tóm tắt luận án GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ PHẢN ỨNG ESTERASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA TIN

Lý do lựa chọn đề tài Ngày nay, cùng với sự hoàn thiện của các phương pháp tính hóa lượng tử, sự xâm nhập của hóa học lý thuyết vào lĩnh vực xúc tác enzym cũng ngày càng phát triển.. Mụ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TỐNG THỊ THU CÚC

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ PHẢN ỨNG ESTERASE

BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA TIN

Chuyên ngành: Hóa lý thuyết và Hóa lý

Mã số: 60.44.01.19

DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Hữu Thọ

Trường Đại học KHTN-ĐHQGHN;

GS TS Lâm Ngọc Thiềm Trường Đại học KHTN-ĐHQGHN

Phản biện:

Phản biện:

Phản biện:

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp tại

vào hồi giờ ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm Thông tin – Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

MỞ ĐẦU

Luận án nghiên cứu một trong những phản ứng quan trọng trong cơ thể sống: phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ enzym acetylcholinesterase Phản ứng được mô phỏng bằng các phương pháp hóa tin để làm rõ những yếu tố xác định hoạt tính của enzym

Lý do lựa chọn đề tài

Ngày nay, cùng với sự hoàn thiện của các phương pháp tính hóa lượng tử, sự xâm nhập của hóa học lý thuyết vào lĩnh vực xúc tác enzym cũng ngày càng phát triển Nghiên cứu hệ xúc tác enzym để làm sáng tỏ bản chất hóa học của các phản ứng trong cơ thể sống đang được nhiều nhà khoa học quan tâm Một khi các phương pháp lý thuyết thành công trong lĩnh vực này sẽ định hướng cho việc điều chỉnh, can thiệp vào các quá trình diễn ra trong cơ thể sống trước khi thử nghiệm trực tiếp trên cơ thể, hạn chế được rủi ro, nguy hiểm

Đến nay, các phương pháp lý thuyết nghiên cứu hệ xúc tác enzym đang trong quá trình hoàn thiện, vì vậy việc tiếp cận để cải tiến các phương pháp này là một hướng phát triển được ưu tiên vì nó sẽ tạo

ra một bước nhảy vọt trong hóa lý thuyết, đưa lý thuyết tiến gần hơn đến thực nghiệm

Trong nhóm esterase, acetylcholinesterase là enzym có hoạt tính cao và tham gia trực tiếp vào quá trình truyền dẫn xung thần kinh Bằng thực nghiệm, tác giả Harry C Froede và Irwin B Wilson đã sử dụng phương pháp nguyên tử đánh dấu 3H để khảo sát cơ chế của phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ xúc tác acetylcholinesterase và đề xuất cơ chế acylenzym Với mong muốn góp phần làm sáng tỏ cơ chế

đã được đề xuất từ thực nghiệm, chúng tôi sử dụng phương pháp hóa

Mục đích của luận án

Mục đích của luận án là tập trung làm sáng tỏ cơ chế xúc tác của một nhóm enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân - enzym esterase, cụ thể là enzym acetylcholinesterase bằng các phương pháp hóa tin

- Nghiên cứu cơ chế giai đoạn acyl hóa của phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ xúc tác enzym ở cá đuối điện và ở người (theo

cơ chế acylenzym) nhằm làm rõ các yếu tố quyết định hoạt tính xúc tác của enzym

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất ức chế acetylcholinesterase

Đối tượng

Đối tượng nghiên cứu của luận án là phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ xúc tác là enzym acetylcholinesterase (thuộc nhóm esterase) ở cá đuối điện và ở người Tác giả lựa chọn acetylcholinesterase ở cá đuối điện là enzym có hoạt tính đặc biệt cao

và acetylcholinesterase ở người để định hướng cho những nghiên cứu tiếp theo liên quan đến lĩnh vực hóa dược

