tóm tắt luận án NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH ADN VÀ TẾ BÀO PHÔI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI CỦA MẸ ĐỂ CHẨN ĐOÁN TRƢỚC SINH

Đây là phát hiện vô cùng quan trọng mở ra một hướng mới đầy triển vọng trong chẩn đoán trước sinh bằng biện pháp không can thiệp.Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Triệu Tiến Sang

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH ADN

VÀ TẾ BÀO PHÔI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI CỦA

Công trình được hoàn thành tại:

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN và

Học viện Quân y

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Văn Khoa

PGS.TS Đinh Đoàn Long

Vào hồi giờ ngày tháng năm 2015

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm thông tin –Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

MỞ ĐẦU

 Tính cấp thiết của đề tài

Dị tật bẩm sinh đã và đang là một vấn đề lớn không chỉ đối với ngành sản khoa mà còn thu hút sự quan tâm của toàn xã hội Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới tỷ lệ dị tật bẩm sinh chiếm khoảng 1,73% Ở Việt Nam, các nghiên cứu cũng cho thấy tỷ lệ dị tật bẩm sinh 2,4% đến 3,6% Hiện nay, việc điều trị các dị tật bẩm sinh vẫn còn hết sức khó khăn và phức tạp Các DTBS hiện nay đa số đều không thể chữa khỏi được hoặc kết quả điều trị rất hạn chế, thai nhi sau khi sinh ra kém phát triển cả về thể lực và trí lực, giảm khả năng lao động hay tự chăm sóc, kém hoà nhập với xã hội Chính vì vậy việc chẩn đoán trước sinh để có biện pháp tư vấn, dự phòng và can thiệp vẫn là biện pháp hàng đầu, hết sức cần thiết và cấp thiết nhằm làm giảm tỷ lệ dị tật bẩm sinh Việc nghiên cứu ứng dụng các phương pháp chẩn đoán trước sinh các dị tật bẩm sinh đã được tiến hành từ lâu

Đã có nhiều phương pháp khả thi được công bố và ứng dụng trong thực tiễn như: siêu âm sản khoa, test sàng lọc bộ ba (triple test)… là những phương pháp không mang tính can thiệp nhưng chẩn đoán muộn và có độ đặc hiệu thấp Bên cạnh đó, các phương pháp như: chọc hút nước ối, sinh thiết gai rau, lấy máu cuống rốn… có độ đặc hiệu cao thông qua phân tích vật liệu di truyền thai nhi, nhưng mang tính can thiệp, gây tỷ lệ tai biến đáng kể cho thai nhi và thai phụ như sẩy thai, rò ối, thai chết lưu, đẻ non, …

Năm 1969, Walknowska và cộng sự đã phát hiện ra sự có mặt của tế bào phôi thai

tự do trong máu ngoai vi của người mẹ Năm 1997, Lo và cộng sự đã phát hiện DNA tự

do của thai nhi (free fetal DNA: ADN phôi thai tự do) trong huyết tương mẹ đây là một bước đột phá trong lĩnh vực chẩn đoán trước sinh Đây là phát hiện vô cùng quan trọng

mở ra một hướng mới đầy triển vọng trong chẩn đoán trước sinh bằng biện pháp không

can thiệp.Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu quy trình tách

chiết, phân tích ADN và tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ để chẩn đoán trước sinh” nhằm mục đích tách được ADN phôi thai tự do và tế bào phôi thai tự do trong

máu ngoại vi của mẹ ứng dụng để chẩn đoán trước sinh bằng phương pháp không can thiệp

 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

 Xây dựng được quy trình tách chiết ADN phôi thi tự do trong máu ngoại vi của mẹ

 Xây dựng được quy trình tách chiết và phân lập tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ

 Ứng dụng ADN phôi thai chẩn đoán bất đồng nhóm máu Rh và tế bào phôi thai chẩn đoán hội chứng Trisomy 21, XXY

 Đối tượng và nội dung nghiên cứu của đề tài

Đối tượng nghiên cứu của đề tài

Các mẫu máu ngoại vi của các phụ nữ mang thai bị dị tật và mang thai không bị dị tật

Nội dung nghiên cứu của đề tài

 Hoàn thiện quy trình tách chiết ADN phôi thai trong máu mẹ

 Nghiên cứu sự biến đổi hàm lượng ADN phôi thai tự do trong máu theo thai kỳ và thời gian tồn tại của chúng sau khi sinh

