Khảo sát sự đa dạng di truyền của nhóm vi khuẩn tích lũy poly-phosphate trong chất thải chăn nuôi heo và cá tra ở vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long và ứng dụng trong xử lý nước ao cá tra.

Đề tài được thực hiện với mục tiêu khảo sát tính đa dạng di truyền nhóm vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-phosphate poly-P trong chất thải chăn nuôi heo đã qua xử lý biogas và ao nuôi t

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LÊ QUANG KHÔI MSHV: 62031101

KHẢO SÁT ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NHÓM

VI KHUẨN TÍCH LŨY POLY-PHOSPHATE TRONG CHẤT THẢI CHĂN NUÔI HEO VÀ CÁ TRA Ở VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ

ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƯỚC AO CÁ TRA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC

MÃ NGÀNH: 62 42 01 07

Năm 2015

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LÊ QUANG KHÔI MSHV: 62031101

KHẢO SÁT ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NHÓM

VI KHUẨN TÍCH LŨY POLY-PHOSPHATE TRONG CHẤT THẢI CHĂN NUÔI HEO VÀ CÁ TRA Ở VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ

ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƯỚC AO CÁ TRA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC

MÃ NGÀNH: 62 42 01 07

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS TS TRƯƠNG TRỌNG NGÔN

GS TS CAO NGỌC ĐIỆP

Năm 2015

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của Nghiên cứu sinh Lê Quang Khôi với sự hướng dẫn của PGS TS Trương Trọng Ngôn và GS.TS Cao Ngọc Điệp Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, chưa từng được công bố riêng lẻ bởi tác giả khác trong bất kỳ công trình nào trước đây./

Người hướng dẫn khoa học Tác giả luận án

GS TS CAO NGỌC ĐIỆP

LỜI CÁM ƠN

Với tất cả lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cám ơn PGS TS Trương Trọng Ngôn và GS TS Cao Ngọc Điệp đã tận tình hướng dẫn và giúp tôi hoàn thành luận án này Thầy là người truyền cho tôi lòng nhiệt huyết và thổi lên ngọn lửa đam mê khoa học, khơi dậy trong tôi sự nỗ lực, tự tin, cố gắng không ngừng và không nản lòng trước những khó khăn trong suốt tiến trình thực hiện luận án tiến sĩ Xin cám ơn Thầy đã dành nhiều thời gian, công sức và luôn giúp tôi có được định hướng đúng đắn trong học tập và nghiên cứu

Tiến trình hơn 3 năm thực hiện các thí nghiệm trong luận án, tôi đã luôn được sự quan tâm, hỗ trợ của Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học-trường Đại học Cần Thơ, quý Thầy Cô đã giúp tôi có thêm nhiều nghị lực để hoàn thành nội dung nghiên cứu

Xin cám ơn:

Cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh vật môi trường-Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học; phòng Thí nghiệm chuyên sâu-Trường Đại học Cần Thơ; phòng thí nghiệm Sinh học phân tử-Viện Công nghệ Sinh học-Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, phòng thí nghiệm Sinh học phân tử-Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học-Trường Đại học Cần Thơ; phòng Thí nghiệm trọng điểm-trường Đại học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ tôi thực hiện nội dung nghiên cứu

Anh chị Nghiên cứu sinh, học viên Cao học và các em Sinh viên đã đồng hành cùng tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu; đã chia sẽ những khó khăn và khuyến khích, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu Cuối cùng, xin được gởi lời biết ơn đến Sở Khoa học và Công nghệ, Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng và Dịch vụ Khoa học Công nghệ Tiền Giang

đã sắp xếp công việc và tạo điều kiện thuận lợi về thời gian để tôi hoàn thành

kế hoạch học tập toàn khóa trong chương trình đào tạo tiến sĩ Đặc biệt là đối với gia đình đã dành cho tôi tất cả tình yêu và sự khuyến khích, ủng hộ tôi trong chặng đường cam go để hoàn thành được luận án nghiên cứu này

Chân thành cám ơn./

TÓM TẮT

Vi khuẩn tích lũy poly-phosphate (poly-phosphate accumulating bacteria -PAB) là nhóm vi khuẩn có vai trò quan trọng trong xử lý nước thải bằng con đường sinh học Chúng tích lũy lượng lớn poly-phosphate nội bào, góp phần vào quá trình loại bỏ phốt-pho hòa tan trong nước

Đề tài được thực hiện với mục tiêu khảo sát tính đa dạng di truyền nhóm

vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-phosphate (poly-P) trong chất thải chăn nuôi heo đã qua xử lý biogas và ao nuôi thâm canh cá tra ở các tỉnh ĐBSCL bao gồm các khâu phân lập và tuyển chọn, phân tích tính đa dạng di truyền và ứng dụng vào trong xử lý phốt-pho hoà tan

Áp dụng phương pháp truyền thống và kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại để phân lập PAB Kết quả có 439 dòng vi khuẩn phân lập từ 196 mẫu chất thải, trong đó có 191 dòng phân lập từ 70 mẫu chất thải ao nuôi thâm canh cá tra và 248 dòng phân lập từ 126 mẫu chất thải chăn nuôi heo Qua tiến trình tuyển chọn và mô tả các đặc tính sinh học của các dòng vi khuẩn có tiềm năng tích lũy poly-phosphate, kết quả nghiên cứu đã tìm ra được 48 dòng vi khuẩn

có khả năng tích lũy hàm lượng poly-P nội bào cao với các đặc tính chủ yếu như: chúng có dạng hình que hoặc que ngắn; chuyển động, dao động tại chỗ hoặc không chuyển động; có sự hiện diện các hạt poly-P bắt màu đen khi quan sát tế bào dưới kính hiển vi điện tử truyền quét; gen tích lũy poly-phosphate hiện diện chủ yếu dưới dạng IIA và IIC; tiềm năng tích lũy poly-phosphate nội bào từ 10-9 đến 10-12 mg poly-phosphate/tế bào

Dựa trên trình tự gen 16S rRNA cho thấy PAB có sự đa dạng về thành phần loài; 22/191 dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải ao nuôi thâm canh cá tra nằm trong bốn lớp Bacilli, Actinobacteria, Beta-proteobacteria, Gamma-proteobacteria; 26/248 dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo nằm trong 4 lớp Bacilli, Actinobacteria, Gramma-proteobacteria, Alpha-

proteobacteria Các dòng vi khuẩn có quan hệ gần gũi với giống Bacillus

chiếm tỉ lệ cao (54%), nhưng dòng vi khuẩn có tiềm năng tích lũy poly-P cao

là Acinetobacter sp trong lớp Gamma-proteobacteria; Rhodococcus sp trong lớp Actinobacteria và Ochrobactrum sp trong lớp Alpha-proteobacteria

Qua phân tích và so sánh tính đa dạng di truyền của 48 dòng vi khuẩn cho thấy trình tự gen 16S rRNA có các vùng nucleotide biến thiên mạnh xen

kẽ với các vùng ít biến thiên, các vùng này tạo ra các đặc trưng về sự đa hình

và đa dạng trình tự nucleotide cho quần xã vi khuẩn tích lũy poly-P cao Số vị trí đa hình khác biệt trong quần xã là 82,02 với chỉ số đa hình trung bình θ=0,11 và có sự biến thiên từ 0,06 đến 0,17 Trung bình sự khác biệt

nucleotide k=116,6 với chỉ số đa dạng nucleotide trung bình Pi=0,16 và có sự biến thiên từ 0,07 đến 0,3 Sự biến thiên các chỉ số θ và Pi tạo nên các dạng haplotype khác nhau trong quần xã vi khuẩn tích lũy poly-P, có 25 haplotype (kiểu gen) được tạo ra từ 48 trình tự nucleotide Sự khác nhau về cấu trúc của các haplotype tạo nên sự đa dạng cao giữa chúng (Hd=0,91) Điều này làm xuất hiện nhiều kiểu gen có tính biến dị di truyền và khả năng thích nghi với môi trường sống trong quá trình tiến hóa của các dòng vi khuẩn có khả năng tích lũy hàm lượng poly-P cao So sánh sự đa dạng di truyền giữa hai quần xã

vi khuẩn phân lập ở hai địa điểm lấy mẫu, kết quả cho thấy tính đa dạng nucleotide, đa dạng haplotype của các dòng vi khuẩn phân lập trong chất thải chăn nuôi heo (Pi=0,16, h=14) thấp hơn và tính bảo tồn gen cao hơn các dòng

vi khuẩn phân lập trong chất thải ao nuôi cá tra (Pi=0,18, h=16) Đây là cơ sở khoa học trong việc lựa chọn nguồn mẫu để phân lập và tuyển chọn các dòng

vi khuẩn tích lũy poly-P

Thông qua quá trình tuyển chọn ban đầu từ tập hợp 20 dòng vi khuẩn phân lập được, 2 dòng TGT013L và TGT025L có khả năng làm giảm hàm lượng phosphate cao nhất trong nước thải tổng hợp từ 17,7 mg/L xuống còn 4,1 và 2,6 mg/L sau 25 giờ thí nghiệm, với hiệu suất loại bỏ phosphat tương ứng là 76,5% và 85,3% (ở pH khoảng 8,1; chỉ số OD.600 nm khoảng 0,6) Tổ hợp 2 dòng TGT013L+TGT025L cho hiệu quả loại bỏ phosphate hoà tan trong nước ao nuôi cá tra xuống còn 0,5 mg/L với hiệu suất xử lý đạt 85,1% sau 36 giờ cấy bổ sung vi khuẩn Kết quả chụp TEM và PCR cho thấy 2 dòng

vi khuẩn này có gen đồng hóa phosphate thành dạng hạt poly-phosphate nội

bào Chúng được xác định có mối quan hệ gần gũi với Acinetobacter

radioresistens (GU145275) và Kurthia sp (JQ398850), cùng tỉ lệ tương đồng

với trình tự gen 16S rRNA trên Genbank, 99% Hai dòng vi khuẩn này có nhiều tiềm năng để xử lý phốt-pho hòa tan trong mô hình nuôi cá tra công nghiệp có ứng dụng công nghệ vi sinh

Từ khóa: Acinetobacter, Kurthia, chỉ số θ, chỉ số Pi, poly-phosphate, vi khuẩn tích lũy poly-phosphate

SUMMARY

Poly-phosphate accumulating bacteria (PAB) is an important bacterial group that can take up large amounts of phosphate and accumulate as intracellular poly-phosphate, contributing to biological phosphorus removal in waste-water treatment

The thesis was conducted to survey a genetic diversity of PAB community isolated from samples of water and sludge of intensive catfish ponds and effluent water and sludge obtained from piggery waste-water treated bio-digesters in the Mekong Delta, Vietnam included isolation and selection, analysis of genetic diversity and application of PAB isolated to treat soluble phosphorus

PAB were isolated by using plating techniques and molecular biology techniques In a total of 439 isolates, there are 191 strains isolated from 70 water and sludge samples of intensive catfish ponds and 284 strains isolated from 126 samples obtained from piggery waste-water treated bio-digesters Throughout the process of selection and description of biological characteristics of 48 isolates that have the potential of accumulating intracellular poly-phosphate shown main characters included shaped like a rods or short rod-shaped; motile, twitching movements or non-motile; expression of poly-phosphate electron dense granules within the cells under TEM examination; accumulated poly-phosphate from poly-phosphate kinase gene 1 type-IIA and IIC that synthesizes intracellular poly-phosphate granules; the content of intracellular poly-phosphate varied from 10-9 to 10-12 mg/cell Based on the partial 16S rRNA genes of these isolates were sequenced and compared with bacterial 16S rRNA genes in Genbank show that PAB have a diversity of the composition of species, 22 strains isolated from intensive catfish ponds included in four classes: Bacilli, Actinobacteria, Beta-proteobacteria, Gamma-proteobacteria; and 26 strains isolated from piggery waste-water treated bio-digesters included in four classes: Bacilli, Actinobacteria, Alpha-proteobacteria, Gamma-proteobacteria The strains

which related to Bacillus were dominant bacteria group constituted up to 54%

of all identified isolates, but high potential strains of accumulating

poly-phosphate are Acinetobacter sp within class Gamma-proteobacteria;