Phạm vi nghiên cứu

Luận án sử dụng các phương pháp hóa tin để làm rõ cơ chế phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ xúc tác enzym, đồng thời nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất đến hoạt tính của enzym Những chất này đã từng được sử dụng làm thuốc điều trị các chứng bệnh liên quan đến rối loạn truyền dẫn xung thần kinh

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Về mặt khoa học: Những kết quả thu được từ các số liệu tính toán sẽ góp phần làm tăng thêm vốn hiểu biết về cơ chế của các phản ứng sinh học

- Về mặt thực tiễn: Những đặc điểm biến đổi về mặt cấu trúc

và năng lượng phản ứng có thể gợi mở cho những ứng dụng mô phỏng sinh học và điều chỉnh, can thiệp vào các quá trình xảy ra trong cơ thể sinh vật

Những điểm mới của luận án

- Trong luận án, tác giả đã sử dụng các phương pháp hóa tin

để khảo sát chi tiết phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ enzym ở cá đuối điện và ở người, phân tích, so sánh phản ứng ở hai trường hợp kể trên để phân định vai trò của các yếu tố cấu trúc đối với hoạt tính của enzym và chỉ rõ quá trình tạo phức với enzym đã hình thành

- Đánh giá sơ bộ ảnh hưởng của một số chất ức chế đến phản ứng bằng kĩ thuật protein docking và phương pháp QM/MM Kết quả cho thấy rằng 6 chất được khảo sát đều có khả năng neo đậu tại hốc phản ứng để thực hiện chức năng ức chế của mình

- Từ các số liệu thu được bằng các phương pháp hóa tin đã khẳng định lại cơ chế đề xuất từ thực nghiệm là có cơ sở

KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO

CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đối tượng nghiên cứu

Esterase là nhóm enzym xúc tác cho quá trình thủy phân nhóm chức este

Acetylcholinesterase là enzym thuộc nhóm esterase, xúc tác cho quá trình thủy phân acetylcholine, một chất dẫn truyền xung thần kinh

1.1.1 Cấu trúc

Acetylcholinesterase ở các loài khác nhau có cấu trúc khác nhau Luận án nghiên cứu enzym ở hai loài: cá đuối điện và ở người a) Cấu trúc bậc 1:

Ở trạng thái hoạt hóa, phân tử acetylcholinesterase ở cá đuối điện có 543 aminoaxit, phân tử acetylcholinesterase ở người có 583 aminoaxit Trên cấu trúc bậc 1, ít thấy sự giống nhau giữa hai enzym Tâm xúc tác trên enzym ở cá đuối điện là Ser200, tâm xúc tác trên enzym ở người là Ser203

b) Cấu trúc bậc 2:

Cấu trúc bậc 2 của acetylcholinesterase ở cá đuối điện và ở người có sự tương đồng về trật tự các đoạn xoắn α, gấp β, các cầu nối sunfua

c) Cấu trúc bậc 3:

Trong cả hai trường hợp, tâm xúc tác Ser nằm ở đáy một hốc sâu trên phân tử enzym (hình 1.3)

Hình 1.3 Vị trí tâm xúc tác trên phân tử acetylcholinesterase

Trong cả 2 trường hợp, hốc phản ứng được bao quanh bởi các aminoaxit có nhánh là vòng thơm

d) Cấu trúc bậc 4:

Cấu trúc bậc 4 của acetylcholinesterase có thể gồm 1, 2, 4, 8,

12 đơn vị cấu trúc bậc 3 và các thành phần khác như glycolipid Tuy vậy, hoạt tính xúc tác của mỗi đơn vị acetylcholinesterase trong các dạng cấu trúc này tương đương nhau Do đó, trong luận án enzym được

mô phngr ở dạng monome

1.1.2 Cơ chế của phản ứng xúc tác enzym

Với acetylcholinesterase, kết quả thực nghiệm xác nhận sự tạo phức giữa enzym và cơ chất Cơ chất trước tiên phản ứng với tâm xúc tác nằm trên Ser200 ở cá đuối điện hoặc Ser203 ở người để tách ra choline, sau đó tâm xúc tác đã bị acetyl hóa sẽ tái tạo lại bằng cách phản ứng với phân tử nước

