủa bằng Natri clorua

Tinh sạch theo phương pháp pha loãng trong nước chỉnh pH và gây

kết tủa bằng Natri clorua được Petr Hokder tối ưu hóa năm 2013

2.3.15 Phương pháp tinh sạch IgY bằng cột “ Hi Trap IgY Purification HP”

Tinh sạch IgY theo hướng dẫn của nhà sản xuất GE Healthcare Bio- Sciences AB

2.3.16 Cố định IgY kháng BSA và IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E) lên màng nitrocelullose

Màng nitrocelullose AE99 (Whatman) được cố định lên các lá vinyl Mylar AD back 79373 (Whatman) Kháng thể IgY kháng BSA và kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E) được phun lên trên màng nitrocellulose lần lượt ở vạch kiểm chứng và vạch thử nghiệm bằng thiết bị Linomat V (CAMAG, Thụy Sĩ) Sau khi gắn thêm giấy thấm, màng được cắt thành từng que thử có bề rộng là 4 mm bằng máy cắt Cutter 4000 (Biodot, Anh)

2.3.17 Chuẩn bị phức hợp phát hiện kháng nguyên - nanocarbon

Kháng nguyên tinh sạch SEC1 ở dạng dung hợp được gắn với hạt nanocarbon ở trạng thái huyền phù theo phương pháp được mô tả bởi nhà sản xuất Maiia Diagnostics