Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis tại thành phố Cần Thơ

Việc nghiên cứu tìm hiểu các yếu tố có khả năng ảnh hưởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn lao là rất cần thiết, nhằm có thể đề xuất biện pháp can thiệp đạt kết quả cao, trong đó, nồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Công trình được hoàn thành tại:

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Người hướng dẫn khoa học:

Có thể tìm hiểu luận án tại:

1 Thư viện Quốc gia

2 Thư viện trường Đại học Cần Thơ

Chương 1 Đặt vấn đề

Năm 2012, Tổ chức y tế thế giới (WHO) ước tính có một phần

ba dân số tương đương với 2 tỷ người trên thế giới nhiễm vi khuẩn lao, trong đó có 8,6 triệu người mắc bệnh lao với 1,3 triệu người chết Hàng năm, trong số những người nhiễm vi khuẩn lao, có khoảng 450.000 bệnh nhân mắc lao đa kháng thuốc (cụ thể là thể lao phổi có vi khuẩn kháng với 2 loại thuốc chống lao hàng đầu rifampicin và isoniazid), gây ra cái chết cho 170.000 người (WHO, 2013) Tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn lao đã và đang là mối quan tâm hàng đầu trong việc điều trị cho bệnh nhân lao Theo WHO cảnh báo, có những bệnh nhân điều trị bằng thuốc chống lao nhưng không đạt hiệu quả, điều này sẽ làm tăng tỷ lệ tử vong trên những bệnh nhân lao, tăng gánh nặng bệnh tật cho cộng đồng và xã hội Việc nghiên cứu tìm hiểu các yếu tố có khả năng ảnh hưởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn lao là rất cần thiết, nhằm có thể đề xuất biện pháp can thiệp đạt kết quả cao, trong đó, nồng độ thuốc chống lao RMP không đạt chuẩn trong huyết tương có thể là điều kiện thuận lợi gây ra những kiểu gen đột biến kháng thuốc khác nhau của

vi khuẩn lao Ngoài ra, cũng theo WHO lao kháng thuốc đã xuất hiện với mức độ khá cao trên những bệnh nhân mắc hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (HIV/AIDS); ở những bệnh nhân này, có sự giảm thiểu về số lượng và chất lượng tế bào lympho T giúp đỡ (Th:

T helper) là tế bào miễn dịch đóng vai trò chính trong việc điều hòa đáp ứng miễn dịch của cơ thể, dẫn đến tình trạng cơ thể chống lại với

vi khuẩn lao không hiệu quả và tạo điều kiện thuận lợi cho tính kháng thuốc của vi khuẩn lao phát triển Từ các giả thuyết nghiên cứu trên, đề tài được thực hiện nhằm các mục tiêu sau:

- Xác định tỷ lệ kháng thuốc ở bệnh nhân lao phổi tái trị tại thành phố Cần Thơ

- Tìm hiểu một số yếu tố ảnh hưởng đến tính kháng thuốc của

vi khuẩn lao qua việc khảo sát (i) Các kiểu gen đột biến kháng thuốc RMP của vi khuẩn lao (ii) Nồng độ thuốc chống lao RMP trong

huyết tương của bệnh nhân lao phổi tái điều trị (so sánh với bệnh

nhân lao phổi mới) (iii) Số lượng các tế bào miễn dịch trong máu

bệnh nhân lao phổi đa kháng thuốc (so sánh với bệnh nhân lao phổi mới và nhóm đối chứng)

Những đóng góp mới của luận án

Luận án đã cung cấp những số liệu cụ thể góp phần làm rõ tình hình dịch tễ bệnh lao kháng thuốc, đặc biệt là dịch tễ học phân

tử của lao phổi đa kháng thuốc tại TP Cần Thơ Ngoài ra, đề tài cũng cung cấp thêm những cơ sở khoa học cho những giả thuyết về sinh bệnh học kháng thuốc của vi khuẩn lao với kết quả cho thấy tỷ lệ kháng thuốc của vi khuẩn lao ở bệnh nhân tái trị tại TP Cần Thơ cao hơn so với kết quả đã được chương trình chống lao Quốc gia công

bố

Kết quả nghiên cứu cũng cung cấp số liệu về tần suất và kiểu gen đột biến kháng thuốc RMP của các chủng vi khuẩn lao đa kháng thuốc tại Cần Thơ; kết quả cho thấy có sự khác nhau về tần suất và các kiểu đột biến khi so sánh với các công trình nghiên cứu khác, có

sự xuất hiện 2 đột biến mới tại codon 510 và codon 532 trên đoạn gen rpoB ở chủng vi khuẩn lao đa kháng thuốc trong nghiên cứu Đặc biệt, kết quả nghiên cứu đã phát hiện có 1 chủng vi khuẩn lao mang đột biến trên cả 7 codon, đây là kiểu đột biến mà chúng tôi chưa thấy công bố trên các tài liệu tham khảo trong cũng như ở ngoài nước

Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu cho thấy có sự giảm thiểu rất đáng lo ngại về nồng độ thuốc RMP trong huyết tương ở các bệnh nhân đang điều trị thuốc chống lao và sự giảm đáng kể số lượng các

tế bào lympho T chung, tế bào T gây độc (Tc: T cytotoxic), tế bào T giúp đỡ (Th: T helper) và cả tế bào diệt tự nhiên (NK: natural killers)

ở các bệnh nhân lao đặc biệt là lao phổi đa kháng thuốc Từ đó, gợi ý rằng có thể đây là những yếu tố thuận lợi làm phát triển đột biến kháng thuốc trên các bệnh nhân; và tình trạng đột biến gây kháng thuốc này sẽ được duy trì và nhân lên theo sự phát triển của các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc

Những kết quả này có thể làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp sau để khẳng định sự ảnh hưởng của các yếu tố nêu trên, góp phần cung cấp thêm thông tin trong việc đánh giá, tiên lượng cho bệnh nhân lao phổi đa kháng thuốc trong tương lai

Chương 2 Tổng quan 2.1 Tình hình bệnh lao phổi kháng thuốc trên thế giới và tại Việt nam

Theo WHO có đến 27 quốc gia có tỉ lệ bệnh nhân lao đa kháng

thuốc cao bao gồm: Armenia, Azerbaijan, Bangladesh, Belarus,

Bulgaria, Trung Quốc, Cộng hòa dân chủ Công Gô, Estonia, Ethiopia, Georgia, Ấn Độ, Indonesia, Kazakhstan, Kyrgyzstan, Latvia, Lithuania, Miến Điện, Nigeria, Pakistan, Philippines, Cộng hòa Moldova, Liên bang Nga, Nam Phi, Tajikistan, Ukraine,

Uzbekistan và Việt Nam (WHO, 2009)

Tỷ lệ kháng thuốc trong các trường hợp đã được điều trị: + Tỷ

lệ kháng thuốc chống lao chung: Thủ đô Baku thuộc Azerbaijan, có

tỉ lệ 84,4% (95% CLs, 76,9-92,4) và Tashkent, Uzbekistan chiếm 85,9% (95% CLs, 76,6-92,5) Việt Nam là 1 trong số 16 quốc gia

thuộc nhóm có tỉ lệ kháng chung trên 50% ở nhóm bệnh nhân lao phổi tái điều trị +Tỷ lệ mắc lao đa kháng: Thủ đô Baku thuộc Azerbaijan có tỉ lệ 55,8% (95% CLs, 49,7-62,4) và Tashkent, Uzbekistan chiếm 60,0% (95% CLs, 48,8-70,5), Estonia 52,1% (95% CLs, 39,9-55,8), Việt Nam thuộc trong nhóm này với tỉ lệ 19% (WHO, 2008)

2.2 Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao

Theo WHO, hiện nay tình trạng vi khuẩn lao kháng thuốc đang là mối lo ngại trên toàn cầu, vi khuẩn lao kháng lại các thuốc chống lao theo nhiều cơ chế khác nhau:

Cơ chế kháng thuốc chung là một đặc tính của một loài nguyên vẹn hoặc do đột biến gen mắc phải hoặc do vận chuyển gen Gen kháng thuốc mã hoá thông tin, từ đó vi sinh vật sử dụng để chống lại hiệu lực ức chế đặc hiệu của kháng sinh theo các cơ chế sau đây: Làm giảm tính thấm của màng bào tương, làm thay đổi đích tác động của kháng sinh (thay đổi cấu trúc của phân tử mà kháng sinh tác động), tạo ra các bơm (efflux) có tác dụng bơm tích cực kháng sinh ra khỏi tế bào, tạo ra enzym (do gen đề kháng tạo ra) có thể làm biến đổi hoặc phá huỷ cấu trúc hoá học của phân tử kháng sinh làm bất hoạt thuốc kháng sinh (Wright, 2010)

