tóm tắt luận án PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT

Các gen mã hóa nhân tố phiên mã mặc dù không tham gia trực tiếp vào quá trình đáp ứng với điều kiện hạn nhưng sự biểu hiện của chúng lại có vai trò điều hòa biểu hiện của rất nhiều gen c

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Duy Phương

PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH

Công trình được hoàn thành tại:

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Hạn là yếu tố môi trường gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất nông nghiệp, làm giảm năng suất, sản lượng cây trồng và dẫn tới tình trạng mất an ninh lương thực Đặc biệt, trong bối cảnh biến đổi khí hậu toàn cầu, tình trạng hạn hán xảy ra ngày càng thường xuyên hơn, với mức độ ngày càng trầm trọng, nhiều lúc vượt quá tầm kiểm soát của con người Chính vì vậy, việc nghiên cứu các gen liên quan tới tính kháng hạn để tiến tới tạo giống cây trồng biến đổi gen có khả năng chịu hạn có ý nghĩa đặc biệt quan trọng đối với việc duy trì và tăng sản lượng nông nghiệp, góp phần giữ ổn định an ninh lương thực quốc gia

Tính trạng chịu hạn là tính trạng đa gen và sự biểu hiện của các gen liên quan chặt chẽ với quá trình phiên mã Các nhà khoa học đã chứng minh được chức năng quan trọng của nhóm gen điều khiển trong việc tăng cường tính chịu hạn ở thực vật Do đó, việc nghiên

mã liên quan đến chịu hạn đang trở thành xu hướng triển vọng và nhận được sự quan tâm đặc biệt Hàng loạt gen mã hóa nhân tố phiên

mã liên quan đến chịu hạn đã được xác định và chuyển vào các giống cây trồng khác nhau Các gen mã hóa nhân tố phiên mã mặc dù không tham gia trực tiếp vào quá trình đáp ứng với điều kiện hạn nhưng sự biểu hiện của chúng lại có vai trò điều hòa biểu hiện của rất nhiều gen chức năng khác, dẫn tới làm tăng cường khả năng chịu hạn của thực vật Nhiều cây trồng chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã

đã được chứng minh tăng cường khả năng chịu hạn so với cây không chuyển gen

2

Ở Việt Nam, cho đến nay chúng ta vẫn chưa có một nghiên cứu

cơ bản hoàn chỉnh nào về phân lập và nghiên cứu chức năng gen liên quan đến đáp ứng chống chịu hạn ở thực vật, đặc biệt là nhóm gen

mã hóa nhân tố phiên mã

Xuất phát từ trên, chúng tôi tiến hành đề tài luận án

tiến sĩ “Phân lập và nghiên cứu gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn của thực vật” với mục tiêu xác định một

gen mã hóa nhân tố phiên mã mới có liên quan tới tăng cường tính chống chịu hạn ở thực vật

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Phân lập và xác định trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã điều khiển tính chịu hạn từ lúa

- Nghiên cứu một số đặc tính của gen mã hóa nhân tố phiên mã phân lập được trên cây lúa chuyển gen mô hình

3 Đối tượng và nội dung nghiên cứu của đề tài

Đối tượng nghiên cứu của đề tài:

Gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng chống chịu

stress hạn của lúa Oryza sativa L

Nội dung nghiên cứu của đề tài:

- Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến chống chịu điều kiện bất lợi ở lúa

- Nghiên cứu đặc điểm chức năng của protein OsNLI-IF

- Thiết kế các hệ vector biểu hiện gen OsNLI-IF trong tế bào thực

vật

- Nghiên cứu biểu hiện OsNLI-IF trong cây chuyển gen mô hình

4 Địa điểm thực hiện đề tài

Các nghiên cứu của luận án được thực hiện tại Bộ môn Bênh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp (Viện Khoa học Nông nghiệp

Việt Nam), e

và Phòng Thí nghiệm Sinh học Phân tử Thực vật thuộc Trung tâm Kỹ thuật Di truyền và Công nghệ Sinh học Quốc tế (New Delhi, Ấn Độ)