Rhodococcus sp within class Actinobacteria; Ochrobactrum sp within class

Alpha-proteobacteria

The process of analysis and comparison of genetic diversity of 48 isolates showed 16S rRNA sequences have nucleotide regions of high variability

interspersed with nucleotide regions of low variability These areas generate characteristics included nucleotide polymorphisms and diversity among 16S rRNA sequences of high poly-phosphate accumulating bacteria Measurement

of the amount of DNA polymorphisms revealed the number of polymorphic sites among DNA sequences was 82.02 with the mean of the number of polymorphic sites was θ=0.11 and the variance of θ ranged from 0.06 to 0.17 Average number of nucleotide differences was k=116.6 with the mean of nucleotide diversity was Pi=0.16 and the variance of Pi ranged from 0.07 to 0.3 The variation of θ and Pi index formed the different types of haplotype in population of PAB There were 25 haplotypes (genotypes) from 48 sequences The difference of the structure of haplotypes formed a high diversity between them (Hd=0.91) The levels of haplotype diversity created many genotypes for the genetic variation and the ability to adapt to the environment in the evolutionary process of bacterial strains capable of high accumulating poly-P Comparison of genetic diversity between populations of bacteria isolated from two sampling places, the results showed that the nucleotide and haplotype diversity of the strains isolated in piggery waste-water treated biodigesters (Pi=0.16, h=14) were lower and the genetic conservation was higher than isolated strains in intensive catfish ponds (Pi=0.18, h=16) This is scientific basis for the selection of the sample sources for the isolation and selection of poly-phosphate accumulating strains

Of the total 20 strains that were initial screen-test, 2 strains as TGT013L and TGT025L were capable of reducing phosphate in the synthesis medium from 17.7 to 4.1 and 2.6 mg PO43-/L respectively after 25 hours of experiment with the efficiency phosphate removal of 76.6 and 85.3% respectively at pH

8.1 and OD.600 nm 0.6 approximately The Acinetobacter radioresistens TGT013L and Kurthia sp TGT025L consortium have the removal efficiecy of

soluble phosphorous in catfish ponds reached 85.1% after 36 hours cultured Association of TEM and PCR confirmed that two isolates have poly-phosphate kinase gene 1 type-IIA that synthesizes intracellular poly-phosphate

granules These strains were related to sequences of Acinetobacter

radioresistens (99% identity) and Kurthia sp (99% identity) Two isolates,

from this study, have application potential to reduce soluble phosphorus from intensive catfish ponds that applied microbial biotechnology

Keyword: Acinetobacter, Kurthia, θ index, Pi index, phosphate, phosphate accumulating bacteria

poly-MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CÁM ƠN ii

TÓM TẮT iii

SUMMARY v

MỤC LỤC vii

DANH SÁCH BẢNG xi

DANH SÁCH HÌNH xii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xv

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2

1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.2.2 Nội dung nghiên cứu 2

1.3 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 3

1.4 Cách tiếp cận và giả thuyết khoa học 3

1.5 Kết cấu của luận án 5

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

2.1 Các dạng phốt-pho tồn tại trong tự nhiên 6

2.2 Sự tích tụ P sinh học trong các lớp bùn trầm tích ở ao-hồ 7

2.3 Tình hình chăn nuôi heo, cá tra ở ĐBSCL 8

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về phân lập, tuyển chọn PAB 11 2.4.1 Ngoài nước 11

2.4.2 Trong nước 13

2.5 Thành phần quần xã vi khuẩn tích lũy poly-phosphate 14

2.5.1 Tình hình nghiên cứu thành phần quần xã PAB trong nước thải 14

2.5.2 Tình hình nghiên cứu thành phần quần xã PAB trong các ao hồ tự nhiên 15

2.6 Phương pháp định tính và định lượng hàm lượng poly-P nội bào 16

2.6.1 Định tính hạt poly-P nội bào 16

2.6.1.1 Kính hiển vi quang học huỳnh quang 16

2.6.1.2 Kính hiển vi điện tử kết hợp với phân tích năng lượng phân tán 17

2.6.2 Xác định hàm lượng poly-P nội bào 18

2.7 Cơ chế quá trình trao đổi chất của nhóm vi khuẩn PAB và sự điều hòa 21

2.7.1 Cơ chế quá trình trao đổi chất của vi khuẩn tích lũy poly-P 21

2.7.2 Quá trình tổng hợp và điều hòa sự tổng hợp poly-phosphate 23

2.7.2.1 Các enzyme tham gia tổng hợp poly-P 24

2.7.2.2 Các enzyme tham gia phân giải poly-P 24

2.7.2.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ giữa hàm lượng carbon và phosphate 25

2.7.2.4 Ảnh hưởng pH và Mg2+ trên quá trình đồng hóa và dị hóa 27

2.8 Cơ sở khoa học phân tích sự đa dạng di truyền ở vi khuẩn 28

2.8.1 Phân tích mối quan hệ di truyền dựa trên trình tự gen 16S rRNA 28

2.8.1.1 Gen rRNA trong phân tích mối quan hệ di truyền của vi khuẩn 28

2.8.1.2 16S Ribosomal RNAs 30

2.8.1.3 Phân tích mối quan hệ di truyền dựa trên gen 16S rRNA 30

2.8.2 Gen ppk1 trong phân tích mối quan hệ di truyền của PAB 32

2.8.3 Phân tích đa dạng di truyền 33

2.8.3.1 Đa dạng trình tự Nucleotide 33

2.8.3.2 Đa dạng loài 34

2.9 Các biện pháp loại bỏ phosphate hòa tan trong nước 35

2.9.1 Loại bỏ phốt-pho hòa tan bằng con đường hóa học 35

2.9.2 Loại bỏ phốt-pho hòa tan bằng con đường sinh học 37

2.9.2.1 Quá trình loại bỏ phosphate trong hệ thống xử l ý nước thải 38

2.9.2.2 Sự kết hợp loại bỏ phosphate bằng hóa học và sinh học 41

2.9.2.3 Sự giống nhau giữa poly-P trong bùn hoạt tính và bùn lắng tụ 42

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44

3.1 Phương tiện nghiên cứu 44

3.1.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 44

3.1.2.1 Thời gian nghiên cứu 44

3.1.2.2 Địa điểm nghiên cứu 44

3.1.3 Thiết bị, hóa chất 44

3.1.3.1 Thiết bị, dụng cụ 44

3.1.3.2 Hóa chất 45

3.2 Phương pháp nghiên cứu 47

3.2.1 Chuẩn bị mẫu 47

3.2.1.1 Đối với mẫu chất thải ao nuôi thâm canh cá tra 47

3.2.1.2 Đối với mẫu chất thải trại heo [sau hầm ủ biogas] 48

3.2.2 Phân lập vi khuẩn 49

3.2.3 Định tính hạt poly-P nội bào 50

2.2.4 Xác định hàm lượng poly-P nội bào 50

3.2.5 Nhận diện gen ppk1 51

3.2.6 Định danh PAB 52

3.2.7 Phân tích sự đa dạng vi khuẩn tích lũy poly-P 53

3.2.8 Thí nghiệm kiểm tra sơ bộ khả năng loại bỏ phosphate hòa tan 54

3.2.9 Thí nghiệm theo dõi sự biến đổi pH, OD.600nm 54

3.2.10 Thí nghiệm kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphate qui mô 10 lít 56

3.2.11 Thí nghiệm kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphate qui mô 500 lít 57

3.2.12 Đánh giá hiệu quả xử l ý của 2 dòng vi khuẩn PAB 58

3.2.13 Phương pháp xử lý số liệu 60

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 61

4.1 Phân lập và xác định đặc điểm hình thái của vi khuẩn phân lập 61

4.1.1 Kết quả phân lập 61

4.1.2 Đặc điểm các dòng vi khuẩn đã phân lập 64

4.1.3 Mô tả đặc tính sinh học của các dòng vi khuẩn PAB 66

4.1.4 Nhận diện gen ppk1 77

4.2 Định danh và phân tích tính đa dạng PAB 80

4.2.1 Định danh và phân tích sự phát sinh loài PAB trong ao nuôi cá tra 80 4.2.2 Định danh và phân tích sự phát sinh loài PAB chất thải chăn nuôi heo.83

4.2.3 Phân tích tính đa dạng di truyền của PAB 92

4.2.3.1 Phân tích tính đa dạng nucleotide 92

4.2.3.2 Phân tích tính đa dạng loài 103

4.3 Kết quả tuyển chọn các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P 104

4.3.1 Kết quả kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphate của 20 dòng vi khuẩn 104

4.3.2 Sự biến đổi chỉ số pH và hàm lượng PO43- theo thời gian 105

4.3.3 Sự biến đổi chỉ số OD.600 nm và hàm lượng PO43- theo thời gian 106

4.3.4 Kết quả loại bỏ phosphate trong nước ao nuôi cá tra 110

4.3.4.1 Sự biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian qui mô 10 lít 110

4.3.4.2 Sự biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian qui mô 500 lít 112

4.3.4.3 Đánh giá hiệu quả xử l ý PO43- vi khuẩn mô hình nuôi cá tra 113

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 120

5.1 Kết luận 120

5.2 Đề nghị 121

TÀI LIỆU THAM KHẢO 122

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 136

PHỤ LỤC 1: ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN PHÂN LẬP 137

Bảng PL1.1: Chỉ số pH và mật số vi khuẩn dị dưỡng của 196 mẫu 137

Bảng PL1.2: Hình dạng 439 dòng vi khuẩn và hàm lượng poly-P nội bào 147

PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S RNA 156

PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ CHỈ SỐ ĐA DẠNG 159

PL3.1: Phân tích sự đa dạng nucleotide giữa 48 dòng 159

PL3.2: Phân tích sự đa dạng nucleotide giữa 22 dòng 159

PL3.3: Phân tích sự đa dạng nucleotide giữa 26 dòng 160

PHỤ LỤC 4: BẢNG THỐNG KÊ SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM 161

PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ANOVA 163

PL5.1: Kết quả phân tích AGH006L, BTT006L, TGT013L, TGT025L 163

PL5.2: Kết quả phân tích TGT025, DC, TGT013, TGT013L+TGT025L 167

PL5.3: Kết quả phân tích TGT025, DC, TGT013, TGT013L+TGT025L 168

DANH SÁCH BẢNG

2.1: Các chất sử dụng và điều kiện ly trích poly-P (Eixler et al., 2005) 20

2.2: Cặp mồi đặc hiệu nhận diện gen ppk1 (He et al., 2007) 25

2.3: Thành phần của ribosome của tế bào nhân sơ và nhân thật 29

2.4: Hóa chất thường dùng để trầm hiện ortho-phosphate 36

2.5: Acid béo hòa tan được hình thành trong bể kỵ khí 40

2.6: Cấu trúc phân tử các đơn vị cấu tạo nên PHAs 40

3.1: Cặp mồi đặc hiệu nhận diện gen ppk1 (He et al., 2007) 47 3.2: Trình tự primer nhận diện 16S rDNA vi khuẩn PAB 47

4.1: Mật số vi khuẩn dị dưỡng (CFU/mL) 61

4.2: Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn 63

4.3: Tỷ lệ phần trăm về đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn 65

4.4: Tổng hợp kết quả kiểm tra hàm lượng poly-P nội bào 66

4.5: Đặc điểm sinh học PAB phân lập từ chất thải ao nuôi cá tra 67

4.6: Đặc điểm sinh học PAB phân lập trong chất thải chăn nuôi heo 70

4.7: Hàm lượng poly-P nội bào vi khuẩn phân lập từ ao nuôi cá tra 75

4.8: Hàm lượng poly-P nội bào vi khuẩn từ chất thải chăn nuôi heo 76

4.9: Kết quả định tên vi khuẩn phân lập trong nước ao nuôi cá tra 82

4.10: Kết quả định tên vi khuẩn phân lập trong chất thải chăn nuôi heo 85

4.11: Đa dạng nucleotide vùng gen 16S rRNA 48 dòng vi khuẩn 94

4.12: Đa dạng nucleotide vùng gen 16S rRNA 101

4.13: Chỉ số H ′ và J ′ của 2 quần xã vi khuẩn tích lũy poly-P 103

4.14: Hiệu suất loại bỏ phosphate của 20 dòng vi khuẩn 105

4.15: Tỉ lệ (%) giữa PO43-/TP và sự chênh lệch giữa hai nghiệm thức 118

4.16: Trọng lượng và tỉ lệ sống cá lúc thu hoạch ở hai nghiệm thức 118

DANH SÁCH HÌNH

2.1: Cấu trúc phân tử ortho-phosphate 6

2.2: Cấu trúc chuỗi pyro-phosphate (Ahlgren, 2006) 6

2.3: Ảnh chụp TEM hạt poly-P vi khuẩn Pseudomonas putida CA-3 7

2.4: Cấu trúc của phân tử ATP (adenosin triphosphate) 7

2.5: Ảnh chụp kính hiển vi điện tử truyền quét hạt poly-P và hạt PHAs 12 2.6: Tổng P được cấu thành từ các thành phần P khác nhau 19