Một số gen kháng thuốc của vi khuẩn lao đã được nghiên cứu như bản đồ gen và nhiều mã gen kháng thuốc của vi khuẩn lao đã được xác định, trong đó có các loại kháng như vi khuẩn kháng rifampicin mang đột biến ở gen rpoB, mã hoá cho quá trình tổng hợp ARN Polymerase; vi khuẩn kháng isoniazid mang đột biến ở gen Kat

G, Inh A, ahp C; vi khuẩn kháng streptomycin và các amynoglycozid mang đột biến ở gen rrS, rpsL, hoặc cả hai gen này; vi khuẩn kháng pyrazinamid mang đột biến ở gen pnc A

2.3 Kỹ thuật xác định nồng độ thuốc chống lao và đếm số lượng các tế bào miễn dịch trong máu bệnh nhân

2.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao trong xác định nồng độ thuốc chống lao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC: high perform liquid chromatography) là một kỹ thuật sắc ký có thể phân tách một thành phần trong hỗn dịch, được sử dụng trong hóa sinh học và hóa phân tích, để nhận diện, định lượng và làm sạch thành phần đặc biệt trong hỗn dịch (Shimadzu HPLC User manual, Shimadzu, Japan) RMP được chiết tách trong huyết tương bằng phương pháp tủa protein với dung môi tủa là acetonitril đáp ứng được yêu cầu độ chính xác (độ lệch chuẩn tương đối <15%) và độ đúng (95,54%–100,6%) về phân

tích thuốc trong dịch sinh học (Nguyễn Thị Kiều Anh và ctv 2007)

2.3.2 Phương pháp đếm dòng chảy tế bào trong xác định số lượng các tế bào miễn dịch trong máu bệnh nhân lao phổi

Nguyên lý của kỹ thuật đếm dòng chảy tế bào với máy flow cytometry dựa trên nguyên lý sử dụng các thành phần kháng thể có trong bộ thuốc thử có khả năng gắn kết đặc hiệu với các dấu ấn kháng nguyên đặc hiệu tế bào: Khi cho thuốc thử vào máu toàn phần thì các kháng thể đã gắn sẵn chất màu huỳnh quang trong thuốc thử

sẽ gắn kết đặc hiệu với các kháng nguyên đặc hiệu tế bào có trên bề mặt tế bào bạch cầu Trong quá trình tiếp nhận, các tế bào này đi qua nguồn sáng phát ra và phân tán các tia laser Các tế bào đã được gắn kết đặc hiệu này sẽ phát quang, những tín hiệu phân tán và phát huỳnh quang được phát hiện bởi một bộ phận đọc và nhận biết thông tin về kích thước của các tế bào, tính phức tạp trong tế bào và cường

độ huỳnh quang phát ra tương ứng

Chương 3 Nội dung nghiên cứu 3.1 Xác định tỷ lệ kháng thuốc ở bệnh nhân lao phổi tái trị tại thành phố Cần Thơ

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu: bệnh nhân đã được chẩn đoán xác định

đang mắc lao phổi tái điều trị tại bệnh viện Lao và Bệnh phổi thành phố Cần Thơ và mẫu đàm của bệnh nhân

3.1.2 Phương pháp nghiên cứu

-Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu mô tả cắt ngang

-Cỡ mẫu, cách chọn mẫu

+Áp dụng công thức tính cỡ mẫu

Trong đó:

Z: hệ số tin cậy với α=0,05 thì Z0,975=1,96

p: tỷ lệ lao đa kháng thuốc là 19% (Theo WHO tỷ lệ lao đa kháng thuốc ở nhóm bệnh nhân lao phổi tái trị của Việt Nam

là 19%)

d: Sai số cho phép: 0,05

Cỡ mẫu tính được là 236 mẫu

+Cách chọn mẫu: chọn mẫu thuận tiện không xác suất

Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã thu được 246 mẫu đàm của bệnh nhân phù hợp với tiêu chuẩn chọn mẫu

3.1.3 Cách tiến hành nghiên cứu

a Thu thập thông tin của bệnh nhân tại phòng khám của bệnh

viện theo mẫu của phiếu nghiên cứu đã được soạn sẵn

b Thực hiện các bước sau: - Tiến hành thu thập mẫu đàm từ

bệnh nhân đã chọn - Nhuộm và soi trực tiếp - Nuôi cấy vi khuẩn lao - Định danh vi khuẩn lao bao gồm 2 phản ứng: Phản ứng Niacin

dương tính và phản ứng Catalase dương tính - Nuôi cấy vi khuẩn lao sau định danh - Thực hiện kháng sinh đồ trên môi trường đặc theo phương pháp tỷ lệ