5 Đóng góp mới của đề tài

Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam thực hiện một cách có

hệ thống về nghiên cứu cơ bản theo định hướng ứng dụng gen

OsNLI-IF chưa được xác định chức năng Gen OsNLI-IF được chứng

minh mã hóa một nhân tố phiên mã hoạt động cảm ứng với điều kiện ngoại cảnh bất lợi như hạn, mặn, lạnh, nhiệt độ cao và có khả năng tăng cường tính chịu hạn trong các cây chuyển gen mô hình (thuốc

lá/ lúa) Ngoài ra, các vector biểu hiện gen OsNLI-IF được điểu khiển bởi các promoter hoạt động liên tục (35S và Ubiquitin) và hoạt động trong điều kiện stress (Lip9) đã được chuyển vào cây mô hình để

nghiên cứu biểu hiện gen Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu của luận án là hoàn toàn mới, có giá trị khoa học và ý nghĩa thực tiễn

trong công tác chọn tạo giống cây trồng chuyển gen

6 Ứng dụng thực tiễn của đề tài

Kết quả nghiên cứu của luận án lần đầu tiên đã chứng minh vai

trò tăng cường tính chịu hạn của gen OsNLI-IF trong các dòng cây

chuyển gen Trên cơ sở kết quả của luận án, các vector biểu hiện gen

OsNLI-IF do luận án tạo ra đang được nghiên cứu chuyển vào các

giống cây trồng quan trọng như ngô, đậu tương, bông… để chọn tạo các giống cây chuyển gen kháng hạn nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết của sản xuất trong điều kiện thay đổi khí hậu toàn cầu

7 Bố cục của luận án

Luận án gồm 179 trang bao gồm: Phần mở đầu (03 trang); Tổng quan tài liệu (41 trang); Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (28

4

trang); Kết quả nghiên cứu và thảo luận (70 trang); Kết luận (02 trang);Kiến nghị(01trang); Các công trình khoa học của tác giảliên

177 quan đến luận án (01 trang); Tài liệu tham khảo (18 trang),

tài liệu gồm 2 thứtiếng tiếng Việt (17 ) và tiếng Anh (160); Phụ lục (06 trang) Luận án có 11bảng, 45hình

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 HẠN HÁN VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT

Hạn đối với thực vật là khái niệm được dùng để chỉ trạng thái thiếu nước do môi trường gây nên trong suốt quá trình sống hay trong từng giai đoạn sống, làm ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng

và phát triển của thực vật Môi trường khô hạn gây ra hàng loạt những tác động tiêu cực tới thực vật ở tất cả các cấp độ, từ hình thái tới phân tử và ở tất cả các giai đoạn phát triển Để đối phó với điều kiện hạn hán, thực vật sẽ khởi động cơ chế phòng vệ chống lại sự thiếu hụt nước, sau đó sẽ là một loạt các cơ chế ở các cấp độ khác nhau Đáp ứng chống chịu stress hạn của thực vật được thực hiện thông qua một chuỗi các quá trình rất phức tạp với sự tham gia của hàng loạt các yếu tố và có thể chia thành 3 giai đoạn: nhận tín hiệu – dẫn truyền tín hiệu – đáp ứng chống chịu khởi đầu chuỗi truyền tín hiệu

1.2 ĐIỀU HÒA HOẠT ĐỘNG GEN TRONG ĐIỀU KIỆN HẠN Ở THỰC VẬT

Thực vật thích nghi với môi trường sống nhờ khả năng điều hòa nhanh biểu hiện của các gen chức năng Quá trình điều hòa biểu hiện gen đóng một vai trò quan trọng trong đáp ứng của thực vật với các điều kiện stress phi sinh học, trong đó có hạn hán Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh stress hạn tác động tới tất cả các bước trong quá trình điều hòa hoạt động gen của thực vật, bao gồm: điều hòa quá trình phiên mã, điều hòa sau phiên mã, điều hòa quá trình dịch mã, điều hòa sau dịch mã, điều hòa hoạt động gen thông qua các phân tử RNA không mã hóa và yếu tố di truyền ngoại sinh (ví dụ như quá trình methyl hóa DNA hay quá trình biến đổi histone)

là các nhóm AP2/ERF, NAC, WRKY, MYB/MYC, bZIP hay ZF 1.4 NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA LÚA BẰNG CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN THỰC VẬT

