LUẤN ÁN TIẾN SĨ NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH ERYTHROMYCIN TRONG TÔM, CÁ BẰNG KỸ THUẬT SÓNG VUÔNG QUÉT NHANH TRÊN CỰC GIỌT CHẬM VÀ KHẢ NĂNG ĐÀO THẢI

HCMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN PHƯỚC MINH NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH ERYTHROMYCIN TRONG TÔM, CÁ BẰNG KỸ THUẬT SÓNG VUÔNG QUÉT NHANH TRÊN CỰC GIỌT CHẬM VÀ KHẢ NĂNG ĐÀO THẢI LUẬN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN PHƯỚC MINH

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH ERYTHROMYCIN TRONG TÔM, CÁ BẰNG KỸ THUẬT SÓNG VUÔNG QUÉT NHANH TRÊN CỰC GIỌT CHẬM VÀ KHẢ NĂNG ĐÀO THẢI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

Tp Hồ Chí Minh năm 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN PHƯỚC MINH

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH ERYTHROMYCIN TRONG TÔM, CÁ BẰNG KỸ THUẬT SÓNG VUÔNG QUÉT NHANH TRÊN CỰC GIỌT CHẬM VÀ KHẢ NĂNG ĐÀO THẢI

Chuyên ngành: Chế Biến Thực Phẩm và Đồ Uống

Mã số chuyên ngành: 62.54.02.01

Phản biện độc lập 1:

Phản biện độc lập 2:

Phản biện 1:

Phản biện 2:

Phản biện 3:

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 TS Trần Bích Lam

2 TS Nguyễn Trọng Giao

Tp Hồ Chí Minh năm 2012

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả Các kết quảnghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực, và không sao chép từ bất kỳmột nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu (nếu có)

đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu

Tác giả luận án

Nguyễn Phước Minh

TÓM TẮT LUẬN ÁN

 Đề tài đã xây dựng được phương pháp sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậmtrong việc phân tích dư lượng kháng sinh erythromycin trong tôm, cá đạt được giới hạnphát hiện (LoD = 0,52 ppb), đáp ứng yêu cầu giới hạn dư lượng cho phép theo tiêu chuẩnquốc tế (Codex, FAO/WHO, EU, Mỹ, Canada, Úc), rút ngắn thời gian phân tích, đơn giảnhóa kỹ thuật, tiết kiệm chi phí

 Giải thích được cơ chế xuất hiện sóng của erythromycin, từ đó khái quát hoá và đưa rađược giả thuyết dự đoán khả năng nhận danh và định lượng từng họ kháng sinh nhưphenicol, nitrofuran, fluoroquinolon (thường gặp trong nuôi trồng thuỷ sản) bằng kỹ thuậtsóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm

 Kết quả đề tài đã cho thấy rằng các dẫn xuất erythromycin không chỉ được chuyển hoá

từ Sacchropolyspora erythrea bằng con đường lên men, mà còn erythromycin A khi vào

cơ thể tôm cá, dưới tác dụng của các enzyme oxy hóa khử và enzyme chuyển methyl hóa,chuyển thành erythromycin C, E, F, sau đó bị đào thải Đề tài cũng đưa ra được giả thuyếtgiải thích cơ chế chuyển hoá erythromycin trong tôm càng xanh, cá rô phi khi nuôi

 Đã đánh giá và rút ra được quy luật thời gian ngưng kháng sinh erythromycin trướcthu hoạch trên đối tượng tôm càng xanh và cá rô phi

 A new sensitive analytical approach for determination of erythromycin A in giant

freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii), tilapia (Oreochromis niloticus) by a fast

scanning stripping square wave voltammetry using the dropping mercury electrode F) was developed and validated to meet requirements of detection limit, low cost andsimple technique

(PSA- Clarify the mechanism of peak appearance of erythromycin on basic of squarewave voltammetry From that point, a general hypothesis about the identified andquantified ability for antibiotic groups such as phenicols, nitrofurans, fluoroquinolones (inaquaculture) by square wave voltammetry at dropping mercury electrode was clearlyintroduced

 Overcome the opinion that derivatives of erythromycins were only metabolized by

Sacchropolyspora erythrea in fermentation Specifically was an evidence of

biotransformation of erythromycin A to erythromycin C, E, F during prawn and tilapiaaquaculture From this point, a hypothesis of bio-transformative mechanism in thesespecies was also established

