Luận án tiến sĩ Nghiên cứu thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus)

Do đó, luận án “Nghiên cứu thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra Pangasius hypophthalmus” đã được thực hiện nhằm xác định đặc điểm phân bố, tính chất của các enzyme tiêu hóa từ n

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận án

Vương Bảo Thy

thách thức lớn, đặc biệt là enzyme từ nguồn phế liệu nội tạng ngành chế biến cá tra ở nước ta Trước hiện trạng đó, vấn đề nghiên cứu cấp thiết được đặt ra và sau không ít những khó khăn, trở ngại nhưng với sự nỗ lực của bản thân cùng sự hỗ trợ của Thầy

Cô, gia đình, đồng nghiệp và bạn bè, luận án đã hoàn thành

Tôi xin gửi lời tri ân sấu sắc đến Thầy, Cô hướng dẫn khoa học là TS Trần Bích Lam và GS.TSKH.VS Lưu Duẩn – những người đã tận tình hướng dẫn, định hướng và

hỗ trợ tôi rất nhiều từ những ngày đầu tiên thực hiện đề tài cho đến tận ngày hôm nay Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Cửu Long- nơi tôi đang công tác giảng dạy- đã luôn tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lòng biết ơn đến quý Thầy, Cô trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm,

Bộ môn Công nghệ sinh học trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM- Quý Thầy, Cô trong Bộ môn Sinh hóa, phòng thí nghiệm Công nghệ enzyme, phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM- Quý Thầy, Cô Bộ môn Công nghệ thực phẩm trường Đại Học Cần Thơ luôn giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm thí nghiệm với điều kiện tốt nhất

Tôi sẽ luôn nhớ ơn Ban Giám Đốc Công ty TNHH Thủy Sản Hùng Vương- Vĩnh Long, các anh chị phòng KCS – đã nhiệt tình hỗ trợ tôi toàn bộ nguyên liệu thí nghiệm trong suốt quá trình thực hiện luận án cũng như tinh thần hợp tác triển khai nghiên cứu ứng dụng tại nhà máy

Xin cảm ơn các bạn đồng nghiệp- Thầy, Cô Bộ môn Công nghệ thực phẩm Trường Đại học Cửu Long, Đại học Công nghệ Sài Gòn cùng bạn bè đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong suốt thời gian thực hiện luận án

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến gia đình và ba mẹ - chính gia đình là nguồn động lực giúp tôi kiên trì vượt qua mọi khó khăn, quyết tâm hoàn thành luận án

Luận án này là món quà vô giá tôi xin trân trọng dành tặng cho Gia đình, Thầy

Cô – những người luôn yêu thương, bên cạnh tôi trong cuộc sống cũng như trong sự nghiệp TPHCM, ngày 12 tháng 12 năm 2014

khẩu chủ lực của nước ta Theo dự báo của VASEP (Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam) đến năm 2015 sản lượng cá tra nguyên liệu khoảng 1,8 triệu tấn thì riêng phần nội tạng cá tra ước tính khoảng 100.000 tấn/năm, đây là nguồn nguyên liệu dồi dào, nhiều tiềm năng để thu nhận các enzyme tiêu hóa Do

đó, luận án “Nghiên cứu thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra (Pangasius

hypophthalmus)” đã được thực hiện nhằm xác định đặc điểm phân bố, tính chất của

các enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra và đề xuất phương pháp chiết tách, tinh sạch, tạo chế phẩm enzyme có giá trị sử dụng cao từ phế liệu Nghiên cứu đã đúc kết được những kết quả mới như sau:

1- Phân tích enzyme trong các cơ quan nội tạng của cá tra xác định rằng các enzyme tiêu hóa tập trung nhiều nhất ở gan tụy với hoạt tính lipase 674,02 U/g chất khô, protease 84,28 U/g chất khô và amylase 419,69 U/g chất khô 2- Điều kiện tốt nhất để trích ly enzyme tiêu hóa từ gan tụy cá tra: tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/2(w/v) với dung môi trích ly là dung dịch đệm Tris-HCl 0,05N, pH8, nhiệt độ 50C, thời gian 1 giờ

3- Sử dụng phương pháp lọc màng có thể thu nhận chế phẩm lipase từ gan tụy

cá tra theo qui trình: lần lượt lọc dịch trích enzyme qua màng MF 1µm và 0,1µm, lọc màng UF 10 kDa để thu enzyme với tỷ lệ pha loãng dịch enzyme thô 1/3, áp suất lọc 6 psi, thời gian lọc 120 phút Hiệu suất thu hồi lipase sau lọc UF 90,6%, độ tinh sạch 2,07 lần Chế phẩm có hoạt tính lipase: 22,22 U/ml, hoạt tính riêng lipase: 52,70 U/mg protein

4- Để sản xuất chế phẩm enzyme, tốt nhất là sử dụng phương pháp kết tủa bằng ethanol theo tỷ lệ với dịch trích enzyme là 3/1 (v/v) Chế phẩm có hoạt tính lipase: 587,85 U/g, hoạt tính riêng lipase: 16,91 U/mg protein, hoạt tính protease: 49,26 U/g, hoạt tính riêng protease 1,42 U/mg protein Hiệu suất thu nhận chế phẩm 8,3% so với nguyên liệu ban đầu (w/w)

5- Đã đề xuất phương pháp tinh sạch protease và lipase từ gan tụy cá tra: từ dịch trích ly enzyme thô, kết tủa enzyme bằng muối amoni sunfate 60% bão hòa,

riêng protease và lipase qua sắc ký lọc gel Sephadex G-75

Protease tinh sạch có hoạt tính riêng 28,59 U/mg protein, độ tinh sạch 22,41 lần, hiệu suất thu hồi 23,67% Lipase tinh sạch có hoạt tính riêng 509,71 U/mg protein, độ tinh sạch 37,95 lần, hiệu suất thu hồi 40,08%

6- Đã xác định được đặc điểm cấu tạo và tính chất của protease từ gan tụy cá tra: là một serine protease có phân tử lượng 31 kDa, có tỷ lệ cao của serine, aspartic và glutamic, pH tối ưu 8,5, bền ở pH 7-9, nhiệt độ tối ưu 550

C, kích thích khi có mặt ion Ca2+ và bị kìm hãm bởi các ion Cu2+, Zn2+, với cơ chất BSA có Km = 897mg/L và Vmax = 15,7 mg/L.phút

7- Đã xác định được đặc điểm cấu tạo và tính chất của lipase từ gan tụy cá tra:

là một lipase có hoạt tính cao và ổn định, phân tử lượng 57 kDa, có tỷ lệ cao nhất là aspartic và glutamic, pH tối ưu 8, bền ở pH 7-9, nhiệt độ tối ưu 500C, tăng hoạt tính khi có mặt ion Ca2+

và bị kìm hãm bởi các ion Cd2+,Zn2+, hoạt động tốt nhất ở nồng độ muối mật NaTC 0,015M, thủy phân liên kết ester vị trí 1,3 của glyceride, với cơ chất triolein có Km = 1,381mg/L và Vmax = 0,063 mg/L.phút

8- Chế phẩm enzyme tiêu hóa từ gan tụy cá tra có khả năng ứng dụng sản xuất pepton trên cơ chất thịt bò và cá thác lác, đạt tỷ lệ Namin/ Ntổng lần lượt là 22,15% và 20,97%, đạt yêu cầu của loại pepton-pancreatic (theo Dược điển Việt Nam); chế phẩm enzyme từ gan tụy cá có đặc tính thủy phân các loại protein và chất béo tương đương pancreatin từ tụy lợn nên có thể sử dụng làm dược liệu bào chế thuốc hoặc ứng dụng trong phòng chống suy dinh dưỡng ở trẻ em

Nghiên cứu đã đóng góp dẫn liệu khoa học về hệ enzyme tuyến tụy cá tra

(Pangasius hypophthalmus) đồng thời góp phần giải quyết thực tế sản xuất của

ngành chế biến cá tra, tạo sản phẩm giá trị gia tăng từ phế liệu cá Kết quả nghiên cứu là đóng góp lý thuyết và thực tiễn cho ngành công nghiệp thủy sản của Việt Nam

I

I

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT IV DANH MỤC BẢNG V DANH MỤC HÌNH VI

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Các enzym tiêu hóa từ nội tạng cá da trơn 4

1.1.1 Protease 4

1.1.2 Lipase 6

1.1.3 Tình hình nghiên cứu về enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá da trơn 15

1.1.4 Nguồn enzyme tiêu hóa tiềm năng từ cá tra 18

1.1.4.1 Cá tra 18

1.1.4.2 Phế liệu nội tạng- nguồn enzyme tiêu hóa tiềm năng 19

1.2 Phương pháp thu nhận và tinh sạch enzyme tiêu hóa 21

1.2.1 Phương pháp thu nhận enzyme bằng kỹ thuật kết tủa 21

1.2.2 Phương pháp thu nhận protein, enzyme bằng công nghệ lọc màng 21

1.2.3 Phương pháp trích ly và tinh sạch enzym tiêu hóa từ nội tạng cá 23

1.3 Ứng dụng của các enzyme tiêu hóa 26

1.3.1 Ứng dụng chế phẩm hỗn hợp đa enzyme 26

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá 27

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 Đối tượng nghiên cứu 32

2.2 Phương pháp nghiên cứu 33

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm phân bố các enzyme trong nội tạng cá tra (Pangasius hypophthamus) 33

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu trích ly enzyme từ nội tạng cá tra 34

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu thu nhận enzyme bằng kỹ thuật lọc màng 35

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu thu nhận enzyme bằng kỹ thuật kết tủa 37

2.5.5 Phương pháp nghiên cứu tinh sạch enzyme bằng kỹ thuật sắc ký 38

2.2.6 Phương pháp xác định một số tính chất của protease gan tụy 41

2.2.7 Phương pháp xác định một số tính chất của lipase gan tụy 42

2.2.8 Phương pháp nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme 43

II

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 45

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 46

3.1 Khảo sát hệ enzyme tiêu hóa trong nội tạng cá tra 46

3.1.1 Tỷ lệ khối lượng các thành phần trong nội tạng cá tra 46

3.1.2 Sự phân bố của lipase, protease và amylase trong các cơ quan nội tạng 47

3.2 Khảo sát quá trình trích ly thu nhận dịch enzyme thô 51

3.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi trích ly 51

3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly 54

3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian trích ly 56

3.3 Khảo sát quá trình tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc màng 59

3.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng dịch enzyme thô đến hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch lipase sau lọc UF 64

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của áp suất vận hành đến hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch lipase sau lọc UF 66

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lọc đến hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch lipase sau lọc UF 68