2.7: Sự hiện diện các hạt poly-P 21

2.8: Hiệu quả trích poly-P bằng nước lạnh, nước nóng và NaOH 21

2.9: Các đặc điểm sinh hóa chính trong quá trình EBPR 22

2.10: Chuyển hoá acetate và glycogen thành PHB bởi PAB 22

2.11: Mối tương quan giữa tốc độ hấp thu phosphate và hàm lượng COD 26

2.12: Sơ đồ mô tả sự đồng vận chuyển MgHPO4/H+ 27

2.13: Ribosome của prokaryote và eukaryote 29

2.14: Ribosomal RNA operon của E.coli 29

2.15: Các ribosomal RNAs genes của eukaryotes 30

2.16: Giản đồ cho 16S rRNA nằm trên tiểu đơn vị nhỏ của ribosome 31

2.17: Biểu đồ các bước phân tích mối quan hệ di truyền 32

2.18: Chỉ số đa dạng Shannon (H ′ ) và chỉ số độ đồng đều (J ′) 34

2.19: Sơ đồ mô tả loại bỏ phốt-pho 35

2.20: Hệ thống tăng cường loại bỏ phốt-pho sinh học 39

2.21: Mô hình tóm tắt quá trình tích lũy poly-P sinh 42

3.1: Thu mẫu chất thải ao nuôi thâm canh cá tra (nước và bùn)……… 48

3.2: Mẫu bùn và nước ao cá tra 48

3.3: Thu mẫu chất thải chăn nuôi trại heo (sau biogas) 48

3.4: Mẫu chất thải trại heo sau biogas 49

3.5: Sơ đồ tóm tắt các bước phân lập vi khuẩn 49

3.6: Sơ đồ tóm tắt các bước trong quá trình ly trích poly-P 51

3.7: Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA 52

3.8: Bố trí các nghiệm thức 55

4.1: Mối tương quan pH chất thải chăn nuôi heo và mật số dưỡng …….62

4.2: Mối tương quan pH chất thải ao nuôi nuôi cá tra và mật số 62

4.3: Hình dạng và kích thước các dòng vi khuẩn phân lập 68

4.4: Khuẩn lạc PAB phân lập trong chất thải ao nuôi cá tra 69

4.5: Khuẩn lạc PAB phân lập trong chất thải chăn nuôi heo 71

4.6: Hình dạng và cấu trúc bên trong PAB trong nước ao nuôi cá tra 73

4.7: Hình dạng và cấu trúc bên trong PAB trong chất thải nuôi heo 74

4.8: Phổ điện di (1) sản phẩm PCR của gen 16S rRNA 77

4.9: Phổ điện di (2) sản phẩm PCR của gen 16S rRNA 78

4.10: Phổ điện di (3) sản phẩm PCR của gen 16S rRNA 78

4.11: Phổ điện di (4) sản phẩm PCR của gen 16S rRNA 78

4.12: Phổ điện di (5) sản phẩm PCR của gen 16S rRNA, gen ppk1 79

4.13: Phổ điện di sản phẩm PCR của gen ppk1 trên gel agarose 1,2 % 79

4.14: Phổ điện di sản phẩm PCR của gen ppk1 trên gel agarose 1,2 % 80

4.15: Cây phả hệ dựa trên trình tự 16S rRNA của 22 dòng vi khuẩn 81

4.16: Cây phả hệ dựa trên trình tự 16S rRNA của 26 dòng vi khuẩn 84

4.17: Tỉ lệ các lớp vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra 87

4.18: Tỉ lệ các lớp vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo 87

4.19: Cây phả hệ dựa trên trình tự 16S rRNA của 48 dòng vi khuẩn 93

4.20: Sự biến thiên chỉ số Theta vùng nucleotide từ 100 đến 816 95

4.21: Đa hình đoạn trình tự gen từ vị trí 112 đến 236 96

4.22: Đa hình đoạn trình tự gen từ vị trí 277 đến 377 97

4.23: Sự biến thiên chỉ số Pi vùng nucleotide vị trí từ 100 đến 816 98

4.24: Sự phân bố các dạng haplotype 98

4.25: Sự đa hình nucleotide trên 25 haplotype của 48 dòng vi khuẩn 99

4.26: Dạng haplotype dòng vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P cao 100

4.27: Sự biến thiên chỉ số Theta trong vùng có vị trí từ 100 đến 866 101

4.28: Sự biến thiên chỉ số Theta trong vùng có vị trí từ 100 đến 829 101

4.29: Sự biến thiên chỉ số Pi trong vùng có vị trí từ 100 đế 866 102

4.30: Sự biến thiên chỉ số Pi trong vùng có vị trí từ 100 đến 866 102

4.31: Biến đổi pH theo thời gian của 5 dòng vi khuẩn 106

4.32: Phương trình tuyến tính giữa OD.600 nm và mật số vi khuẩn 107

4.33: Sự biến đổi hàm lượng PO43- và chỉ số OD.600 nm 108

4.34: Hiệu suất loại bỏ phosphate của 5 dòng vi khuẩn sau 25 giờ 109

4.35: Biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian 111

4.36: Hiệu suất loại bỏ phosphate của 2 dòng vi khuẩn 111

4.37: Biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian giữa 2 nghiệm thức 112

4.38: Sự biến đổi chỉ tiêu pH trong nước bể ao nuôi cá tra 114

4.39: Sự biến đổi hàm lượng PO43- trong nước bể ao nuôi cá tra 115

4.40: Sự biến đổi hàm lượng TP trong nước bể ao nuôi cá tra 117

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

31P-NMR: Phosphorus-31 nuclear magnetic resonance-cộng hưởng từ electron 31P ACCT: American Type Culture Collection – mã dòng vi khuẩn được phân lập

và tuyển chọn ở Hoa Kỳ

ACS: acetyl-CoA synthase

AGH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở An Giang AGT: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở An Giang BLH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Bạc Liêu BTT: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở Bến Tre

BTH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Bến Tre CMH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Cà Mau CTT: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở Cần Thơ

CTH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Cần Thơ DAP: 4‘, 6-Diamidino-2-phenylindole dehydrochloride

DPAB: Denitrifying poly-phosphate accumulating organisms-vi khuẩn tích lũy poly-P khử nitơ

DTT: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở Đồng Tháp DTH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Đồng Tháp ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long

EBPR: Enhanced biological phosphorus removal-Tăng cường sự loại bỏ pho bằng sinh học

phốt-EDX: Phân tích sự phân tán năng lượng tia X

EELS: Electron energy loss spectroscopy-quang phổ phân tán năng lượng điện tử GAOs: Glycogen accumulating organisms-vi khuẩn tích lũy glycogen

HAc: Hydroxy-Acetate

HGH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Hậu Giang HGT: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở Hậu Giang KGH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Kiên Giang KGT: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở Kiên Giang LAH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Long An

SCFAs: Short chain fatty acids-axid béo mạch ngắn

SEM: Scanning electron microscopy-Kính hiển vi điện tử quét

STT: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở Sóc Trăng STH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Sóc Trăng TEM: Transmission electron microscopy-kính hiển vi điện tử truyền quét TGH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở tTiền Giang TGT: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở Tiền Giang TP: Total phosphorous - tổng P

TVH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Trà Vinh TVT: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở Trà Vinh

VFAs: Volatile fatty acids-acid béo dễ bay hơi

VLH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Vĩnh Long

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Ngành nuôi trồng thủy sản, chăn nuôi gia súc ở ĐBSCL đã và đang phát triển theo hướng chăn nuôi tập trung và kết quả của xu thế đổi mới là làm tăng cường hiệu quả sản xuất trên một đơn vị lao động và đất đai Bên cạnh sự phát triển đó là những nguy cơ ảnh hưởng mạnh mẽ đến môi trường sống Các nguồn gây ô nhiễm nước chủ yếu là thức ăn tồn đọng, chất thải bài tiết của cá

và heo… Thành phần các chất gây ô nhiễm chủ yếu là protein, lipid, acid béo, phospholipid, carbohydrate, hàm lượng nitơ, chất khoáng… (Lê Văn Cát, 2007) Thông qua quá trình phân hủy của vi sinh vật và các tiến trình phân hủy

tự nhiên, lượng thức ăn dư thừa và chất thải sẽ chuyển thành các dạng nitơ (N) và phốt-pho (P) vô cơ Hàm lượng N và P vô cơ cao trong môi trường nước sẽ kích thích mạnh mẽ khả năng tăng sinh khối của thủy sinh vật như tảo

và vi khuẩn lam là nhân tố chủ yếu gây ra hiện tượng phú dưỡng hóa và tiến trình phân hủy tảo sẽ làm cho môi trường nước ao bị ô nhiễm, thiếu oxy cung cấp cho hoạt động hô hấp của cá, cá sẽ suy yếu và dễ nhiễm bệnh

Để xử l ý phốt-pho hòa tan, một số biện pháp được sử dụng là xử lý bằng hóa học và sinh học Trong biện pháp xử lý bằng sinh học, nhóm vi khuẩn có khả năng hấp thu và tồn trữ P như nguồn phốt-pho nội bào giữ vai trò quan trọng và chúng được xem như là vi khuẩn tích lũy poly-phosphate Loại bỏ phốt-pho hoà tan dạng PO43- thông qua hoạt động vi khuẩn ngày càng được ứng dụng bởi vì các đặc tính hữu dụng của chúng là dễ ứng dụng, hiệu quả về

mặt kinh tế và thân thiện với môi trường sống (Mino et al., 1998)

Các nghiên cứu trên thế giới về thành phần quần xã vi khuẩn tích lũy poly-phosphate bằng cách sử dụng các phương pháp mô tả truyền thống và kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại cho thấy quần xã vi khuẩn tích lũy poly-phosphate có sự đa dạng về thành phần loài kể cả trong các hệ thống xử lý nước thải và trong các ao-hồ tự nhiên Sự hiện diện của các loài và thành phần phần trăm của chúng trong môi trường cũng có sự khác nhau giữa 2 hệ sinh thái: nhân tạo (hệ thống xử lý nước thải) và tự nhiên (ao-hồ) Tuy nhiên, chúng chủ yếu thuộc các lớp Bacilli, Alpha-proteobacteria, Beta-proteobacteria,

Gamma-proteobacteria và Actinobacteria (Crocetti et al., 2000; Ahn et al., 2007; Bond et al., 1995, Beer et al., 2006; Szabó et al., 2011) Việc phân lập,

định danh vi khuẩn tích lũy poly-P bằng kỹ thuật sinh học phân tử có vai trò quan trọng không chỉ để ứng dụng chúng trong quá trình xử lý phốt-pho hòa tan mà còn hỗ trợ trong việc đánh giá sự phân bố và tính di truyền quần thể của chúng

Hiện nay chưa có nghiên cứu về thành phần quần xã vi khuẩn tích lũy poly-phosphate trong nước và bùn của ao nuôi thâm canh cá tra (sau đây gọi là chất thải ao nuôi cá tra) và chất thải chăn nuôi heo đã qua xử lý biogas (sau

đây gọi là chất thải chăn nuôi heo) ở ĐBSCL Tuy nhiên, Phan et al., (2009)

nghiên cứu sự tích lũy các thành phần dinh dưỡng trong ao nuôi cá tra ở ĐBSCL cho thấy khoảng 51% P được tích lũy trong bùn đáy Điều này cho thấy có sự đóng góp của vi sinh vật trong quá trình tích tụ P hòa tan Chúng hấp thu PO43- hòa tan trong nước và tích lũy chúng trong sinh khối trước khi lắng tụ xuống đáy ao Chính vì vậy việc phân lập, tuyển chọn vi khuẩn tích lũy poly-P có hiệu suất loại bỏ phosphate cao sẽ tạo nên cơ sở dữ liệu cho đánh giá tính đa dạng sinh học của PAB (Poly-phosphate accumulating bacteria-vi khuẩn tích lũy poly-P); là một nghiên cứu cần thiết nhằm đưa các giải pháp khai thác và sử dụng bền vững nguồn vi khuẩn tích lũy poly-phosphate bản địa, có lợi trong tự nhiên để ứng dụng vào trong xử lý P hòa tan dư thừa trong nước

1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá sự đa dạng sinh học của nhóm vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P với hàm lượng cao được phân lập từ chất thải chăn nuôi heo và cá tra ở các tỉnh ĐBSCL để tìm hiểu sự phân bố và tính di truyền quần thể của chúng Tìm ra nguồn vi khuẩn có khả năng loại bỏ phosphate cao làm cơ sở cho việc sản xuất chế phẩm sinh học xử lý phốt-pho hòa tan