 Xây dựng quy trình phân lập tế bào phôi thai trong máu mẹ

 Kiểm tra, đánh giá ADN phôi thai trong máu mẹ

 Kiểm tra, đánh giá tế bào phôi thai trong máu mẹ

 Ứng dụng sàng lọc và chẩn đoán di truyền trước sinh: tăng sản thượng thận, teo cơ Duchenne, bất đồng nhóm máu, hội chứng trisomy 21, XXY

 Địa điểm thực hiện của đề tài

Các nghiên cứu được thực hiện chủ yếu tại Phòng Công nghệ gen và Di truyền tế bào – Trung tâm Sinh Y dược học – Học viện Quân y

 Đóng góp mới của đề tài

 Đánh giá được nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ ứng dụng chẩn đoán trước sinh ở thời điểm thích hợp nhất trong thời gian phát triển của thai kỳ

 Xây dựng được quy trình phân lập tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ, ứng dụng cho chẩn đoán các dị tật bẩm sinh

 Góp phần sàng lọc và chẩn đoán các bệnh di truyền trước sinh bằng biện pháp không can thiệp

 Ứng dụng thực tiễn của đề tài

 Lý luận: Góp phần làm sáng tỏ sự tồn tại ADN và tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ ứng dụng sàng lọc và chẩn đoán trước sinh các bệnh di truyền

 Hoàn thiện được các quy trình tách chiết ADN tự do và phân lập tế bào phôi thai tự

do trong máu ngoại vi của mẹ

 Thực tiễn: Góp phần giảm thiểu các trường hợp sinh con bị bệnh di truyền, DTBS, giảm gánh nặng cho gia đình và xã hội

 Bố cục của luận án

Luận án gồm 157 trang bao gồm: Phần đặt vấn đề (3 trang); Tổng quan tài liệu (39 trang); Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (21 trang); Kết quả và thảo luận (56 trang); Kết luận và kiến nghị (1 trang), Các công trình khoa học của tác giả liên quan đến luận

án (2 trang), Tài liệu tham khảo (29 trang),với 251 tài liệu gồm 2 thứ tiếng tiếng Việt (37 tài liệu) và tiếng Anh (214 tài liệu) Luận án có 26 bảng, 43 hình

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

 Phương pháp chẩn đoán không can thiệp

Phương pháp không can thiệp là phương pháp chẩn đoán dựa vào phân tích vật liệu di truyền của thai nhi nhưng không từ các mẫu can thiệp vào tử cung buồng ối mà từ vật liệu di truyền thai nhi có trong máu ngoại vi của người mẹ

Ngày nay, việc chẩn đoán sớm các dị tật trước sinh là một vấn đề rất quan trọng

Nó góp phần quan trọng cho việc giảm bớt gánh nặng cho xã hội, giảm bớt sự bất hạnh của các gia đình có những đứa trẻ khuyết tật đó Những gia đình mà bố mẹ mang các di chứng của chất độc màu da cam, những gia đình tiếp xúc nhiều với hóa chất độc hại hay những gia đình gặp khó khăn do việc sinh con muộn, đó là những gia đình mang tần suất sinh con mắc các dị tật cao Những thai nhi thì ngày một lớn lên, thai nhi càng lớn thì các tai biến do đình chỉ thai ngày càng cao Do vậy việc lựa chọn các phương thức và các kỹ thuật dùng cho việc chuẩn đoán sớm rất có ý nghĩa trong việc chẩn đoán trước sinh Có 2 phương thức chẩn đoán sớm trước sinh qua máu mẹ:

-Phân tích di truyền ADN phôi thai tự do lưu hành trong máu mẹ

-Phân tích di truyền tế bào phôi thai lưu hành trong máu mẹ

 Sàng lọc và chẩn đoán di truyền qua ADN phôi thai tự do trong máu mẹ

Sự phát hiện DNA tự do của thai nhi (free fetal DNA: ADN phôi thai tự do) trong huyết tương mẹ là một bước đột phá trong lĩnh vực chẩn đoán trước sinh (Lo và cộng sự,

1997 Các ứng dụng lâm sàng của DNA phôi thai đã được tiến hành gần 10 năm sau khi giải mã bộ gen của Rhesus D (Zhong và cộng sự, 2000; Lo YMD và cộng sự, 1993), những rối loạn gen đơn (Chiu và cộng sự, 2008)và chẩn đoán giới tính của bào thai (Costa và cộng

sự, 2001; Edwards và cộng sự, 1966; Grosset L và cộng sự, 1974;) Ưu điểm nữa là việc định lượng DNA phôi thai, nhờ đó cho phép nghiên cứu DNA thai nhi trong các điều kiện bệnh lý và lâm sàng khác nhau trong quá trình mang thai (Costa và cộng sự, 2001; Lo và cộng sự, 1998) và sự tăng hàm lượng DNA phôi thai cũng được tìm thấy khi thai nhi có biểu hiện bất thường, chậm phát triển thai nhi, sinh sớm, bệnh Down, tiền sản giật vv (Lo

và cộng sự, 1999; Sekizawa và cộng sự, 2000; Troeger và cộng sự., 1999)