3.4 Khảo sát quá trình tinh sạch enzyme bằng phương pháp kết tủa 71

3.4.1 Kết tủa bằng amoni sunfate 71

3.4.2 Kết tủa bằng ethanol 74

3.4.3 Kết tủa bằng aceton 76

3.4.4 Kết tủa bằng isopropanol 78

3.4.5 So sánh hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch enzym từ các tác nhân kết tủa 79

3.5 Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất protease gan tụy cá tra 84

3.5.1 Thử nghiệm quá trình tinh sạch protease bằng sắc ký lọc gel Sephadex 84

3.5.2 Tinh sạch protease bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose kết hợp sắc ký lọc gel Sephadex 85

3.5.2.1 Tinh sạch protease bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose 85

3.5.2.2 Kết hợp sắc ký lọc gel Sephadex -G75 hoặc Sephadex-G100 87

3.5.2.3 Kiểm tra độ tinh sạch và xác định phân tử lượng protease 90

III

3.5.3.2 Ảnh hưởng của pH độ bền pH theo thời gian của protease 93

3.5.3.3 Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt độ của protease 95

3.5.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ của protease 96

3.5.3.5 Thành phần acid amin của protease gan tụy 96

3.6 Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất lipase gan tụy cá tra 98

3.6.1 Tinh sạch lipase gan tụy bằng sắc ký lọc gel Sephadex 98

3.6.2 Khảo sát quá trình tinh sạch lipase bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose kết hợp sắc ký lọc gel Sephadex 99

3.6.2.1 Sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose 99

3.6.2.2 Kết hợp với sắc ký lọc gel Sephadex -G75/ Sephadex-G100 102

3.6.2.3 Kiểm tra độ tinh sạch và xác định phân tử lượng lipase 104

3.6.3 Xác định một số tính chất của lipase gan tụy tinh sạch 106

3.6.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ bền nhiệt theo thời gian của lipase 106

3.6.3.2 Ảnh hưởng của pH độ bền pH theo thời gian của lipase 108

3.6.3.3 Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt độ lipase 109

3.6.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ của lipase 110

3.6.3.5 Xác định thành phần acid amin của lipase gan tụy 111

3.6.3.6 Ảnh hưởng của muối mật đến hoạt độ lipase gan tụy 112

3.6.3.7 Ảnh hưởng của loại cơ chất đến hoạt độ lipase gan tụy 113

3.7 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme từ gan tụy cá tra 114

3.7.1 Ứng dụng chế phẩm enzyme trong sản xuất pepton 114

3.7.2 Ứng dụng chế phẩm enzyme trong hỗ trợ tiêu hóa 116

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 119 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfat- Polyacryamide gel

V

Bảng 1.2: Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ lipase 14

Bảng 1.3: Phân tích khả năng thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra 20

Bảng 3.1: Tỷ lệ khối lượng các thành phần nội tạng cá tra(Pangasius hypophthamus) 46 Bảng 3.2: Hoạt độ lipase, protease và amylase trong nội tạng cá tra 47

Bảng 3.3: Hoạt độ lipase, protease và amylase trong gan tụy cá tra 48

Bảng 3.4: Hoạt độ lipase, protease và amylase trong ruột cá tra 48

Bảng 3.5: Hoạt độ enzym lipase, protease và amylase tại pH trích ly tối ưu 50

Bảng 3.6: Kết quả thu được sau quá trình ly tâm 61

Bảng 3.7: Kết quả thu được sau quá trình lọc MF 61

Bảng 3.8: Kết quả thu lipase trong dòng retentate sau lọc UF thay đổi theo tỷ lệ pha loãng 65

Bảng 3.9: Kết quả thu lipase trong dòng retentate theo áp suất vận hành 66

Bảng 3.10: Kết quả thu được trong dòng retentate theo thời gian lọc 68

Bảng 3.11: Thất thoát lipase theo dòng permeate ở các chế độ khảo sát 69

Bảng 3.12: Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của enzyme lipase sau lọc UF 70

Bảng 3.13: Hiệu suất thu nhận chế phẩm enzyme tiêu hóa từ gan tụy cá tra 82

Bảng 3.14: Tóm tắt quá trình tinh sạch protease gan tụy cá tra 89

Bảng 3.15: Ảnh hưởng của một số tác nhân đến hoạt độ protease gan tụy cá tra 95

Bảng 3.16: Kết quả phân tích thành phần acid amin protease tinh sạch 96

Bảng 3.17: Tóm tắt quá trình tinh sạch lipase gan tụy cá tra 104

Bảng 3.18: Ảnh hưởng của một số tác nhân đến hoạt độ lipase gan tụy cá tra 110

Bảng 3.19: Kết quả phân tích thành phần acid amin lipase tinh sạch 111

Bảng 3.20: Hàm lượng nitơ tổng và nitơ amin của các pepton 115

Bảng 3.21: So sánh hoạt độ protease, lipase của chế phẩm enzyme và Enzyplex 116

VI

trypsin Schistocerca gregaria (SGTI) 5

Hình 1.2: Cấu trúc không gian lipase tụy của cá hồi (Salmo Salar) 8

Hình 1.3: Hình tiếp xúc của lipase dạng mở và đóng 9

Hình 1.4: Phản ứng tổng quát ở mặt tiếp xúc của lipase với cơ chất 10

Hình 1.5: Cơ chế thủy phân của enzyme lipase 11

Hình 1.6: Phương pháp xác định tính đặc hiệu vị trí của enzyme lipase 13

Hình 1.7: Cá tra (Pangasius hypophthamus) 19

Hình 2.1: Nội tạng cá tra 32

Hình 3.1: Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng protein trích ly 50 Hình 3.2: Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hoạt độ protease 51

Hình 3.3: Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hoạt độ lipase 51

Hình 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng protein trích ly 53

Hình 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hoạt độ protease 53

Hình 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hoạt độ lipase 54

Hình 3.7: Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng protein trích ly 55

Hình 3.8: Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hoạt độ protease 56

Hình 3.9: Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hoạt độ lipase 56

Hình 3.10: Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng đến hiệu suất thu hồi lipase sau lọc MF 63

Hình 3.11: Ảnh hưởng của áp suất đến độ phân riêng protein trong dịch enzyme 65

Hình 3.12: Ảnh hưởng của độ bảo hòa amoni sunfate đến hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch protease 70

Hình 3.13: Ảnh hưởng của độ bảo hòa amoni sunfate đến hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch lipase 71

Hình 3.14: Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol/dịch trích ly đến hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch protease 73

Hình 3.15: Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol/dịch trích ly đến hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch lipase 73

Hình 3.16: Ảnh hưởng của tỷ lệ aceton/dịch trích ly đến hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch protease 75

Hình 3.17: Ảnh hưởng của tỷ lệ aceton/dịch trích ly đến hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch lipase 75

Hình 3.18: Ảnh hưởng của tỷ lệ isopropanol/dịch trích ly đến hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch protease 76

VII

hồi và độ tinh sạch protease 78

Hình 3.21: So sánh khả năng kết tủa của các tác nhân khác nhau đến hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch lipase 78

Hình 3.22: Chế phẩm enzyme tiêu hóa thu nhận theo phương pháp kết tủa 80

Hình 3.23: Qui trình công nghệ thu nhận chế phẩm enzyme từ gan tụy cá tra…… 83

Hình 3.24: Sắc ký đồ lọc gel Sephadex G-75 dung dịch enzym sau thẩm tích 84

Hình 3.25: Kết quả điện di sau sắc ký lọc gel Sephadex G-75 85

Hình 3.26: Sắc ký đồ trao đổi ion của protease gan tụy cá tra trên cột DEAE-cellulose với dãy nồng độ NaCl 85

Hình 3.27: Sắc ký đồ trao đổi ion của protease gan tụy cá tra trên cột DEAE-cellulose với gradient nồng độ dung dịch NaCl 86

Hình 3.28: Sắc ký lọc gel của protease gan tụy cá tra trên gel Sephadex-100 87

Hình 3.29: Sắc ký lọc gel của protease gan tụy cá tra trên gel Sephadex-75 88

Hình 3.30: Kết quả điện di trên gel SDS–PAGE 90

Hình 3.31: Qui trình tinh sạch protease gan tụy cá tra từ dịch trích ly enzyme…… 91

Hình 3.32: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease 92

Hình 3.33: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của protease tinh sạch theo thời gian 92

Hình 3.34: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease 93

Hình 3.35: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease tinh sạch theo thời gian 94

Hình 3.36: Đồ thị Lineweaver- Burk của protease tinh sạch trên cơ chất BSA 96

Hình 3.37: Sắc ký đồ lọc gel Sephadex G-75 từ enzym sau thẩm tích 98

Hình 3.38: Kết quả điện di sau sắc ký lọc gel Sephadex G-75 99

Hình 3.39: Sắc ký đồ trao đổi ion của lipase gan tụy cá tra trên cột DEAE-cellulose với dãy nồng độ NaCl 100

Hình 3.40: Sắc ký đồ trao đổi ion của lipase gan tụy cá tra trên cột DEAE-cellulose với gradient nồng độ dung dịch NaCl 101

Hình 3.41: Sắc ký lọc gel của lipase gan tụy cá tra trên gel Sephadex-100 102

Hình 3.42: Sắc ký lọc gel của lipase gan tụy cá tra trên gel Sephadex-75 103

Hình 3.43: Kết quả điện di trên gel SDS- (PAGE) 105

Hình 3.44: Qui trình tinh sạch protease/ lipase gan tụy cá tra từ dịch trích ly enzyme 106

Hình 3.45: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ lipase 106

Hình 3.46: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ lipase tinh sạch theo thời gian 107

VIII

Hình 3.50: Ảnh hưởng của muối mật (NaTC) đến hoạt độ lipase tinh sạch 112 Hình 3.51: Ảnh hưởng của cơ chất đến hoạt độ lipase tinh sạch 113 Hình 3.52: Sự tương quan giữa hàm lượng nitơ amin và thời gian thủy phân 115 Hình 3.53: So sánh khả năng thủy phân của chế phẩm enzyme với Enzyplex trên

một số protein thực phẩm 117

Hình 3.54: So sánh khả năng thủy phân của chế phẩm enzyme so với Enzyplex đối

với một số loại dầu thực vật 117

MỞ ĐẦU

TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cùng với sự tiến bộ của khoa học, công nghệ enzyme trở thành ngành mũi nhọn được phát triển nhanh trên thế giới Trong đó, nghiên cứu enzyme tiêu hóa của các loài cá được đặc biệt quan tâm trong vài thập kỷ vừa qua Do cá sống trong môi trường nhiệt độ thấp nên để duy trì sự sống, chúng cần phải có hệ enzyme tương đối mạnh Ưu điểm của các enzyme cá là có hoạt độ cao hơn tại các giá trị nhiệt độ thấp hơn so với enzyme tương ứng từ động vật máu nóng

