Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis tại thành phố Cần Thơ

Đề tài được thực hiện với các mục tiêu i Xác định tỷ lệ kháng thuốc ở bệnh nhân lao phổi tái trị tại thành phố Cần Thơ, ii Tìm hiểu một số yếu tố ảnh hưởng đến tính kháng thuốc của vi kh

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Trần Nhân Dũng và PGS.TS Trần Ngọc Dung, hai người đã dành nhiều thời gian hướng dẫn tận tình, động viên giúp đỡ, cung cấp tài liệu, kiến thức quí báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi và tốt nhất để tôi hoàn thành quyển luận án này

Tôi muốn gửi lời cám ơn đến Bác sĩ chuyên khoa I Nguyễn Thị Thanh Nhàn, Giám đốc Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thành phố Cần Thơ, Bác sĩ Nguyễn Ngọc Thủy, phó trưởng phòng xét nghiệm, các Bác sĩ phòng khám, các Anh chị em nhân viên y tế của Bệnh viện lao và bệnh phổi Cần Thơ, nhân viên y

tế của các Trung tâm phòng chống lao Quận Ninh Kiều, Cái Răng, Phong Điền đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi được tiếp xúc với bệnh nhân, từ đó, tôi có cơ hội chọn được các mẫu đạt tiêu chuẩn cho mục tiêu nghiên cứu của luận án

Về phía Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, tôi vô cùng biết ơn lãnh đạo nhà trường, đặc biêt, tôi vô cùng biết ơn GS.TS Phạm Văn Lình đã cho phép, ủng hộ, tạo cơ hội tốt nhất trong thời gian vừa qua để tôi có điều kiện học tập, nghiên cứu

và hoàn thành luận án nghiên cứu sinh này

Tôi sẽ không bao giờ quên tập thể Bộ môn Sinh Lý Bệnh-Miễn dịch, Khoa

Y, Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, nơi đã động viên, chia sẽ, khích lệ, an ủi tôi trong suốt quá trình 4 năm học tập, nghiên cứu, giúp đỡ để tôi có thể vừa hoàn thành công tác, vừa hoàn thành nhiệm vụ học tập, nghiên cứu và hoàn thành quyển luận án này

Tôi cũng xin gửi lời cám ơn đến Ths Đỗ Tấn Khang và Em Trần Văn Bé Năm của phòng Sinh học phân tử, thuộc Viện Nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, đã tích cực hổ trợ, không ngại khó khăn cùng với tôi thực hiện các kỹ thuật PCR, gửi sản phẩm PCR giải trình tự, nhằm giúp tôi hoàn tất mục tiêu phát hiện các đột biến gen của những chủng vi khuẩn lao trên các bệnh nhân tại Thành phố Cần Thơ

Xin cám ơn các cán bộ của Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh đã giúp

đỡ tôi thực hiện xét nghiệm xác định các tế bào miễn dịch bằng kỹ thuật đếm dòng chảy tế bào tại viện

Tôi xin gửi lời cảm ơn các cán bộ của phòng Thí nghiệm chuyên sâu đã nhiệt tình giúp đỡ khi tôi thực hiện kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao, chụp ảnh

vi khuẩn lao dưới kính hiển vi điện tử

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình đã yêu thương, thông cảm, chia sẽ,

an ủi, khích lệ tôi trong những lúc khó khăn khi thực hiện đề tài, giúp tôi có thêm động lực để hoàn tất quá trình học tập và thực hiện luận án nghiên cứu sinh Đây chính là niềm vui, là phần thưởng vô giá cho bản thân tôi

TÓM TẮT

Đề tài “Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn

Mycobacterium tuberculosis tại thành phố Cần Thơ“ được thực hiện tại phòng xét

nghiệm Sinh học phân tử, khoa Y - Trường Đại học Y Dược Cần Thơ; phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thuộc Viện Nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, phòng Thí nghiệm chuyên sâu, Trường Đại học Cần Thơ; phòng Xét nghiệm vi sinh thuộc bệnh viện Lao và Bệnh phổi thành phố Cần Thơ; Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh, trong thời gian từ tháng 6.2010 đến tháng 1.2014

Đề tài được thực hiện với các mục tiêu (i) Xác định tỷ lệ kháng thuốc ở bệnh nhân lao phổi tái trị tại thành phố Cần Thơ, (ii) Tìm hiểu một số yếu tố ảnh hưởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn lao gồm: (iia) Xác định các kiểu gen đột biến kháng thuốc rifampicin của vi khuẩn lao, (iib) Xác định nồng độ thuốc rifampicin trong huyết tương của bệnh nhân lao phổi tái trị (iic) Xác định số

lượng các tế bào miễn dịch trong máu của bệnh nhân lao phổi đa kháng thuốc Việc xác định tỷ lệ kháng thuốc được thực hiện với 246 bệnh nhân mắc lao phổi tái trị tại thành phố Cần Thơ có mẫu đàm được thu thập, đem nhuộm bằng phương pháp Ziehl-Neelsen, nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường Lowenstein-Jensen, thực hiện kỹ thuật kháng sinh đồ trên môi trường đặc theo phương pháp

tỷ lệ Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ kháng thuốc chung là 63,8%, trong đó, tỷ

lệ đa kháng thuốc là 23,2%, tỷ lệ kháng đơn thuốc lần lượt với streptomycin: 52,4%; isoniazid: 47,2%; rifampicin: 25,2%; ethambutol: 11,8% và kháng pyrazinamid: 9,8%; tỷ lệ kháng kết hợp thuốc gồm kháng với 1 loại thuốc là 21,5%; kháng 2 loại thuốc là 17,1%; kháng 3 loại thuốc là 13,1%; kháng 4 loại thuốc là 8,5%; kháng cả 5 loại thuốc là 3,3%

Các kiểu gen đột biến kháng thuốc rifampicin được tiến hành trên 42 chủng

vi khuẩn đã được nuôi cấy từ các mẫu đàm của 40 bệnh nhân lao phổi đa kháng thuốc và 2 bệnh nhân mắc lao phổi còn nhạy trong số 246 bệnh nhân mắc lao phổi tái trị tại thành phố Cần Thơ, ADN được ly trích để làm khuôn cho phản ứng PCR nhằm khuếch đại đoạn gen rpoB với chiều dài 411bp chứa đoạn gen 81bp là vùng có trình tự xác định kháng rifampicin (RRDR: rifampicin resistance determining region), đoạn gen được giải trình tự và so sánh với chủng hoang dại

từ dữ liệu trên ngân hàng gen, việc so sánh được thực hiện tại vị trí từ codon 507 đến 534, kết quả cho thấy có 30/40 chủng vi khuẩn lao nghiên cứu xảy ra đột biến thay thế base chiếm 75% và 10/40 chủng vi khuẩn lao nghiên cứu không tìm thấy đột biến gen trên vùng 81bp của gen rpoB, chiếm tỷ lệ 25%

Nồng độ thuốc rifampicin trong huyết tương của bệnh nhân được đo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, kết quả khảo sát cho thấy có 92,4% số

bệnh nhân ở nhóm lao phổi tái trị và 90% của nhóm lao phổi mới có nồng độ thuốc rifampicin huyết tương rất thấp <8 µg/ml (so với nồng độ điều trị chuẩn phải đạt từ 8-24µg/ml theo khuyến cáo)

Số lượng các tế bào miễn dịch trong máu của bệnh nhân lao phổi đa kháng thuốc được khảo sát bằng phương pháp đếm dòng chảy tế bào thông qua các dấu

ấn kháng nguyên đặc hiệu tế bào, từng loại dấu ấn được phát hiện bằng các kháng thể đơn dòng có đánh dấu chất huỳnh quang Kết quả cho thấy có sự giảm một cách có ý nghĩa (p<0,05) số lượng các tế bào lympho T chung, lympho T giúp đỡ, lympho T gây độc và tế bào diệt tự nhiên ở nhóm bệnh nhân lao phổi đa kháng thuốc Trong khi đó, số lượng monocyte trong công thức bạch cầu ở nhóm lao phổi đa kháng thuốc lại tăng cao có ý nghĩa thống kê so với nhóm lao mới và nhóm người bình thường với p<0,05

Các kết quả trong nghiên cứu này cho thấy: kiểu đột biến gen của vi khuẩn lao, nồng độ thuốc rifampicin trong huyết tương và số lượng các tế bào miễn dịch trong máu bệnh nhân, có thể là các yếu tố ảnh hưởng đến việc kháng thuốc của vi khuẩn lao

Từ khóa: bệnh lao phổi, lao phổi đa kháng thuốc, lao phổi tái điều trị, rifampicin, sắc ký lỏng hiệu năng cao, tế bào miễn dịch

ABSTRACT

The study entitled “Some factors affecting drug resistance of the

Mycobacterrium tuberculosis in the Can Tho city” This study was carried out at

(1) The Molecular Biology Laboratory - Faculty of Medicine – Can Tho University of Medicine and Pharmacy (CTUMP), (2) The Biotechnology Research and Development Institute of Can Tho University (CTU), (3) the Advanced Laboratory of CTU; (4) The Microbiology laboratory of the Can Tho Tuberculosis and Pulmonary Disease Hospital (CTPDH); and at (5) The Pasteur Institute of Ho Chi Minh City Duration of the study was from June 2010 to January 2014

The objectives of the study were to (i) Determine the percentage of retreated pulmonary tuberculosis patients who resists to drug; (ii) understand factors affecting drug resistance of the Mycobacterrium tuberculosis The

objective (ii) consists of: (1) Determine the mutated genotype of

rifampicin-resistant Mycobacterrium tuberculosis strains isolated from patients who live in the Can Tho city; (2) Investigate concentration of rifampicin drug in plasma of

retreated pulmonary tuberculosis patients and (3) Determine the immunocytes in blood of patients who got multi-drug resistant tuberculosis

Percentage of patients who resisted to drug at the CTPDH was determined from 246 retreated tuberculosis patients Sputum samples were collected and dyed by Ziehl-Neelsen method Drug susceptibility testing was performed on Lowenstein-Jensen medium according to the proportion method Results showed that prevalence of any anti-tuberculosis drug resistance was 63.8%; multidrug-resistant tuberculosis was 23.2%, monoresistance drug in which streptomycin was 52.4%; isoniazid was 47.2%; rifampicin was 25.2%; ethambutol was 11.8%; pyrazinamid was 9.8% Patients who resisted with one, two or more type of drugs: 21.5% found with one type of drug, two types of drug were 17.1%; three types of drug were 13.1%; four types of drug were 8.5% and five types of drug were 3.3%