Ứng dụng các dòng vi khuẩn phân lập được để xử lý phốt-pho hòa tan trong nước ao cá tra ở qui mô phòng thí nghiệm

1.2.2 Nội dung nghiên cứu

Phân lập vi khuẩn tích lũy poly-P từ các nguồn thải của trại chăn nuôi heo và ao cá tra của 13 tỉnh ĐBSCL từ đó tuyển chọn các dòng có hiệu quả tích lũy poly-P cao

Xây dựng cây phả hệ các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P được phân lập dựa trên trình tự gen 16S rRNA từ đó phân tích sự đa dạng di truyền dựa trên các chỉ số đa dạng sinh học

Đánh giá khả năng xử lý phốt-pho hòa tan trong nước ao cá tra của các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P phân lập được thông qua qui mô thử nghiệm chế phẩm này (ở phòng thí nghiệm với qui mô là 500 lít)

1.3 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

Luận án nghiên cứu có tính hệ thống về vi khuẩn tích lũy poly-P hiện diện trong chất thải chăn nuôi heo và ao nuôi cá tra, bao gồm các khâu phân lập, tuyển chọn, đánh giá tính đa dạng sinh học và ứng dụng vào trong xử lý phốt-pho hòa tan trong nước ao cá tra Trên cơ sở kết quả nghiên cứu, các dòng vi khuẩn phân lập được xem như là các đại diện của PAB trong chất thải chăn nuôi heo và ao nuôi cá tra ở các tỉnh ĐBSCL

Quá trình phân lập dựa vào cơ chế trao đổi chất đặc biệt trong quá trình tăng trưởng và phát triển của vi khuẩn tích lũy poly-P, cho phép điều chỉnh thành phần carbon giữa hai môi trường phân lập và cấy chuyền để sàng lọc và tuyển chọn ban đầu nguồn vi khuẩn mong muốn, là phương pháp mới để phân lập vi khuẩn tích lũy poly-P Sự kết hợp các phương pháp khác nhau như vừa định tính vừa định lượng poly-P nội bào và nhận diện gen poly-phosphate kinase bằng các cặp mồi đặc hiệu, là phương pháp tin cậy để tuyển chọn nguồn vi khuẩn tích lũy poly-P Thông qua phương pháp này, đã phân lập và tuyển chọn được 48/439 dòng vi khuẩn phân lập có khả năng tích lũy poly-P cao làm cơ sở cho việc đánh giá tính đa dạng di truyền và chọn lọc các dòng vi khuẩn có hiệu suất loại bỏ phốt-pho hoà tan cao để ứng dụng xử lý phosphate trong nước ao cá tra

Ứng dụng các kỹ thuật sinh học sinh tử hiện đại (thực hiện trên trình tự

gen 16S rRNA và gen ppk1), kết hợp phương pháp truyền thống trong định

danh vi khuẩn cho thấy 48 loài vi khuẩn tích lũy poly-P được phân lập thể hiện sự phong phú và sự đa dạng tương đối cao thuộc 5 lớp Bacilli, Actinobacteria, Alpha-protepbacteria, Beta-proteobacteria và Gamma-proteobacteria Kết quả chụp TEM và PCR cho thấy rằng các dòng vi khuẩn này có gen đồng hóa phosphate thành dạng hạt poly-phosphate nội bào

Đề tài đã tuyển chọn được các dòng vi khuẩn có hiệu suất loại bỏ

phốt-pho hòa tan cao Đặc biệt là hai 2 dòng vi khuẩn Acinetobacter radioresistens TGT013L và Kurthia sp TGT025L cho hiệu suất loại bỏ PO43- đạt 85,1% trong nước ao nuôi cá tra sau 36 giờ thí nghiệm Kết quả nghiên cứu mang lại nhiều triển vọng trong thực tiễn ứng dụng 2 dòng vi khuẩn tích lũy poly-P này

để xử lý phốt-pho hòa tan trong mô hình nuôi cá tra công nghiệp có ứng dụng công nghệ vi sinh

1.4 Cách tiếp cận và giả thuyết khoa học

Quá trình phân lập vi khuẩn tích lũy poly-P được dựa trên các quy trình

phân lập của Fuhs và Chen (1975); Sidat et al., (1999); Nakamura et al.,

(1991) và đặc tính sinh học đặc biệt là vi khuẩn tích lũy poly-P có khả năng

hấp thu các acid béo mạch ngắn (short chain fatty acids-SCFAs) như acetate

và đồng hóa chúng thành poly-hydroxyalkanoates (PHAs) PHAs được xem như là nguồn carbon nội bào cần thiết cho tế bào vi sinh vật sống sót trong

điều kiện môi trường nghèo dinh dưỡng (Mino et al., 1998) Chính vì vậy, các

khuẩn lạc có hình thái khác nhau trên môi trường phân lập (có nguồn carbon)

sẽ được chọn và cấy chuyển sang môi trường thiếu nguồn carbon (môi trường cấy chuyền), chỉ có những vi khuẩn có đặc tính trên mới có thể tăng trưởng và phát triển được Thao tác trên được lặp đi lặp lại và luân phiên giữa hai môi trường phân lập và cấy chuyền cho đến khi chọn được dòng vi khuẩn thuần

Vi khuẩn tích lũy poly-P là vi khuẩn có khả năng hấp thu lượng lớn phosphate ngoại bào và đồng hóa thành poly-P nội bào Do đó, để chứng minh nguồn vi khuẩn phân lập thuộc nhóm vi khuẩn tích lũy poly-P và đồng thời xác định được khả năng hoạt động của chúng, cần phải kiểm tra hàm lượng poly-P nội bào Hiện nay chưa tìm thấy phương pháp xác định trực tiếp hàm lượng poly-P nội bào Trong Luận án, việc kiểm tra các đặc tính sinh hoá của các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P phân lập thông qua việc áp dụng các phương pháp có sự kết hợp giữa định tính và định lượng như: định tính hạt poly-P bằng phương pháp chụp tế bào dưới kính hiển vi điện tử truyền quét

thông qua xử l ý sinh khối theo Boswell et al., (2001) Định hàm lượng poly-P nội bào thông qua phương pháp ly tích của Eixler et al., (2005)

Các phương pháp và kỹ thuật sinh học phân tử áp dụng trong luận án là phù hợp với các tài liệu nghiên cứu về vi khuẩn tích lũy poly-P như ly trích

DNA thực hiện theo Carr et al., (2001) Cặp mồi 27F và 1492R (Lane et al.,

1991) được sử dụng khuếch đại gen 16S rRNA Phản ứng PCR thực hiện theo

Ivanov et al., (2005) Nhận diện gen ppk1 theo He et al., (2007)

Định danh PAB phân lập dựa trên mức độ tương đồng của gen 16S rRNA trên cây phả hệ Cây phả hệ được xây dựng dựa trên sự khoảng cách

tiến hóa bằng phần mềm phân tích MEGA.5 (Tamura et al., 2011) Phân loại

và xếp lớp vi khuẩn dựa trên Bergey’s Manual of determinative Bacteriology, 2nd edition (New York: Springer) (Garrity, 2005)

Phân tích tính đa hình nucleotide bằng chương trình DNASP 5.10 (Rozas

et al., 2003) kết hợp với phần mềm BioEdit (Hall, 1999) để định lượng các chỉ

số đa hình và đa dạng nucleotide như chỉ số Theta (θ) (Hall, 1999), chỉ số Pi (Tajima, 1993), haplotype và sự đa dạng gen Đánh giá mức độ đa dạng loài của các dòng vi khuẩn phân lập và tuyển chọn dựa trên phân tích định lượng

các chỉ số đa dạng sinh học [biodiversity measurement: chỉ số đa dạng loài H ′

-Shannon-Weiner’s index; chỉ số đồng đều J ′-Shannon Evenness index

(Richard, 2005)] Phân tích các chỉ số đa dạng di truyền để thấy tính đa hình nucleotide (θ) và sự đa dạng nucleotide (Pi) vùng gen 16S rRNA của nhóm vi khuẩn tích lũy poly-P và tìm sự khác nhau giữa hai quần xã vi khuẩn tích lũy poly-phosphate phân lập được trong chất thải ao nuôi cá tra và chăn nuôi heo

Sự biến thiên các chỉ số θ và Pi tạo nên các dạng haplotype khác nhau Sự khác nhau về cấu trúc của các haplotype tạo nên sự đa dạng gen giữa chúng Điều này làm xuất hiện nhiều kiểu gen có tính biến dị di truyền và khả năng thích nghi với môi trường sống trong quá trình tiến hóa của các dòng vi khuẩn

có khả năng tích lũy poly-P Đây là cơ sở khoa học trong việc lựa chọn nguồn mẫu để phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P có khả năng thích nghi cao với môi trường

Quá trình tuyển chọn vi khuẩn tích lũy poly-P có khả năng loại bỏ pho hòa tan cao trong nước ao cá tra được thực hiện qua nhiều công đoạn với cách bố trí thí nghiệm phù hợp, mang tính khoa học cao Số liệu được thu thập, xử lý và so sánh bằng các phương pháp phân tích và phần mềm thống kê đáng tin cậy (phân tích ANOVA với phép thử Turkey để tìm ra sự khác biệt trị

phốt-số trung bình giữa các nghiệm thức bằng phần mềm phân tích thống kê Minitab 16)

1.5 Kết cấu của luận án

Luận án có 3 phần: Phần đầu (16 trang được đánh số từ i đến xvi) Phần chính luận án gồm 5 chương: Chương 1: Giới thiệu (5 trang với 5 tiểu mục, được đánh số từ 1 đến 5); Chương 2: Tổng quan tài liệu (38 trang với 9 tiểu mục được đánh số từ 6 đến 43); Chương 3: Phương tiện và phương pháp nghiên cứu (17 trang với gồm 2 tiểu mục và 6 thí nghiệm ứng dụng, được đánh số từ 44 đến 60); Chương 4: Kết quả và thảo luận (59 trang với 3 tiểu mục được đánh giá số từ 61 đến 119); Chương 5: Kết luận và đề nghị (2 trang với 2 tiểu mục được đánh số từ 120 đến 121) Phần cuối [72 trang bao gồm các phần, tài liệu tham khảo (14 trang), danh mục các công trình đã công bố (01 trang), phụ lục (57 trang)] Số bảng và hình trong luận án gồm 24 bảng và

69 hình Bài viết sử dụng 158 tài liệu tham khảo, bao gồm 141 tài liệu tiếng Anh, 17 tài liệu tiếng Việt

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Các dạng phốt-pho tồn tại trong tự nhiên

Phốt-pho tồn tại trong môi trường ở 3 dạng chính: P dạng hữu cơ (P liên kết trong các hợp chất hữu cơ), ortho-phosphate (PO43-) và poly-phosphate Hầu hết P hữu cơ và poly-phosphate có thể chuyển hóa thành PO43- thông qua quá trình phân hủy bởi các vi sinh vật (Ahlgren, 2006)

Thể vô cơ bao gồm 2 dạng: ortho-phosphate (Hình 2.1a) và phosphate (Hình 2.1b) Ortho-phosphate là thể hòa tan thích hợp cho sinh vật hấp thu dễ dàng, gồm có các dạng PO43-, HPO42-, H2PO4- và H3PO4

Hình 2.1: Cấu trúc phân tử: (a) ortho-phosphate, (b) poly-phosphate (Ahlgren, 2006)

Thể ortho-phosphate thường gặp nhất trong nước là HPO42- và H2PO4-,

số lượng của mỗi loại tùy vào pH của môi trường Trong hầu hết các hệ thống

xử lý nước thải, HPO42-, H2PO4- là dạng nổi trội ở giá trị pH lớn hơn 7 (Ahlgren, 2006) Ortho-phosphate dễ dàng loại bỏ khỏi môi trường thông qua quá trình kết tủa bằng các muối kim loại AlPO4.2H2O, FePO4.H2O,

Ca5(PO4)3.OH

Poly-phosphate là thể phức tạp hơn, nó gồm 2 dạng poly-P hữu cơ và poly-P vô cơ Pyro-phosphate là chuỗi đầu tiên của poly-phosphate không phân nhánh [P2O73- (Hình 2.2)]

Hình 2.2: Cấu trúc chuỗi pyro-phosphate (Ahlgren, 2006)

Poly-phosphate dạng vô cơ là polymer đầu tiên được xác định bởi Wiame (1947) như là một trong những thành phần hạt quan trọng được tích lũy trong nội bào (Hình 2.3)