Trong các enzyme nội tạng cá, lipase ngày càng được quan tâm do có khả năng ứng dụng cao trong y học và công nghệ thực phẩm Một số lipase từ nội tạng cá đã được thế giới nghiên cứu như lipase cá mập, cá tuyết, cá mòi, cá hồi, cá tráp, cá ngừ

vây xanh, cá đối, cá rô Riêng lipase cá tra (Pangasius hypophthalmus), hiện nay

chưa có nghiên cứu nào được công bố Trong khi đó, về lý thuyết, ở cá tra có mô mỡ rất phát triển so với các loại cá da trơn khác, như vậy ở loài cá này enzyme lipase phải đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất Vì vậy việc nghiên cứu tính chất của lipase gan tụy cá tra có giá trị khoa học và cần đặc biệt quan tâm So với lipase thì protease nội tạng cá đã được nghiên cứu ở nhiều loài như protease cá mòi, cá ốt vảy nhỏ, cá tuyết, cá hồi trứng, cá hồi bạc, cá trồng, cá thu…Tuy nhiên,

về cá da trơn ở Việt Nam cho đến nay, ngoài một số khảo sát chung về protease nội

tạng, chưa có công bố nào phân tích riêng tính chất protease gan tụy cá tra Vì thế,

cần thiết phải có những công trình nghiên cứu chuyên sâu, cung cấp đầy đủ dẫn liệu khoa học về hệ enzyme tiêu hóa ở cá tra

Mặt khác, trong ngành công nghiệp chế biến cá tra tại Việt Nam, phi lê cá chiếm khoảng 30%, phần còn lại là phế phụ phẩm, trong đó, phần nội tạng chiếm khoảng 5-6% trọng lượng cơ thể cá Theo dự báo của VASEP (Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam) đến năm 2015 sản lượng cá tra nguyên liệu khoảng 1,8 triệu tấn thì riêng phần nội tạng ước tính khoảng 100.000 tấn, đây là nguồn nguyên liệu dồi dào, nhiều tiềm năng để thu nhận các enzyme tiêu hóa ứng dụng trong y học, công nghệ thực phẩm

Đề tài “Nghiên cứu thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra (Pangasius

hypophthalmus)” nhằm góp phần giải quyết các vấn đề trên

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Xác định đặc tính phân bố, phân lập và xác định tính chất của các enzyme tiêu

hóa trong nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus)

Xác định phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme tiêu hóa từ nguồn nội tạng cá tra sẵn có để đưa vào ứng dụng

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của luận án là các enzyme tiêu hóa có trong cơ quan nội

tạng của cá tra (Pangasius hypophthalmus) nhưng chủ yếu tập trung vào enzyme

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp nghiên cứu để thực hiện luận án là phương pháp nghiên cứu thực nghiệm hóa sinh học kết hợp với phương pháp phân tích lý thuyết và tổng hợp tài liệu

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1 Khảo sát hệ enzyme tiêu hóa trong các cơ quan nội tạng cá tra

2 Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme tiêu hóa từ gan tụy cá tra

3 Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất protease gan tụy cá tra

4 Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất lipase gan tụy cá tra

5 Nghiên cứu khả năng ứng dụng chế phẩm enzyme tiêu hóa

Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN

Ý nghĩa khoa học

Là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống, phân tích

chuyên sâu về hệ enzyme protease, lipase từ gan tụy cá tra (Pangasius hypophthalmus), đóng góp những dẫn liệu khoa học quan trọng về hệ enzyme tiêu

hóa từ nội tạng cá tra

Đã xác định được đặc điểm cấu tạo và tính chất của protease và lipase từ gan tụy

cá tra; đưa ra điều kiện trích ly và phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme gan tụy

cá tra bằng phương pháp lọc màng và phương pháp kết tủa; đề xuất phương pháp tinh sạch protease và lipase từ gan tụy cá tra

Ý nghĩa thực tiễn

Là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu thu nhận, tinh sạch các enzyme tiêu hóa từ nguồn phế liệu nội tạng của ngành chế biến cá tra, góp phần làm phong phú thêm nguồn thu các chế phẩm enzyme nói chung và protease, lipase nói riêng Chế phẩm enzyme từ nội tạng cá tra bước đầu khảo sát ứng dụng có hiệu quả cao trong sản xuất pepton, hỗ trợ tiêu hóa Kết quả nghiên cứu là giải pháp thiết thực từ thực tế sản xuất của ngành chế biến cá tra, tạo sản phẩm có giá trị gia tăng từ nguồn phế liệu cá, góp phần phát triển bền vững công nghiệp cá tra của Việt Nam

BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN

Luận án gồm 120 trang bao gồm: Mở đầu 3 trang; Chương 1: Tổng quan 28 trang; Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 14 trang; Chương 3: Kết quả và bàn luận 73 trang; Kết luận và kiến nghị 2 trang, 150 tài liệu tham khảo Trong luận án có 24 bảng, 62 hình và đồ thị

CHÖÔNG 1 TOÅNG QUAN

1.1 Các enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá da trơn

Trong số các enzym tiêu hóa từ nội tạng cá thì ngoại trừ enzym pepsin từ dạ dày

cá đã được các tác giả trên thế giới nghiên cứu thu nhận, tinh sạch, xác định tính chất và đưa vào ứng dụng, các hiểu biết cho đến nay về hệ enzyme tiêu hóa từ tụy tạng cá vẫn còn khá hạn chế [1] Trong khi đó, nguồn nguyên liệu nội tạng cá tra cần nghiên cứu thu nhận enzyme không bao gồm dạ dày cá nên trong phạm vi đề tài này chúng tôi sẽ không đề cập đến pepsin Các enzym tiêu hóa khác chủ yếu được sản xuất ở tuyến tụy

Ở động vật bậc cao các enzyme tiêu hóa của tuyến tụy (pancreatin) được tiết ra

từ các tế bào ngoại tiết của tuyến tụy, gồm chủ yếu là lipase, protease và amylase Đến nay, chỉ có enzyme tuyến tụy của lợn, bò được sản xuất dưới dạng chế phẩm để đưa vào ứng dụng Các dạng chế phẩm hỗn hợp đa enzyme rất phổ biến, ngoài ra cũng có các chế phẩm mặc dù gồm vài enzyme nhưng hoạt động ưu thế trên một loại cơ chất Điển hình như: pancreatic protease là chế phẩm hỗn hợp giữa trypsin

và chymotrypsin Pancreatic lipase là chế phẩm hỗn hợp có chứa cả esterase, protease, amylase và các zymogen [1]

Ngoài chế phẩm hỗn hợp, một số enzyme tuyến tụy cũng đã được thu nhận dưới dạng tinh sạch như trypsin, chymotrypsin, lipase tụy

1.1.1 Protease

Protease tuyến tụy bao gồm chủ yếu là trypsin và chymotrypsin, chúng thuộc nhóm serine-protease, có nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động, có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Các protease tuyến tụy thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng [2]

Trypsin [E.C.3.4.21.4]

Nghiên cứu trypsin của lợn cho thấy đây là một chuỗi polypeptide có 249 acid amin, trọng lượng phân tử 22.680 - 23.400 Da Trypsin thủy phân liên kết peptide giữa gốc carboxyl của lysine và arginine với nhóm amine của các acid amin khác

pH tối ưu cho hoạt động của trypsin là 8 và pH thích hợp là 7,8 - 9,5 Nhiệt độ thích

hợp cho hoạt động của trypsin trong khoảng 30 - 400C, ở nhiệt độ này và pH 8,5 - 9 trypsin có khả năng thủy phân mạnh các cơ chất như casein, hemoglobin hay gelatin Ion Ca2+ được xem như là chất bảo vệ cho enzyme khỏi bị biến tính và bảo

vệ chống lại sự tự phân protein Ngược lại, Cu2+, Ag2+, Hg2+ có tác dụng ức chế enzyme Ngoài ra trypsin còn bị ức chế bởi các chất kháng-trypsin tự nhiên có trong tuyến tụy, đậu tương, đậu ván, các cây họ đậu, mướp đắng Trung tâm hoạt động của trypsin có thứ tự các acid amin -Gly-Asp-Ser-Gly-Pro- [2]

Hình 1.1 Cấu trúc không gian của trypsin crayfish khi liên kết với chất kháng

trypsin Schistocerca gregaria (SGTI) [3]

Chymotrypsin [E.C.3.4.21.1]

Chymotrypsin là một protease hoạt động trong điều kiện môi trường có pH kiềm nên được xếp vào nhóm protease kiềm tính tương tự như trypsin Chymotrypsin hoạt động trong điều kiện pH 7 - 9 và pH tối ưu là 8 - 9, điểm đẳng điện pI = 5,4;

pH 5 không thuận tiện cho hoạt động của chymotrypsin nhưng ở pH này chymotrypsin lại bền vững hơn trong môi trường pH 8 Chymotrypsin là một chuỗi polypeptide có 245 acid amin, trọng lượng phân tử 22.500 Da Chymotrypsin hoạt động như một endopeptidase phân cắt mạch polypeptide thành các peptide ngắn và tác dụng trên những liên kết mà trypsin không phân cắt Những liên kết này được

tạo thành bởi nhóm carboxyl của acid amin có nhân thơm như tyrosine, tryptophan, phenylalanine với nhóm amine của acid amin khác [2]

Sự khác nhau giữa trung tâm liên kết của trypsin và chymotrypsin

Trypsin và chymotrypsin thuộc nhóm serine protease, trung tâm hoạt động của chúng giống nhau, trung tâm liên kết tương tự nhau ngoại trừ khác nhau ở một acid amin Ở trypsin có một gốc lysine ở đáy túi liên kết, ở chymotrypsin có gốc tyrosine

ở đáy túi liên kết thay vào vị trí của lysine Do sự khác nhau này, cơ chất protein hoặc chuỗi peptide có các gốc acid amin là arginyl và lysyl mới có thể kết hợp với trung tâm hoạt động của trypsin để thủy phân liên kết peptide Ở chymotrypsin, cơ chất protein hoặc chuỗi peptide có các gốc acid amin là tyrosyl, phenylalanyl và tryptophanyl mới có thể kết hợp với trung tâm hoạt động của chymotrypsin [2]

Sự tương đồng về cấu trúc của trypsin và lipase tuyến tụy

Trung tâm hoạt động của trypsin là chuỗi pentapeptide Gly-Asp-Ser-Gly-Gly, tương đồng với trung tâm hoạt động của lipase tụy với chuỗi pentapeptide Gly-X-Ser-X-Gly Mặt khác, lipase tụy sẽ bị mất hoạt độ khi có mặt các chất kìm hãm serine-protease như diisopropylphosphofluoridate và diethyl-p-nitrophenyl phosphate Từ minh chứng trên, lipase tụy được xem như thuộc nhóm serine-

protease Các phân tích cấu trúc gần đây cho thấy ở lipase tụy hiện diện cấu trúc

Ser…His…Asp, cấu trúc này có mặt ở tất cả các serine protease mặc dù các thành phần acid amin còn lại khác nhau Cấu trúc tương đồng ở trung tâm hoạt động của serine protease và lipase tụy như sau [4]