 Investigate the elimination and bio-transformation of erythromycin A in giantfreshwater prawn and tilapia so that appropriated withdrawal time periods were outlined

to each specie

LỜI CÁM ƠN

Nhìn lại những gì đã qua, trước tiên em xin bày tỏ tình thương mến và lòng biết ơnsâu sắc đến Ba Mẹ đã nuôi dưỡng và lo lắng cho em đến ngày hôm nay, không chỉ là giátrị vật chất mà còn là những giá trị tinh thần hết sức quý báu không gì so sánh được

Em xin trân trọng gửi lời cám ơn đến thầy Nguyễn Trọng Giao và cô Trần BíchLam những người thầy cô hướng dẫn rất đáng kính, người đã tận tình chỉ dẫn và giúp đỡ

em trong suốt thời gian thực hiện luận án

Sự biết ơn này cũng xin được chân thành gửi đến quý thầy cô: thầy Lê Văn ViệtMẫn, thầy Nguyễn Hoàng Dũng, cô Đống Thị Anh Đào, cô Phan Ngọc Hoà tại Bộ MônCông Nghệ Thực Phẩm, Khoa Kỹ Thuật Hoá Học, ĐH Bách Khoa Tp HCM; thầyNguyễn Phước Thành - Trường ĐH Tôn Đức Thắng; thầy Nguyễn Bá Hoài Anh - Trường

ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp HCM; thầy Nguyễn Như Trí - ĐH Nông Lâm Tp HCMcùng bạn bè gần xa đã có những định hướng và góp ý hết sức quý báo cho em trong suốtthời gian qua

Sau cùng, em rất tự hào và vinh dự khi được học tập dưới mái trường ĐH BáchKhoa Tp HCM, một trong những trường ĐH hàng đầu ở Việt Nam với những điều kiệnhọc tập thuận lợi nhất

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

TÓM TẮT LUẬN ÁN ii

ABSTRACT iii

LỜI CÁM ƠN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

DANH MỤC CÁC BẢNG x

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT xi

TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3

Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 4

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 6

1.1 Tồn dư kháng sinh đối với an toàn thực phẩm 6

1.1.1 Thực trạng về tình hình sử dụng kháng sinh trong thú y và chăn nuôi 6

1.1.2 Ảnh hưởng của chất kháng sinh tồn dư đến chất lượng thực phẩm 6

1.1.3 Những qui định về sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi – thú y 7

1.2 Erythromycin và biến đổi của erythromycin trên cơ thể thủy sản 7

1.2.1 Erythromycin 7

1.2.2 Chuyển hóa sinh học của erythromycin bởi Saccharopolyspora erythraea 9

1.2.3 Chuyển hóa và đào thải erythromycin trên cơ thể thủy sản 11

1.2.4 Vì sao chọn đối tượng thủy sản trong nghiên cứu này là tôm càng xanh và cá rô phi 14

1.3 Các kỹ thuật dùng để phân tích erythromycin 15

1.3.1 Phương pháp ELISA 15

1.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ 16

1.3.3 Phương pháp Von-ampe 22

1.4 Những vấn đề tồn tại cần giải quyết 28

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị dụng cụ, hóa chất 29

2.1.1 Nguyên vật liệu 29

2.1.2 Thiết bị dụng cụ 29

2.1.3 Hoá chất 29

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.2.1 Sơ đồ tiến trình nghiên cứu 30

2.2.2 Phương pháp thực nghiệm 32

2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 39

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 40

3.1 Các điều kiện phù hợp cho quá trình định lượng erythromycin bằng phương pháp sóng vuông quét nhanh và stripping sóng vuông quét nhanh 40

3.1.1 Nghiên cứu thăm dò định hướng và chọn vùng quét thế 40

3.1.2 Nghiên cứu tìm dung dịch nền và pH thích hợp 41

3.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nền 49

3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi hoà tan erythromycin 51

3.1.5 Nghiên cứu các điều kiện chạy máy thích hợp 53

3.1.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của các ion gây nhiễu 63

3.1.7 Nghiên cứu xây dựng đường chuẩn 63

3.1.8 Nghiên cứu lựa chọn quy trình trích ly mẫu 66

3.2 Các thông số thẩm định phương pháp 67

3.2.1 Khoảng tuyến tính 67

3.2.2 Giới hạn phát hiện 67

3.2.3 Độ đúng, độ chính xác, hiệu suất thu hồi 67

3.2.4 Đánh giá khả năng nhận danh erythromycin A với các kháng sinh khác 68

3.2.5 So sánh đối chứng kết quả SWV với LC-MS/MS 76

3.2.6 So sánh hiệu quả kinh tế giữa SWV với các phương pháp khác 78

3.3 Ứng dụng phân tích erythromycin trên các mẫu thực tế tôm, cá tại các địa phương 78