(a) (b)

Hình 2.3: Ảnh chụp TEM hạt poly-P màu đen trong vi khuẩn Pseudomonas putida

CA-3 (Tobin et al., 2007)

Poly-P là những phân tử mang điện âm mạnh và tạo phức với nhiều ion kim loại Phức hợp của poly-P với những kim loại như Ba2+, Pb2+, Mg2+ là những hợp chất kém hòa tan Điều này có thể gây kết tủa phức hợp poly-phosphate-kim loại trong tế bào như là những hạt nhỏ poly-P và bắt màu khi

nhuộm (Bonting et al., 1993) Ngày nay, poly-P được nhận biết như là

bio-polymer hiện diện hầu hết trong các sinh vật: vi khuẩn, nấm, thực vật và động vật (Dawes và Senior, 1973) Poly-P là chuỗi thẳng bao gồm gốc phosphate nối với nhau bằng cầu nối giàu năng lượng phospho-alhydride (Hình 2.4) và chiều dài từ 3 tới 1000 gốc phosphate (Kulaev, 1979)

Hình 2.4: Cấu trúc của phân tử ATP (adenosin triphosphate)

https://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem/MBWeb/mb1/part2/bioener.htm (ngày 25/12/2013)

Phốt-pho dạng hữu cơ là phần tử quan trọng cần thiết cho tất cả các tế bào sống Phốt-pho là thành cấu tạo nên các hợp chất quan trọng của sự sống như các phân tử di truyền DNA, RNA; các phân tử cấu trúc như protein, phospho-lipid; các phân tử dự trữ năng lượng cho tế bào như ATP (Hình 2.4), poly-phosphate… ATP là phân tử giàu năng lượng, được dùng để vận chuyển năng lượng trong tế bào Phospho-lipid là thành phần quan trọng trong cấu trúc của màng tế bào Acid teichoic, acid teichuronic là thành phần quan trọng trong cấu trúc vách tế bào vi khuẩn gram dương

2.2 Sự tích tụ P sinh học trong các lớp bùn trầm tích ở ao-hồ

Trương Quốc Phú và Trần Kim Tính (2012) xác định thành phần hóa học của bùn đáy ao nuôi cá tra, cho thấy tổng lượng P trung bình trong các ao nuôi

là 0,29% (dao động từ 0,06-0,62%), tổng lượng P có khuynh hướng tăng về

cuối vụ nuôi và cao nhất ở các ao có mức độ thâm canh cao Phan et al.,

(2009) quan sát sự tích lũy thành phần dinh dưỡng trong ao cho thấy rằng, khoảng 51% tổng lượng P hòa tan trong nước được tích lũy trong bùn đáy ao Tuy nhiên, trong các nghiên cứu này không đề cặp đến quá trình tích lũy P trong bùn đáy là do quá trình lắng tụ hóa học hay sinh học

Các nghiên cứu trên thế giới gần đây cho thấy sự tích tụ và giải phóng phốt-pho từ lớp bùn trầm tích là một quá trình phức tạp hơn so với các nghiên cứu của Mortimer (1941) Sự thay đổi pH và tiềm năng oxy hóa khử tạo ra bởi hoạt động của các vi sinh vật ảnh hưởng đến khả năng lắng tụ của P vô cơ (Gächter và Müller, 2003) Ngoài ra, vi khuẩn trong các lớp trầm tích sẽ tạo ra chất dinh dưỡng vô cơ thông qua quá trình phân hủy các chất hữu cơ (Boström

et al., 1988) Để mật số và hoạt động các vi sinh vật hiện diện trong các lớp

bùn bề mặt trầm tích cao (Uhlmann et al., 1990; Haglund et al., 2003) thì phần

lớn P phải được lưu trữ trong tế bào của vi sinh vật dưới dạng acid nucleic, phospho-lipid,phosphate đường và các hợp chất P hữu cơ khác Do đó, một số nghiên cứu cho rằng vi sinh vật trực tiếp tham gia vào việc trao đổi P giữa bùn lắng và môi trường nước xung quanh bằng cách thay đổi hàm lượng P trong tế

bào (Boström et al., 1988, Gächter và Meyer, 1993; Davelaar, 1993)

Các nghiên cứu (Gächter et al.,1988; Waara et al., 1993; Brumberg,

1995), các lý thuyết (Davelaar, 1993; Gächter và Meyer, 1993), và sự phát hiện các chuỗi poly-P trong các lớp bùn trầm tích (Hupeer et al., 2004;

Carmanet al., 2000) cho thấy vi sinh vật hiện diện trong các lớp bùn trầm tích

có liên quan đến quá trình dự trữ P tạm thờibằng cách tổng hợp poly-P nội bào Sự gia tăng đột ngột hàm lượng P hòa tan đã đượcgiải thích là do sự thủy phân chuỗi poly-P trong điều kiện thay đổi oxy hóa khử (Schulz vàSchulz, 2005) Do đó, sự khác biệt các phản ứng oxy hóa khử thông qua con đường sinh học và hóa học tác động lên quá trình tích tụ P cần được xem xét

2.3 Tình hình chăn nuôi heo, cá tra ở ĐBSCL và tác động chất thải chứa P đến chất lượng nước

Đối với nuôi trồng thủy sản, nghề nuôi cá tra ở các tỉnh ĐBSCL có đóng góp quan trọng cho nền kinh tế Theo số liệu của Cục Thống kê (2006) chỉ trong khoảng thời gian 2000-2005 diện tích nuôi trồng thủy sản vùng ĐBSCL

đã tăng gần gấp đôi từ 445.300 ha lên đến gần 700.000 ha Năm 2008, sản lượng cá tra ở ĐBSCL đã đạt hơn 1,1 triệu tấn Các sản phẩm cá tra của Việt Nam đã có mặt tại hơn 130 quốc gia trên thế giới, mang về cho đất nước hơn 1,4 tỉ USD Năm 2011, ĐBSCL thả nuôi cá tra 5.430 ha, đạt sản lượng gần 1,2

triệu tấn, chế biến-xuất khẩu hơn 600.000 tấn, thu về cho đất nước trên 1,8 tỷ USD, tăng 27% so với năm trước Mục tiêu năm 2012 vừa được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đưa ra là năm 2014, sản lượng cá tra sẽ đạt 1,2-

1,5 triệu tấn, kim ngạch xuất khẩu 1,85-2 tỷ USD

Đối với chăn nuôi gia súc, theo số liệu thống kê của Cục thống kê năm

2011, thì tổng đàn heo cả nước vào tháng 4 năm 2011 là 26,3 triệu con, đến tháng 9 năm 2011 tổng đàn heo ước đạt 27,2 triệu con tăng 3,3% so với thời điểm tháng 4/2011 Mặc dù số lượng này giảm so với năm 2010 (27,3 triệu con) do dịch bệnh, thời tiết, giá thức ăn cao vào cuối năm 2010 Tuy nhiên số lượng đàn heo nước ta vẫn khá cao trên thế giới, Việt Nam có tổng đàn heo đứng thứ tư thế giới (sau Trung Quốc, Hoa Kỳ và Brazil) Theo dự đoán của Tổng cục nông nghiệp thì số lượng đàn heo ở nước ta trong những năm tới với

xu hướng vẫn tiếp tục tăng do nhu cầu tiêu thụ của dân số ngày một tăng nhanh Trong đó ĐBSCL chiếm 3,8 triệu con trong năm 2010

Quá trình nuôi thủy sản sẽ dẫn đến sự tích tụ nhiều chất hữu cơ và đây là

nguyên nhân gây ô nhiễm cho các thủy vực Theo De Silva et al., (2010) tổng

(N) và phốt-pho (P) thải ra từ các ao nuôi cá tra khoảng 31,6 ngàn tấn N và 9,8 ngàn tấn P năm 2007 và 50,4 ngàn tấn N và 15,7 ngàn tấn P năm 2008 [tương đương với 46 kg N và 14,4 kg P/tấn cá (đối với thức ăn thương mại) và 46,8

kg N và 18,4 kg P/tấn cá (đối với thức ăn tự chế)] Đối với chất thải chăn nuôi heo, theo Lochr (1984) lượng phân thải ra hàng ngày bằng 6-8% khối lượng

cơ thể heo (trích dẫn theo Vũ Đình Tôn và ctv., 2008), như vậy thì tổng lượng

phân heo thải ra cả chục triệu tấn/ngày ở ĐBSCL Thành phần gây ô nhiễm trong các loại chất thải chăn nuôi là các chất hữu cơ, vô cơ và nhiều mầm bệnh; những chất thải này gây ô nhiễm đến môi trường sống xung quanh, nguồn nước, đất và ảnh hưởng đến kết quả chăn nuôi Có nhiều biện pháp xử

lý chất thải chăn nuôi heo; ở ĐBSCL chất thải chăn nuôi heo thường được xử

lý bằng hệ thống biogas Theo đánh giá của Viện khoa học và công nghệ Việt Nam, hàm lượng BOD, COD giảm gần 30 lần, lượng oxy tăng gần 10 lần so với đầu vào trước khi xử lý qua hệ thống biogas (Bùi Văn Dũng, 2007) Tuy nhiên, thực tế việc áp dụng hệ thống này vào xử lý chất thải còn nhiều hạn chế, nhiều hộ gia đình xây dựng hệ thống biogas sử dụng một thời gian thì bỏ, hay thể tích hầm biogas không xử lý hết lượng chất thải tạo ra từ chăn nuôi

Nghiên cứu của Lưu Hữu Mãnh và ctv., (2009) trên 5 phương pháp xử lý

khác nhau được áp dụng là túi biogas-ao cá (11,29%); hầm ủ biogas (4,84%); hầm lắng (11,29%); ao lục bình (46,47%) và chất thải đổ trực tiếp xuống sông rạch (25,81%) Mô hình xử lý có sự kết hợp túi biogas-ao cá và ao lục bình có

hiệu quả tốt cho việc xử lý chất thải chăn nuôi heo ở nông hộ, đáp ứng được tiêu chuẩn chất lượng chất thải hiện hành và có thể áp dụng được ở ĐBSCL

Châu Minh Khôi và ctv., (2012) đánh giá nguy cơ gây ô nhiễm môi

trường nước từ nước thải của các ao nuôi thâm canh cá tra cho thấy hàm lượng

N và P vô cơ hòa tan trong 9 mẫu nước lấy từ các ao nuôi cá tra thâm canh ở các địa phương khác nhau trong vùng ĐBSCL đều ở mức cao, biến động trong khoảng 0,5-11,6 ppm đối với N và 0,05-7,7 ppm đối với P So với các thành phần hữu cơ, thành phần N và P vô cơ chiếm tỷ lệ cao trong nước ao và đạt cao nhất vào giai đoạn cá 3-4 tháng tuổi Trong bùn đáy ao, hàm lượng N và P

dễ tiêu biến động cao phụ thuộc vào khả năng bơm thoát bùn đáy So với hàm lượng chất hữu cơ, N và P hiện diện trong đất phù sa trồng lúa, đa số các mẫu bùn đáy ao có hàm lượng các dưỡng chất này cao hơn nhiều lần

Lê Văn Cát (2007) cho rằng động vật thủy sản chỉ hấp thu được khoảng 25-40% lượng nitơ, 17-25% lượng phốt-pho trong thức ăn tổng hợp, phần dư thừa sẽ hòa tan và phân hủy trong môi trường nước Phần lớn lượng thức ăn

dư thừa, trong đó khoảng 16% lượng nitơ, 26-30% lượng phốt-pho tích lũy trong các lớp trầm tích đáy ao và khoảng 22% nitơ, 54-59% lượng phốt-pho được phát tán vào nước (Yomjinda, 1993) Các nghiên cứu của Boyd (1993) cho thấy cá tra chỉ hấp thu được 27-30% đạm (N), 16 - 30% lân (P) và khoảng 25% chất hữu cơ được cung cấp từ thức ăn Chính vì thế, việc thay nước ao là việc làm rất cần thiết trong quá trình nuôi cá tra Trong 2 tháng đầu của quá trình nuôi, việc thay nước thường được thực hiện hàng tuần; những tháng về sau, nhất là về gần cuối vụ nuôi thì việc thay nước được thực hiện 2 ngày/lần