SERINE PROTEASE

LIPASE

1.1.2 Lipase tụy [E.C.3.1.1.3]

Các enzyme lipase hay các acylglycerol acylhydrolase (E.C 3.1.1.3) được định nghĩa như là các enzyme thuỷ phân các liên kết ester giữa các acid béo mạch dài và glycerol trong dầu béo tại bề mặt phân pha dầu-nước Các enzyme lipase thủy phân triacylglycerol (TAG) không tan trong nước thành các diacylglycerol, các monoacylglycerol phân cực hơn cũng như các acid béo và glycerol hỗ trợ cho quá trình hấp thu và chuyển hoá qua màng Trừ các trường hợp ngoại lệ, pH hoạt động tối thích cho hầu hết các lipase nằm trong khoảng 7 – 9, các lipase hoạt động trong khoảng nhiệt độ rất rộng, từ 20 – 65oC, nhưng thông dụng nhất là từ 30 – 45oC [5] Nhiều chuỗi acid amin của lipase tụy đã được tìm ra như: lipase tụy của người,

bò (Bos tauru), chuột (Rattus norvegi-cus), chó (Canis familiaris), lợn (Cavia orcellus), thỏ (Oryctolagus cuniculus), ngựa (Equus caballus) Cấu trúc tinh thể của một số lipase cũng đã được nghiên cứu như: lipase tụy của người, bò (Bos Taurus), lợn (Sus scrofa), chuột (Rattus norvegicus) [4]

Tính chất của lipase tụy

Cấu trúc

Trong những lipase đã biết, không có trình tự acid amin đặc trưng nào cho mọi lipase Trái lại, trình tự của chúng rất khác biệt Điểm giống nhau của tất cả các lipase là một đoạn nhỏ gồm 5 acid amin Gly-X-Ser-X-Gly (trong rất hiếm trường hợp, glycine bị thay thế bằng những acid amin khác) Trình tự này nằm gần trung tâm hoạt động và sau này, các nhà nghiên cứu đã sử dụng chuỗi pentapeptide này để định danh những protein là lipase [6]

Mặc dù có sự khác biệt lớn trong trình tự acid amin, tất cả lipase đều có một kiểu cấu trúc tương tự nhau gọi là gấp nếp β có liên quan đến cơ chế xúc tác của nó Cấu trúc này lần đầu tiên được giới thiệu khi so sánh cấu trúc 3 chiều của enzyme

có trình tự acid amin khác nhau và so sánh khi chúng gắn với cơ chất Cấu trúc gấp nếp này có phần trung tâm là 8 chuỗi xếp song song cùng chiều, chỉ có chuỗi β2 ngược chiều Các chuỗi β3 đến β8 nối lại với nhau bằng các đoạn xoắn Sự khác biệt giữa các cấu trúc này là số chuỗi trên gấp nếp β, sự hiện diện của nhóm phụ và cấu trúc của tiểu phần sẽ liên kết với cơ chất [7]

Cấu trúc lập thể của lipase được làm sáng tỏ vào năm 1990, các nghiên cứu cho thấy vùng hoạt động của enzyme lipase bị che chắn khỏi dung môi bằng một cấu trúc di động [8] Theo Winkler, F.K và cộng sự, cấu trúc di động cần di chuyển trên

bề mặt liên pha cơ chất và nước để tạo ra cấu trúc hoạt động của enzyme với trung tâm xúc tác có thể tiếp xúc với cơ chất Cấu trúc tinh thể của lipase hay cấu trúc dạng phức đã tạo điều kiện cho việc làm sáng tỏ sự thay đổi cấu trúc của lipase Lipase sẽ chuyển từ trạng thái bất hoạt sang trạng thái hoạt động khi cấu trúc di động chuyển từ đóng sang mở [9] Cơ chế đóng mở nắp có thể khác nhau giữa các lipase nhưng chúng đều tạo điều kiện cho trung tâm hoạt động của lipase thông suốt

để có thể liên kết với lipid [10]

Hình 1.2: Cấu trúc không gian lipase tụy của cá hồi (Salmo Salar) [11]

Cấu trúc di động

Lipase sẽ có sự thay đổi hình dạng để ổn định hoạt độ khi tương tác với bề mặt liên pha nước và cơ chất Ở trạng thái đóng, cái nắp sẽ che phủ trung tâm hoạt động của enzyme, làm cho phân tử cơ chất không gắn kết được vào đó Khi chuyển sang dạng mở, trung tâm này trở thành con đường hầm để cơ chất đi vào và tham gia phản ứng Trong những năm gần đây, chức năng của cấu trúc nắp đã được làm sáng

tỏ nhiều hơn Nó không chỉ đơn thuần là cái cổng đi vào trung tâm hoạt động Nắp

có cấu trúc của một phân tử vừa có tính kỵ nước vừa có tính ái nước: khi đóng nắp, phần mặt ưa nước hướng ra ngoài dung môi và mặt kỵ nước hướng vào lõi protein;

khi enzyme chuyển sang trạng thái mở, mặt kỵ nước sẽ lộ ra ngoài làm tăng diện tích bề mặt kỵ nước, tăng khả năng liên kết với cơ chất Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng cấu trúc phần nắp còn ảnh hưởng đến hoạt độ và tính chọn lọc của lipase Ví

dụ, cùng trong một nhóm lipase, lipase tụy người và lipase tụy heo, nhưng 2 lipase lại cho thấy tính đặc hiệu khác nhau Lipase tụy người chỉ có hoạt độ cao với triglyceride, trong khi lipase tụy heo còn thể hiện hoạt độ của phospholipase và galactolipase Điểm khác nhau chính trong cấu trúc của 2 enzyme này là kích thước rất nhỏ của nắp trên lipase tụy heo (5 acid amin) Đột biến gene gây ra những biến đổi trên cái nắp đã cho thấy tầm ảnh hưởng của cái nắp đến tính chọn lọc đối với triglyceride, phospholipid và galactolipid Đột biến trên nắp của lipase này sẽ làm thay đổi chiều dài mạch của cơ chất mà nó tương thích [12]

Phức lipase

Lipase tụy có cấu trúc phức với nhóm phụ là protein hay lipid Lipase tụy chứa 2 phần gắn với nhau bằng một khớp linh động, đầu N của phần protein xúc tác có kích thước lớn và đầu C của gấp nếp β có kích thước nhỏ hơn Nó liên quan đến hoạt độ của lipase trong những điều kiện môi trường sinh lý trong cơ thể Trong ống tiêu hóa, triglyceride được hòa với phospholipid, acid béo, protein và muối mật có tác dụng như chất nhũ hóa Muối mật sẽ ngăn cản sự hấp phụ của lipase tụy trên cơ chất lipid nếu không có sự hỗ trợ của một protein được tiết ra cùng với dịch tụy, colipase Colipase là một phân tử protein vừa có tính ưa nước vừa có tính kỵ nước,

nó có thể gắn lipase vào bề mặt phân chia pha và ổn định hoạt độ của lipase trên đó Khi liên kết với đầu C của lipase, colipase sẽ làm lộ phần cấu trúc kỵ nước ở mặt đối diện và giúp enzyme tiếp xúc với bề mặt liên pha [13] Liên kết với colipase không gây ra sự thay đổi về hình dạng của phân tử lipase nhưng một cách gián tiếp,

nó tác động đến cái nắp trên lipase, làm nó mở ra và mở ra phần kỵ nước giúp tăng cường hoạt động trên bề mặt liên pha nước-lipid [14]

Cơ chế xúc tác của lipase

Trung tâm hoạt động

Trung tâm hoạt động của lipase gồm ba gốc acid amin: serine; aspartate hay glutamate và một histidine

Hình 1.3: Vùng tiếp xúc của lipase dạng mở và đóng

Nhóm kỵ nước màu trắng, nhóm ưa nước màu vàng, các nhóm mang điện tích

dương màu xanh và các nhóm mang điện tích âm màu đỏ [15]

Sự hoạt hóa enzyme lipase thường xảy ra ở bề mặt tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất ở dạng hạt nhũ (miccelar substrates), do dịch chuyển một hoặc nhiều nắp (lid) của enzyme Sự tác động này tương đối khác nhau tuỳ loại cơ chất [15]

Hình 1.4 mô tả cơ chế tác động của lipase theo Jaeger và cộng sự (1999)

Hình 1.4: Phản ứng tổng quát ở mặt tiếp xúc của lipase với cơ chất [16]

Trong đó, phản ứng 1 mô tả quá trình chuyển từ dạng enzyme hòa tan sang dạng enzyme hoạt hóa kết hợp cơ chất Quá trình này bao gồm các giai đoạn: (1) kết gắn, (2) định hướng, (3) hoạt hóa và cuối cùng (4) gắn cơ chất vào vị trí hoạt hóa Phần còn lại (phản ứng 2) là phản ứng xúc tác giữa enzyme và cơ chất phù hợp, tạo ra dạng trung gian (Ea*S) Cơ chế xúc tác thủy phân cơ chất gồm hai bước: Độ ái nhân của serine được tăng cường bằng việc chuyển proton đến histidine tạo thành oxyanion tấn công vào carbon của nhóm carbonyl trên liên kết ester Một hình tứ

diện được hình thành mang điện tích âm của nguyên tử oxy trong nhóm carbonyl và

nó được giữ ổn định nhờ liên kết hydro với nhóm NH của mạch chính Proton trên histidin sau đó được chuyển đến oxy trên liên kết ester Liên kết ester này sau đó bị cắt đứt và một liên kết cộng hóa trị trung gian mới được hình thành giữa acid béo mới giải phóng với serine Bước 2 của quá trình là việc deacyl hóa enzyme nhờ phân tử nước đến thủy phân liên kết cộng hóa trị trên Trong bước này, proton từ nước sẽ chuyển đến serine trên tạo thành ion hydroxide Ion này sẽ gắn với nguyên

tử carbon của carbonyl trên cơ chất [17]

Acyl hóa Ea*S Ea*Ac+P1 và đề acyl hóa Ea*Ac Ea*+P2

(Ea*: adsorbed and activated enzyme – enzyme hoạt hóa kết bám)

Cơ chế phân tử của phản ứng xúc tác bởi lipase được mô tả ở hình 1.5

Hình 1.5: Cơ chế thủy phân của enzyme lipase [17]

1) Sự kết gắn lipid, hoạt hoá nhóm serine ưa nhân bởi histidine lân cận và O-Ser tấn công ưa nhân vào nguyên tố C-carbonyl của cơ chất

2) Dạng tetrahydral chuyển tiếp hình thành, với nguyên tử O được ổn định bởi hai nhóm NH-peptid, histidine phóng thích một proton đến phần alcohol của cơ chất

3) Dạng trung gian đồng trị (“acyl enzyme”) được hình thành, trong đó thành phần acid của cơ chất được ester hoá với serine của enzyme Phân tử nước thu vào được hoạt hóa nhờ histidine bên cạnh và ion hydroxyl tấn công ưa nhân nguyên tử