Các nghiên cứu ADN phôi thai tự do trong huyết tương mẹ (nguồn gốc, vận chuyển từ mẹ sang bào thai, hàm lượng trong quá trình mang thai, sự biến mất hoàn toàn sau sinh) đã được đề cập đến trong một số tài liệu Tuy nhiên, nguồn gốc xuất hiện ADN phôi thai tự do vẫn còn là một vấn đề chưa rõ trong nhiều năm Gần đây, nhiều công trình

đã xác định được chúng có nguồn gốc từ tế bào apoptosis của thai Rất nhiều các loại mô khác nhau như các tế bào biểu mô, tế bào gan của bào thai đã được giả định như nguồn gốc sơ khai của ADN phôi thai tự do và việc phân huỷ các tế bào của`` thai nhi trong huyết tương mẹ có do đó giải phóng DNA bào thai Việc truyền trực tiếp DNA thai nhi qua màng ối hoặc các DNA thai nhi tự do trong huyết tương cũng được đề cập đến (Kolialexi và cộng sự 2004; Sekizawa và cộng sự, 2000; Illanes và cộng sự, 2005; Kondo

số lượng các tế bào này rất thấp

Các tế bào này mang vật chất di truyền của phôi thai do vậy rất có ý nghĩa trong chẩn đoán dị tật sớm cho thai Tuy nhiên, có sự khác biệt giữa các loại tế bào:Trophoblast (lá nuôi phôi): xuất hiên sớm nhất, nhanh bị hủy, không xuất hiện trong máu ngoại vi của

mẹ ở tất cả các thai, không có kháng nguyên bề mặt đặc hiệu.Bạch cầu phôi thai: Lần đầu tiên bạch cầu phôi thai được chứng minh có mặt trong máu ngoại vi của mẹ vào năm

1969 bởi Walknowska, đặc biệt với những thai nhi mang giới tính nam Sự tồn tại của nó được chứng minh bằng sự khác biệt trong biểu hiện kháng nguyên bạch cầu người (HLA) Tuy vậy, việc nghiên cứu về loại tế bào này gặp phải những khó khăn nhất định: (1) các tế bào này không có kháng nguyên bề mặt đặc hiệu; (2) tuổi thọ của các tế nào này tương đối dài có thể tồn tại nhiều năm sau khi sinh dẫn đến tăng khả năng chẩn đoán sai.Hồng cầu nhân (hồng cầu thai nhi hay NRBCs): Luôn được coi là loại tế bào đầy hứa hẹn cho

kỹ thuật này với những ưu điểm: xuất hiện sớm và tồn tại trong suốt trong thai kì, tuổi thọ ngắn loại bỏ được khả năng của các tế bào xuất hiện từ lần mang thai trước đó, có kháng nguyên bề mặt đặc hiệu Hơn nữa số lượng tế bào này còn tăng lên ở những phôi thai mang các dị tật bẩm sinh Do vậy, các nghiên cứu trên thế giới đang tập trung vào phân tách hồng cầu có nhân của thai nhi

Hình 1.6: Hình minh họa các thành phần trong máu ngoại vi của mẹ(http://www.camurrilamberto.it/genLamberto/MCC_NonInvasive_Prenatal_Diagnosis

_.pdf ) Các đặc trưng chính của hồng cầu nhân: Xuất hiện sớm trong máu ngoại vi, mang

bộ gen hoàn chỉnh của phôi thai, mang kháng nguyên bề mặt đặc hiệu, thời gian tồn tại ở máu ngoại vi có giới hạn

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu máu ngoại vi của những phụ nữ mang thai từ 6 tuần tuổi đến 22 tuần tuổi thai

số lượng mẫu 279 mẫu và 5 mẫu máu ngoại vi của những phụ nữ mang thai mắc các hội chứngtrisomy 13, 18, 21, Klinefelter (XXY tại Bệnh Viện Từ Dũ, và 34 mẫu máu ngoại vi của các phụ nữ có nguy cơ sinh con dị tật được chọc ối và chẩn đoán tại Trung tâm nghiên cứu Sinh Y Dược học – HVQY Thể tích mẫu máu ngoại vi cần lấy từ 5 ml từ các phụ nữ mang thai tuần 14-22 tuần