Determination of mutated genotypes was carried out on 42 strains of

Mycobacterium tuberculosis in which 40 patients were multidrug-resistant

tuberculosis and 2 patients were still sensitive with drug and positive with tuberculosis DNA was extracted and used as template to amplify the rpoB gen by PCR method The rpoB gen length (411bp) in which contains 81bp fragment (a rifampicin resistance determining region) The DNA were sequenced and compared with DNA from the gene bank This activity was aimed to find

mutation from the codon 507 to 534 The results showed that there were 30 over

40 strains showing base substitutions mutation (75%) and in 10 over 40 strains (25%) showed phenotypically rifampicin-resistance, but no nucleotide changes were detected at the rpoB gene

The concentration of rifampicin in plasma of retreated pulmonary tuberculosis patients was determined by high performance liquid chromatography (HPLC) The results showed that 92.4% of retreated pulmonary tuberculosis and 90% of new pulmonary tuberculosis having low concentration of rifampicin in plasma (<8 µg/ml), while recommended concentration of drugs should be between 8 to 24µg/ml in plasma

The immunocytes in blood of multidrug-resistant tuberculosis patients were investigated The Flow cytometry method was used to determine the number of immunocytes by antigen markers in leucocytes and these antigen combine with the monoclonal antibody was recognized with fluorescence method The results showed that the number of T lymphocyte, helper T cells, cytotoxic T cells and natural killer cells signicficantly decreased (p<0,05) in multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) patients, while number of monocytes in multidrug-resistant tuberculosis patients significantly increased (p<0.05) in comparision with new pulmonary tuberculosis and the healthy people

Results from this study showed: mutated genotype of the Mycobacterrium

tuberculosis, drug concentration in plasma and number of immunocytes in blood

of patients indicating the factors that affect to drug resistance

Keywords: high performance liquid chromatography, immunocytes, resistant tuberculosis, pulmonary tuberculosis, retreated pulmonary tuberculosis, rifampicin,

multidrug-TRANG CAM KẾT KẾT QUẢ

Tôi xin cam kết luận án này đƣợc hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi Các kết quả của nghiên cứu này chƣa đƣợc dùng cho bất cứ luận án cùng cấp nào khác

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ I TÓM TẮT III ABSTRACT V TRANG CAM KẾT KẾT QUẢ VII MỤC LỤC VIII DANH SÁCH BẢNG X DANH SÁCH HÌNH XI DANH MỤC VIẾT TẮT XII

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Giả thuyết khoa học, cách tiếp cận và mục tiêu của luận án 2

1.3 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiển của luận án 4

1.4 Kết cấu của luận án 5

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 6

2.1 Sơ lược về lịch sử phát hiện bệnh lao 6

2.2 Vi khuẩn lao 7

2.2.1 Phân loại vi khuẩn lao 7

2.2.2 Cấu tạo của vi khuẩn lao 7

2.2.3 Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn lao 8

2.2.4 Hệ gen của vi khuẩn lao 11

2.2.5 Đặc tính đột biến kháng thuốc ở các loài vi khuẩn nói chung và vi khuẩn lao nói riêng 12

2.3 Đáp ứng miễn dịch trong bệnh lao và khả năng tồn tại của vi khuẩn lao trong cơ thể vật chủ 16

2.3.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu chống vi khuẩn lao 18

2.3.2 Khả năng tồn tại của vi khuẩn lao sau đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu 23

2.3.3 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống vi khuẩn lao 24

2.3.4 Đáp ứng miễn dịch trong lao phổi kháng thuốc 28

2.4 Điều trị bệnh lao phổi 28

2.4.1 Thuốc chống lao 29

2.4.2 Phác đồ điều trị bệnh lao 31

2.4.3 Thuốc chống lao rifampicin 32

2.5 Tình hình bệnh lao phổi kháng thuốc 34

2.5.1 Những điều kiện thuận lợi gây bệnh lao phổi kháng thuốc 34

2.5.2 Một số định nghĩa, phân loại về bệnh lao phổi và bệnh lao phổi kháng thuốc 34

2.5.3 Tình hình bệnh lao phổi kháng thuốc trên thế giới và tại Việt nam 36

2.6 Kỹ thuật xác định nồng độ thuốc chống lao và đếm số lượng các tế bào miễn dịch trong máu bệnh nhân 38

2.6.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao trong xác định nồng độ thuốc chống

lao 38

2.6.2 Phương pháp đếm dòng chảy tế bào trong xác định số lượng các tế bào miễn dịch trong máu bệnh nhân lao phổi 38

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 40

3.2 Nội dung nghiên cứu 41

3.2.1 Xác định tỷ lệ kháng thuốc ở bệnh nhân lao phổi tái trị tại thành phố Cần Thơ 41

3.2.2 Tìm hiểu một số yếu tố ảnh hưởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn lao tại thành phố Cần Thơ 45

3.3 Vấn đề y đức 58

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 60

4.1 Tỷ lệ kháng thuốc ở bệnh nhân lao phổi tái trị tại thành phố Cần Thơ 60

4.1.1 Đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu 60

4.1.2 Tỷ lệ kháng thuốc ở bệnh nhân lao phổi tái trị tại thành phố Cần Thơ 60

4.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn lao nghiên cứu 66

4.2.1 Các kiểu đột biến gen gây kháng thuốc rifampicin của vi khuẩn lao tại thành phố Cần Thơ 66

4.2.2 Sự giảm nồng độ thuốc chống lao rifampicin trong huyết tương của bệnh nhân lao phổi tái trị so sánh với nhóm bệnh nhân lao phổi mới 86

4.2.3 Sự giảm số lượng các tế bào miễn dịch trong máu của bệnh nhân lao phổi đa kháng thuốc so với nhóm lao phổi mới và nhóm đối chứng người bình thường 101

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 114

5.1 Kết luận 114

5.1.1 Tỷ lệ các loại lao phổi kháng thuốc tại thành phố Cần Thơ 114

5.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn lao tại thành phố Cần Thơ 114

5.2 Đề xuất 115

TÀI LIỆU THAM KHẢO 116

PHỤ LỤC 127

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1 Giá trị nội kiểm tham chiếu cho bộ thuốc thử BD Multitest 6-color TBNK sử

dụng với các ống BD Trucount 57

Bảng 4.1 Đặc điểm giới tính, nhóm tuổi của bệnh nhân nghiên cứu 60

Bảng 4.2 So sánh tỷ lệ mắc lao phổi kháng thuốc chung ở các nghiên cứu trong và ngoài nước 61

Bảng 4.3 So sánh kết quả tỷ lệ lao phổi đa kháng thuốc với các nghiên cứu khác 63

Bảng 4.4 Các kiểu đột biến thay thế base có thay đổi acid amin 69

Bảng 4.5 Các kiểu đột biến thay thế base không gây thay đổi acid amin 79

Bảng 4.6 Tỷ lệ bệnh nhân mang vi khuẩn lao có đột biến tại 1 codon 80

Bảng 4.7 Tỷ lệ bệnh nhân mang vi khuẩn lao có kiểu đột biến tại 2 codon 81

Bảng 4.8 Tỷ lệ bệnh nhân mang vi khuẩn lao có kiểu đột biến tại 3 codon 82

Bảng 4.9 Tỷ lệ bệnh nhân mang vi khuẩn lao có kiểu đột biến tại 4 codon 83

Bảng 4.10 Tỷ lệ bệnh nhân mang vi khuẩn lao có kiểu đột biến tại 7 codon 84

Bảng 4.11 Sự khác nhau về kiểu đột biến của vi khuẩn lao kháng RMP ở các nghiên cứu 85

Bảng 4.12 Đặc điểm giới tính, nhóm tuổi và cân nặng của 2 nhóm bệnh nhân nghiên cứu 87

Bảng 4.13 Liều điều trị RMP trung bình theo cân nặng ở 2 nhóm bệnh nhân nghiên cứu 89

Bảng 4.14 Nồng độ thuốc RMP trong huyết tương đo ở thời điểm 2 giờ của 2 nhóm bệnh nhân nghiên cứu 90

Bảng 4.15 Nồng độ thuốc RMP trong huyết tương đo ở thời điểm 3 giờ của 2 nhóm bệnh nhân nghiên cứu 91

Bảng 4.16 Nồng độ RMP trung bình trong huyết tương ở cả 2 thời điểm của 2 nhóm bệnh nhân nghiên cứu 92

Bảng 4.17 Nồng độ tối đa trong huyết tương của 2 nhóm bệnh nhân nghiên cứu 93

Bảng 4.18 Liên quan giữa nồng độ RMP tối đa trong huyết tương với giới tính ở nhóm bệnh nhân lao phổi mới 99

Bảng 4.19 Liên quan giữa nồng độ RMP tối đa trong huyết tương với giới tính ở nhóm bệnh nhân lao phổi tái điều trị 99

Bảng 4.20 Đặc điểm chung của các nhóm bệnh nhân nghiên cứu 101

Bảng 4.21 Số lượng bạch cầu chung và các loại bạch cầu ở các nhóm nghiên cứu 102

Bảng 4.22 Số lượng tế bào bạch cầu momo ở các nhóm nghiên cứu 104

Bảng 4.23 Số lượng trung bình của tế bào lympho T chung (CD3+ ) 106

Bảng 4.24 Số lượng trung bình của tế bào lympho T giúp đỡ (Th - CD4+) 107

Bảng 4.25 Số lượng trung bình của tế bào lympho Tc (CD8+) 108

Bảng 4.26 Tỷ số tế bào lympho Th / Tc (T CD4+/ T CD8+) 109

Bảng 4.27 Số lượng trung bình của tế bào diệt tự nhiên (NK) 110

Bảng 4.28 Phân tích tương quan đơn biến giữa số lượng một số bạch cầu trong máu ngoại vi với tình trạng kháng thuốc của bệnh lao phổi 111

Bảng 4.29 Phân tích tương quan đa biến giữa số lượng một số bạch cầu trong máu vi với tình trạng kháng thuốc của bệnh nhân lao phổi 112

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc vách tế bào của vi khuẩn lao 8

Hình 2.2 Vi khuẩn lao nhuộm bằng phương pháp Ziehl-Neelsen 9

Hình 2.3 Khuẩn lạc của vi khuẩn lao trên môi trường nuôi cấy Lowenstein Jensen 9

Hình 2.4 Vi khuẩn lao chụp phóng đại x7.500 qua KHV điện tử quét (SEM-JSM 5550) 10

Hình 2.5 Đường lây truyền của vi khuẩn lao 10

Hình 2.6 Quá trình nhiễm lao 11

Hình 2.7 Bản đồ nhiễm sắc thể của vi khuẩn lao 12

Hình 2.8 Các loại đột biến điểm 14

Hình 2.9 Kiểu đột biến thay thế base 14

Hình 2.10 Các dạng ảnh hưởng của đột biến điểm 15

Hình 2.11 Các cơ chế kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn 16

Hình 2.12 Sự hình thành u hạt (granuloma) và hoại tử bã đậu (caseum) trong nhiễm lao 17