C của dạng đồng trị đó

4) Histidine giải phóng 1 proton đến nguyên tử O của gốc serine hoạt hoá, liên kết ester giữa serine và acyl bị bẻ gãy giải phóng gốc acyl

Trung tâm liên kết với cơ chất

Trung tâm hoạt động của lipase bị bao phủ bên trong cấu trúc protein Cơ chất đi vào đó thông qua một trung tâm liên kết là một cái túi ở phần đầu của gấp nếp β ở trung tâm phân tử enzyme Mặc dù các lipase có cấu trúc gấp nếp tương tự nhau, trung tâm liên kết với cơ chất lại khác nhau về kích thước, cấu trúc, và tính chất lý hóa, đặc biệt là tính kỵ nước của những phần tử trong túi Độ dài, hình dạng, tính kỵ nước của túi có liên quan đến chiều dài mạch carbon của cơ chất [18]

Tính đặc hiệu của lipase

Khả năng sử dụng lipase làm xúc tác sinh học đều dựa vào tính chọn lọc và đặc hiệu rất tinh tế của nó Tính đặc hiệu hay tính chọn lọc có thể là chọn lọc vị trí không gian, ví dụ như vị trí nhóm phân tử cơ chất của liên kết ester bị thủy phân hoặc hình thành; cũng có thể là chọn lọc hóa học , ví dụ như khả năng nhận biết cơ chất; và chọn lọc đồng phân lập thể Hầu hết lipase thông dụng có tính đặc hiệu vị trí nhóm hydroxyl 1,3 trong mạch glycerol Ngoài ra cũng có lipase có tính đặc hiệu cho vị trí sn-2 cho phép việc thủy phân hoàn toàn triglyceride thành acid béo và glycerol Về tính chọn lọc đối với acid béo, lipase có thể chuyển ester với acid béo

có độ dài mạch bên trung bình đến dài (C4 đến C18, có thể lên đến C22) nhưng với hiệu quả khác nhau Lipase tụy thể hiện hoạt độ trên các acid béo không no nhiều nối đôi (polyunsaturated fatty acid, PUFA) [19]

Đặc hiệu cơ chất

Dầu và mỡ động thực vật là những cơ chất thích hợp của enzyme lipase Tuy nhiên, đối với các loại cơ chất khác nhau thì hoạt độ của enzyme cũng không giống nhau [20]

Bảng 1.1: Tính đặc hiệu cơ chất của lipase [20]

Đặc hiệu vị trí hay đặc hiệu vùng (sn-1,3)

Tính đặc hiệu này có thể được xác định qua quá trình transester hóa triolein (OOO) với palmitic acid (P), xúc tác bởi enzyme lipase Sự tạo thành tripalmitin (PPP) cho thấy enzyme không có tính đặc hiệu vị trí và sự không tạo tripalmitin mà chỉ tạo 1,3-dipalmitin 2-olein chứng tỏ enzyme có tính đặc hiệu vị trí -1,3

Hình 1.6: Phương pháp xác định tính đặc hiệu vị trí cuả enzyme lipase [21]

Enzyme đặc hiệu vị trí chỉ cắt các liên kết ester ở vị trí acylglycerol 1 và 3 Trong trường hợp này, triacylglycerol sau khi bị thuỷ giải bởi enzyme sẽ tạo ra 1,2-

hoặc 2,3-diacylglycerol và monoacylglycerrol Các sản phẩm này, đặc biệt là monoacylglycerrol không bền, dễ dàng bị isomer hoá để tạo ra 1,3-diacylglycerol và 1(3)-monoacylglycerrol Nếu xử lý tiếp hỗn hợp trên bằng lipase có hoạt độ đặc hiệu vị trí 1,3 thì sẽ thuỷ giải hoàn toàn triglyceride tạo ra glycerine Tuy nhiên, enzyme lipase cắt đặc hiệu vị trí 1,3 chỉ xúc tác sự trao đổi các gốc acid béo vị trí 1

2-và 3 trong phân tử triacylglycerol 2-và như vậy, các sản phẩm nhận được sẽ khác với các sản phẩm cắt bằng hoá học Khả năng tạo hỗn hợp triacylglycerol mới do tính đặc hiệu của enzyme lipase nói trên đã được ứng dụng trong thực tế [21]

Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme lipase

Sự thủy phân lipid tùy thuộc vào các yếu tố khác nhau như pH, nhiệt độ, nồng

độ cơ chất, nồng độ enzyme, diện tích bề mặt tiếp xúc của enzyme với cơ chất

Bảng 1.2: Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ lipase [20]

1.1.3 Tình hình nghiên cứu về enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá da trơn

Trước đây, enzyme tiêu hóa (pancreatin) được sản xuất chủ yếu từ tụy tạng lợn theo phương pháp truyền thống với tỷ lệ các enzyme trong chế phẩm khác nhau như: Colin và cộng sự nghiên cứu qui trình sản xuất chế phẩm pancreatin từ tụy lợn với hàm lượng protease cao, chế phẩm pancreatin có tỷ lệ protease/ lipase là 1/3 [22] Frink và cộng sự nghiên cứu qui trình sản xuất chế phẩm pancreatin tiệt trùng, phương pháp này giúp giảm thiểu tối đa lượng vi khuẩn, virus gây bệnh bằng cách

xử lý nhiệt độ ở mức thấp nhất là 850C Sản phẩm có dư lượng dung môi thấp hơn 9% [23] GS.TS Phạm Quốc Thăng ở Đại học Bách Khoa Hà Nội đã nghiên cứu thu nhận pancreatin từ tụy tạng lợn, ứng dụng trong lĩnh vực y học, làm men tiêu hóa cho trẻ em ớ các bệnh viện nhi Hà Nội Trần Tựu (1993) ở Liên hiệp Xí nghiệp Dược TP Hồ Chí Minh với sự hỗ trợ của dự án VIE/86/016 đã được tài trợ một hệ thống dây chuyền thiết bị sản xuất các hoạt chất sinh học Liên hiệp xí nghiệp Dược

đã phối hợp với bộ môn Sinh hóa Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.Hồ Chí Minh tiến hành chiết tách pancreatin và chymotrypsin từ phế phẩm của cơ sở giết

mổ gia súc [24] Nguyễn Thị Tiết (2004) đã nghiên cứu tạo chế phẩm pancreatin từ tụy tạng lợn, bổ sung vào khẩu phần ăn cho heo thịt tại các trại chăn nuôi trong khu vực TP Hồ Chí Minh [25]

Tuy nhiên, hiện nay các enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá ngày càng được quan tâm hơn, do cá sống ở môi trường nhiệt độ thấp nên hệ enzyme của chúng tương đối mạnh hơn so với động vật máu nóng Các nghiên cứu về hệ tiêu hóa của các loài cá nói chung và cá da trơn nói riêng chủ yếu tập trung vào việc khảo sát thói quen về

ăn uống của chúng Các hiểu biết về hệ enzyme tiêu hóa của chúng vẫn còn khá hạn chế

Theo Edwin H.Robinson và cộng sự, cá da trơn có quá trình tiêu hóa giống với những động vật có cấu tạo dạ dày đơn giản Bộ phận tiêu hóa của cá da trơn gồm có miệng, họng, thực quản, dạ dày, ruột và những bộ phận khác như tụy tạng, gan, và túi mật pH trong dạ dày của cá da trơn thay đổi trong khoảng từ 2-4 còn pH trong ruột dao động từ 7-9 Hệ enzyme tiêu hóa của cá gồm các enzyme protease, lipase

và amylase [26]

Nghiên cứu về protease từ nội tạng cá

Các protease cá thường được tiết ra từ manh tràng môn vị (pyloric caeca) hay từ tuyến tuỵ [27] Các nghiên cứu protease tụy tạng cá cho thấy đây là các protease kiềm, có hai loại protease là trypsin và chymotrypsin [28]

Trypsin và các enzyme giống trypsin có hoạt độ protease đã được tinh sạch và định tính ở một số loài cá như: cá mòi, cá ốt vảy nhỏ, cá tuyết đảo băng, cá tuyết Đại Tây Dương, cá hồi trứng, cá hồi Đại Tây Dương, cá hồi bạc, cá trồng [29]

Trypsin và các enzyme giống trypsin có phân tử lượng khoảng 25.000 Da [2] Simpson và cộng sự cũng đã ghi nhận phân tử lượng trypsin từ cá tuyết Đại Tây Dương và cá tuyết đảo băng tương ứng là 24.000 và 23.500 Da [30] Nếu đa phần các trypsin thu nhận từ động vật có vú là bền với pH acid thì ngược lại, các trypsin của hầu hết các loài cá đều bền ở pH kiềm Tính bền nhiệt của các trypsin thu từ cá khác nhau tuỳ thuộc vào loài cũng như điều kiện ủ nhiệt [31]

Tính chất động học của các trypsin thu từ ba loài cá đã được khảo sát và kết quả cho thấy vận tốc các phản ứng esterase và amidase của trypsin từ cá cao hơn so với trypsin từ bò Trong khi đó, năng lượng hoạt hoá Arrhenius của trypsin từ cá thấp hơn so với các trypsin thu từ động vật có vú và điều này được lý giải là do phản ứng của chúng ít nhạy cảm với sự sai khác về nhiệt độ hơn [27]

So với trypsin, chymotrypsin thu từ cá vẫn còn ít được nghiên cứu, nghiên cứu đầu tiên về nó do Overnell thực hiện vào năm 1973 [31] Việc tinh sạch và định tính các chymotrypsin từ một số loài cá đã được tiến hành như: cá ốt vảy nhỏ, cá trích, cá nhám góc có gai và cá tuyết Đại Tây Dương Kết quả cho thấy chymotrypsin thu từ

cá tuyết Đại Tây Dương có hoạt độ cao hơn ở cả cơ chất dạng ester và cơ chất dạng amide Các nhà nghiên cứu đã giải thích rằng sự khác biệt về các tính chất động học của chymotrypsin thu từ cá tuyết Đại Tây Dương so với chymotrypsin thu từ động vật có vú là do khả năng đáp ứng với nhiệt độ môi trường sống thấp của nó [32]

Một số tài liệu cũng đã ghi nhận sự có mặt cũng như đặc tính của trypsin và chymotrypsin ở các loài cá nước ngọt như cá chép [33]

Lundstedt L M đã phát hiện trypsin và chymotrypsin trong toàn bộ đoạn ruột

và dạ dày của Brazilian catfish (P.coruscans) Sự hiện diện của trypsin và

chymotrypsin trong dạ dày cá là một kết quả nghiên cứu đã gây ngạc nhiên lớn cho giới khoa học [34]