Việc phát triển các giống lúa chịu hạn và giảm lượng nước tiêu thụ trong sản xuất lúa gạo có ý nghĩa vô cùng to lớn để tăng sản lượng và đảm bảo an ninh lương thực Một hướng nghiên cứu phổ biến và rất được quan tâm hiện nay là tăng cường biểu hiện các gen đáp ứng hoặc liên quan đến đáp ứng chống chịu hạn trong cây lúa chuyển gen Do cơ chế chống chịu hạn phức tạp của thực vật, việc sử dụng các gen điều hòa (mã hóa các protein tham gia vào mạng lưới điều hòa đáp ứng stress) trong nghiên cứu chuyển gen tạo giống lúa chịu hạn thường mang lại hiệu quả cao hơn so với các gen chức năng (mã hóa protein/ enzyme trực tiếp tham gia vào đáp úng chống chịu stress) Tuy nhiên, cho đến nay mới chỉ có một vài nghiên cứu chứng minh khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen trong điều kiện thử nghiệm trên đồng ruộng Ở Việt Nam chưa có một nghiên cứu hoàn chỉnh nào về các gen liên quan đến đáp ứng chống chịu stress ở thực vật, đặc biệt là nhóm gen mã hoá nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng chống chịu hạn ở lúa

Chương 2 VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Thư viện cDNA sơ cấp của lúa Oryza sativa L xử lý điều kiện

hạn và mặn ấp bởi Bộ môn Bệnh học Phân tử, Viện Di

truyền Nông nghiệp Hạt lúa PB1 và hạt thuốc lá Nicotiana tabacum

(L.) doTrung tâm Kỹ thuật Di truyền & Công nghệ sinh học Quốc tế (Ấn Độ) cung cấp

2.1.2 Chủng vi sinh vật

Chủng vi khuẩn E coli DH5α được mua từ hãng Fermentas (Mỹ); chủng vi khuẩn E coli XLOR, XL1-Blue MRF và phage “trợ

giúp” được mua từ Công ty Agilent Technologies (Mỹ); chủng vi

khuẩn E coli Rosetta (DE3) khả biến được mua từ Công ty Merck Millipore (Mỹ); chủng vi khuẩn Agrobacterium LBA4404 khả biến, chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae YM4271 và AH109 được

mua từ Công ty Clontech (Mỹ)

2.1.3 Vector và oligonucleotide

Các vector pLacZi/JRC0332, pLacZi/JRC0528, pLacZi/JRC2606, pHISi/JRC0332, pHISi/JRC0528, pHISi/JRC2606 do nhóm nghiên cứu của Phạm Xuân Hội thiết kế và cung cấp; vector YEpGAP, pBI-Lip9, pBI-Ubi do nhóm nghiên cứu của Kazuko Yamaguchi-Shinozaki thiết kế và cung cấp; các vector pAD-GAL4, pGBKT7 được mua từ Công ty Clontech; vector pET28a được mua từ hãng Novagen, vector pRT101 do nhóm nghiên cứu của Reinhard Topfer thiết kế; vector pCAMBIA1301 được mua từ Công ty Marker Gene Technologies; vector pGEM-T được mua của hãng Promega

Các cặp sử dụng làm mồi oligonucleotide đầu dò

8

được đặt mua từ hãng Invitrogen (Mỹ) và Sigma (Mỹ)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Xử lý mẫu thực vật theo phương pháp của Qin (2007), Dubouzet (2003) và Tran (2004)