3.3.1 Tôm càng xanh 79

3.3.2 Cá rô phi 79

3.4 Xác định quy luật chuyển hóa sinh học và đào thải kháng sinh erythromycin trên cơ

thể thủy sản khi nuôi 81

3.4.1 Đào thải erythromycin A trong cơ thịt thuỷ sản 81

3.4.2 Chuyển hoá sinh học của kháng sinh gốc 85

KẾT LUẬN 91

KIẾN NGHỊ 93

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ 94

TÀI LIỆU THAM KHẢO 95

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của erythromycin 8

Hình 1.2: Chuyển hoá sinh học các dẫn xuất erythromycin 10

Hình 1.3: Nguyên lý khái quát của kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm 25 Hình 1.4: Nguyên lý khái quát của kỹ thuật Stripping sóng vuông trên cực giọt chậm 27

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu phân tích erythromycin 31

Hình 3.1: Các nhóm chức trong công thức cấu tạo của erythromycin 40

Hình 3.2: Phổ erythromycin ghi 5 lần trong nền đệm Amoni axetat 0,1 M; pH 8,0 41

Hình 3.3: Phổ erythromycin trên nền Natri axetat 0,1M 43

Hình 3.4: Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Amoni axetat 0,1M 44

Hình 3.5: Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Citrat – Phosphat 0,1M 45

Hình 3.6: Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Borax 0,1M 46

Hình 3.7: Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Tris 0,1M 46

Hình 3.8: Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Amoni axetat pH 8,0 50

Hình 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nền Amoni axetat đến cường độ dòng của erythromycin A 50

Hình 3.10: Phổ erythromycin ghi 5 lần khi dùng dung môi hòa tan 52

Hình 3.11: Phổ erythromycin theo chiều quét 53

Hình 3.12: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở Vstart 54

Hình 3.13: Ảnh hưởng của Vstart đến cường độ dòng của erythromycin A 55

Hình 3.14: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở Vstep 56

Hình 3.15: Ảnh hưởng của Vstepđến cường độ dòng của erythromycin A 56

Hình 3.16: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở Vpulse 57

Hình 3.17: Ảnh hưởng của Vpulseđến cường độ dòng của erythromycin A 58

Hình 3.18: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở Tdrop= 1.000 ms 59

Hình 3.19: Ảnh hưởng của Tdropđến cường độ dòng của erythromycin A 59

Hình 3.20: Phổ erythromycin ghi 5 lần với Telectrolise 60

Hình 3.21: Ảnh hưởng của Telectroliseđến cường độ dòng của erythromycin A 61

Hình 3.22: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở Velectrolise 62

Hình 3.23: Ảnh hưởng của Velectroliseđến cường độ dòng của erythromycin A 62

Hình 3.24: Đường chuẩn erythromycin A trên dung dịch nền Amoni axetat 0,1 M, pH 8,0 65

Hình 3.25: Hiệu suất trích ly erythromycin trên tôm càng xanh khi so sánh các quy trình 66

Hình 3.26: Hiệu suất trích ly erythromycin trên cá rô phi khi so sánh các quy trình 66

Hình 3.27: Nồng độ erythromycin được xác định trên mẫu tôm càng xanh ở các thời điểm và mức nồng độ khác nhau 67

Hình 3.28: Nồng độ erythromycin được xác định trên mẫu cá rô phi ở các thời điểm và mức nồng độ khác nhau 68

Hình 3.29: Đường chuẩn erythromycin trên nền mẫu tôm càng xanh 76

Hình 3.30: Đường chuẩn erythromycin trên nền mẫu cá rô phi 76

Hình 3.31: Thực trạng nhiễm erythromycin ở tôm càng xanh tại các tỉnh ĐBSCL 79

Hình 3.32: Thực trạng nhiễm erythromycin ở cá rô phi tại các tỉnh ĐBSCL 79

Hình 3.33: Đào thải hàm lượng erythromycin A trong cơ thịt tôm càng xanh đã được cho ăn 50 và 100 mg.kg-1thể trọng.ngày-1trong 7 ngày 81

Hình 3.34: Đào thải hàm lượng erythromycin A trong cơ thịt cá rô phi đã cho ăn 50 và 100 mg.kg-1thể trọng.ngày-1trong 7 ngày 82