Hình 2.13 Vi trí gắn kết của vi khuẩn lao và các tế bào thực bào 18

Hình 2.14 Vai trò của IFN-γ và TNF-α 20

Hình 2.15 Sự chết lập trình và hoại tử của các đại thực bào nhiễm vi khuẩn lao 21

Hình 2.16 Cơ chế miễn dịch tự nhiên trong nhiễm lao 22

Hình 2.17 Vai trò của CD4 và CD8 của miễn dịch thích nghi trong nhiễm vi khuẩn lao26 Hình 2.18 Quá trình nhiễm lao và các đáp ứng miễn dịch trong nhiễm lao 27

Hình 2.19 Cơ chế tác dụng của các thuốc chống lao hạng 1 trên vi khuẩn lao 30

Hình 2.20 Cơ chế tác dụng của các thuốc chống lao hàng 2 trên vi khuẩn lao 31

Hình 2.21 Công thức hóa học của RMP 32

Hình 2.22 Sự gắn kết của RMP vào vị trí hoạt động tổng hợp RNA polymerase 32

Hình 2.23 Các nước có lao phổi kháng thuốc cao ở những bệnh nhân tái điều trị 37

Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 40

Hình 4.1 Tỷ lệ kháng thuốc chung của vi khuẩn lao 61

Hình 4.2 Tỷ lệ mắc lao phổi đa kháng thuốc ở bệnh nhân nghiên cứu 62

Hình 4.3 Tỷ lệ mắc lao phổi đơn kháng thuốc 64

Hình 4.4 Tỷ lệ các loại lao phổi kháng thuốc kết hợp 66

Hình 4.5 Sản phẩm PCR có chiều dài 411bp trên bảng gel 67

Hình 4.6 Các đỉnh của các nucleotid trên biểu đồ giải trình tự 67

Hình 4.7 Tỷ lệ đột biến kháng RMP của các chủng vi khuẩn lao đa kháng 68

Hình 4.8 Liên quan giữa nồng độ thuốc RMP ở thời điểm 2 giờ với liều điều trị của nhóm bệnh nhân lao phổi mới 95

Hình 4.9 Liên quan giữa nồng độ thuốc RMP ở thời điểm 3 giờ với liều điều trị của nhóm bệnh nhân lao phổi mới 96

Hình 4.10 Liên quan giữa nồng độ thuốc RMP ở thời điểm 2 giờ với liều điều trị của nhóm bệnh nhân lao phổi tái trị 96

Hình 4.11 Liên quan giữa nồng độ thuốc RMP ở thời điểm 3 giờ với liều điều trị của nhóm bệnh nhân lao phổi tái trị 97

Hình 4.12 Liên quan giữa nồng độ RMP tối đa trong huyết tương với độ tuổi của nhóm bệnh nhân lao phổi mới 98

Hình 4.13 Liên quan giữa nồng độ RMP tối đa trong huyết tương với độ tuổi của nhóm bệnh nhân lao phổi tái trị 98

DANH MỤC VIẾT TẮT

AFB Acid Fast Bacilli: trực khuẩn kháng acid

ATSH An toàn sinh học

APC antigen presentation cell: tế bào trình diện kháng nguyên BAL broncoalveolar lavage liquid: dịch rửa phế quản

BK Bacilli de Koch: trực khuẩn Kock

BSC Bio – Safety – Cabinet: tủ an toàn sinh học

Cmax maximium concentration: nồng độ tối đa

CD cluster differentiation: cụm biệt hóa

CMI cell mediated immunity: miễn dịch qua trung gian tế bào CTLs cytotoxic T lymphocytes: lympho T gây độc tế bào

CR complement receptor: thụ thể của bổ thể

CTCLQG chương trình chống lao quốc gia

DC dendritic cell: tế bào tua

DC-SIGN Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion

molecule-3-Grabbing Non-integrin DOTS Directly Observed Treatment, Short-course: phác đồ điều trị

ngắn ngày có kiểm soát

FDC fixed dose combination: sự kết hợp liều thuốc cố định FMH functional mutant homozygotes: đồng hợp tử đột biến chức

năng GM-CSF granulocyte-macrophage-colony stimulating factor: yếu tố

kích thích đại thực bào - bạch cầu hạt

HLA human leukocyte antigen system: hệ thống kháng nguyên

bạch cầu ở người- hệ HLA HNP1-3 human neutrophile peptides 1-3

HLPC high-performance liquid chromatography: sắc ký lỏng hiệu

năng cao ICAM Intercellular Adhesion Molecule: phân tử dính nội bào

iNOS2 inducible nitric oxide synthase 2

IUATLD International Union Against Tuberculosis and Lung Disease:

Hiệp hội chống lao và bệnh phổi quốc tế

INH (H) isoniazid

LAM lipoarabino mannan

LJ Lowenstein-Jensen: môi trường đặc nuôi cấy vi khuẩn lao MAC Mycobacterium avium complexes

MBL Mannose binding lectin: chất lectin gắn đường mannose MCP monocyte chemoattractant protein: protein hấp dẫn bạch cầu

đơn nhân MDR-TB multidrug resistant tuberculosis: lao đa kháng thuốc

MHC major histocompatibility complexes: phức hợp hòa hợp mô

chủ yếu MIP macrophage inflammatory protein: protein viêm đại thực bào MTB Mycobacterium tuberculosis: vi khuẩn lao

MR mannose receptor: thụ thể đường mannose

NFkB nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B

cells NALC N – acetyl L-cysteine): hóa chất làm tan đàm

NK natural killer: diệt tự nhiên

NTM Non tuberculosis mycobacteria: không phải lao

NTP National Tuberculosis Program: chương trình chống lao

quốc gia PAS para-aminosalicylic acid

PIM phosphatidylinositol mannoside

PBMCs peripheral blood mononuclear cells: các tế bào đơn nhân ở

máu ngoại vi PMN polymorphonuclear: bạch cầu đa nhân

RANTES regulated on activation normal T cell expressed and secreted RNI reactive nitrogen intermediate: chất trung gian nitơ hoạt hóa ROI reactive oxygen intermediate: chất trung gian oxy hoạt hóa

RHZ thuốc kháng lao hỗn hợp 3 thành phần RMP-INH-PZA

SD Standard Deviation: độ lệch chuẩn

SP-TB sensitive positive tuberculosis: bệnh lao còn nhạy thuốc

TCYTTG tổ chức y tế thế giới

TCR T cell receptor: thụ thể tế bào lympho T

TLR toll like receptor

TNF tumor necrosis factor: yếu tố gây hoại tử khối u

VDR vitamine D receptor: thụ thể vitamin D

WHO world heath organization: tổ chức y tế thế giới

XDR-TB extensively drug-tuberculosis: bệnh lao cực kháng

Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Bệnh lao đã được biết rõ từ hơn một thế kỷ nay và được xem là bệnh nan y của thời đại, cho đến những năm 1950, các loại thuốc kháng sinh dùng chữa trị bệnh lao tỏ ra rất có hiệu quả (Iseman, 2002), thì bệnh lao đã được các thầy thuốc khống chế và kiểm soát bệnh một cách dễ dàng Tuy nhiên, từ thập niên 1990 trở lại đây, trên thế giới đã xuất hiện nhiều chủng trực khuẩn lao kháng thuốc, rất khó chữa trị và đang có nguy cơ lây lan rất nhanh trong cộng đồng và hiện nay, lao kháng thuốc đang trở thành một thách thức lớn đối với chương trình phòng chống

lao toàn cầu và trong y học (Raja et al, 2011) vì nó làm gia tăng tỉ lệ tử vong ở

người bệnh

Năm 2012, Tổ chức y tế thế giới (WHO) ước tính có một phần ba dân số tương đương với 2 tỷ người trên thế giới nhiễm vi khuẩn lao, trong đó có 8,6 triệu người mắc bệnh lao với 1,3 triệu người chết Hàng năm, trong số những người nhiễm vi khuẩn lao, có khoảng 450.000 bệnh nhân mắc lao đa kháng thuốc (cụ thể là thể lao phổi có vi khuẩn kháng với 2 loại thuốc chống lao hàng đầu rifampicin và isoniazid), gây ra cái chết cho 170.000 người (WHO, 2013) Điều này đã khiến bệnh lao trở thành một bệnh truyền nhiễm gây tử vong cao nhất so với các loại bệnh nhiễm trùng khác trên thế giới (Truscott, 1993), (Daniel, 2006) Hiện nay, tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn lao đã và đang là mối quan tâm hàng đầu trong việc điều trị cho bệnh nhân lao, do mối tương quan phức tạp giữa yếu tố gây bệnh, người bệnh và nồng độ thuốc trong huyết tương ảnh hưởng rất lớn đến kết quả điều trị Có nhiều yếu tố góp phần tác động gây kháng thuốc

đã được đề cập đến, từ việc sử dụng thuốc không đúng cách của các bác sĩ điều trị không chuyên nghiệp hoặc do nhận thức sai lầm của chính bản thân người bệnh, bệnh nhân không tuân thủ chặt chẽ qui trình điều trị, như uống thuốc không đủ liều, không đúng cách, không đủ thời gian hay tự ý ngưng thuốc (Sharma and Mohan, 2004) làm cho nồng độ thuốc chống lao trong huyết tương bệnh nhân không đủ cao để có thể tiêu diệt vi khuẩn lao và các quần thể vi khuẩn lao không được tiêu diệt hết, thường sẽ biến đổi, nhằm kháng với các thuốc chống lao bằng nhiều cách, trong đó có việc thay đổi cấu trúc một số gen dẫn đến thất bại trong

điều trị (Faustini et al, 2006) Hiện nay, phác đồ điều trị bệnh lao được WHO đưa

ra bao gồm 5 loại thuốc kết hợp với nhau đó là isoniazid (INH), rifampicin (RMP), pyrazinamid (PZA), streptomycin (SM) và ethambutol (EMB) Với các thuốc chống lao này, việc chữa khỏi bệnh lao có thể đạt được trên 95%; thêm vào

việc giải quyết vấn đề khẩn cấp về tình hình lao kháng thuốc hiện nay (Iseman, 2002) Tuy nhiên, trên thực tế, theo WHO cảnh báo, vẫn còn những bệnh nhân điều trị bằng thuốc chống lao nhưng không đem lại hiệu quả, điều này sẽ dẫn đến

là làm tăng tỷ lệ tử vong cho bệnh nhân lao, tăng gánh nặng bệnh tật cho cộng đồng và xã hội Tại sao lại xảy ra điều đó? Để trả lời câu hỏi này là vấn đề lớn cho xã hội, đặc biệt cho ngành y tế và trên cơ sở đó, việc nghiên cứu tìm hiểu các yếu tố có khả năng ảnh hưởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn lao là rất cần thiết, nhằm có thể đề xuất biện pháp can thiệp đạt kết quả cao, giúp cho việc điều trị bệnh nhân lao ngày càng có hiệu quả