Mẫu chứng: Các phụ nữ chưa mang thai và chưa quan hệ tình dục bao giờ lấy 02 mẫu máu ngoại vi Mẫu máu ngoại vi của phụ nữ mang thai có nguy cơ sinh con bị

TSTTBS là 11 mẫu, Teo cơ Duchenne là 10 mẫu máu ngoại và 13 mẫu máu ngoại vi của những phụ nữ có nhóm máu Rh(-) đang mang thai để chẩn đoán nhóm máu Rh củacon

 Hoá chất và thiết bị máy móc

 Hoá chất tách chiết ADN

 Hoá chất cho PCR

 Hoá chất dùng cho điện di

Agarose, Đệm TBE 1, buffer GA 1X, Polymer POP4, HiDi formamid, Gene Scan GS500

 Phương pháp tách ADN phôi thai tự do và phương pháp nhân gen PCR và

realtime-PCR

 Quy trình tách và phân lập tế bào phôi thai tự do, phương pháp nhuộm tế bào

bằng kỹ thuật FISH, phương pháp QF-PCR chứng minh sự tồn tại của tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ

 Kỹ thuật phân lập tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ

 Kỹ thuật cố định tế bào phôi thai và nhuộm tế bào phôi thai sau khi phân lập

 Tách chiết ADN từ phôi bào và khuếch đại bộ gen bằng bộ kit WGA REPLI-g

Single Cell Kit của Qiagene

 Kỹ thuật QF-PCR cho chẩn đoán bệnh nhiễm sắc thể bằng phương pháp

phân tích đoạn STRs

 Kỹ thuật điện di sản phẩm QF-PCR trên máy ABI 3130 XL

 Phương pháp phân tích kết quả sản phẩm định lượng huỳnh quang sau điện

di mao quản

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

 KẾT QUẢ QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ADN PHÔI THAI TỰ DO TRONG MÁU

NGOẠI VI CỦA MẸ

 Kết quả tách chiết ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ

Mẫu huyết tương này sẽ được tách ADN phôi thai tự do bằng nhiều phương pháp, phương pháp ban đầu chúng tôi tách là dùng 200µl dung dịch huyết tương sau đó biến tính

ở nhiệt độ 99oC trong 5 phút, dung dịch sau biến tính sẽ được ly tâm tốc độ cao 13.000 vòng/phút trong 2 phút và thu dung dịch trong phía trên vào ống 1,5ml mới khác Phương pháp thứ 2 chúng tôi tách là sử dụng bộ kít của Qiagene có cải tiến với các bước được nêu chi tiết trong phần phương pháp nghiên cứu Sau khi tách xong và đo nồng độ của ADN phôi thai tự do tách chiết được như sau:

Bảng 3.1 Bảng kết quả đo nồng độ ADN của phương pháp tách bằng nhiệt và phương pháp tách bằng bộ Kít Qiagene (Chi tiết ở Phụ luc bảng 3.1)

Tuổi

mẹ

Bằng nhiệt độ Kít Qiagene Nồng độ ADN

(ng/ul)

Độ tinh sạch

Nồng độ ADN (ng/ul)

Độ tinh sạch

Trong phương pháp tách ADN tự do bằng kỹ thuật biến tính ở nhiệt độ 99o

C trong

5 phút cho thấy nồng độ trung bình của phương pháp này khá thấp 0,81±0,18 ng/µl và độ tinh sạch 0,97±0,20 Kết quả tách chiết bằng bộ kít Qiagene nồng độ cao hơn 3,95±0,53 ng/µl và độ tinh sạch 1,81±0,31 Trong quá trình tách chiết ADN tự do bằng bộ kít Qiagene chúng tôi có cải tiến sử dụng 400ul huyết tương, việc tăng lượng mẫu để tách ADN phôi thai tự do cũng đã được Lo và cộng sự đề cập tới năm 1998 khi ông sử dụng từ 400ul đến 700ul mẫu để tách ADN

 Kết quả chạy PCR nhân gen SRY

Các mẫu ADN sau khi tách xong ở trên sẽ được nhân gen bằng kỹ thuật Nested

PCR (PCR lồng) cho gen SRY và nhân gen PCR thường cho gen GAPDH

Hình 3.1 Hình ảnh kết quả điện di của gen SRY với gen GAPDH của các mẫu nghiên

cứu từ 811 đến 825

M: Marker 100bp- Thang ADN với band nhỏ nhất là 100bp; Các giếng từ 811 đến 825 là các mẫu nghiên cứu Phía trên là các mẫu nhân gen SRY kích thước sản phẩm 198bp Phía