1.1.3 Một số chất ức chế đối với acetylcholinesterase

Harry C Froede và Irwin B Wilson bằng thực nghiệm đã đưa

ra bằng chứng về cơ chế acylenzym với Ser200/203 đóng vai trò tác nhân nucleophin và His440/447 đóng vai trò xúc tác axit – bazơ

1.4 Tổng quan phương pháp nghiên cứu

1.4.1 Phương pháp cơ học phân tử

Trong phương pháp cơ học phân tử, phân tử được mô hình như hệ các quả cầu và lò xo, gồm các nguyên tử được giữ với nhau bằng các liên kết Các nguyên tử được xử lí theo cơ học cổ điển Năng lượng điện tử được mô tả dưới dạng motọ hàm tham số của các tọa độ hạt nhân Các tham số này được lấy phù hợp với thực nghiệm hay các phương pháp tính toán mức cao hơn

1.4.3 Phương pháp kết hợp cơ học lượng tử - cơ học phân tử (QM/MM)

Trong phương pháp QM/MM, phần trực tiếp tham gia vào phản ứng hóa học (có sự hình thành, phá vỡ liên kết) được tính bằng phương pháp cơ học lượng tử để đảm bảo độ chính xác, phần còn lại được tính bằng phương pháp cơ học phân tử để tiết kiệm thời gian tính toán

1.4.4 Kĩ thuật protein docking

Protein docking là kĩ thuật mô hình hóa nhằm dự đoán vị trí

và cấu hình thuận lợi mà phân tử cơ chất có thể gắn kết trên phân tử protein Phân tử cơ chất được cho dịch chuyển trong không gian bao quanh phân tử protein để tìm vị trí có năng lượng gắn kết âm nhất sử dụng các hàm đánh giá và phương pháp tìm kiếm cực trị toàn cục khác nhau

CHƯƠNG 2 NGUỒN DỮ LIỆU VÀ CÔNG CỤ NGHIÊN CỨU 2.1 Nguồn dữ liệu

Cấu trúc enzym ở cá đuối điện và ở người được lấy từ ngân hàng cơ sở dữ liệu protein, với mã lần lượt là 1EVE và 4EY4 Các aminoaxit bị thiếu được bổ sung dùng phần mềm Acelrys Discovery Studio 4.0 Visualizer và GaussView 5.0.8 và tối ưu lại dùng trường lực Amber

2.2 AutoDock Vina 1.1.1

AutoDock Vina được dùng để khảo sát docking Trong AutoDock Vina các thông số của hàm đánh giá được đặt sẵn từ kết quả khớp với ngân hàng cơ sở dữ liệu PDB Thuật toán tìm kiếm được sử dụng là lặp đi lặp lại các bước đột biến và tối ưu cục bộ theo tiêu chuẩn Metropolis

2.3 Gaussian 09W và GaussView 5.0.8

Gaussian là phần mềm tính toán hóa học được sử dụng rộng rãi, kết hợp với GaussView để hỗ trợ giao diện đồ họa Các tính toán QM/MM trong luận án được thực hiện trên Gaussian 09W

Phân vùng QM bao gồm phân tử acetylcholine, tâm xúc tác Ser200 ở cá đuối điện hoặc Ser203 ở người, nhánh của His440 ở cá đuối điện hoặc His447 ở người, phần còn lại của phân tử enzym được tính theo phương pháp MM (hình 2.4)

Hình 2.4 Phân vùng QM, MM cho hệ phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ xúc tác acetylcholinesterase

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả khảo sát docking cho cơ chất acetylcholine

3.1.1 Kết quả docking đối với acetylcholinesterase ở cá đuối điện

Acetylcholine gắn kết thuận lợi nhất trong hốc phản ứng, định hướng trên tâm xúc tác Ser200, nhóm amoni bậc 4 hướng định hướng thẳng góc với vòng Trp84, năng lượng gắn kết là -4.8 kcal/mol (hình 3.5)