1.2 Giả thuyết khoa học, cách tiếp cận và mục tiêu của luận án

Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 quốc gia có tỷ lệ bệnh lao xuất hiện cao, cũng là một trong 14/27 nước có bệnh lao phổi đa kháng thuốc cao trên thế giới Theo nhận định của Raja (2011), thuốc chống lao giống như con dao hai lưỡi, thuốc có tác dụng diệt vi khuẩn, mặt khác thuốc cũng là nguyên nhân gây kháng

thuốc (Raja et al, 2011) Có nhiều nghiên cứu cho thấy vi khuẩn lao có khả năng

chống lại với các thuốc dùng để điều trị bệnh lao bằng cách thay đổi kiểu gen hoặc làm bất hoạt hệ thống bảo vệ cơ thể của túc chủ thông qua cơ chế trốn thoát hiện tượng thực bào hoặc làm giảm số lượng và chức năng các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch chống vi khuẩn lao, khi nồng độ thuốc chống lao không đạt nồng độ chuẩn trong huyết tương theo khuyến cáo của chương trình chống lao Quốc gia, có thể xảy ra đột biến

kháng thuốc dẫn đến hậu quả là thất bại trong điều trị chống lao (Williamson et al,

2011)

Mối lo ngại trong kiểm soát bệnh lao chính là làm thế nào để phát hiện sớm bệnh lao kháng thuốc (Gillespie, 2002) và quản lý tốt việc điều trị bệnh nhân; Việc này hiện nay đang gặp rất nhiều khó khăn Năm 2012, có khoảng 75% số bệnh nhân tại 27 quốc gia có bệnh lao kháng thuốc cao trên thế giới chưa được phát hiện và quản lý điều trị (WHO, 2013) Hiện nay, các quốc gia phát triển có nền công nghệ sinh học hiện đại, đã ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh lao kháng thuốc nhằm khắc phục việc phát triển rất chậm của vi khuẩn lao trong nuôi cấy, rút ngắn thời gian chẩn đoán xác định lao kháng thuốc

từ 4-10 tuần (qua cách nuôi cấy tự nhiên) xuống còn 1 ngày Việc phát hiện sớm các chủng lao kháng thuốc có ý nghĩa rất lớn trong điều trị bệnh, vì có thể áp dụng phác đồ điều trị đúng, nhằm đạt tỷ lệ thành công cao trong điều trị bệnh nhân lao kháng thuốc Bên cạnh đó, mặc dù các vùng, miền khắp nơi trên thế giới đều áp dụng phác đồ điều trị do WHO đưa ra, nhưng kết quả điều trị ở các nơi lại rất khác nhau, do hiện tượng đột biến của vi khuẩn ở các nơi cũng khác nhau Sự

khác nhau này có thể xảy ra ngay cả trong cùng một quốc gia (Sandgren et al, 2009), (Lishi Qian et al, 2002) Theo Sandgren et al (2009) cần có thêm nhiều

nghiên cứu về kiểu gen gây kháng thuốc của vi khuẩn lao, để có nhận định chính xác hơn, đưa ra khuyến cáo phù hợp hơn trong công tác phòng, chống bệnh lao nói chung và lao đa kháng thuốc nói riêng; trong đó, xét nghiệm phát hiện kháng thuốc rifampicin (RMP) đối với vi khuẩn lao là bắt buộc, bởi vì trong các loại thuốc kết hợp điều trị bệnh lao, RMP là thuốc quan trọng ưu tiên hàng đầu trong chỉ định thuốc chống lao của các bác sĩ Do đó, nếu vi khuẩn lao kháng với thuốc RMP thì sẽ có đến trên 95% số bệnh nhân thuộc nhóm lao đa kháng thuốc (Ormerod, 2005)

Việt Nam đã thực hiện các kỹ thuật nêu trên trong việc phát hiện nhanh bệnh lao kháng thuốc (Đinh Ngọc Sỹ, 2011), trong đó, có phát hiện lao phổi đề kháng thuốc RMP Bệnh viện Lao và Bệnh phổi thành phố Cần Thơ là đơn vị đã

và đang sử dụng một máy Gene-Xpert có khả năng phát hiện lao phổi đề kháng với thuốc RMP chỉ trong vòng 3 giờ bằng kỹ thuật nhận dạng các đột biến gây kháng RMP Tuy nhiên, hiện nay chưa có công trình nghiên cứu nào để đánh giá

về việc phát hiện kiểu gen kháng thuốc RMP của vi khuẩn lao tại thành phố Cần Thơ

Mặt khác, nồng độ thuốc chống lao RMP không đạt chuẩn trong huyết tương có thể là điều kiện thuận lợi gây ra những kiểu gen đột biến kháng thuốc khác nhau của vi khuẩn lao, điều này lại ít được các bác sĩ điều trị quan tâm Ngoài ra, theo WHO cảnh báo, lao kháng thuốc cũng đã xuất hiện với mức độ khá cao trên những bệnh nhân mắc hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (HIV/AIDS); ở những bệnh nhân này, có sự giảm thiểu về số lượng và chất lượng

tế bào lympho T giúp đỡ, là tế bào miễn dịch đóng vai trò chính trong điều hòa đáp ứng miễn dịch của cơ thể, dẫn đến tình trạng cơ thể trở nên đáp ứng kém với thuốc chống lao và tạo điều kiện thuận lợi cho tính kháng thuốc của vi khuẩn lao phát triển Đây là cơ sở cho việc đặt vấn đề nghiên cứu về số lượng các tế bào miễn dịch như là một yếu tố ảnh hưởng đến sự kháng thuốc của vi khuẩn lao ở bệnh nhân lao kháng thuốc Từ các giả thuyết nghiên cứu trên, đề tài được thực hiện nhằm các mục tiêu sau:

a Xác định tỷ lệ kháng thuốc ở bệnh nhân lao phổi tái trị tại thành phố

Cần Thơ

b Tìm hiểu một số yếu tố ảnh hưởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn

lao qua việc xác định (i) Các kiểu gen đột biến kháng thuốc rifampicin của

vi khuẩn lao (ii) Nồng độ thuốc chống lao rifampicin trong huyết tương

của bệnh nhân lao phổi tái điều trị (so sánh với bệnh nhân lao phổi mới)

(iii) Số lượng các tế bào miễn dịch trong máu bệnh nhân lao phổi đa kháng

thuốc (so sánh với bệnh nhân lao phổi mới và người bình thường làm đối chứng)

1.3 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiển của luận án

Luận án đã cung cấp những số liệu cụ thể góp phần làm rõ tình hình dịch tễ bệnh lao kháng thuốc, đặc biệt là dịch tễ học phân tử của lao phổi đa kháng thuốc tại thành phố Cần Thơ Ngoài ra, đề tài cũng cung cấp thêm những cơ sở khoa học cho những giả thuyết về sinh bệnh học kháng thuốc của vi khuẩn lao tại thành phố Cần Thơ, cụ thể:

Kết quả đề tài cho thấy tỷ lệ kháng thuốc của vi khuẩn lao ở bệnh nhân tái trị tại thành phố Cần Thơ cao hơn so với kết quả đã được chương trình chống lao Quốc gia công bố

Kết quả nghiên cứu cũng cung cấp số liệu về tần suất và các kiểu gen đột biến kháng thuốc rifampicin của vi khuẩn lao đa kháng thuốc tại Cần Thơ; tần suất đột biến và các kiểu gen đột biến rất khác nhau khi so sánh với các công trình nghiên cứu khác Kết quả còn cho thấy, ngoài những kiểu gen đột biến đã được công bố, chúng tôi còn phát hiện thêm 2 đột biến mới tại codon 510 và codon 532 trên đoạn gen rpoB ở chủng vi khuẩn lao đa kháng thuốc tại thành phố Cần Thơ Đặc biệt, chúng tôi cũng đã phát hiện có 1 chủng vi khuẩn lao có sự xuất hiện đột biến trên cả 7 codon, đây là kiểu đột biến mà chúng tôi chưa thấy công bố trên các tài liệu tham khảo nào cả trong cũng như ngoài nước

Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu cho thấy có sự giảm thiểu rất đáng lo ngại

về nồng độ thuốc rifampicin trong huyết tương ở các bệnh nhân đang điều trị thuốc chống lao và sự giảm đáng kể số lượng các tế bào lympho T chung, tế bào

T gây độc, tế bào T giúp đỡ và cả tế bào diệt tự nhiên ở các bệnh nhân lao đặc biệt là lao phổi đa kháng thuốc Từ đó, gợi ý rằng có thể đây là những yếu tố thuận lợi làm phát triển đột biến kháng thuốc trên các bệnh nhân; và tình trạng đột biến gây kháng thuốc này sẽ được duy trì và nhân lên theo sự phát triển của vi khuẩn lao kháng thuốc

Những kết quả này có thể làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp sau để khẳng định sự ảnh hưởng của các yếu tố nêu trên, góp phần cung cấp thêm thông tin trong việc đánh giá, tiên lượng bệnh nhân lao phổi đa kháng thuốc trong tương lai

1.4 Kết cấu của luận án

Luận án dài 115 trang, nội dung chính của luận án gồm 5 chương: (i) chương 1: Giới thiệu (5 trang với 4 tiểu mục); (ii) chương 2: Lược khảo tài liệu (34 trang với 6 tiểu mục); (iii) chương 3: Phương pháp nghiên cứu (20 trang có 2 tiểu mục); (iv) chương 4: Kết quả và thảo luận (54 trang với 2 tiểu mục); (v)

chương 5: Kết luận và đề nghị (2 trang với 2 tiểu mục)

Số bảng và hình trong nội dung chính gồm: 30 bảng và 37 hình, bài viết sử dụng 113 tài liệu tham khảo, bao gồm 18 tài liệu tham khảo tiếng Việt và 95 tài liệu tham khảo tiếng Anh

Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về lịch sử phát hiện bệnh lao