dưới là các mẫu nhân gen GAPDH với kích thước sản phẩm PCR là 97bp

Nhận xét: Các mẫu từ 811 đến mẫu số 825 chúng tôi thấy đều xuất hiện băng của gen GAPDH (nửa điện di phía dưới) điều này cho thấy các mẫu này chúng tôi đều tách được ADN Từ các hình trên cho chúng ta thấy các băng điện di xuất hiện khá rõ nét và gọn, kích thước sản phẩm PCR phù hợp với tính toán lý thuyết Trong hình ảnh kết quả điện di các mẫu nghiên cứu của gen SRY có một số mẫu không xuất hiện băng vạch của 198bp và các mẫu xuất hiện băng vạch 198bp Các mẫu này được nhân gen GAPDH ở hình trên cho chúng ta thấy tất cả các mẫu nghiên cứu này đều xuất hiện băng vạch của gen GAPDH 97bp điều đó chứng tỏ các mẫu nghiên cứu này đều tách chiết được ADN Từ kết quả này chúng tôi chứng minh được rằng trong máu mẹ người mang thai có ADN phôi thai

tự do của con lưu hành trong đó

Kết quả này được kiểm chứng bằng kỹ thuật siêu âm ở tuần thứ 16 và sau sinh cho kết quả hoàn toàn phù hợp Dưới đây là kết quả của 30 trường hợp nghiên cứu ban đầu cho Nghiên cứu quy trình tách chiết ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ và chứng minh được sự tồn tại của ADN phôi thai tự do lưu hành trong máu ngoại vi của mẹ Theo nghiên cứu của Zolotukhina T.V., (2005), tách chiết ADN phôi thai trong huyết tương và huyết thanh mẹ xác định giới tính bằng nested PCR qua mồi SRY trên nhiễm sắc thể Y Nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy kết quả hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả trên thế giới

Với 30 mẫu máu ngoại vi của các phụ nữ mang thai với tuổi thai từ tuần thứ 7 đến tuần thứ 9 của thai kỳ, kết quả chúng tôi thấy xuất hiện 16/30 trường hợp dương tính với gen SRY và 14/30 trường hợp âm tính với gen SRY, 30 mẫu nghiên cứu này đều dương tính với gen GAPDH, do vậy chúng tôi nhận định rằng các mẫu nghiên cứu đều tách được ADN phôi thai tự do, các mẫu âm tính với gen SRY là âm tính thật Từ kết quả trên đây, chúng tôi cũng đã chứng minh được sự tồn tại của ADN phôi thai tự do lưu hành trong máu

mẹ Và các nhận định rằng quy trình tách chiết ADN phôi thai tự do lưu hành trong máu ngoại vi của mẹ có cải tiến bằng bộ kít Qiagene đạt kết quả tốt Kết quả này mở ra một hướng mới trong chẩn đoán trước sinh không

 Kết quả định lượng số bản copy của ADN phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ

Từ bảng này chúng tôi cũng thấy rằng nồng độ trung bình của ADN phôi thai tự

do trong máu ngoại vi của mẹ ở các tuần từ tuần thứ 6 đến tuần thứ 12 này có độ lệch chuẩn rất lớn, và lớn hơn cả giá trị trung bình điều này chứng tỏ nồng độ ADN phôi thai này dao động ở một khoảng rất lớn như ở tuần 6 của thai kỳ nồng độ trung bình của ADN

phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ là 50,69 ± 83,56 bản copy/ml, hay ở tuần thứ 12

là 206,63 ± 742,55 copy/ml

Bảng 3.6 Bảng kết quả số bản copy và nồng độ gen DYS14 và nồng độ gen GAPDH ở các tuần 6 đến 12 của thai kỳ (chi tiết xem phần phụ lục bảng 3.6)

Tỷ lệ gen DYS14/G APDH (%)

Số bản cop

y gen DY S14

Số bản copy gen GAP DH

Tỷ lệ gen DYS14/G APDH (%)

Số bản cop

y gen DY S14

Số bản copy gen GAP DH

Tỷ lệ gen DYS14/G APDH (%)

Số bản copy gen DYS 14

Số bản copy gen GAP DH

Tỷ lệ gen DYS14/G APDH (%)

Số bản copy gen DYS 14

Số bản copy gen GAP DH

Tỷ lệ gen DYS14/G APDH (%)

Số bản copy gen DYS 14

Số bản copy gen GAP DH

Tỷ lệ gen DYS14/G APDH (%)

Số bản cop

y gen DY S14

Số bản copy gen GAP DH

Tỷ lệ gen DYS14/G APDH (%)

1 269 332 6942 4,78

129

1 9692 13,32

297 0

1130

0 2,77

345, 9