- Tách chiết, định lượng DNA/RNA

- Nhân dòng gen OsNLI-IF vào vector pGEM-T

- Thiết kế vector biểu hiện gen OsNLI-IF

Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế vector pCAM-35S/OsNLI-IF

Hình 2.3: Sơ đồ thiết kế vector pBI-Lip9 và pBI-Ubi

- Sàng lọc gen từ thư viện cDNA bằng kỹ thuật lai phân tử trong tế bào nấm men

- Tạo kháng thể đa dòng kháng protein OsNLI-IF tái tổ hợp

- Tạo cây chuyển gen biểu hiện OsNLI-IF

Chương 3 KẾT QUẢ & THẢO LUẬN

3.1 PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN CHỐNG CHỊU ĐIỀU KIỆN BẤT LỢI Ở LÚA

Trong nghiên cứu được công bố năm 2003, Rabbani và cộng sự

đã xác định được 72 gen biểu hiện cảm ứng với các điều kiện stress khác nhau ở lúa Khi phân tích trình tự promoter của các gen này, hai motif (đoạn trình tự lặp lại) có trình tự là CCTCCTCC và CTCCAC được tìm thấy xuất hiện lặp lại nhiều lần trong vùng promoter của

nhiều gen và được dự đoán là những yếu tố cis điều hòa biểu hiện

gen trong điều kiện stress Chúng tôi đã sử dụng hai đoạn DNA kích thước 50 bp được tổng hợp dựa trên trình tự của hai promoter

JRC0528 và JRC0332 có chứa đồng thời cả hai motif làm “mồi câu”

trong thí nghiệm sàng lọc gen mã hoá nhân tố phiên mã từ thư viện cDNA bằng kỹ thuật Y1H

Bảng 3.2: Protein liên kết với đoạn DNA đích

Protein liên kết JRC0332 Protein liên kết JRC0528

R2R3 typical-P-type 1 Protein họ Zinc Finger 1 Protein cảm ứng lạnh 1 Protein C3HC4-type ring finger 1 Nhân tố ức chế dịch mã EIF4D 1 Protein liên kết RNA 1

Protein liên kết RNA 1 Protein giống methallothionein 1 Protein mang acyl 1 Carboxylase ribulose-bisphosphate 1 Protein liên kết RNA 1 Protein chuyển hóa lipid 1

Protein ưu nhiệt 1 Protein liên kết axit béo 1 Trình tự DNA không xác định 5 Trình tự DNA không xác định 4 Chúng tôi đã sàng lọc thư viện cDNA xử lý stress hạn và mặn của lúa và xác định được 37 dòng cDNA dương tính, trong đó có 8

10

dòng mã hóa cho protein NLI-IF (Bảng 3.2) Tám dòng cDNA đều

có chiều dài ~1850 bp, trong đó vùng ORF dài 1.320 bp mã hóa cho

439 axit amin, vùng không mã hóa đầu 5’ dài 311 bp, vùng không mã

hóa đầu 3’ dài 219 bp Gen OsNLI-IF sau đó được nhân bản bằng

phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu và nhân dòng vào vector pGEM-T 3.2 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CHỨC NĂNG CỦA OsNLI-IF

3.2.1 Biểu hiện của OsNLI-IF trong các điều kiện stress

Mức độ biểu hiện gen OsNLI-IF trong cây lúa được phân tích trong các điều kiện stress giả định, bao gồm mất nước, hạn, mặn, lạnh, nhiệt độ cao và hormone ABA

Hình 3.14: Biểu hiện của OsNLI-IF trong điều kiện bất lợi

Ghi chú: (Hình trên) OsNLI-IF mRNA được phát hiện bằng đầu dò gắn

phóng xạ P 32 ; rRNA 18S được điện di trên gel agarose (Hình dưới) Mức

độ biểu hiện OsNLI-IF được xác định bằng Real-time RT-PCR với khuôn là mẫu RNA tách chiết từ mô thân & lá (cột màu xám) và mô rễ (cột màu đen); mức độ biểu hiện gen tại thời điểm chưa xử lý stress có giá trị bằng 1; gen actin được sử dụng làm gen nội chuẩn; giá trị thể hiện trên đồ thị là kết quả trung bình của 3 lần thí nghiệm

Kết quả phân tích bằng kỹ thuật lai RNA và Real-time RT-PCR

cho thấy OsNLI-IF tăng cường biểu hiện bởi các yếu tố stress mặn,

hạn, mất nước, lạnh, nhiệt độ cao trong mô rễ và không cảm ứng biểu hiện với ABA (Hình 3.14)