Ngoài trypsin và chymotrypsin, các nghiên cứu cũng đặc biệt quan tâm đến protease kiềm từ nội tạng cá như: Santos M R nhận thấy rằng hoạt độ protease

kiềm ở những phân đoạn ruột khác nhau của cá South American catfish (Rhamdia quelen) thì khác nhau Hoạt độ protease kiềm được tìm thấy trong suốt chiều dài của

ruột cá nhưng thường giảm khi về cuối đoạn ruột [35]

Poonsuk Prasertsan và cộng sự đã khảo sát hoạt độ của protease trên đối tượng

là nội tạng của 3 loại cá ngừ Kết quả thu được cho thấy trong số những cơ quan nội tạng (bao tử, gan, tụy tạng, lá lách) thì lượng protease cao nhất ở lá lách (0.723 U/mg protein) [36]

Thông thường sự phân bố và hoạt độ của enzyme trong hệ tiêu hóa biến đổi theo tập tính ăn và thành phần thức ăn Kết quả nghiên cứu ghi nhận rằng: hoạt độ enzyme protease kiềm, protease acid, trypsin và chymotrypsin trong nội tạng cá

South American catfish (Rhamdia quelen) luôn thay đổi theo tỷ lệ hàm lượng

protein có trong khẩu phần thức ăn cho cá Hoạt độ protease kiềm trong đoạn ruột trước và đoạn ruột giữa được ghi nhận là 1,40 UI/mg protein Đây là giá trị hoạt độ protease cao nhất được ghi nhận khi khẩu phần thức ăn cho cá chứa tỷ lệ hàm lượng protein là 27% [37]

Nghiên cứu về các enzyme protease trong hệ tiêu hoá của các loài cá khác nhau

đã cho thấy rằng các serine protease phân bố ở ruột cá có hoạt độ trong môi trường kiềm cao hơn so với giá trị tương ứng trong môi trường trung tính Ngoài ra, nhiều nghiên cứu khác cũng chứng tỏ rằng các serine protease từ cá cũng tương tự với các enzyme này ở động vật máu nóng về kích thước phân tử, thành phần acid amin và

sự nhạy cảm với các chất có tác động ức chế các serine protease [38]

Nghiên cứu về lipase từ nội tạng cá

Sự hiện diện, các tính chất và vai trò sinh lý của các lipase ở các động vật thuỷ sản đã được nhiều nhà nghiên cứu ghi nhận [39] Một số lipase từ nội tạng cá đã

được nghiên cứu như lipase cá mập [40], cá tuyết [41], cá tráp [42], cá đối [43], cá rô [44] Các lipid-acylhydrolase không đặc thù biểu hiện tác động của nhiều loại lipase khác nhau như các phospholipase cũng được phát hiện ở các sinh vật sống dưới nước [45]

Jonh S Patton tìm thấy hai loại lipase gan tuỵ ở dạng hoạt hoá ở cá mập, một loại lipase được hoạt hoá bởi muối mật có thể đặc hiệu cho các acid béo không bão hoà bất kể vị trí cũng như tính đặc hiệu nhóm cho các ester [46]

Tocher và Sargent đã tìm hiểu sâu hơn về lipase trong một nghiên cứu được thực

hiện ở loài cá hồi có đốm đen và hai vệt hơi đỏ kéo từ mõm đến đuôi (Salmo gairdnerii), các nhà nghiên cứu cho rằng có hai loại enzyme với hoạt độ lipase khác

nhau trong đường ruột của loài cá này [47]

Lie và Lambertsen cho thấy các enzyme lipase thu được từ ruột cá tuyết Đại Tây

Dương (Gadus morhua) thuỷ phân chủ yếu các PUFA và cho thấy chúng có tính

đặc hiệu acid béo hoàn toàn đối lập với các enzyme lipase vi sinh vật [48]

Alberta N.A Aryee đã thu nhận phân đoạn lipase từ nội tạng cá grey mullet

(Mugil cephalus), sử dụng amoni sulfate làm tác nhân kết tủa sau đó tinh sạch bằng

phương pháp vi lọc Kết quả nghiên cứu cho thấy điều kiện hoạt động của lipase như sau: pH tối thích 8, nhiệt độ tối thích 50o

C [49]

Poonsuk Prasertsan đã khảo sát hoạt độ của lipase trên đối tương nghiên cứu là nội tạng của 3 loại cá ngừ Kết quả thu được trong số những cơ quan nội tạng (bao tử, gan, tụy tạng, lá lách) thì lượng lipase cao nhất ở tụy tạng (0.03 U/mg protein) [50]

1.1.4 Nguồn enzyme tiêu hóa tiềm năng từ cá tra

1.1.4.1 Cá tra

Cá tra (Pangasius hypophthalmus) là một trong những loài cá có giá trị kinh tế

phổ biến ở Đông Nam Á (Campuchia, Thái Lan, Lào, Việt Nam) Dựa vào đặc điểm phân bố tự nhiên của cá tra người ta chia thành hai quần thể riêng biệt: một đàn cá phân bố ở phía trên thác Khôn ở Lào và Thái Lan tạo ra quần thể phía Bắc, một đàn

cá phân bố ở đoạn Mê Kông từ Campuchia về Việt Nam hay quần thể phía Nam Đồng bằng Nam Bộ Việt Nam đã có truyền thống nuôi cá tra phổ biến trong ao và

bè Năng suất nuôi cá tra rất cao, trong ao đạt tới 60-70 tấn/ha, trong bè có thể đạt tới 100-300 kg/m2 nước bè nuôi [51]

Theo tài liệu phân loại, cá tra được xác định vị trí sắp xếp như sau:

Giới: Animalia Linnaeus

Lớp: Actinopterygii

Giống (chi): Pangasius

Loài: Pangasius hypophthalmus

Hình 1.7: Cá tra (Pangasius hypophthalmus)

1.1.4.2 Phế liệu nội tạng - nguồn enzyme tiêu hóa tiềm năng

Hiện nay, đồng bằng sông Cửu Long đang có 193 nhà máy chế biến mặt hàng phi-lê cá tra với khả năng tiêu thụ khoảng 40.000 tấn nguyên liệu/ngày Theo dự đoán của VASEP về phát triển sản xuất và tiêu thụ cá tra vùng đồng bằng sông Cửu Long ước tính đến năm 2015 đạt sản lượng cá nguyên liệu 1,8 triệu tấn Cá tra sau khi lấy phi lê (tỷ lệ 30%) thì phần còn lại (70%) là phế phụ phẩm gồm có da, mỡ, đầu, xương, nội tạng… Hiện nay chúng đã và đang được nghiên cứu tận dụng như sau: da cá được nghiên cứu sản xuất gelatin để sử dụng trong ngành công nghiệp dược và mỹ phẩm; mỡ cá được các cơ sở chế biến thành 2 loại dầu: loại nhẹ có thể trích ly DHA (omega 3) sử dụng trong công nghệ dược phẩm, thực phẩm; loại nặng

sản xuất dầu biodiesel sử dụng cho động cơ; đầu, xương sống được chế biến thành thức ăn gia súc; bong bóng cá, bao tử cá làm thực phẩm; máu cá được nghiên cứu thu nhận protein Riêng nội tạng cá chiếm 5-6% trọng lượng cá, ước tính khoảng 100.000 tấn, chứa nhiều enzyme tiêu hóa như protease, lipase thì vẫn chưa được sử dụng hợp lý nên cần thiết nghiên cứu thu nhận enzyme từ nguồn nguyên liệu tiềm năng này

Phân tích khả năng thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra

Khả năng thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra được xem xét trên cơ sở phân tích các điểm mạnh và điểm yếu như bảng 1.3:

Bảng 1.3: Phân tích khả năng thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra

- Nội tạng của cá tra là nguồn nguyên

liệu giàu enzyme

- Trữ lượng nguồn nguyên liệu này ở

nước ta rất lớn

- Có cơ sở lý thuyết về enzyme tiêu hóa,

có thể ứng dụng các kỹ thuật hiện đại

trong nghiên cứu và thu nhận enzyme từ

nội tạng cá tra

- Giá trị sản phẩm cao

- Dự đoán nhu cầu sử dụng enzyme tiêu

hóa tăng cao trong tương lai

- Khác với tụy tạng lợn, bò hay gia cầm,

sử dụng chế phẩm enzyme từ cá không

gặp cản trở về tôn giáo hay dịch bệnh

- Giới hạn nguyên liệu là nội tạng cá tra

- Để đạt hiệu suất trích ly tối đa enzyme từ nội tạng yêu cầu nội tạng tươi ngay sau giết mổ, nếu bảo quản nguyên liệu không tốt gây hư hỏng và giảm hoạt độ enzyme

- Có thể trở ngại về mùi nguyên liệu

- Tận dụng lượng nhỏ phế thải ngành chế biến cá

- Hướng xử lý chất thải hữu cơ

Tạo sản phẩm giá trị gia tăng và tận thu

phế thải của ngành chế biến cá

Sản xuất sản phẩm giá thấp hơn các nước khác

Theo bảng phân tích 1.3 cho thấy việc thu nhận enzyme tiêu hóa từ nguồn nguyên liệu tiềm năng này được đánh giá là mang tính khả thi cao

1.3 Phương pháp thu nhận và tinh sạch enzyme tiêu hóa

1.3.1 Thu nhận enzyme bằng phương pháp kết tủa

Trước đây, chế phẩm enzyme tiêu hóa (pancreatin) được thu nhận chủ yếu theo các phương pháp sau:

Phương pháp thu pancreatin với tác nhân tủa là aceton Các bước thực hiện như sau: a) tụy tạng được loại bỏ mỡ và mô liên kết; b) xay nhuyễn cân trọng lượng; c)

bổ sung NaCO3 1,2% với tỷ lệ 1/2 (w/v); d) lọc qua rây thu dịch; e) dùng aceton với

tỷ lệ 1/4 (v/v) kết tủa pancreatin, khuấy 10 phút, để lắng 15 phút ở nhiệt độ lạnh; f)

ly tâm thu tủa (lần 1), rửa tủa bằng aceton, ly tâm thu tủa (lần 2); g) sấy tủa nhẹ ở 35-400C; h) nghiền nhỏ thu nhận pancreatin thô (có thể sử dụng cồn tuyệt đối hoặc cồn 960 thay cho aceton ) [24]

Phương pháp tách chiết pancreatin, kết tủa bằng muối (NH4)2SO4: tụy lợn cho tự phân trong nước cất ở 200C từ 6-8 giờ Sau đó, lọc lấy dung dịch và cho kết tủa với (NH4)2SO4 [25]

Phương pháp sản xuất pancreatin với hàm lượng protease cao Phương pháp này gồm các bước sau: a) nghiền tụy tạng đông lạnh; b) tự phân; c) lọc tách các phần không hòa tan để thu dòng qua lọc; d) phối trộn dòng qua lọc trên với isopropanol thu tủa; e) rửa tủa với isopropanol; f) lọc thu tủa ở bước e) Sản phẩm thu được có hàm lượng protease cao do điều chỉnh pH trong qui trình sản xuất [22]