Bệnh lao đã có từ rất lâu cùng với lịch sử phát triển của xã hội loài người,

bệnh do một loại vi khuẩn có tên là Mycobacterium tuberculosis gây ra, đây là

loại vi khuẩn đã giết chết nhiều người hơn bất cứ loại vi khuẩn gây bệnh nào khác

trên khắp thế giới (Daniel, 2006) Chi Mycobacterium đã có từ hơn 150 triệu năm

trước, nó được chứng minh đã hiện diện rất sớm từ 5000 năm trước đây ở Ai Cập,

3300 năm ở Ấn Độ và 2300 năm ở Trung Hoa (Daniel, 2006) Lần đầu tiên trên các tài liệu của Hy Lạp, bệnh lao xuất hiện dưới tên gọi là “Phthisis hay Consumption” Vào khoảng năm 460 trước công nguyên, Hyppocrates đã khẳng định bệnh lao là bệnh gây lây lan cho nhiều người nhất trong thời gian đó, những bệnh nhân mắc phải căn bệnh này đều ở lứa tuổi từ 18 đến 35 và hầu hết đều tử vong Lúc bấy giờ, Hyppocrates cũng đã cảnh báo các bác sĩ không nên thăm khám cho những bệnh nhân lao trong giai đoạn bệnh đang tiến triển, để bảo vệ cho chính bản thân của các bác sĩ Mặc dù Aristotle (384-322 BC) đã lưu ý đây là bệnh truyền nhiễm, nhưng những người Hy Lạp lúc đó vẫn cho rằng bệnh lao là

do di truyền Về sau, Clarissimus Galen (131-201 AD), một bác sĩ nổi tiếng sau Hypopcrates, đã xác định bệnh lao là do ổ loét trong phổi, ngực hoặc họng đi kèm

ho, sốt nhẹ và khạc ra mủ, ông cũng mô tả đây là một bệnh của tình trạng suy dinh dưỡng (Pease, 1940 trích dẫn của Juan Carlos Palomino, 2007)

Tại Châu Âu, do việc bùng nổ dân số và sự phát triển quá nhanh của các thành phố lớn, đã khiến châu lục này trở thành trung tâm của dịch bệnh lao có lẽ

từ đầu thế kỷ thứ 17 và tiếp tục cho đến 200 năm sau đó, bệnh lao được biết đến như “Great White Plague” là nguyên nhân chủ yếu dẫn đến tử vong và cái chết do bệnh lao là điều không thể tránh khỏi Ở Châu Âu và Bắc Mỹ, những đặc điểm phổ biến của các thành phố lớn lúc bấy giờ như mật độ dân cư đông đúc, điều kiện vệ sinh thiếu thốn, chính là những nguyên nhân tạo ra dịch bệnh lao tại hai châu lục trên, dịch bệnh này tiếp tục âm ỉ lan rộng ra những châu lục khác do xu hướng thực dân hóa và phong trào thám hiểm để khám phá các vùng đất mới của người Châu Âu Những người Châu Âu di cư đã mang bệnh lao cùng với họ tới những vùng đất mà họ mới đến (Juan Carlos Palomino, 2007) Có khoảng một phần tư dân số Châu Âu đã chết vì bệnh lao, nghiên cứu ở một bệnh viện tại Paris

đã ghi nhận, trong số 696 thi hài được khám nghiệm đã có đến 250 thi hài chết do mắc phải bệnh lao (Dubos, R and J Dubos, 1952 trích dẫn của Smith Issar, 2003) Trước khi Columbus phát hiện ra Châu Mỹ, có rất ít người dân địa phương mắc bệnh lao Mãi cho đến năm 1880, bệnh lao bùng phát chủ yếu trong số những

cư dân địa phương, sau khi họ trở về từ vùng đất dành riêng cho người da đỏ hoặc

bị ép buộc sống trong những trại giam hoặc trại lính tập trung Đến năm 1886, tốc

độ tử vong do bệnh lao đã tăng lên một cách đáng kể với tần suất 9000 người trên 100.000 dân (Bates, 1993 trích dẫn của Juan Carlos Palomino, 2007)

Đối với lục địa Châu Phi, bệnh lao gần như rất ít xuất hiện tại những nơi mà người dân sống trong những vùng xa xôi hẻo lánh, nhưng họ đã bị phơi nhiễm lao khi tiếp xúc với những dân cư đến từ Châu Âu và những người dân Châu Phi bị bắt mang đi làm nô lệ tại Châu Mỹ, sau đó họ được trả tự do và di cư đến các thành phố, theo cách này, bệnh lao đã lây lan và nhanh chóng tăng lên đưa tỉ lệ mắc bệnh lên đến 700 người trên 100.000 dân (Bates, 1993 trích dẫn của Juan Carlos Palomino, 2007)

Riêng các quốc gia thuộc Châu Á, đỉnh điểm của tỉ lệ mắc bệnh lao được ghi nhận ở hai nước Ấn Độ và Trung Hoa vào cuối thế kỷ thứ 19 (Juan Carlos Palomino, 2007)

Năm 1882, một nhà bác học người Đức Robert Kock (1843-1910) đã tìm ra

loại trực khuẩn gây ra bệnh lao, do đó, trực khuẩn này còn có tên gọi là Bacilli de

Kock, viết tắt là BK Ngày nay, vi khuẩn lao có tên khoa học là Mycobacterium tuberculosis.

2.2 Vi khuẩn lao

2.2.1 Phân loại vi khuẩn lao

Vi khuẩn lao được phân loại theo sách Bergeys như sau:

Giới (Kingdom): Bacteria

Ngành (Phylum): Actinobacteria

Bộ (Order): Actinomycetales

Dưới bộ (Suborder): Corynebacteriaceae

Họ (Family): Mycobacteriaceae

Chi (Genus): Mycobacterium

Loài (Species): M tuberculosis

(Zopf, 1883)

2.2.2 Cấu tạo của vi khuẩn lao

Trực khuẩn lao gồm có các thành phần như: lipid (lớp sáp) chiếm 40% trọng lượng khô, các chất lipid có mối liên hệ chặt chẽ với cấu trúc vách tế bào làm cho

vi khuẩn có tính kháng acid Đây là đặc điểm cấu tạo của trực khuẩn lao khác với các vi khuẩn khác, lớp sáp đã được phân tích có nhiều yếu tố gây bệnh, có yếu tố chỉ mang tính kháng nguyên, cùng với các thành phần khác như protein, polysaccharide…vi khuẩn có nhiều yếu tố sợi ở vách và chất nguyên sinh là những yếu tố gây bệnh (Đoàn Thị Nguyện, 2009)

Hình 2.1 Cấu trúc vách tế bào của vi khuẩn lao Nguồn http://www.hindawi.com/journals/cdi/2011/405310/fig1/

Cấu trúc vách tế bào của vi khuẩn lao với những thành phần chủ yếu bao

gồm: (i) Lớp lipid bên ngoài, (ii) Lớp acide mycolic, (iii) Lớp polysaccharide (arabinogalactan), (iv) Lớp peptidoglycan, (v) Lớp lipoarabinomannan (LAM),

(vi) Lớp phosphatidylinositol mannoside (PIM), (vii) Lớp màng plasma

2.2.3 Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn lao

Vi khuẩn lao là loại sinh sản chậm, vi khuẩn “nằm vùng” ở nơi tổn thương rất lâu (Persister) Ở điều kiện tự nhiên, vi khuẩn tồn tại 3–4 tháng Trong phòng thí nghiệm, có thể bảo quản vi khuẩn trong nhiều năm Trong đàm của bệnh nhân lao ở phòng tối, ẩm sau 3 tháng, vi khuẩn này vẫn tồn tại và còn giữ được độc lực Dưới ánh nắng mặt trời, vi khuẩn bị chết sau 1 giờ 30 phút Ở 420C, vi khuẩn ngừng phát triển và ở nhiệt độ 800

C, vi khuẩn chết sau 10 phút; Với cồn 900, vi khuẩn tồn tại được ba phút, trong acid phenic 5%, vi khuẩn sống được một phút

Vi khuẩn lao cần đủ oxy, điều này giải thích tại sao lao phổi là thể hay gặp nhiều nhất (Trần Văn Sáng, 2007)

2.2.3.1 Đặc điểm nhuộm và soi dưới kính hiển vi của vi khuẩn lao

Nhuộm bằng phương pháp Ziehl-Neelsen, vi khuẩn lao bắt màu đỏ, không

có vỏ, không có lông, không có nha bào, trong bệnh phẩm, trực khuẩn lao thường

đứng thành từng đám nối đầu vào nhau Kích thước từ 0,5µm x 2-5µm (xem Hình

2.2) (Lê Huy Chính, 2013)

Hình 2.2 Vi khuẩn lao nhuộm bằng phương pháp Ziehl-Neelsen

(thực hiện tại BV Lao và Bệnh phổi Cần Thơ)

2.2.3.2 Đặc điểm nuôi cấy của vi khuẩn lao

Đây là một xét nghiệm có độ đặc hiệu rất cao, vì mỗi một vi khuẩn lao sẽ mọc thành một khuẩn lạc, rất dễ quan sát bằng mắt thường và khả năng phát hiện

sẽ tăng hơn 30-50% so với phương pháp soi kính hiển vi Vi khuẩn lao chỉ nhân lên được ở trong môi trường nuôi cấy đặc biệt chứa đầy đủ chất đường, đạm, dưỡng khí, các loại muối, các vitamin, pH từ 6,8 đến 7,2 và nhiệt độ từ 370

Hình 2.3 Khuẩn lạc của vi khuẩn lao trên môi trường nuôi cấy Lowenstein Jensen

Hình 2.4 Vi khuẩn lao chụp phóng đại x7.500 qua KHV điện tử quét (SEM-JSM 5550)

(chụp tại phòng Thí nghiệm Chuyên sâu - Đại học Cần Thơ)

2.2.3.3 Đặc điểm lây truyền và gây bệnh của vi khuẩn lao

Trực khuẩn lao lây truyền từ người này sang người khác, qua những giọt nước bọt bắn ra từ người đang mắc bệnh lao và người lành hít phải những giọt nước bọt này Có hai kiểu tổn thương chủ yếu ở phổi: tổn thương dạng bài tiết (sự đáp ứng của viêm cấp) và tổn thương dạng hạt Tuy nhiên, chỉ khoảng 10% số

người nhiễm lao trở thành bệnh nhân lao (Trần Văn Sáng, 2007), (Flynn et al,

2011)

Hình 2.5 Đường lây truyền của vi khuẩn lao

Nguồn: http://www.cdc.gov/contact/

Vi khuẩn lao M tuberculosis là một vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, là tác nhân

gây bệnh nội bào, vị trí ưa thích của loài vi khuẩn này là mô phổi, một tổ chức rất giàu oxy Vi khuẩn đi vào cơ thể qua đường hô hấp, sau đó lan rộng từ vị trí nhiễm trùng đầu tiên ở phổi đến hạch bạch huyết hoặc máu để đến các nơi khác trong cơ thể, vùng đỉnh phổi và các nốt hạch là nơi cư trú ưa thích của vi khuẩn này (Raja, 2004)