3.2.2 Hoạt tính liên kết đặc hiệu DNA đích của OsNLI-IF

Để chứng minh khả năng liên kết đặc hiệu DNA của protein OsNLI-IF, chúng tôi sử dụng kỹ thuật Y1H với hai đoạn DNA đích

JRC0528 và JRC0332 đột biến (Hình 3.17A) Đoạn gen OsNLI-IF

được ghép nối với trình tự mã hoá domain hoạt hoá phiên mã GAL4 trên vector biểu hiện pAD-GAL4 và biến nạp vào tế bào nấm men chỉ thị YM4271

AD-Hình 3.17: Khả năng liên kết DNA đặc hiệu của OsNLI-IF

Ghi chú: (A) Trình tự các đoạn DNA đích nguyên bản (WT) và đột biến

(MU) (B) Biểu hiện của gen chỉ thị trong tế bào nấm men: (i) sơ đồ bố trí

thí nghiệm các chủng nấm men mang các cấu trúc khác nhau, (ĐC+): đối chứng dương, (ĐC-): đối chứng âm, (JRC0332-WT, JRC0528-WT, JRC0332-MU, JRC0528-MU): chủng nấm men chỉ thị mang các đoạn DNA đích JRC0332 hay JRC0528 được biến nạp vector pAD/OsNLI-IF; (ii) môi trường YPD; (iii) môi trường SD/-Leu/-Ura/-His; (iv) môi trường SD/-Leu/- Ura/-His có 3-AT 30 mM; (v) hoạt tính biến đổi cơ chất X-Gal của β- galactosidase

Kết quả đánh giá biểu hiện của gen chỉ thị HIS3 và lacZ cho thấy

chỉ có tế bào nấm men tái tổ hợp mang một trong hai đoạn DNA đích

12

nguyên bản có thể sinh trưởng được trên môi trường chọn lọc và thể hiện hoạt tính β-galactosidase (Hình 3.17B) Kết quả này chứng tỏ protein dung hợp AD-OsNLI-IF đã liên kết đặc hiệu với đoạn DNA chứa hai motif CCTCCTCC và CTCCAC và hoạt hoá quá trình phiên

mã của gen chỉ thị

3.2.3 Hoạt tính hoạt hóa phiên mã của OsNLI-IF

Hoạt tính hoạt hóa phiên mã của OsNLI-IF được phân tích bằng

kỹ thuật Y1H Đoạn gen OsNLI-IF được ghép nối vào vector biểu

hiện YEpGAP và biến nạp vào chủng tế bào nấm men chỉ thị YM4271

Hình 3.20: Hoạt tính hoạt hóa phiên mã của OsNLI-IF

Ghi chú: (A) Sơ đồ bố trí thí nghiệm các chủng nấm men mang các cấu trúc

khác nhau (B) Môi trường YPD (C) Môi trường SD/-Leu/-Ura/-His (D) Môi trường SD/-Leu/-Ura/-His có 3-AT 30 mM (E) Hoạt tính biến đổi cơ

chất X-Gal của β-galactosidase (ĐC+): đối chứng dương; (YM4271-WT): nấm men YM4271 nguyên bản; (OsNLI-IF): nấm men mang YEpGAP/OsNLI-IF; (JRC0332): nấm men mang pHis/JRC0332 + pLac/JRC0332; (Vector + JRC0332): nấm men mang pHis/JRC0332 + pLac/JRC0332 + YepGAP; (OsNLI-IF + JRC0332): nấm men mang pHis/JRC0332 + pLac/JRC0332 + YepGAP/OsNLI-IF

Kết quả thu được cho thấy chỉ có chủng nấm men mang đồng thời YEpGAP/OsNLI-IF và vector chỉ thị chứa đoạn DNA đích

JRC0332 trong vùng điều khiển của gen HIS3 và lacZ có thể sinh

trưởng trên môi trường chọn lọc và biến đổi cơ chất X-Gal để tạo thành màu xanh (Hình 3.20D & E) Kết quả này chứng tỏ protein OsNLI-IF đã tương tác với đoạn DNA đích JRC0332 và hoạt động