Phương pháp sản xuất bột pancreatin tiệt trùng Phương pháp này sản xuất pancreatin giảm thiểu tối đa lượng vi khuẩn, virus gây bệnh bằng cách xử lý nhiệt

độ mức thấp nhất là 850

C Sản phẩm có dư lượng dung môi thấp hơn 9% [23]

Thu nhận pancreatin thô bằng phương pháp sấy: lấy tụy tươi đã được bảo quản, cân trọng lượng và trộn với một lượng tinh bột bằng 10% so với trọng lượng tụy tươi, sau đó đem sấy khô ở nhiệt độ 500

C, 600C, 700C Sau một thời gian sấy đến khô, đem xay nhuyễn và được chế phẩm pancreatin thô, khô [25]

1.3.2 Phương pháp thu nhận protein, enzyme bằng kỹ thuật lọc màng

Ưu điểm của phương pháp lọc màng là ít gây ô nhiễm môi trường hơn phương pháp truyền thống vì không sử dụng dung môi hữu cơ như aceton, ethanol, hoặc isopropanol (thể tích gấp 3 - 4 lần thể tích dịch enzyme) để kết tủa enzyme Nhược điểm của phương pháp lọc màng là kích thước phân tử phân riêng giao động trong khoảng lớn, do đó phương pháp lọc màng không tách riêng hoàn toàn được các protein Kỹ thuật lọc màng vì vậy được ứng dụng hiệu quả trong công nghiệp thu chế phẩm thô, nhưng kém hiệu quả trong việc thu chế phẩm tinh khiết

Richard W.Baker đã nghiên cứu tinh sạch -amylase từ canh trường vi sinh vật

Đầu tiên, canh trường vi sinh vật sẽ được lọc qua màng vi lọc (Microfiltration) 0,2

m cellulose acetate, đây là bước quan trọng để loại bỏ tế bào và các cặn lơ lửng Trong khi van lọc đóng, áp suất qua màng không vượt quá 0,5 bar Sau 5 phút mở

từ từ van lọc để tăng áp suất qua màng từ 0,5 đến 2 bar, quá trình lọc ở điều kiện áp suất qua màng không đổi, chất chống bọt được thêm vào dung dịch để hạn chế tắc

lỗ do enzyme Quá trình lọc được thực hiện trong 5 giờ, trong 210 phút đầu lọc màng vi lọc, enzyme được chuyển qua toàn bộ trong 42L dòng permeate, không thấy hoạt độ enzyme ở dòng retentate Bước lọc thứ 2, dùng màng siêu lọc, phân đoạn 10 KDa để chặn enzyme có phân tử lượng 25 KDa, kết quả sau 90 phút lọc, từ 42L thu được 2L dòng retentate với nồng độ 70% chất khô Không thấy hoạt độ enzyme ở dòng permeate [52]

Huỳnh Ngọc Oanh và cộng sự đã nghiên cứu tinh sạch enzyme pectinase từ Asp niger – bằng phương pháp lọc màng, sử dụng hệ thống lọc QuixStand Benchtop

Systems Kết quả cho thấy khi tinh sạch chế phẩm enzyme bằng phương pháp lọc màng (cross flow membrane) với tốc độ bơm đầu vào 150rpm thì độ tinh sạch (tăng 3,1 lần trước khi lọc) cao hơn ở tốc độ 200rmp có độ tinh sạch (chỉ tăng 2,2 lần so với trước khi lọc) [53]

D Marutani và cộng sự đã nghiên cứu thu nhận enzyme lipase bằng công nghệ lọc màng, kết quả cho thấy lipase được phân riêng bởi quá trình UF, khi sử dụng ống lọc Amicon, kiểu lọc dead-end, kích thước màng là 20 kDa để lọc dịch lipase (phân tử lượng 65 KDa) thì hầu như giữ lại được toàn bộ enzyme [54].M.Moresi nghiên cứu sử dụng màng vi lọc và siêu lọc trong thu hồi kháng thể,

kháng thể có phân tử lượng 15.500 Da được sản xuất bởi vi khuẩn E coli, được tách

khỏi sinh khối bằng công đoạn vi lọc và siêu lọc Bước đầu tiên, sinh khối được loại

bỏ bởi màng vi lọc 0,45 m trong thiết bị khung bản, van permeate đóng trong khi van retentate mở để bơm tăng áp suất đầu vào lên 2 bar và duy trì trong 3-5 phút để tránh hình thành lớp bánh lọc trên bề mặt màng Sau đó van permeate được mở và

áp suất được chỉnh như sau: Pin=2,0 bar, Pret=0 bar, Pperm=0 bar Bước lọc thứ hai, dùng màng siêu lọc phân đoạn 10 kDa polysulfone thiết bị lọc bản, áp suất được chỉnh như sau Pin= 2,5bar, Pret= 0,5bar, Pperm= 0bar Sau 90 phút lọc, 6044 ml dung dịch kháng thể được rút xuống còn 425 ml [55]

Roland Ulber và cộng sự đã nghiên cứu phân đoạn protein huyết tương bằng hệ thống màng: Albumin thu từ huyết thanh theo quy trình của Cohn dựa vào sự kết tủa khác nhau của protein trong máu với ethanol Ngoài ra, nhiệt độ và pH cũng ảnh hưởng khác nhau đến kết tủa từng protein, từ đó có thể phân tách được chúng; Sản phẩm albumin từ máu ước tính khoảng 300 tấn thu được từ 17 triệu lít huyết tương Sau nhiều lần ly tâm và kết tủa, phần trên của quá trình ly tâm có nồng độ albumin xấp xỉ 13 g/l và độ cồn là 40%; Để chuẩn bị cho bước siêu lọc, dung dịch trải qua bốn bước sau: Pha loãng độ cồn xuống còn 20% để tránh làm hư màng siêu lọc polysulfone; Lọc đến nồng độ albumin khoảng 80g/l; Thẩm tích để loại bớt cồn; Lọc đến nồng độ bằng 200 g/ml Lưu lượng đạt ổn định sau 10 -15 phút và không ảnh hưởng nhiều bởi nồng độ cồn [56]

1.3.3 Phương pháp trích ly và tinh sạch enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá

Quá trình trích ly nhằm mục đích chiết enzyme từ nội tạng cá vào dung môi, dung môi trích ly là dung dịch đệm có pH thích hợp Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng khuếch tán enzyme từ nguyên liệu vào dung môi như: tỷ lệ nguyên liệu và dung môi, pH, nhiệt độ, thời gian [57]

Dung dịch sau trích ly, ngoài enzyme còn có các tạp chất khác như protein phi enzyme, muối Vì thế cần thiết phải loại bỏ những tạp chất này để thu nhận enzyme có độ tinh khiết cao Hiện nay, những phương pháp được sử dụng để tinh sạch enzyme phổ biến như: thẩm tích, ứng dụng để loại muối và các tạp chất có phân tử lượng nhỏ, các chất có phân tử lượng lớn như enzyme, protein bị giữ lại;

kết tủa phân đoạn bằng muối hay dung môi hữu cơ; sắc ký trao đổi ion; sắc ký lọc gel; sắc ký hấp phụ, ứng dụng để loại các protein và các tạp chất có phân tử lượng cao Trong tinh sạch enzyme, người ta thường dùng phối hợp 2-3 phương pháp để cho kết quả tốt hơn [58]

Yoonhwa Jeong và cộng sự đã tinh sạch protease từ gan tụy crawfish

(Procambarus Clarkii), quá trình tinh sạch như sau: kết tủa protease bằng muối

amoni sulfate 60% nồng độ bão hòa, thẩm tích loại muối, sau đó qua sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose, thể tích cột 2,5 x 30 cm, rửa giải bằng dung dịch đệm Tris-HC1 50 mM, pH 7,8 với NaCl gradient nồng độ 0-0,2 M, tốc độ 0,2 ml/phút, thu các phân đoạn thể tích 4ml/ống Dịch enzyme sau đó qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G-75 với kích thước 1 x 40 cm, rửa giải bằng đệm Tris-HC1 50 mM, pH 7,8, tốc độ 20 ml/h, thu ống 3 ml/ống [59]

A.E El-Beltagy và cộng sự đã tinh sạch protease từ nội tạng cá bơn (Tilapia Nilotica), quá trình tinh sạch gồm các bước sau: kết tủa protease bằng muối amoni

sulfate 60% nồng độ bão hòa, thẩm tích loại muối, sau đó qua lọc gel Sephadex G100 với cột 1x 50 cm, rửa giải bằng dung dịch đệm Tris–HCl nồng độ 20 mM, pH 7,8, tốc độ 20 ml/h, thu các ống thể tích 3ml/ống [60]

-M.A Islam và cộng sự đã nghiên cứu tinh sạch lipase nội tạng cá đối (Liza parsia), quá trình tinh sạch gồm các bước như sau: kết tủa bằng amoni sulfate, thẩm

tích, qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose, rửa giải bằng NaCl nồng độ khác nhau trong dung dịch đệm Tris-HCl 10mM, pH8,4 Sau đó qua sắc ký lọc gel Sephadex G-75, rửa giải bằng đệm Tris-HCl, pH8,4 [43]

Từ nhiều tài liệu tham khảo khác nhau [26], [28], [32], [38], [42], [43], chúng tôi tóm tắt quá trình tinh sạch protease, lipase từ nội tạng cá qua các bước như sau: (1) nguyên liệu cân, nghiền nhỏ, kết tủa bằng dung môi aceton tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi từ 1/3 – 1/5, lọc tủa thu nhận bột enzyme thô; (2) bột enzyme thô được trích ly bằng dung dịch đệm Tris-HCl nồng độ 10-50 mM, pH 7,5-8, tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi từ 1/2 – 1/10, nhiệt độ 50C trong 0,5- 3 giờ kết hợp khuấy từ; bước (1) và (2) có thể kết hợp bằng đồng hóa và trích ly nguyên liệu mà không qua kết tủa bằng aceton; (3) ly tâm vận tốc 6.000-10.000 vòng/phút trong 10-30 phút thu dịch trích

ly; (4) kết tủa enzyme bằng muối amoni sulfate 30-70% nồng độ bão hòa; (5) thẩm tích loại muối bằng màng cellophan kích thước 12.000 Da trong dung dịch đệm Tris-HCl 10-50mM, pH 7,5-8 trong 24 giờ; (6) enzyme sau đó qua sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose (hoặc DEAE-Sepharose), tỷ lệ đường kính/ chiều dài cột từ 1/10- 1/15 như thể tích cột 2,5 x 30 cm, cột 1,8 x 22 cm, rửa giải bằng dung dịch đệm Tris-HC1 10-50 mM, pH 7,5-8 với NaCl gradient nồng độ 0-0,5 M, tốc độ 20-