(Phan et al., 2009) Tỉ lệ nước thay đổi từ 30-70% lượng nước thay mới

Thông qua quá trình phân hủy của vi sinh vật và các tiến trình phân hủy

tự nhiên, lượng thức ăn dư thừa và chất thải của sẽ chuyển thành các dạng N

vô cơ (ammonium, nitrate) và P vô cơ (phosphate) Hàm lượng N và P vô cơ cao trong môi trường nước sẽ kích thích sự phát triển quá mức của tảo (hiện tượng nở hoa của tảo) trong ao và tiến trình phân hủy tảo sẽ làm cho môi trường nước ao bị ô nhiễm, thiếu oxy cung cấp cho hoạt động hô hấp của thủy sinh vật Chính vì thế, phốt-pho được xem là nhân tố chủ yếu gây ra hiện tượng phú dưỡng hóa Trong một vài trường hợp, có sự xuất hiện của tảo độc

như Microsystis Sự quá dư thừa lượng dinh dưỡng trong nước làm gia tăng sự hoạt động các vi sinh vật có hại như Pfiesteria (Hasselgren et al., 2008) Điều

này sẽ tác động đến nền kinh tế thông qua ảnh hưởng của chúng đến nghề nuôi

cá thương mại, du lịch sinh thái và có thể ảnh hưởng đến sức khỏe con người

(Levin et al., 2002; Pretty et al., 2003) Chính vì vậy, nước thải chứa hàm

lượng phốt-pho hòa tan cao dạng phosphate là một những vấn đề nghiêm trọng

có liên quan trực tiếp đến ô nhiễm môi trường nước xung quanh mà còn tác động gián tiếp đến phát triển nền kinh tế trong khu vực

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về phân lập, tuyển chọn vi khuẩn tích lũy poly-P

2.4.1 Ngoài nước

Từ nghiên cứu phân lập đầu tiên của Fuhs và Chen (1975) cho thấy các

loài vi khuẩn thuộc giống Acinetobacter được xác định là vi khuẩn tích lũy

poly-phosphate Vào những năm 1980, một số nghiên cứu cũng cho rằng sự đa

dạng loài thuộc giống Acinetobacter trong bùn hoạt tính của các hệ thống xử

lý nước thải (Stephenson, 1987) Sau đó, Acinetobacter được xem là nhóm vi

khuẩn có vai trò chính trong quá trình là tăng cường sự loại bỏ phốt-pho (Carr

et al., 2001; Ohtake et al., 1985; Tandoi et al., 1998; Boswell et al., 2001;

Sidat et al., 1999) Các nghiên cứu về các kiểu trao đổi chất của PAB tập trung vào nhóm vi khuẩn này (Wentzel et al., 1986) Trong các loài thuộc giống

Acinetobacter, A Johnsonii cho thấy có khả năng tích lũy lượng lớn

poly-phosphate (poly-P) và được xem là loài vi khuẩn kiểu mẫu cho nghiên cứu về quá trình trao đổi năng lượng, các enzyme chuyển hóa poly-P và quá trình vận

chuyển các hoạt chất qua màng tế bào (van Veen et al., 1994)

Ubukata và Takii (1994) cũng phân lập dòng vi khuẩn tương tự và chứng minh rằng các vi khuẩn này chỉ thể hiện sự đồng hóa nguồn carbon (PHAs) và tích lũy poly-P vào trong tế bào khi có sự luân phiên quá trình kỵ khí-hiếu khí Tuy nhiên, chúng không phải là một trong các vi khuẩn nổi trội trong tiến trình EBPR (Enhanced Biological Phosphorus Removal-Tăng cường sự loại bỏ phốt-pho bằng sinh học) Gần đây, việc áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử

như FISH (Fluorescence in situ hydridization) (Wagner et al., 1994 ; Kampfer

et al., 1996 ; Liu, 1995) cho thấy có ít nhất ba nhóm vi khuẩn có vai trò quan

trọng trong quá trình EBPR với hình dạng khác nhau

Mặc dù Acinetobacter spp thường hiện diện và dễ dàng được phân lập

trong các hệ thống có sự tăng cường loại bỏ phốt-pho sinh học, nhưng các nghiên cứu phân tích thành phần quần xã vi khuẩn tích lũy poly-P thì cho rằng

Acinetobacter không phải nhóm vi khuẩn chiến ưu thế trong các hệ thống xử

lý nước thải (Wagner et al., 1994) Bên cạnh Acinetobacter, các giống

Pseudomonas, Alcaligenes, Comamonas-Pseudomonas, Cytophaga, Moraxella, Xanthomonas, Paracoccus, Bacillus, Corynebacterium

Flavobacterium-cũng được phân lập và cho thấy rằng chúng vai trò quan trọng trong quá trình

tích lũy poly-P trong bùn hoạt tính (Hiraishi và Morishita, 1990; Streichan et

al., 1990; Van Groenestijn, 1987; Sidat et al., 1999; Lin-lin et al., 2007;

Usharani et al., 2011)

Sidat et al., (1999) phân lập các vi khuẩn tích lũy Poly-P trong bùn hoạt

tính cho thấy có sự đa dạng thành phần loài vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P từ 5,56x10-12 mg/tế bào (Staphyloccocus sp.) đến 2,5x10-10 mg/tế bào

(Acinetobacter calcoaceticus) Bên cạnh hai giống Pseudomonas sp (chiếm 58% trên tổng số vi khuẩn phân lập được) và Staphylococcus spp (chiếm

40%), còn có một số giống cũng có khả năng tích lũy lượng lớn poly-P như

Acinetobacter calcoaceticus, Enterobacter sp., Aeromonas sp., Moraxella sp., Bacillus cereus Trong đó, Enterobacter sp và Pseudomonas spp tích lũy

poly-P nhiều nhất (>5,3 x 10-12 mg/tế bào)

Shoda et al., (1980) phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng tích lũy cao, trong đó dòng Arthrobacter globiformis PAB-6 tích lũy hàm lượng phosphate

nội bào đạt tới 20% trọng lượng sinh khối khô trong môi trường tổng hợp, gấp 3-7 lần so với các nghiên cứu trước đây Trong giai đoạn tế bào ngừng phân

chia, A Globiformis PAB-6 không phóng thích phosphate trở lại môi trường

nuôi cấy Phần lớn (50%) phosphate nội bào dạng acid nucleic, 20% ở dạng poly-phosphate và chuyển hoá dạng phosphate hoà tan

Lin-lin et al., (2007) đã phân lập 8 dòng vi khuẩn tích lũy poly-P trong

hệ thống xử lý nước thải có bùn hoạt tính tuần hoàn cho thấy có 5 dòng có khả năng sử dụng oxy và nitrate như là chất nhận điện tử, 3 dòng có khả năng tích lũy phosphate cao dưới điều kiện có và thiếu oxy Chúng được xác định là

Alcaligenes, Pseudomonas và Streptococcus

Tobin et al (2007) nghiên cứu khả năng hấp thu và tích lũy poly-P dòng

Pseudomonas putida CA-3, kết quả cho thấy dòng P Putida CA-3 vừa có khả

năng tích lũy poly-P vừa có khả năng hấp thu các acid béo và đồng hoá thành chuỗi poly-hydroxyalkanoate trong quá trình sinh tổng hợp (Hình 2.5)

Hình 2.5: Ảnh chụp kính hiển vi điện tử truyền quét tế bào vi khuẩn Pseudomonas

putida Ca-3 có hạt poly-P nội bào (hạt màu đen) và hạt poly-hydroxyalkanoate (màu

trắng) [Tobin et al., (2007)]

Usharani et al., (2011) phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn tích lũy

poly-P trong các mẫu nước bị ô nhiễm và mẫu đất rừng cho thấy các dòng

Bacillus sp RS-1, Pseudomonas sp YLW-7 và Enterobacter sp KLW-2 có

hiệu suất loại bỏ phosphate hữu dụng cao Hiệu quả loại bỏ phosphate hòa tan

có sự khác nhau giữa các môi trường và giữa các dòng riêng lẻ hay có sự kết hợp giữa các dòng Hiệu suất loại bỏ phosphate hoà tan Trong môi trường

MSM (mineral salts medium) của dòng Pseudomonas sp YLW-7 đạt 68% sau

72 giờ, ở pH trung tính với glucose là nguồn carbon; sự kết hợp 3 dòng

Bacillus sp RS-1, Pseudomonas sp YLW-7 và Enterobacter sp KLW-2 cho

hiệu suất đạt 92,5% sau 72 giờ với lactose là nguồn carbon Trong môi trường tổng hợp với hàm lượng phosphate hoà tan ban đầu là 100mg/L, nguồn carbon

là lactose, hiệu suất loại bỏ phosphate đạt cao nhất là 63,4% ở nghiệm thức có

sự giữa 3 dòng, và 52,3% đối với dòng Pseudomonas sp YLW-7 sau 72 giờ

2.4.2 Trong nước

Trong nước có vài nghiên cứu về sử dụng các dòng vi khuẩn để giảm

thiểu lượng đạm, lân trong nước ao nuôi cá tra Bùi Thế Vinh và ctv., (2011) phân lập 2 dòng Arthrobacter protophormiae LV1 và Bacillus megaterium

LV8b từ mẫu chất thải từ trại nuôi bò sữa, và ứng dụng chúng trong xử lý nước thải nhân tạo có hàm lượng phosphate ban đầu từ 9÷11 mg/L; dòng LV1 làm giảm hàm lượng phosphate xuống còn 1,11 mg/L; dòng LV8b làm giảm xuống còn 3,42 mg/L; hai dòng kết hợp làm giảm hàm lượng phosphate xuống

còn 2,38 mg/L sau 3 ngày xử lý Cao Ngọc Điệp và ctv., (2012) ứng dụng chế

phẩm sinh học bao gồm 3 dòng vi khuẩn khử đạm và lân (dòng N9b, 6Rc và LV1) để xử lý nước-bùn thải từ đáy ao cá tra, kết quả cho thấy hỗn hợp 3 dòng

vi khuẩn (N9b+6Rc+LV1) làm giảm hàm lượng lân hoà tan trong nước ổn định PO43-<0,5 mg/L sau 60 giờ trong mô hình thí nghiệm bình 10-Lít Trong thí nghiệm ứng dụng chế phẩm sinh học cho thể tích 200m3 nước-bùn đáy ao, hàm lượng PO43- <0,74 mg/L trong nước ao thấp sau 48 giờ

Theo QCVN 40:2011/BTNMT ngưỡng cho phép hàm lượng tổng pho (tính theo P) thải ra môi trường đối với nước thải là 4 mg/L (loại A) và 6 mg/L (loại B) và đối với nước ao nuôi thủy không nên cao hơn 0,01 mg/L và thích hợp cho ao cá từ 0,005-0,2mg/L [theo khuyến cáo của (Boyd,1998)] thì những nghiên cứu trên cho thấy việc xây dựng mô hình xử lý sinh học nước ao nuôi cá tra công nghiệp là một hướng nghiên cứu đáng được quan tâm Mô hình có tính hiệu quả cao trong việc giảm thiểu các chỉ tiêu đến mức cho phép, đơn giản, dễ vận hành, chi phí thấp và thời gian xử lý ngắn Việc ứng dụng công nghệ vi sinh trong vấn đề xử lý phosphate hòa tan gây ô nhiễm môi trường nước là một trong những yếu tố mang tính khả thi cao

phốt-2.5 Thành phần quần xã vi khuẩn tích lũy poly-phosphate

2.5.1 Tình hình nghiên cứu thành phần quần xã vi khuẩn poly-P trong hệ thống xử lý nước thải

Những năm gần đây, các kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để mô

tả thành phần quần xã của PAB dựa trên mối quan hệ phát sinh loài Áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong việc xác định quần xã của PAB cho thấy vi khuẩn trong bùn hoạt tính của các hệ thống xử lý nước thải rất đa dạng bao gồm nhiều giống loài thuộc các lớp Proteobacteria (α, β và ɣ), Gram positive với hàm lượng G+C cao (Actinobacteria), Planctomycetes và Bacteroides

(Crocetti et al., 2000; Ahn et al., 2007; Bond et al., 1995; Bond et al., 1999; Kong et al., 2005; Liu et al., 2001; Gloess et al., 2008; Tamaki et al., 2005)

Bên cạnh đó, thường có sự khác nhau về thành phần các nhóm vi khuẩn chiếm

ưu thế trong các hệ thống xử lý khác nhau Sự thể hiện thành phần và tính chất

của từng loại nước thải mà có sự khác biệt trong thành phần của PAB (Beer et

al., 2006; Wong et al., 2005; Crocetti et al., 2000) Trong lớp Actinobacteria

các vi khuẩn được xem là PAB như Arthrobacter sp (Shoda et al., 1980),

Mycobacterium sp (McMahon et al., 2002), Gordonia sp (Beer et al., 2006)