Hình 2.6 Quá trình nhiễm lao Nguồn http://www.annualreviews.org/

2.2.4 Hệ gen của vi khuẩn lao

Hệ gen của vi khuẩn lao đã đƣợc giải trình tự có chiều dài 4.411.522 cặp base, trong đó, có 3.924 trình tự đƣợc dự đoán là có mã hóa protein, tỷ lệ G+C chiếm đến 65,6% Genome của vi khuẩn lao có chứa tới 90,8% trình tự mã hóa

protein và chỉ có 6 gen giả (Cole et al, 1998)

Hình 2.7 Bản đồ nhiễm sắc thể của vi khuẩn lao

Nguồn: Cole.S.T et al, 1998

2.2.5 Đặc tính đột biến kháng thuốc ở các loài vi khuẩn nói chung và vi khuẩn lao nói riêng

Thuốc kháng sinh được coi là một giải pháp cho loài người trong phòng tránh và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, nhờ có thuốc kháng sinh mà chúng ta có thể kiểm soát được nhiều dịch bệnh, có nhiều loại kháng sinh, nhưng dù là loại nào thì chúng đều có một tác dụng chung là ức chế và tiêu diệt vi khuẩn Cơ chế tác dụng dược lý của mỗi thuốc là khác nhau và tính nhạy cảm của các vi khuẩn đối với mỗi thuốc cũng khác nhau, vì thế, chúng ta cần có nhiều loại thuốc kháng sinh, để đẩy lùi tất cả những mầm bệnh này Hiện nay, vi khuẩn đang có xu hướng kháng lại các loại thuốc kháng sinh Việc kháng thuốc kháng sinh là một mối hiểm họa lớn, vì những vi khuẩn kháng thuốc sẽ nhân lên nhanh chóng, di truyền tính kháng thuốc cho các thế hệ vi khuẩn con cháu, các vi khuẩn này lại lây lan sang những người xung quanh và con người khi mắc bệnh do vi khuẩn kháng thuốc gây ra, sẽ có ít cơ hội để được điều trị khỏi bệnh Một trong những phương cách kháng thuốc chính là xảy ra hiện tượng đột biến trong quá trình vi khuẩn sinh sôi nảy nở của loài Đột biến được hiểu theo nghĩa rộng là chỉ các biến đổi di truyền xảy ra đột ngột ở một thời điểm trong quá trình nhân lên của vi khuẩn Từ xa xưa con người đã nhận thấy có nhiều kiểu đột biến tự nhiên, có

nhiều giống cây trồng và vật nuôi được sinh sản bắt nguồn từ các gen có đột biến Đột biến gen là đột biến theo nghĩa hẹp, chỉ những biến đổi xảy ra bên trong cấu trúc gen Mỗi đột biến gen dẫn đến sự thay đổi trình tự các nucleotid tạo ra các alen khác nhau Đột biến có thể do biến đổi nhiều nucleotid, hoặc 1 nucleotid, loại đột biến này không phát hiện được khi quan sát tế bào, đột biến có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu di truyền học Các đột biến bao gồm nhiều loại khác nhau và đột biến gen bắt nguồn từ những biến đổi phân tử trên ADN, con người có thể sử dụng các tác nhân vật lí và hóa học gây nên các đột biến nhân tạo hay cảm ứng, trong tự nhiên, dù giữ trong điều kiện nào tất cả các gen đều có thể đột biến, được gọi là đột biến tự nhiên hay ngẫu nhiên (spontanous mutation) Các đột biến tự nhiên thường xuất hiện rất ít và khái niệm tần số đột biến được dùng để đánh giá mức độ xuất hiện nhiều hay ít đột biến ở một gen Các gen khác nhau của cùng 1 sinh vật có thể có tần số đột biến khác nhau Nhưng tần số đột biến tự nhiên đối với mỗi gen là một số ổn định Tần số đột biến được đánh giá theo các căn cứ khác nhau như: trên 1 lần sao chép, 1 lần phân bào hay trên 1 giao tử và trên 1 tế bào của 1 thế hệ Ví dụ như vi khuẩn lao từ chủng nhạy cảm với rifampicin sang kháng với rifampicin tức là RMP nhạy  RMP kháng với tần số 2,25.10-10 đột biến tính trên 1 tế bào/1 thế hệ và ta có thể tính ngược lại, tức là trong 10 tỉ tế bào của một thế hệ có trên 2 đột biến kháng RMP xuất hiện ngẫu nhiên Tương tự với các thuốc chống lao khác, như isoniazid (tức INH nhạy  INH kháng) với tấn số 2,56.10-8, thuốc streptomycin (tức S nhạy  S kháng) với tấn số 2,95.10-8, thuốc ethambutol (tức E nhạy  E kháng) với tần số 2,95.10-7 (David, 1970) Tuy tần

số đột biến của từng gen là rất thấp, nhưng tổng các đột biến của nhiều gen là một

số đáng kể và có ý nghĩa quan trọng cho sự tiến hóa của loài Đột biến ảnh hưởng đến mọi tính trạng khác nhau của sinh vật và tác động theo mọi hướng Như vậy, loại đột biến ở vi sinh vật có ý nghĩa quan trọng đối với di truyền phân tử, đó là đột biến gen hay sự biến đổi ADN, thường liên quan đến 1 nucleotit hay 1 cặp nucleotit Có 3 loại đột biến gen đó là thay thế base, thêm base hay mất base (xem Hình 2.8)

Hình 2.8 Các loại đột biến điểm Nguồn: http://catalog.flatworldknowledge.com/users/sign_in

2.2.5.1 Các kiểu đột biến gen ở các loài vi khuẩn

a Kiểu đột biến thay thế base (base substitutions)

Đột biến thay thế bazơ hay còn gọi là đột biến điểm là loại thường gặp nhất,

có hai kiểu thay thế (i) Sự đồng chuyển (transition): thay cặp G-C bằng A-T và ngược lại (ii) Sự đảo chuyển (transversion): thay A-T bằng T-A và ngược lại

Hình 2.9 Kiểu đột biến thay thế base Nguồn http://en.wikipedia.org/wiki/File:Transitions-transversions-v3.png

b Kiểu đột biến mất base (deletion)

Là loại đột biến dẫn đến sự dịch mã lệch khung, làm thay đổi trình tự các acid amin của các phân tử protein từ điểm biến đổi trở về sau và từ bộ ba bị sai, sự sai sót sẽ kéo dài liên tục đến cuối mạch polypeptit

C Kiểu đột biến thêm base (insertion)

Là sự thêm base vào phân tử ADN, đột biến loại này cũng làm sai lệch trình

tự của các codon mã hóa cho các acid amin, nên cũng gây nên sự thay đổi trình tự các loại acid amin Những đột biến điểm xảy ra trên những trình tự mã hóa cho các protein, có thể gây nên các dạng như đột biến sai nghĩa (missense) sẽ có hậu quả là thay đổi từ axit amin này thành axit amin khác trong mạch polypeptit, hoặc là đột biến vô nghĩa (nonsense) hay đột biến im lặng (silent) sẽ không ảnh hưởng đến mạch polypeptit

Hình 2.10 Các dạng ảnh hưởng của đột biến điểm Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Point_mutations-en.png

2.2.5.2 Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao

Theo WHO, hiện nay tình trạng vi khuẩn lao kháng thuốc đang là mối lo ngại trên toàn cầu, vi khuẩn lao kháng lại các thuốc chống lao theo nhiều cơ chế khác nhau:

a Cơ chế kháng thuốc là một đặc tính chung của một loài nguyên vẹn hoặc

do đột biến gen mắc phải hoặc do vận chuyển gen, gen kháng thuốc nằm trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn Gen kháng thuốc mã hoá thông tin, từ đó vi sinh vật

sử dụng để chống lại hiệu lực ức chế đặc hiệu của kháng sinh theo các cơ chế sau

đây: Làm giảm tính thấm của màng bào tương, làm thay đổi đích tác động của kháng sinh (thay đổi cấu trúc của phân tử mà kháng sinh tác động), tạo ra các bơm (efflux) có tác dụng bơm tích cực kháng sinh ra khỏi tế bào, tạo ra enzym (do gen đề kháng tạo ra) có thể làm biến đổi hoặc phá huỷ cấu trúc hoá học của phân tử kháng sinh làm bất hoạt thuốc kháng sinh (Wright, 2010)

Hình 2.11 Các cơ chế kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Nguồn http://www.britannica.com/media/full/129670

b Một số gen kháng thuốc của vi khuẩn lao đã được nghiên cứu: Hiện

nay, người ta đã xác định được bản đồ gen và nhiều mã gen kháng thuốc của vi khuẩn lao, trong đó có các loại kháng như vi khuẩn kháng rifampicin mang đột biến ở gen rpoB, mã hoá cho quá trình tổng hợp ARN Polymerase; vi khuẩn kháng isoniazid mang đột biến ở gen Kat G, Inh A, ahp C; vi khuẩn kháng streptomycin và các amynoglycozid mang đột biến ở gen rrS, rpsL, hoặc cả hai gen này; vi khuẩn kháng pyrazinamid mang đột biến ở gen pnc A

2.3 Đáp ứng miễn dịch trong bệnh lao và khả năng tồn tại của vi khuẩn lao trong

cơ thể vật chủ

Khi nhiễm lao, đầu tiên các đại thực bào ở phế nang thực hiện quá trình thực bào vi khuẩn, đây là hiện tượng miễn dịch không đặc hiệu, xảy ra trong mối tương tác giữa vật chủ với tác nhân gây bệnh; Tương tác này sẽ quyết định hậu

quả của tình trạng nhiễm trùng về sau (McDonough et al, 1993), (Flynn et al,

2011) Từ 2-6 tuần đầu sau nhiễm trùng, quá trình đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào (CMI) bắt đầu xuất hiện, khi đó có hiện tượng di chuyển của các tế

bào lympho, các đại thực bào đã được hoạt hóa đến nơi tổn thương lao (có mặt vi khuẩn lao), dẫn đến sự hình thành các u hạt (granuloma) (Davis and

Ramakrishnan, 2009), (Crevel et al, 2002)

Sự tăng trưởng theo cấp số nhân của vi khuẩn lao sẽ được kiểm soát Tại vị trí tổn thương lao, các đại thực bào bị chết sẽ hình thành một hoại tử bã đậu gọi là caseum Các vi khuẩn lao hiện diện ở trung tâm vùng hoại tử của u hạt, chúng vẫn còn tồn tại rất lâu và có khả năng sẽ tái hoạt động sau đó, hoặc chúng có thể bị thải ra môi trường bên ngoài qua đường thở sau khi phát triển và gia tăng về số

lượng (Crevel et al 2002) (xem Hình 2.12)