25 ml/h, thu ống thể tích 4ml/ống Sau đó qua sắc ký lọc gel Sephadex G-75 (hoặc Sephadex G-50, Sephadex G-100) với tỷ lệ đường kính/chiều dài cột 1/20 -1/40 như thể tích cột 1 x 40 cm, cột 1,5 x 30 cm, rửa giải bằng đệm Tris-HC1 10-50 mM, pH 7,5-8, tốc độ 20-25 ml/h, thu ống 3 ml/ống

Các phương pháp tinh sạch lipase từ nội tạng cá tương tự như các phương pháp tinh sạch lipase từ động vật máu nóng đã được nghiên cứu như sau:

Theo Verger và cộng sự, lipase trong dịch tụy lợn trích ly được phân tách bằng ammoni sulfate, sau đó qua sắc ký cột DEAE-cellulose (hoặc CM-cellulose), Sephadex G-100; Có 2 dạng phân tử của lipase (lipase A và lipase B) có cùng khối lượng phân tử (khoảng 50 kDa) và được tách ra ở pH thấp với cột CM-cellulose trao đổi cation Lipase A có tính acid hơn và được tách ra trước tiên trong cột CM-cellulose, còn với cột DEAE-cellulose trao đổi anion thì nó ra sau lipase B Với cách làm sạch này, lipase được làm sạch 30 lần dựa vào hoạt độ riêng lipase và hiệu suất thu hồi 15% [61]

Các chế phẩm từ tụy lợn theo phương pháp trên thường chứa khá nhiều loại colipase, là một protein có tác dụng kích hoạt lipase trong cơ thể Nhiều nỗ lực nhằm loại bỏ hoàn toàn colipase trong chế phẩm lipase tụy như biến đổi hóa học trên nhóm sulphydryl, biến đổi amino acid, sắc ký hấp phụ trên cột hydroxyapatite hay sắc ký ái lực trên cột A-Sepharose đều cho những kết quả không khả quan [62].Việc tinh sạch lipase từ tụy hay dịch tụy của các loài khác như gà tây, đà điểu cũng đã được nghiên cứu, phương pháp tinh sạch rất giống với những phương pháp trên bao gồm lọc gel trên Sephadex G-100, sắc ký trao đổi cation/anion [63], [64].Các lipase từ vi sinh vật cũng đã được nghiên cứu tinh sạch bằng các phương pháp tương tự, cụ thể như sau:

Abel Hiol và cộng sự khi tinh sạch lipase từ Rhizopus oryzae đã áp dụng các

bước làm sạch sau: lọc, kết tủa với ammonium sulfate 2 lần, sau đó qua sắc ký cột Sulphopropyl-Sepharose rồi qua tiếp cột Sephadex G-75 [65]

Ramani và cộng sự đã tinh sạch lipase từ Pseudomonas gessardii qua các bước

như sau: kết tủa bằng amoni sulfate, sắc ký cột DEAE-cellulose, sắc ký cột

Sephadex G-25 [66]

1.3 Ứng dụng của các enzyme tiêu hóa

1.3.1 Ứng dụng chế phẩm hỗn hợp đa enzyme

Ứng dụng pancreatin trong y dược

Pancreatin là thuốc trợ tiêu hóa, trong y học, các enzyme tuyến tụy được ứng dụng rộng rãi trong chữa bệnh kém tiêu hóa như: chymotrypsin (EC 3.4.4.5), trypsin (EC 3.4.4.4), amylase (EC 3.2.1.1), lipase (EC 3.1.1.3), pancreatin hỗn hợp Nguồn thu nhận enzyme chủ yếu từ tụy bò hoặc tụy lợn, ứng dụng chữa trị những vấn đề liên quan đến tiêu hóa như chứng ợ nóng, viêm, loét dạ dày, bệnh trĩ, táo bón, ung thư ruột [1]

Các tiêu chuẩn của chế phẩm pancreatin ứng dụng trong sản xuất thuốc trợ tiêu hóa: hoạt độ enzyme cao, có khả năng chịu được dịch dạ dày, có khả năng phân tán đều trong bao tử, enzyme thể hiện hoạt độ cao nhất trong ruột non [22]

Theo tiêu chuẩn sản xuất pancreatin của Biochemie Gesellschaft M.B.H- Đức, các chỉ tiêu chất lượng của chế phẩm pancreatin: Hoạt độ lipase: 56.9 U/mg protein; hoạt độ amylase: 45.4 U/mg protein; hoạt độ protease: 3.39 U/mg protein; chất béo: 0.7%; hàm ẩm: 1.9 %; tỷ trọng: 0.41 g/ml; cỡ hạt: 80% giữa sàng 0.85 và 0.35 mm [23]

Theo FDA, 6 loại sản phẩm hỗn hợp chứa enzyme tuyến tụy lipase, protease và amylase (Pancreatic enzyme products-PEP) được chấp nhận đạt tiêu chuẩn chất lượng, an toàn, hiệu quả là Creon và Zenpep (được chấp nhận 2009), Pancreaze (2010), Ultresa và Viokace (2012), Pertzye (2012) Ngoài ra còn một số thương hiệu

uy tín cung cấp enzyme tuyến tụy như Creon, Nutrizym, Pancrease HL, Pancrex, Zenpep, Pancreaze [1]

Ứng dụng pancreatin trong sản xuất bột cá từ phế liệu cá

Phế liệu cá tra từ các nhà máy chế biến có giá trị thấp nhưng lại có hàm lượng protein cao, rất thuận lợi để sản xuất bột cá, bột cá được sản xuất từ nguyên liệu này

có giá thành rẻ hơn các loại bột cá sản xuất từ nguyên liệu khác Công nghệ sử dụng chế phẩm enzyme protease để thủy phân phụ phẩm cá được ứng dụng trong nhiều nhà máy chế biến thủy sản tạo ra sản phẩm an toàn làm nguyên liệu thức ăn trong chăn nuôi có giá trị kinh tế và có ý nghĩa trong bảo vệ môi trường [67]

Ứng dụng pancreatin trong sản xuất pepton

Pepton là sản phẩm thủy phân protein không hoàn toàn, là hỗn hợp nhiều peptid ngắn từ 5-8 acid amin, dễ tiêu hóa, vì vậy, pepton được xem là loại thực phẩm dinh dưỡng đặc biệt dùng cho người bệnh trong giai đoạn hồi phục, pepton cũng được bổ sung vào các loại thực phẩm cho trẻ em suy dinh dưỡng, bổ sung vào khẩu phần ăn của vật nuôi Ngoài ra, pepton còn là nguyên liệu trong việc tạo môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy vi sinh vật [68]

Ứng dụng pancreatin bổ sung vào khẩu phần ăn trong chăn nuôi thú y

Nghiên cứu theo dõi trên 338 heo con cai sữa, bổ sung hỗn hợp enzyme (pancreatin, bột tụy tạng do Pháp sản xuất 0,25g/kg thức ăn) đã cải thiện tăng trọng ngày từ 9-25%, giảm chỉ số chuyển thức ăn từ 9,95-15,57%, giảm tỷ lệ tiêu chảy 1,31-4,8%, tiết kiệm cho nhà chăn nuôi 5,56 đến 14,6% chi phí thức ăn [69]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng enzyme tiêu hóa từ một số loài cá

Enzyme tiêu hóa của cá da trơn có thể được thu nhận từ phế phụ phẩm hay chất thải của ngành chế biến cá [70] Hầu hết enzyme cá có đặc tính khác biệt so với enzyme từ động vật máu nóng, chúng hoạt động xúc tác mạnh hơn ở nhiệt độ tương đối thấp so với các enzyme tương tự từ động vật có vú, thực vật Xử lý nhiệt độ thấp mang lại nhiều lợi ích như chi phí nhiệt thấp, bảo vệ cơ chất, sản phẩm không

bị biến tính, phân hủy do nhiệt và giảm thiểu phản ứng phụ không mong muốn [71] Các enzyme tiêu hóa thu nhận từ nội tạng cá được ứng dụng trong: xử lý thịt, trích ly dầu cá từ nguyên liệu thô, sản xuất acid béo -3 dạng concentrate, dùng trong kỹ thuật tái tổ hợp gen, dùng làm enzyme chống vi khuẩn, dùng làm enzyme chống oxy hóa, tách loại da cá và động vật thủy sinh không xương sống, tinh sạch

trứng cá, loại bỏ màng gan cá tuyết, tách bỏ vỏ của động vật có vỏ, sản xuất nước chấm từ cá, sản xuất thức ăn gia súc từ cá, sản xuất protein thủy phân từ cá, tận thu các hợp chất màu từ phế phẩm của động vật có vỏ, dùng chymosin thay thế rennet trong sản xuất phô mai, khử mùi ôi do oxy hoá ở sữa, xử lý nước thải có độ nhớt cao [72]

Tình hình nghiên cứu ứng dụng protease từ nội tạng cá

Gần đây, ứng dụng protease tuyến tụy từ nội tạng cá, đặc biệt là trypsin, gia tăng đáng kể bởi vì nó vừa ổn định vừa có hoạt độ cao trong điều kiện khắc nghiệt như nhiệt độ 50-600C, pH cao, có mặt của chất hoạt động bề mặt hay chất chống oxy hóa [73]

Cano-Lopez và cộng sự đã sử dụng trypsin từ môn vị cá tuyết với tác nhân EDTA tăng hiệu suất thu hồi cả protein và chất màu trong chất thải Phương pháp này cho phép thu hồi 80% astaxanthin, carotenoprotein và protein từ chất thải ngành chế biến tôm [74]

Klomklao và cộng sự đã nghiên cứu thu nhận carotenoproteins từ chất thải tôm hùm khi sử dụng trypsin cá bluefish Sản phẩm thu được chứa hàm lượng protein và chất màu cao hơn và hàm lượng chitin, tro thấp hơn [75]

Chaveesuk và cộng sự đã bổ sung trypsin và chymotrypsin từ cá làm gia tăng đáng kể sự thủy phân protein trong sản xuất nước mắm [76]

Gildberg và cộng sự đã nghiên cứu bổ sung 5-10% protease từ cá trong sản xuất nước mắm, kết quả thu được nước mắm tăng hàm lượng protein 60% sau trữ 6 tháng [77]

Nghiên cứu sản xuất nước mắm từ cá hồi có bổ sung protease từ cá cho hàm lượng nitơ tổng, nitơ amino, nitơ formaldehyde, nitơ ammonia cao hơn so với khi không bổ sung protease [78]

Trong ngành công nghiệp chế biến sữa, sự oxy hoá sữa là một hiện tượng không mong muốn Các enzyme tiêu hoá thu nhận từ các loài cá sống ở môi trường nhiệt

độ thấp có thể rất hữu dụng trong trường hợp này do chúng có thể dễ dàng bị vô hoạt bằng cách gia nhiệt sữa sau khi quá trình xử lý theo ý muốn kết thúc Nghiên cứu cho thấy các trypsin từ bò và cá đều tạo ra các tác động tương tự nhau để chống