Nguyen et al., (2011) sử dụng kỹ thuật dò mẫu gen kết hợp khuếch đại

và giải trình tự đoạn gen 16S rRNA bằng cặp mồi (27F và 1492R) của nhóm

vi khuẩn Actinobacteria trong các hệ thống EBPR phát hiện chúng chiếm khoảng 30% trên tổng số vi khuẩn quan sát và có các kiểu hình khác nhau Khả năng hấp thu phosphate dưới điều kiện hiếu khí chỉ xảy ra khi chúng hấp thu nguồn carbon dưới điều kiện kỵ khí Nguồn carbon rất đa dạng như amino acid, glucose và acetate Chúng có hình dạng rất khác nhau như hình que ngắn, que chia nhánh, hình cầu, hình sợi

Ivanov et al., (2005) phân tích và định danh vi khuẩn loại bỏ phosphate

dựa trên khuếch đại và giải trình tự gen 16S rRNA bằng cặp mồi 27F và

1492R cho thấy Stenotrophomonas maltophilia LMG 10989 có khả năng loại

bỏ phosphate và là giảm hàm lượng Fe với tỉ lệ 0,17 g P/g Fe2+

Auling et al., (1991) sử dụng phương pháp nhuộm DAP (4’, Diamidino-2-phenylindole dehydrochloride) để phân tích quần xãvi sinh vật

6-tích lũy poly-P trong hệ thống xử lý nước thải Bên cạnh Acinetobacter còn có

Pseudomonas sp và Xanthobacter sp cũng góp phần quan trọng trong quá

trình EBPR

Crocetti et al., (2000) đã sử dụng phương pháp FISH để phân tích các vi

sinh vật tích lũy P trong bùn nước thải Các nhóm vi sinh vật tích lũy P ở mức cao chiếm khoảng 15,1% trong lượng sinh khối có chứa vi khuẩn coccobacilli

Có hơn 80% vi khuẩn là β -2 Proteobacteria thuộc nhóm coccobacilli là nhóm

vi sinh vật PAB Nhóm vi khuẩn trội thứ hai là Actinobacteria Bên cạnh đó, phương pháp PCR để khuếch đại gen 16S rRNA của vi khuẩn, những dòng

thuộc nhóm β-2 Proteobacteria được giải trình tự Trong các dòng này có mức

độ tương đồng của Rhodocyclus spp (94-97%) và Propionibacter pelophilus

(95-96%) được nhận diện là các vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P nhiều nhất Ba mẫu dò PAO462, PAO651 và PAO846 cũng được thiết lập để nhận

diện PAB Cả ba mẫu dò nhận diện vi khuẩn thuộc nhóm β -proteobacteria

2.5.2 Tình hình nghiên cứu thành phần quần xã vi khuẩn poly-P trong các ao hồ tự nhiên

Các vi sinh vật trong các ao hồ có vai trò quan trọng trong sự khoáng hóa nguồn carbon từ các hợp chất hữu cơ tích tụ tầng đáy và giải phóng phosphate

Sự phân hủy các hợp chất hữu cơ với sự hiện diện của oxy và nitrate là điều kiện thiết yếu (Gächter và Meyer, 1993) Sử dụng các ion mangan và sulfat như là chất nhận điện tử để tăng cường giải phóng phosphate từ sự phân hủy các hợp chất hữu cơ (Nealson, 1997) Mặc dù có nhiều nghiên cứu về các khía cạnh liên quan đến vi khuẩn tích lũy poly-P trong các hệ thống xử lý nước thải (như đã trình bày ở trên), tuy nhiên các thông tin về sự phát sinh loài, sự phong phú và mối liên quan giữa vi khuẩn tích lũy poly-P và môi trường trong

các ao-hồ thì không nhiều (Waara et al., 1993; Hupfer et al., 2007)

Szabó et al., (2011) nghiên cứu thành phần quần xã vi khuẩn theo thời

gian ở hồ Balaton (Hungary) bằng kỹ thuật phân lập và giải trình tự gen 16S rRNA Nhận diện vi khuẩn tích lũy poly-P bằng phương pháp nhuộm Neisser (nhuộm xanh methylen kiềm để xem các hạt nhiễm sắc trong tế bào) Dựa trên trình tự gen 16S rRNA, 63/216 dòng phân lập được định danh, chúng liên kết với 6 nhóm chính: Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes, Alpha-

proteobacteria, Beta-proteobacteria và Gamma-proteobacteria Giống Bacillus

sp hiện diện trong hầu hết các mẫu Kết quả nhuộm Neisser cho thấy rằng

Firmicutes, Actinobacteria, Alpha-proteobacteria và Aeromonas có khả năng

tích lũy lượng lớn poly-P nội bào Mặc dù các chi vi khuẩn thuộc lớp Firmicutes cho thấy tỉ lệ phần trăm dương tính khi nhuộm Neisser (67%

Bacillus sp.), nhưng chúng có sự khác biệt đáng kể hàm lượng poly-P nội bào

giữa các loài Phần lớn các loài B pumilus, B idriensis, B barbaricus, B

muralis đều dương tính khi nhuộm Neisser, trong khi đó các loài B megaterium, B mycoides, B weihenstephanensis, B thuringiensis, B drentensis chỉ chiếm khoảng 40% cho dương tính khi nhuộm Neisser Trong

lớp Actinobacteria, các giống Arthrobacter sp., Microbacterium sp.,

Rhodococcus sp., Leucobacter sp., Plantibacter và Williamsia tích lũy lượng

lớn poly-P Trong lớp Alpha-proteobacteria, chỉ có loài Mycoplana bullata

dương tính khi nhuộm với Neisser Ở lớp Gamma-proteobacteria, 40%

Rheinheimera, 33% Shewanella và 33% Pseudomonas phản ứng dương tính

với Neisser

Các nghiên cứu trên cho thấy rằng, thành phần quần xã PAB đa dạng và phong phú kể cả trong các hệ thống xử lý nước thải và trong các ao-hồ tự nhiên Sự hiện diện của các giống loài và thành phần phần trăm các giống cũng có sự khác nhau giữa 2 các địa điểm khác nhau như hệ thống xử lý nước thải (nhân tạo) và ao-hồ tự nhiên Tuy nhiên, chúng chủ yếu thuộc các lớp Bacilli, Alpha-proteobacteria, Beta-proteobacteria, Gamma-proteobacteria, Actinobacteria Tùy vào hệ sinh thái mà thành phần nào chiếm ưu thế, thường trong hệ thống xử lý nước thải có thành phần dinh dưỡng cao thì lớp Beta-proteobacteria, Actinobacteria và Gamma-proteobacteria được cho là các lớp

có nhiều ưu thế nổi trội về thành phần và số lượng Trong khi ở các ao hồ có thành phần dinh dưỡng ít hơn thì lớp Bacilli, Actinobacteria được nhận thấy là PAB chiếm ưu thế

2.6 Phương pháp định tính và định lượng poly-P nội bào

Trong quá trình phân lập và tuyển chọn vi khuẩn tích lũy poly-P, một trong các phương pháp để kiểm tra sinh hóa là xác định khả năng tích lũy poly-P nội bào Việc xác định khả năng tích lũy poly-P nội bào được tiến hành thông qua hai phương pháp là định tính và định lượng

2.6.1 Định tính hạt poly-P nội bào

2.6.1.1 Kính hiển vi quang học huỳnh quang

Hạt poly-P trong các vi sinh vật được biết là "Hạt bắt metachromatic" hoặc "hạt volutin" và chúng có ái lực cao với phẩm nhuộm cation Ánh sáng hấp thụ thay đổi đáng kể khi vết phẩm nhuộm cation liên kết chặt chẽ với các anion "hạt volutin" và điều nay cho phép phân biệt giữa tế bào và hiện diện của các "hạt volutin" sau khi nhuộm Neisser (Gurr, 1965),

màu-Loeffler Methylen Blue (Murray et al., 1994), và nhuộm xanh Toluidine

(Onda và Takii, 2002) là một trong những phương pháp nhuộm phổ biến nhất dùng để ghi nhận sự hiện diện của hạt poly-P khi quan sát dưới kính hiển vi quang học Định tính hạt poly-P bởi bất kỳ kỹ thuật nhuộm được đề cập là không đáng tin cậy vì tất cả các thuốc nhuộm đều không đặc hiệu Ngoài ra nhiều loài vi khuẩn thường khá nhỏ, hơn nữa có nhiều hạn chế để phát hiện các thể vùi poly-P trong tế bào bằng phương pháp nhuộm Do đó, việc sử dụng các phương pháp nhuộm đơn trong việc ước lượng hàm lượng poly-P nội bào

cần được đánh giá một cách thận trọng (Serafim et al., 2002)

2.6.1.2 Kính hiển vi điện tử kết hợp với phân tích năng lượng phân tán X-Ray

Kết hợp kính hiển vi điện tử (Electron microscopy-EM) với phân tích sự phân tán năng lượng tia X (EDX) cho phép định lượng trực tiếp khối lượng khô và hàm lượng nguyên tố của các tế bào riêng lẻ và thể vùi của chúng

(Pallerla et al., 2005) Bằng cách sử dụng kỹ thuật EM-EDX cho thấy sự hiện

diện hạt poly-P trong các tế bào vi khuẩn khi nuôi cấy (Baxter và Jensen, 1980) và trong bùn hoạt tính (Buchan, 1981) Hạt poly-P có thể nhận biết như cấu trúc đậm màu điện tử, tối hơn so với vật chất xung quanh của tế bào Phốt-pho cho thấy bức xạ X-quang đặc trưng có thể dễ dàng được nhận biết bởi hệ thống EDX-quang phổ sử dụng các nguyên tố với số nguyên tử lớn hơn 10 Nồng độ tương đối của các yếu tố khác nhau có thể được ước tính từ đỉnh cao cường độ trong phổ tia X bằng cách sử dụng một chương trình tính toán nội bộ

(Krivtsov et al., 2005) Mẫu đồng nhất được đưa trực tiếp vào một lưới phủ một lớp carbon (Schönborn et al., 2001) hoặc được cố định trong

glutaraldehyde, khử nước, và bao bọc trong một lớp nhựa để chuẩn bị cho lớp

cắt siêu mỏng (Bode et al., 1993; Eixler et al., 2005) Boswell et al., (2001) đã

quan sát sự hiện diện các hạt poly-P nội bào thông qua chụp TEM Transmission Electron Microscopy-chụp kính hiển vi điện tử truyền quét] Lượng thấp một số nguyên tố chứa trong các tế bào đòi hỏi việc sử dụng các kỹ thuật nhạy cảm hơn để phân tích các nguyên tố như quang phổ năng

[TEM-lượng electron [(EELS), Bode et al., 1993] Nói chung, kỹ thuật nhuộm phức

tạp để phân tích X-quang nên tránh vì sự biến mất không thể đoán trước của P

và các yếu tố khác từ các tế bào (Heldal, 1993; Brumberg, 1995) Số lượng và kích thước của hạt poly-P bên trong tế bào là rất khác nhau Kính hiển vi điện

tử được dùng để xác định vị trí các hạt poly-P bên trong tế bào Poly-P ở hàm lượng cao đã được quan sát trong màng tế bào, trên bề mặt, và trong tế bào

chất (Serafim et al., 2002) Đường kính tối đa quan sát của poly-P hạt dao

động từ 0,3 μm cho vi sinh vật phù du (Jensen và Corpe, 1993), 0,4 μm cho

Microcystis aeruginosa khi nuôi cấy (Jacobson và Halmann, 1982), 0,4 μm

cho Acinetobacter dòng 210 A (Bonting et al., 1993), và thậm chí đến 1,5 μm cho vi khuẩn trong bùn hoạt tính (Schönborn et al.,2001) Nhiều nghiên cứu

bùn hoạt tính đã chỉ ra rằng vi khuẩn có liên quan đến loại bỏ lượng lớn P có thể khác nhau đáng kể về hình thái và quá trình trao đổi chất (Buchan, 1981;

Streichan et al., 1990) Ca, Mg, K là những nguyên tố chủ yếu liên kết trong hạt poly-P (Bonting et al., 1993; Schönborn et al., 2001) Các cation đóng vai trò phản chiếu lại anion P Nghiên cứu của Schönborn et al., (2001) cho rằng

sự ổn định các hạt poly-P dưới sự hiện hiện của Mg2+ và K+ có liên quan đến

quá trình giải phóng và sự hấp thu P, trong khi sự hiện diện của Ca2+ không làm thay đổi hạt poly-P ngay cả trong điều kiện oxy hóa khử thay đổi Khái niệm này được chứng minh là cả hai Mg2+ và K+ được giải phóng và hấp thu đồng thời với P trong bùn hoạt tính (Pattarkine và Randall, 1999)