Hình 3.5 Trạng thái gắn kết có mức năng lượng thấp nhất của

acetylcholine lên enzym ở cá đuối điện

3.1.2 Kết quả docking đối với acetylcholinesterase ở người

Trong trạng thái có mức năng lượng gắn kết âm nhất, acetylcholine định hướng trên tâm xúc tác Ser203, gốc amoni bậc 4 hướng về phía vòng Trp86 với mức năng lượng gắn kết -5.1 kcal/mol

Vị trí gắn kết thuận lợi của acetylcholine phù hợp với kết quả xác định tâm xúc tác từ thực nghiệm

3.2 Kết quả tính QM/MM cho phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ xúc tác enzym ở cá đuối điện và ở người

3.2.1 Kết quả tính QM/MM cho phản ứng ở cá đuối điện

Phân tử acetylcholine được đưa vào hốc phản ứng theo định hướng từ kết quả docking, tối ưu theo phương pháp QM/MM (EE) được cấu trúc Tp_INT1 (hình 3.9)

Hình 3 9 Cấu trúc tối ưu Tp_INT1

Khoảng cách C(24) và O(6) là 2.62 Å, phân tử acetylcholine chưa thể hiện tương tác hóa học với tâm xúc tác nhưng phân tử acetylcholine đã bị kéo giãn, momen lưỡng cực tăng từ 6.626 Debye đến 9.638 Debye

Cấu trúc tối ưu của trạng thái phức Tp_INT2 được thể hiện trên hình 3.12 Phức có cấu trúc tứ diện tại C(24), nguyên tử H(14) chuyển từ nhóm OH trong Ser200 sang N của His440 và quay hướng tạo liên kết hydro với nguyên tử O(26)

Hình 3 12 Cấu trúc tối ưu Tp_INT2

Trên hình 3.13 là cấu trúc tối ưu của trạng thái tách choline Tp_INT3 Trong cấu trúc Tp_INT3, nguyên tử H(14) chuyển từ His440 sang liên kết với O(26), liên kết C(24) – O(26) đã đứt hẳn

Hình 3.13 Cấu trúc tối ưu Tp_INT3

Cấu trúc trạng thái chuyển tiếp giai đoạn tạo phức Tp_TS1 (hình 3.15) được khoanh vùng bằng cách quét thế theo khoảng cách C(24) – O(6) từ trạng thái Tp_INT1 đến Tp_INT2

Hình 3.15 Cấu trúc trạng thái chuyển tiếp

giai đoạn tạo phức Tp_TS1

Năng lượng hoạt hóa của giai đoạn tạo phức ở cá đuối điện là 4.581 kcal/mol

Cấu trúc trạng thái chuyển tiếp giai đoạn tách choline Tp_TS2 (hình 3.18) được khoanh vùng bằng cách quét thế theo khoảng cách N(11) và H(14) từ trạng thái Tp_INT2 đến Tp_INT3 Năng lượng hoạt hóa của giai đoạn tách choline ở cá đuối điện là 7.598 kcal/mol

Hình 3.18 Cấu trúc trạng thái chuyển tiếp

giai đoạn tách choline Tp_TS2

Trên hình 3.19 là sơ đồ biến đổi năng lượng chung cho 2 giai đoạn Năng lượng hoạt hóa cho giai đoạn acyl hóa ở cá đuối điện là 4.581 kcal/mol

Hình 3 19 Sơ đồ biến đổi năng lượng của quá trình tạo phức và

tách choline ở cá đuối điện

Tách riêng phần QM trong các trạng thái Tp_INT1, Tp_INT2, Tp_INT3, tối ưu bằng phương pháp DFT/B3LYP, bộ hàm 6-31G(d) với các điểm nút cắt cố định được các trạng thái Tp_Vir1, Tp_Vir2, Tp_Vir3 Trong trạng thái Tp_Vir1, nguyên tử C trong nhóm este của acetylcholine không còn định hướng trên tâm xúc tác (hình 3.21) Cấu trúc trạng thái phức cũng không còn ổn định