3.1.4 Phương pháp xử lý số liệu: Dùng phần mềm thống kê SPSS

3.2.1.1 Đối tượng nghiên cứu: bốn mươi chủng vi khuẩn lao của

bệnh nhân mắc lao phổi đa kháng thuốc (kháng với RMP và INH) và

2 chủng vi khuẩn lao còn nhạy với RMP, những bệnh nhân này nhập viện tại bệnh viện Lao và Bệnh phổi thành phố Cần Thơ, được quản

lý và điều trị theo phác đồ của chương trình phòng chống lao Quốc gia

3.2.1.2 Phương pháp nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu mô tả cắt ngang với cỡ mẫu:

40 chủng vi khuẩn lao đa kháng thuốc (kháng với 2 thuốc RMP và INH) được chọn từ 42 chủng vi khuẩn lao đã được nuôi cấy và có kết quả kháng sinh đồ với 5 loại thuốc chống lao hàng 1 cùng với 2 chủng vi khuẩn lao còn nhạy với thuốc RMP

3.2.1.3 Cách tiến hành nghiên cứu: - Thu nhận mẫu đàm, nuôi cấy

trên môi trường lỏng - Định danh vi khuẩn lao - Nuôi cấy trên môi trường đặc - Thực hiện kháng sinh đồ - Tách chiết ADN từ vi khuẩn lao - Dùng ADN đã tách chiết để làm khuôn cho phản ứng PCR có chiều dài 411bp, nhằm khuếch đại đoạn ADN có chứa 81bp của gen rpoB hay còn gọi là vùng kháng rifampicin (RRDR: rifampicin resistance determining region) với cặp mồi đặc hiệu: rpoB-F: TAC

GGT CGG CGA GCT GAT CC; rpoB-R: TAC GGC GTT TCG ATG AAC C - Phản ứng PCR được thực hiện với các thành phần

PCR mix và các chu kỳ nhiệt được cài đặt theo Yuen L K W et al,

(1999) - Tinh sạch sản phẩm PCR - sử dụng mồi xuôi để giải trình tự

và mẫu được gửi cho công ty Macrogen của Hàn quốc thực hiện giải trình tự

3.2.1.4 Phương pháp xử lý số liệu: sử dụng phần mềm Mega 5.0 và

BioEdit: 7.0.5.3 để phân tích và so sánh với dữ liệu trên ngân hàng

gen: GeneBank database (accession no L27989) (Yuen L K W et

al 1999)

3.2.2 Nồng độ thuốc chống lao RMP trong huyết tương của bệnh nhân lao phổi tái trị (so sánh với nhóm bệnh nhân lao phổi mới) 3.2.2.1 Đối tượng nghiên cứu: là những bệnh nhân lao phổi tái điều

trị và lao phổi mới mắc, được quản lý và theo dõi điều trị tại Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Cần Thơ

3.2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu: mô tả cắt ngang với cỡ mẫu bao gồm 75 bệnh nhân trong đó có 35 bệnh nhân mắc lao phổi tái trị và 40 bệnh nhân mắc lao phổi mới

3.2.2.3 Cách tiến hành nghiên cứu:

+ Người bệnh uống thuốc RMP lúc 6-7 giờ sáng + 2,5 ml máu được rút từ tĩnh mạch của bệnh nhân, chống đông bằng heparin, ở thời điểm 2 giờ và 3 giờ sau khi uống thuốc

+ Ly tâm các mẫu máu (4000 vòng/phút) để thu 1ml huyết tương, đem trữ trong tủ lạnh sâu -200C cho đến khi định lượng

+ Định lượng thuốc rifampicin trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

3.2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu: Dùng phần mềm thống kê SPSS

18.0 để xử lý số liệu thu thập

3.2.3 Số lượng bạch cầu chung, bạch cầu lympho và một số tế bào miễn dịch trong máu của bệnh nhân lao phổi đa kháng thuốc (so sánh với nhóm bệnh nhân lao phổi mới và nhóm chứng là người bình thường)

3.2.3.1 Đối tượng nghiên cứu: Gồm 3 nhóm đối tượng: nhóm bệnh

nhân mắc lao phổi đa kháng thuốc, nhóm lao phổi mới và nhóm chứng là những người bình thường