Sự kết hợp phân tích TEM và X-quang là một phương pháp tin cậy để xác nhận sự tồn tại của PAB trong một mẫu và cho phép phát hiện thể vùi giàu

P trong tế bào Bằng cách sử dụng 31P-NMR (Phosphorus-31 nuclear magnetic

resonance-cộng hưởng từ electron), Pallerla et al., (2005) đã chứng minh poly-P

là thành phần chính trong hạt giàu P trong tế bào Corynebacterium

glutamicum Ngược lại, Hensgens et al., (1996) nghiên cứu các tạp chất trong

vi khuẩn khử sulfat Desulfovibrio gigas bằng cách phân tích X-quang và kết

luận rằng hạt giàu P không chỉ bao gồm poly-P mà còn của các hợp chất P khác Vì vậy, việc xác định chính xác và định lượng poly-P trong các mẫu tự nhiên đòi hỏi các phương pháp khác bổ sung

2.6.2 Xác định hàm lượng poly-P nội bào

Hiện nay, chưa có phương pháp định lượng trực tiếp hàm lượng poly-P nội bào Có nhiều nghiên cứu cho rằng có thể định lượng gián tiếp hàm lượng poly-P nội bào thông qua quá trình ly trích các hạt poly-P Poly-phosphate sau khi ly trích được thủy phân thành phosphate Sự khác biệt giữa hàm lượng phosphate trước và sau thủy phân sẽ ước lượng hàm lượng poly-P nội bào Quy trình ly trích để định lượng và mô tả đặc tính của các hạt poly-P nội bào phải hiệu quả và đặc hiệu Điều này thường rất khó đạt được bởi vì (1) poly-P vô cơ có thể kết hợp với một số hợp chất khác của tế bào theo nhiều cách khác nhau như protein và acid nucleic (Wood và Clark, 1988), (2) Sự phân giải của chuỗi poly-P phụ thuộc nhiều vào chiều dài chuỗi cũng như sự hiện diện và nồng độ của các cation kiềm (Lorenz và Schröder, 1999), (3) Sự phân hủy của tế bào có thể dẫn đến thay đổi độ dài chuỗi, hàm lượng, tái cấu trúc lại các hạt poly-P khác nhau và poly-P có thể kết hợp với các phân tử vô

cơ khác Vì vậy, lựa chọn phương pháp thích hợp để ly trích poly-P phụ thuộc mạnh mẽ vào đối tượng nghiên cứu Ngoài ra, các mẫu có thành phần càng phức tạp (bùn hoạt tính và bùn trầm tích) thì quy trình ly trích càng phức tạp

để đáp ứng được tính hiệu quả, tính đặc hiệu và sự ổn định của chuỗi poly-P không bị thủy phân và sự phân giải bởi enzyme Chính vì những điều này, các quy trình ly trích khó có khả năng ly trích hoàn toàn chuỗi poly-P hoặc rất khó thu được các chuỗi poly-P dạng nguyên thuỷ

Những năm 1950 quy trình ly trích poly-P đã được thử nghiệm cho nhiều mẫu sinh học khác nhau (Fitzgerald và Nelson, 1966) Các phương pháp ly

trích phân đoạn đã được đề xuất để phân biệt sự khác nhau giữa các hợp chất P

nội bào cũng như P dự trữ dạng hóa học hay sinh học (De Haas et al., 2000)

Sự phân biệt giữa poly-P dạng hóa học hay sinh học trong bùn hoạt tính

được thực hiện bởi phương pháp ly trích phân đoạn của Uhlmann et al.,

(1990) Phương pháp này ban đầu được ứng dụng để ly trích hạt poly-P trong các lớp bùn trầm tích trong ao-hồ, bao gồm năm bước theo trình tự sau đây: (1) Ly trích P liên kết lỏng lẻo trong bọt nước

(2) Ly trích P hòa tan trong các chất khử, P liên kết với Fe-hydroxit (3) Ly trích P liên kết với Fe hay oxít Al (P bị thuỷ phân trong NaOH) (4) Ly trích P liên kết trong các hợp chất hữu cơ và P vô cơ trong tế bào (P không bị thủy phân trong NaOH)

(5) Ly trích P liên kết với carbonate (P bị thuỷ phân trong HCl)

Phốt-pho trong phần còn lại là khó ly trích và có thể dễ dàng được xác

định sau khi phân giải Uhlmann et al., (1990) sử dụng phương pháp 31P-NMR phát hiện ra rằng hạt poly-P ly trích từ bùn hoạt tính trong hệ thống xử l ý có thể hòa tan trong NaOH Hình 2.6 cho thấy việc so sánh các phân đoạn P của

các chuỗi poly-P dự trữ trong Acinetobacter 210 A nuôi cấy từ bùn hoạt tính

từ một nhà máy xử lý và bùn hoạt tính của một trạm xử lý có sự kết hợp loại

bỏ P sinh học và hóa học bằng Fe2(SO4)3

Hình 2.6: Tổng P được cấu thành từ các thành phần P khác nhau được xác định thông

qua quá trình ly trích phân đoạn (Uhlmann et al., 1990)

Ghi chú: (A) Acinetobacter 210A, (B) Bùn hệ thống xử lý có thêm Fe 2 (SO 4 ) 3 , (C) Hệ thống xử lý với

EBPR (giai đoạn kỵ khí) (D) Hệ thống xử lý với EBPR (giai đoạn hiếu khí)

Kết quả nghiên cứu của Uhlmann et al., (1990) cho thấy hầu hết poly-P

trong các mẫu (nuôi cấy và bùn hoạt tính) được xác định như là poly-P không

bị thủy phân (non reactive phosphorus-NRP) khi ly trích bằng NaOH NRP là

sự khác biệt giữa tổng P và P bị thuỷ phân (soluble reactive phosphorus-SRP) được xác định bằng phương pháp molypden-blue Tuy nhiên, trong hệ thống

xử lý có sự kết hợp loại bỏ P sinh học và hóa học bằng Fe2(SO4)3, hơn 60% P

ly trích là P hòa tan (P liên kết với Fe) Phần P (không thuỷ phân bởi NaOH)

từ bùn hoạt tính không liên kết với sắt có sự khác nhau dưới sự biến đổi các điều kiện oxy hóa khử Điều này cho thấy phương pháp sử dụng NaOH để ly trích chuỗi poly-P là quy trình ly trích thuận tiện, đặc biệt là trong bùn lắng tụ Ngoài ra, poly-P hòa tan được xác định như P không bị phân huỷ, điều này được chứng minh bằng việc bổ sung các tinh thể poly-P vào các lớp bùn trầm

tích (Hupeer et al., 1995) Tuy nhiên, NaOH-NRP không được coi là một biện

pháp hữu hiệu khi ly trích poly-P dạng hữu cơ Điều này đã được chứng minh bởi phân tích 31P-NMR khi ly trích poly-P bùn hoạt tính và bùn trầm tích bằng NaOH Trong lớp trầm tích ở hồ một phần đáng kể (lên đến 50%) là poly-P

không bị thuỷ phân (Hupeer et al., 1995) Khi ly trích trong điều kiện nhiệt

cao (100oC, 1giờ) theo Fitzgerald và Nelson (1966) cũng cho kết quả tương tự

khi ly trích bằng NaOH-NRP (Uhlmann et al., 1990) trong các mẫu bùn hoạt

tính Tuy nhiên, trong nước nóng, một phần đáng kể của poly-P đã được thủy phân để tạo ra phosphate Trong bùn hoạt tính khi ly trích bằng nước nóng thì hàm lượng poly-P thấp hơn giá trị thực bởi vì sự kết tủa phosphate và các phân đoạn poly-P Ước lượng sai cũng có thể được xảy ra khi sử dụng nước nóng ly trích bùn trầm tích trong ao-hồ với hàm lượng cao poly-P

Eixler et al., (2005) sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để ly trích hạt poly-P nội bào của Chlorella vulgaris và Synechocystic sp (Bảng 2.1)

Bảng 2.1: Các chất sử dụng và điều kiện ly trích poly-P (Eixler et al., 2005)

Số nghiệm thức Dung môi Thời gian ly trích Nhiệt độ ủ (0C) Điều kiện khác

Kết quả cho thấy rằng NaOH và nước nóng thích hợp để ly trích poly-P trong vi sinh vật mà không ảnh hưởng đến sự thủy phân poly-P (Hình 2.7)

Hình 2.7: Sự hiện diện các hạt poly-P (Eixler et al., 2005)

Ghi chú: (B) ảnh chụp TEM tế bào Synechocystis sp với các hạt poly-P sậm màu đen, (E) các hạt poly-P

trong dung môi sau khi ly trích

Ở nồng độ 0,2 M NaOH và thời gian ly trích từ 6 đến 36 giờ là thích hợp

để ly trích poly-P nội bào (Hình 2.8) Nghiên cứu này đã bổ sung việc sử dụng NaOH như là một dung môi thích hợp để ly trích các hạt poly-P nội bào

Hình 2.8: Hiệu quả trích poly-P bằng nước lạnh, nước nóng và NaOH ở những nồng

độ khác nhau từ Chlorella vulgaris (Eixler et al., 2005)

Sau khi ly trích poly-P, dịch ly trích được lọc qua giấy lọc vi khuẩn có đường kính lổ lọc 0,45µm để loại bỏ xác tế bào và dịch lọc chứa poly-P Kết quả cũng cho thấy rằng, trong dịch lọc bên cạnh poly-P cũng còn có một phần

phosphate tự do (Eixler et al., 2005) Hiện nay, chưa có phương pháp định

lượng hàm lượng poly-P mà chỉ có thể xác định hàm lượng poly-P thông qua hàm lượng phosphate sau khi thủy phân poly-P poly-P dễ dàng thủy phân trong dung dịch acid 1 M HCl ở nhiệt độ 1000C (Buzoleva et al., 2006)

2.7 Cơ chế quá trình trao đổi chất của nhóm vi khuẩn tích lũy poly-P

và sự điều hòa

2.7.1 Cơ chế quá trình trao đổi chất của vi khuẩn tích lũy poly-P

Vài dạng trao đổi chất được nghiên cứu để mô tả sự biến đổi sinh hóa nguồn carbon trong quá trình trao đổi chất Khi nghiên cứu với acetate như là nguồn carbon duy nhất, quá trình trao đổi chất được trình bày trong Hình 2.9

Ghi chú:

- e-SRP: Soluble reactive phosphorus

- polyP: polyphosphate

- Cold water: nước lạnh

- Hot water: nước nóng

Hình 2.9: Các đặc điểm sinh hóa chính trong quá trình EBPR (van Loosdrecht et al., 1997)

Quá trình EBPR được biết đến như sự biến đổi theo chu trình của các chất tích lũy nội bào như poly-P, PHB và glycogen Trong điều kiện kỵ khí, poly-P nội bào bị thủy phân tạo năng lượng ATP cho quá trình hấp thu các chất hữu cơ như các axid béo mạch ngắn (VFAs-như acetate) và thông qua quá trình đó phosphate phóng thích ra môi trường VFAs được chuyển hóa thành PHB Ngược lại, dưới điều kiện hiếu khí, PHB bị oxy hóa và P được hấp thu vào trong tế bào trở lại và đồng hóa thành poly-P Song song với quá trình này thì glycogen được tái tổng hợp và tế bào sẽ tăng trưởng và phát triển Acetate (HAc: Hydroxy-Acetate) là nguồn carbon được sử dụng rộng rãi

trong nghiên cứu về quá trình EBPR Trong E coli, acetate được vận chuyển

qua kênh đồng vận chuyển acetate xuyên màng (ActP) (He và McMahon, 2011) Acetate được chuyển xuyên màng thông qua kênh ActP cùng với sự chênh lệch gradient nồng độ H+ hoặc Na+

Hình 2.10: Chuyển hoá acetate và glycogen thành PHB bởi PA

[(A) Comeau et al., (1986) (B), Mino et al., (1987)]

Saunder et al., (2007) và Burow et al., (2008) chứng minh rằng acetate

được vận chuyển qua màng bởi lực chuyển proton, không do sự chênh lệch gradient Na+ Acetate sau khi hấp thu vào tế bào sẽ được chuyển hóa tới

- ATP: Adenosine triphosphate

- NADH: Nicotinamide adenine dinucleotide

- P i : phosphate

ACS AckA/Pta ACS AckA/Pta