Vi khuẩn lao sẽ gây hoại tử các phế quản tận, tạo nên các hốc nang (cavitation), kèm theo quá trình xơ hóa và hiện tượng này được xem như là cơ chế bảo vệ, là chiến hào cuối cùng (last-ditch) của vật chủ, hay đó chính là khả năng hình thành bức tường chống nhiễm trùng cuối cùng khi các cơ chế miễn dịch bảo vệ khác bị thất bại

Hình 2.12 Sự hình thành u hạt (granuloma) và hoại tử bã đậu (caseum) trong nhiễm lao

2.3.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu chống vi khuẩn lao

2.3.1.1 Quá trình thực bào vi khuẩn lao của đại thực bào

Trước tiên, các đại thực bào sẽ gắn lên bề mặt của các tế bào vi khuẩn lao

để hình thành những túi thực bào phagosom-lysosom (đây là quá trình ức chế hoặc giết các vi khuẩn lao); kèm theo đó, có sự chiêu mộ (thu hút) các tế bào có thẩm quyền miễn dịch gây nên phản ứng viêm tại chỗ, đồng thời cũng xảy ra quá trình trình diện kháng nguyên của vi khuẩn lao cho tế bào lympho T nhận biết

(đáp ứng miễn dịch đặc hiệu) (Puig-Kroger et al, 2004), Condos et al, 1998)

a) Cơ chế gắn kết

Các đại thực bào hay tế bào đơn nhân gắn kết được với vi khuẩn lao là do trên bề mặt các tế bào này có các thụ thể của bổ thể (CR), thụ thể đường mannose (MR) và các phân tử thụ thể khác, vị trí gắn kết là phân tử glycoprotein như

lipoarabinomannan (LAM) có trên vách tế bào của vi khuẩn lao (Bermudez et al, 1997), (Chan et al, 1991), (Hunter and Brennan, 1990) (xem Hình 2.13)

Ngoài ra, phân tử PGE2 (prostaglandin E2) và IL-4 (một cytokine do tế bào Th2 của vật chủ tiết ra) có tác dụng điều hòa, làm tăng khả năng bộc lộ thụ thể CR và MR, làm tăng khả năng hoạt động chức năng của đại thực bào Thụ thể CD14 và các thụ thể scavenger cũng có vai trò là các thụ thể protein bề mặt có tác

dụng gắn kết với vi khuẩn (Bernado et al, 1998), (Ernst, 1998), (Peterson et al,

1995)

Hình 2.13 Vi trí gắn kết của vi khuẩn lao và các tế bào thực bào

Nguồn: www.vigilanciasanitaria.es/en/articles/visavet-outreach-journal.php

b) Tác dụng của túi thực bào (phagolysosom)

Nhờ những men thủy phân có tính acid trong lysosome, vi sinh vật bị thực bào đều bị tiêu hủy bên trong túi thực bào Hiện tượng này được kiểm soát chặt chẽ, góp phần vào cơ chế chống vi sinh vật rất có hiệu quả của các tế bào thực

bào Hart et al, (1972) đặt ra giả thuyết là việc ngăn ngừa sự hình thành nên túi

thực bào (phagolysosome) là một cơ chế khiến cho vi khuẩn lao tồn tại và có khả năng sống sót bên trong đại thực bào Giả thuyết khác cho rằng chất sulphatid của

vi khuẩn lao (một chất có nguồn gốc từ trehalose 2-sulphat bị đa acyl hóa) là chất

có khả năng ức chế túi thực bào phagolysosome Trong các nghiên cứu in vitro

cho thấy, vi khuẩn lao có khả năng tạo ra môi trường có rất nhiều muối ammonia, điều này có thể là nguyên nhân gây ức chế hiện tượng thực bào Đại thực bào sẽ

xử lý vi khuẩn lao sau khi nuốt, bằng cách tạo ra các chất trung gian oxy hoạt hóa (ROI), chất trung gian nitơ hoạt hóa (RNI) và một số cơ chế khác qua các cytokine (xem Hình 2.14)

- Chất trung gian oxy hoạt hóa (ROI) như H2O2 (hydrogen peroxide) là một trong số các chất ROI được tạo ra bởi đại thực bào, thông qua việc tăng quá trình oxy hóa, là phân tử hiệu ứng được xác định có tác dụng diệt vi khuẩn của các đại thực bào đơn nhân Tuy nhiên, khả năng các chất ROI giết chết vi khuẩn lao chỉ được thấy ở chuột và vẫn còn cần được nghiên cứu để khẳng định ở người Các nghiên cứu của Raja (2004) cho thấy, nhiễm vi khuẩn lao dẫn đến hiện tượng tích tụ các đại thực bào ở phổi với khả năng sản sinh H2O2, nhưng sự tăng sản xuất các hydrogen peroxide từ các đại thực bào phế nang thì không đặc hiệu cho vi khuẩn lao Hơn nữa, các đại thực bào phế nang sản xuất H2O2 ít hơn

so với các đại thực bào đơn nhân của máu

- Chất trung gian nitơ hoạt hóa (RNI): các tế bào thực bào tăng hoạt hóa

nhờ chất IFN-γ và TNF-α, sẽ tạo ra nitrit oxid (NO) và RNI có liên quan đến con đường tổng hợp NO (iNOS2) do sử dụng L-arginin làm cơ chất Ý nghĩa của các chất oxid nitơ gây độc này trong khả năng bảo vệ vật chủ chống lại vi khuẩn lao

đã được ghi nhận rất rõ cả trong in vitro và in vivo, cụ thể, trên thực nghiệm ở hệ

thống miễn dịch của chuột: ở những con chuột GKO (đã knock-out gen) iNOS2,

vi khuẩn lao sinh sôi nhanh hơn rất nhiều so với loài chuột hoang dại, điều đó cho thấy vai trò quan trọng của NO trong cơ chế bảo vệ vật chủ đối với vi khuẩn lao

Cũng trong nghiên cứu của Raja (2004), các đại thực bào ở màng bụng của

chuột được gây nhiễm in vitro với vi khuẩn lao, theo dõi các quá trình xảy ra bên

trong các đại thực bào, sự thay đổi về nồng độ của NO, H2O2 và các enzyme của lysosom như acid phosphatase, capthesin-D và β-glucoronidase cũng được nghiên

acid phosphatase và β-glucoronidase Tuy nhiên, người ta thấy rằng các chất diệt

vi khuẩn này không loại trừ được khả năng sống sót bên trong tế bào của vi khuẩn lao

Vai trò của RNI trong nhiễm trùng ở người vẫn còn bàn cãi và khác so với loài chuột, vitamin D3 (1,25-dihydroxy vitamin D3 [1,25-(OH)2D3]) được ghi nhận là một chất làm tăng bộc lộ NOS2, tạo hoạt động ức chế vi khuẩn lao ở dòng

tế bào giống đại thực bào HL-60 của người Chính vì thế, kết quả này xác định

NO và RNI có liên quan với khả năng chống lao và được xem là các yếu tố chống

vi khuẩn lao do đại thực bào của người sản xuất Sự bộc lộ nồng độ cao của NOS2 được phát hiện bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch ở đại thực bào được lấy từ

dịch rửa phế quản phổi (BAL) ở những người bệnh lao phổi hoạt động (Chan et

al, 1992), (MacMicking et al, 1997), (Nicholson et al, 1996), (Nozaki et al,

1997)

Ngoài ra, còn có các cơ chế ức chế hoặc giết chết vi khuẩn lao do các hiệu

ứng chống vi khuẩn qua IFN-γ và TNF-α đã được báo cáo (Ray et al, 2009)

(Hình 2.14)

Hình 2.14 Vai trò của IFN-γ và TNF-α Nguồn: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1473309903005450#gr1

c) Sự chết lập trình của đại thực bào

Một cơ chế rất có hiệu quả khác, liên quan đến khả năng bảo vệ của đại thực bào trong việc chống lại vi khuẩn lao là quá trình tự chết lập trình (apotosis) của đại thực bào sau khi nuốt vi khuẩn lao (xem Hình 2.15)

Tác giả Molloy et al (1994) nghiên cứu cho thấy rằng sự chết lập trình của

đại thực bào đã tạo nên khả năng sống sót của vi khuẩn lao Tuy nhiên, các ảnh hưởng của sự chết lập trình (thông qua Fas L- hay do TNF-α gây ra) tạo khả năng tồn tại của vi khuẩn lao ở người và ở các đại thực bào chuột là điều vẫn còn đang bàn cãi; một số nghiên cứu ghi nhận, số lượng vi khuẩn lao bị giảm sau quá trình chết lập trình của đại thực bào; trong khi ở những nghiên cứu khác, lại cho rằng

cơ chế này có rất ít hiệu quả chống vi khuẩn lao (Raja, 2004)

Hình 2.15 Sự chết lập trình và hoại tử của các đại thực bào nhiễm vi khuẩn lao

Nguồn:http://www.nature.com/ Review/immunol

Quá trình thực bào và sự bài tiết IL-2 là các quá trình xử lý khởi đầu để

hình thành một phần của đáp ứng miễn dịch bẩm sinh (Pryjma et al, 1994), ngoài

ra, còn có các thành phần khác của miễn dịch không đặc hiệu, đó là sức đề kháng

tự nhiên của cơ thể có liên quan đến, nhƣ protein của đại thực bào, các tế bào Neutrophil, tế bào NK (tế bào giết tự nhiên) (Raja, 2004) (xem Hình 2.16)

Hình 2.16 Cơ chế miễn dịch tự nhiên trong nhiễm lao

vệ, mà các chất này không tìm thấy ở các đại thực bào

2.3.1.3 Vai trò của tế bào diệt tự nhiên (NK) trong đáp ứng miễn dịch chống

vi khuẩn lao

Tế bào diệt tự nhiên (NK: natural killer) là các tế bào có vai trò quan trọng trong miễn dịch bẩm sinh Các tế bào này có thể ly giải trực tiếp các tác nhân

bệnh, hoặc có thể ly giải các tế bào đơn nhân đã bị nhiễm vi khuẩn lao Trong

môi trường nuôi cấy in vitro có chứa vi khuẩn lao sống đã gây ra sự lan rộng các

tế bào NK, điều này cho thấy, chúng có thể là các tế bào chịu trách nhiệm quan

trọng đối với nhiễm lao in vivo Trong quá trình nhiễm trùng lao ban đầu, các tế

bào NK có khả năng hoạt hóa các tế bào thực bào tại vị trí nhiễm trùng Sự suy giảm trầm trọng hoạt động của tế bào NK có liên quan đến tình trạng đa kháng thuốc của vi khuẩn lao (MDR-TB) Nghiên cứu hoạt động của NK trong dịch rửa phế quản phổi cho thấy, các loại lao phổi khác nhau sẽ có mức độ ức chế khác nhau, sự chết lập trình là một cơ chế khả dĩ của quá trình gây độc tế bào của NK,

tế bào NK tạo ra IFN-γ và có thể ly giải tế bào đích bị nhiễm vi khuẩn lao (Flynn

et al, 1993)