3.2.3.2 Phương pháp nghiên cứu: Thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang với cỡ mẫu bao gồm 96 mẫu máu trong đó có 32 mẫu máu của

bệnh nhân mắc lao phổi đa kháng thuốc, 31 mẫu máu của bệnh nhân mắc lao phổi mới và 33 mẫu máu chứng của người khỏe mạnh bình thường

3.2.3.3 Cách tiến hành nghiên cứu: 1,0 ml máu tĩnh mạch được thu

nhận và chống đông bằng EDTA, tiếp đến sử dụng 50µl máu đã được chống đông đem nhuộm với kháng thể đặc hiệu trong vòng 24 giờ, phân tích bằng máy đếm dòng chảy tế bào (flow-cytometer) trong vòng 6 giờ tiếp theo

3.2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu: Sử dụng phần mềm BD

FACSCanto và phần mềm thống kê SPSS 18.0 để xử lý số liệu

Chương 4 Kết quả và thảo luận 4.1 Tỷ lệ kháng thuốc ở bệnh nhân lao phổi tái trị tại thành phố Cần Thơ

4.1.1 Tỷ lệ kháng thuốc chung của vi khuẩn lao

Tỷ lệ bệnh nhân mắc lao phổi kháng thuốc chung tại thành phố Cần Thơ là 63,8% (157/246 bệnh nhân)

4.1.2 Tỷ lệ các loại kháng thuốc của vi khuẩn lao

a Tỷ lệ lao phổi đa kháng thuốc ở bệnh nhân nghiên cứu: kết quả nghiên cứu cho thấy có 57/246 bệnh nhân mắc lao phổi đa kháng thuốc (MDR-TB), chiếm tỷ lệ là 23,2%

b Tỷ lệ kháng đơn thuốc ở bệnh nhân nghiên cứu: kết quả về các loại kháng đơn thuốc của vi khuẩn lao, lần lượt như sau: kháng với thuốc streptomycin chiếm tỷ lệ 52,4% (129/246), kế đến là isoniazid chiếm 47,2% (116/246), Kháng rifampicin chiếm 25,2% (62/246); Kháng ethambutol chiếm 11,8% (29/246), Kháng pyrazinamid là 9,8% (24/246 bệnh nhân)

c Tỷ lệ kháng thuốc chống lao kết hợp: kết quả cho thấy chiếm cao nhất là tỷ lệ bệnh nhân kháng chỉ 1 loại thuốc 21,5% (53/246);

kế đó lần lượt là kháng kết hợp 2 loại thuốc 17,1% (42/246); kháng kết hợp 3 loại thuốc là 13,4% (33/246); kháng kết hợp 4 loại thuốc là 8,5% (21/246) và kháng cả 5 loại thuốc chống lao là 3,3% (8/246)

4.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn lao nghiên cứu

4.2.1 Các kiểu đột biến gen gây kháng thuốc RMP của vi khuẩn lao tại thành phố Cần Thơ

4.2.1.1 Tỷ lệ đột biến gen của các chủng vi khuẩn lao tại thành phố Cần Thơ

Kết quả nghiên cứu này đã chỉ ra có 30/40 chủng vi khuẩn xảy ra đột biến trên vùng xác định kháng với thuốc RMP chiếm tỷ lệ 75%, và có 10/40 chủng vi khuẩn lao trong nghiên cứu mặc dù có kết quả kháng sinh đồ được xác định đang mắc lao phổi đa kháng thuốc nhưng kết quả giải trình tự vùng 81bp của gen rpoB đã không phát hiện đột biến

Sử dụng 2 phần mềm Mega 5.0 và BioEdit 7.0.5.3 để so sánh trình tự của các nucleotid nằm trên vùng xác định kháng RMP (còn gọi là vùng RRDR-Rifampicin Resistance Determining Region) của gen rpoB có chiều dài 81bp từ các chủng vi khuẩn lao đa kháng thuốc tại thành phố Cần Thơ, kết quả chỉ ra các kiểu đột biến như sau:

4.2.1.2 Kiểu thay thế nucleotid gây thay đổi acid amin

Bảng 4.8 Các kiểu đột biến thay thế base có thay đổi acid amin

nucleotide

(n=40)

Tỷ lệ (100%)

 TTG

Glutamine  Leucine Glutamine  Leucine

2

3

1

5 7,5 2,5

Kết quả cho thấy có sự thay thế các nuceotide tại các codon nằm trong vùng 81bp của gen rpoB gây thay đổi các acid amin, hậu quả là cấu trúc của enzyme RNA polymerase sau quá trình phiên mã