Hình 3 21 Cấu trúc Tp_Vir1

Trong quá trình phản ứng, khoảng cách từ nguyên tử N trong nhóm amoni bậc 4 của acetylcholine đến vòng Trp84 gần như không đổi Tách lấy phần QM cùng với Trp84 từ các cấu trúc Tp_INT1 và Tp_INT2, tối ưu với các điểm nút cắt và vòng Trp84 cố định để được các trạng thái Tp_Vir1Trp và Tp_Vir2Trp Trong cấu trúc Tp_Vir1Trp (hình 3.25), nguyên tử C trong nhóm este của acetylcholine định hướng trên tâm xúc tác Tuy vậy, cấu trúc phức vẫn không ổn định

Hình 3.25 Cấu trúc Tp_Vir1Trp

Như vậy, vòng Trp84 có vai trò neo giữ đối với phần gốc amoni bậc 4 để phân tử acetylcholine có định hướng phù hợp để phản ứng xảy ra thuận lợi

3.2.2 Kết quả tính QM/MM cho phản ứng ở người

Các cấu trúc Ho_INT1, Ho_INT2, Ho_INT3 cũng được tối ưu theo phương pháp QM/MM (EE) và được thể hiện lần lượt trên các hình 3.27, 3.30, 3.31

Hình 3 27 Cấu trúc tối ưu Ho_INT1

Hình 3.30 Cấu trúc Ho_INT2

Hình 3 31 Cấu trúc Ho_INT3

Trong cấu trúc Ho_INT1, khoảng cách giữa C(24) và O(8) là 2.666 Å, lớn hơn khoảng cách tương ứng trong cấu trúc Tp_INT1

biến đổi độ dài liên tại tâm phản ứng nằm giữa trạng thái Tp_INT2 và Tp_TS2

Cấu trúc các trạng thái chuyển tiếp Ho_TS1 và Ho_TS2 được khoanh vùng và thể hiện lần lượt trên hình 3.33 và 3.35

Hình 3.33 Cấu trúc trạng thái chuyển tiếp giai đoạn tạo phức

ở người Ho_TS1

Hình 3.35 Cấu trúc trạng thái chuyển tiếp giai đoạn tách choline

ở người Ho_TS2

Sơ đồ biến đổi năng lượng cho giai đoạn tạo phức và tách choline ở người được biểu diễn trên hình 3.36

Hình 3.36 Sơ đồ biến đổi năng lượng của quá trình tạo phức và

Qua khảo sát cơ chế phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ enzym ở cá đuối điện và ở người có thể rút ra các kết luận sau:

- Acetylcholine tạo phức với enzym tại tâm xúc tác trên Ser200/203, quá trình này được cảm ứng bởi quá trình chuyển dịch

trong His440/447 His440/447 có vai trò như một xúc tác axit – bazơ Vòng Trp84/86 có vai trò neo giữ gốc amoni bậc 4 của acetylcholine

để phân tử có định hướng thuận lợi cho quá trình phản ứng

- Phần còn lại của phân tử enzym, tương tác với cơ chất chủ yếu qua tương tác tĩnh điện, vừa đóng vai trò làm bộ khung định hình cho tâm xúc tác, vừa tạo ra trường điện tích giúp ổn định cấu trúc phức

cơ sở 6-31G(d), sau đó được đưa vào khảo sát docking

3.3.1 Kết quả docking của Donepezil

Donepezil gắn kết thuận lợi tại hốc phản ứng của enzym ở cá đuối điện với mức năng lượng gắn kết âm nhất ghi nhận được là -11.0 kcal/mol

Đối với enzym ở người, trong 20 trạng thái có mức năng lượng gắn kết âm nhất, Donepezil gắn kết thuận lợi tại hốc phản ứng và hõm

α (hình 3.52) Năng lượng gắn kết âm nhất khi Donepezil nằm trong hốc phản ứng với giá trị là -9.4 kcal/mol