Nghiên cứu của Raja (2004) cho thấy hoạt động NK rất thấp trong nhiễm lao, có lẽ là hậu quả chứ không phải là nguyên nhân đối với bệnh này Vấn đề hỗ trợ làm tăng hoạt động của NK với các cytokine được xem như là biện pháp điều trị hỗ trợ mạnh mẽ đối với hóa trị liệu trong điều trị bệnh lao

2.3.1.4 Vai trò của các thụ thể TLR trong nhận biết vi khuẩn lao

Khám phá gần đây về tầm quan trọng của họ protein thụ thể Toll-like receptor (TLR) trong đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thích nghi, sự tương tác giữa vi khuẩn lao và thụ thể TLR thì khá phức tạp và dường như những thành phần cấu tạo của vi khuẩn lao riêng biệt có thể tương tác với các nhóm khác nhau của họ thụ thể TLR Về mặt miễn dịch học, vi khuẩn lao có thể hoạt hóa các

tế bào theo thụ thể TLR2 hoặc TLR4 qua CD14-độc lập, một phối tử gắn-đặc

hiệu (Drage, et al, 2009), (Kasmi et al, 2008), (Means et al, 1999)

2.3.2 Khả năng tồn tại của vi khuẩn lao sau đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu

Vi khuẩn lao được trang bị rất nhiều chiến lược xâm nhập vào hệ miễn dịch, bao gồm từ sự thay đổi quá trình trình diện kháng nguyên, cho đến khả năng

có thể tránh né được sự tiêu diệt của tế bào lympho T Một số loại protein được tiết ra từ vi khuẩn lao, như superoxide dismutase và catalase, đều là các chất đối kháng với các chất ROI của đại thực bào Các thành phần cấu tạo của vi khuẩn lao như sulphatide, LAM, PGL-I (phenolic-glycolipid I) có tác dụng chống lại tác

dụng của các gốc oxy hóa mạnh (Chan et al, 1991) Các đại thực bào bị nhiễm vi

khuẩn lao, dường như bị giảm khả năng trình diện kháng nguyên cho T CD4+, làm kéo dài hiện tượng nhiễm trùng Một cơ chế khác mà các tế bào trình diện kháng nguyên (APCs) góp phần thúc đẩy, làm tăng khả năng phát triển và tăng

các chức năng của những tế bào T, bằng cách sản xuất các cytokine bao gồm TGF-β, IL-10 hay IL-6 bị thiếu hụt (Raja, 2004)

2.3.3 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống vi khuẩn lao

2.3.3.1 Đáp ứng miễn dịch dịch thể

Vi khuẩn lao M tuberculosis, là một tác nhân gây bệnh nội bào, nên các

thành phần kháng thể huyết thanh không thể tiếp cận được và không có vai trò bảo vệ vật chủ Mặc dù rất nhiều nhà nghiên cứu đã loại trừ vai trò của tế bào B (CD19) hay kháng thể trong bảo vệ chống lao, nhưng một số nghiên cứu gần đây gợi ý rằng, chúng cũng có góp phần ít nhiều vào đáp ứng chống lao

Các kháng nguyên lao tạo đáp ứng miễn dịch dịch thể ở người được nghiên cứu, chủ yếu với quan điểm xác định các kháng nguyên có liên quan về

mặt chẩn đoán bệnh lao (Raja, 2004), (Nules-Alves et al, 2014)

2.3.3.2 Đáp ứng miễn dịch tế bào

Vi khuẩn lao là một minh họa cổ điển cho tác nhân gây bệnh mà khả năng

bảo vệ của vật chủ dựa vào đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào (Comas et al,

2010) Trong thập niên 1980, các nghiên cứu đã xác định được các tế bào lympho

T CD4+ sản xuất IFN-γ (cũng là các tế bào Th1), là quần thể tế bào lympho T chủ yếu tham gia đáp ứng miễn dịch chống vi khuẩn lao Đến thập niên 1990, vai trò của các tế bào T CD8+, iNKT và γδ T cũng thấy khá quan trọng trong kiểm soát

bệnh lao (Nules-Alves et al, 2014) (xem Hình 2.17)

Trên mô hình chuột, trong vòng 1 tuần bị nhiễm vi khuẩn lao cực độc, số lượng các tế bào T CD4+ và T CD8+ hoạt hóa trong các hạch lympho dẫn lưu ở phổi gia tăng lên, trong khoảng 2-4 tuần sau nhiễm trùng, cả T CD4+ và T CD8+

di chuyển đến phổi, điều này cho thấy các tế bào lympho T hoạt hóa di chuyển đến vị trí nhiễm trùng và tương tác với các tế bào trình diện kháng nguyên

(Chackerian et al, 2002)

a) Các tế bào T CD4+

Vi khuẩn lao cư trú trong không bào bên trong các đại thực bào, nên sự trình diện các kháng nguyên vi khuẩn lao trong khuôn MHC lớp II trên màng đại thực bào là có liên quan đến các tế bào lympho T CD4+ Đây là các tế bào quan trọng nhất trong đáp ứng miễn dịch chống vi khuẩn lao, với vai trò kiểm soát nhiễm trùng Ở người, cơ chế bệnh sinh của nhiễm HIV cho thấy việc mất các tế bào T CD4+ làm gia tăng tính nhạy cảm rất lớn đối với nhiễm lao cấp tính và cả

nhiễm lao tái hoạt động (Raja, 2004), (Nules-Alves et al, 2014) Chức năng hiệu

ứng chính của tế bào T CD4+

là sản xuất IFN-γ và những cytokine khác để hoạt hóa các đại thực bào, chất IFN-γ làm hoạt hóa đại thực bào để giết chết vi khuẩn lao bằng cách hoạt hóa nhiều cách thức hiệu ứng chống lao, gồm tổng hợp nitric oxid cảm ứng (iNOS), GTPase cảm ứng do IFN-γ, sự chín mùi và acid hóa của túi thực bào, sự tự tiêu (autophagy) và con đường tín hiệu thông qua thụ thể vitamin

D (Nules-Alves et al, 2014) Như vậy, việc khám phá ra IFN-γ do các tế bào

lympho T tạo ra, đã trở thành một yếu tố được ứng dụng rộng rãi nhất trong vấn

đề theo dõi đáp ứng miễn dịch sau khi nhiễm trùng hay tiêm vacxin

Ở những con chuột CD4-/- hay MHC lớp II-/- thì nồng độ IFN-γ giảm trầm trọng và rất sớm trong nhiễm trùng Sự biểu lộ NOS2 của đại thực bào cũng

bị trì hoãn ở những con chuột thiếu tế bào T CD4+, ngược lại, với loài chuột hoang dại xuất hiện các nồng độ NOS2 tương xứng với sự biểu lộ IFN-γ Trong

mô hình nhiễm lao mạn tính ở chuột, sự kiệt quệ tế bào T CD4+ gây ra sự tái hoạt động nhiễm lao rất nhanh Tuy nhiên, nồng độ IFN-γ lại giống nhau ở các con chuột bị mất tế bào T CD4+

và ở các con chuột chứng, bởi vì, sự sản xuất IFN-γ còn được tạo ra bởi các tế bào T CD8+ Hơn nữa, không có thay đổi khác biệt nào

ở sự sản xuất NOS2 hay hoạt động của đại thực bào ở những con chuột bị cạn kiệt

tế bào T CD4+ Điều này cho thấy, cơ chế kiểm soát lao phụ thuộc-T CD4+ độc lập với việc tạo NOS2 và IFN-γ (Raja, 2004) Quá trình chết lập trình hay ly giải

tế bào bị nhiễm lao của tế bào T CD8+

cũng góp phần kiểm soát quá trình nhiễm lao Vì thế, các chức năng khác của T CD4+ trong đáp ứng bảo vệ, được cho là có những liên quan chặt chẽ trong đáp ứng miễn dịch với mục tiêu để thiết kế

vaccine (Nules-Alves et al, 2014)

b) Các tế bào T CD8+

Các tế bào CD8+

cũng có khả năng bài tiết các cytokine như IFN-γ và

IL-4, vì thế cũng có vai trò điều hòa cân bằng các tế bào Th1 và Th2 ở phổi của những bệnh nhân mắc lao phổi Cơ chế mà các protein của vi khuẩn lao được tế bào T CD8+ tiếp cận thông qua phân tử MHC lớp I thì chưa được biết rõ Các vi khuẩn lao hiện diện trong túi thực bào của đại thực bào, nhưng cũng được thấy hiện diện bên ngoài túi thực bào sau 4-5 ngày nhiễm trùng Việc trình diện kháng nguyên lao của đại thực bào bị nhiễm lao cho tế bào T CD8+ có thể xảy ra sớm sau 12 giờ nhiễm trùng Các kết quả nghiên cứu cung cấp bằng chứng rằng vi khuẩn lao có khả năng phá vỡ màng của không bào bao quanh vi khuẩn lao, giúp kháng nguyên lao hiện diện trong bào tương của tế bào bị nhiễm

Một nghiên cứu về các quần thể tế bào T CD4+

và CD8+ ở các bệnh nhân

có sự thoái lui bệnh lao nhanh, chậm và vừa trong quá trình điều trị, đã phát hiện

rằng, những bệnh nhân có sự thoái lui bệnh chậm có liên quan đến tình trạng tăng

số tế bào T CD8+

trong dịch rửa phế quản phổi Một nghiên cứu khác cũng đã phát hiện, tế bào T CD8+ tăng lên trong dịch rửa phế quản phổi của bệnh nhân có tình trạng lao đang hoạt động Như vậy, các nghiên cứu này đã chỉ ra vai trò to lớn của tế bào T CD8+

trong đáp ứng miễn dịch chống vi khuẩn lao Đó là tế bào

T CD8+ (giới hạn MHC I và CD1-) đặc hiệu cho kháng nguyên của vi khuẩn lao, gây ly giải các tế bào tua và đại thực bào bị nhiễm vi khuẩn lao, làm giảm đi số lượng vi khuẩn nội bào Sự giết vi khuẩn nội bào này phụ thuộc vào chất perforin/granulysis, granzymes, yếu tố chết Fas/FasL và TNF (Raja, 2004),

(Nules-Alves et al, 2014) (xem Hình 2.17)

Một số nghiên cứu xác định, những kháng nguyên được nhận diện bằng tế bào T CD8+ từ vật chủ bị nhiễm lao mà không có tình trạng lao hoạt động, đã cung cấp những nguồn vaccine hấp dẫn và ủng hộ cho ý tưởng về đáp ứng tế bào

T CD8+ cũng như T CD4+ bắt buộc phải được kích thích để tạo miễn dịch bảo vệ