Hình 3.35: Đường hồi quy tuyến tính và giới hạn chấp nhận 1 phía (95%), với độ tin cậy 95%, của nồng độ erythromycin A trong cơ thịt tôm càng xanh đã cho ăn erythromycin trong 7 ngày (100 mg.kg-1thể trọng.ngày-1) 83

Hình 3.36: Đường hồi quy tuyến tính và giới hạn chấp nhận 1 phía (95%), với độ tin cậy 95%, của nồng độ erythromycin A trong cơ thịt cá rô phi đã cho ăn erythromycin trong 7 ngày (50 mg.kg-1thể trọng.ngày-1) 83

Hình 3.37: Đường hồi quy tuyến tính và giới hạn chấp nhận 1 phía (95%), với độ tin cậy 95%, của nồng độ erythromycin A trong cơ thịt cá rô phi đã cho ăn erythromycin trong 7 ngày (100 mg.kg-1thể trọng.ngày-1) 84

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Công thức phân tử và nhóm thế của các erythromycin 8

Bảng 1.2: Mức dư lượng tối đa cho phép (MRL) của erythromycin trong sản phẩm thực phẩm theo quy định của từng thị trường nhập khẩu 9

Bảng 1.3: Diễn biến đào thải erythromycin ra khỏi cơ thể cá hồi ở các thời điểm, đo mẫu cơ thịt + da cá (giá trị trung bìnhđộ lệch chuẩn, n=10) 12

Bảng 1.4: Một số công trình nghiên cứu erythromycin trên thế giới 21

Bảng 2.1: Xây dựng đường chuẩn trên dung dịch nền 33

Bảng 3.1: Sự biến đổi cường độ dòng của erythromycin A theo loại dung dịch nền, và pH 47

Bảng 3.2: Giá trị thế bán sóng E1/2 và cường độ dòng của erythromycin trong dung dịch đệm Amoni axetat pH 8,0 47

Bảng 3.3: Thế bán sóng đặc trưng của một số kháng sinh 69

Bảng 3.4: So sánh kết quả phân tích mẫu tôm càng xanh bởi 2 phương pháp 77

Bảng 3.5: So sánh kết quả phân tích mẫu cá rô phi bởi 2 phương pháp 77

Bảng 3.6: So sánh hiệu quả kinh tế giữa phương pháp SWV với một số phương pháp khác khi định lượng erythromycin 78

Bảng 3.7: Các dạng chuyển hóa sinh học của erythromycin theo thời gian trên cơ thịt tôm càng xanh đã được cho ăn ở liều 50 &100 mg.kg-1 thể trọng.ngày-1 trong 7 ngày 87

Bảng 3.8: Các dạng chuyển hóa sinh học của erythromycin theo thời gian trên cơ thịt cá rô phi đã được cho ăn ở liều 50 & 100 mg.kg-1thể trọng.ngày-1trong 7 ngày 88

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AdSV: Adsorptive Stripping Voltammetry (Von-ampe stripping hấp phụ)

APCI: Atmospheric Pressure Chemical Ionization (Ion hóa bằng hóa học ở áp suất khí

quyển)

APPI: Atmospheric Pressure Photoionization (Ion hóa quang ở áp suất không khí)

ASC: Aquaculture Stewardship Council (Hội đồng quản lý nuôi trồng thuỷ sản)

ASV: Anodic Stripping Voltammetry (Von-ampe stripping anod)

(Von-ampe stripping hấp phụ - điện cực tiền xử lý thuỷ tinh carbon)

BAP: Best Aquaculture Practices (Thực hành thuỷ sản tốt nhất)

CSV: Cathodic Stripping Voltammetry (Von-ampe stripping cathod)

CV: Cyclic Voltammetry (Von-ampe tuần hoàn)

DME: Dropping Mercury Electrode (Cực giọt thủy ngân rơi)

DPV: Differential Pulse Voltammetry (Von-ampe xung vi phân)

ECL: Capillary Electrophoresis Coupled With End-Column Electrochemiluminescence

(ECL) (Điện di mao quản - đầu dò quang điện hóa)

EIA: Enzyme ImmunoAssay (Phân tích miễn dịch enzyme)

ESI: Electrospray Ionization (Ion hóa phun điện tử)

EI-GC-MS: Electron Impact – Gas chromatography – Mass spectrometry (Sắc ký khí –

Khối phổ sử dụng ion hóa điện tử)

ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Phân tích miễn dịch hấp phụ enzyme) GC: Gas Chromatography (Sắc ký khí)

GC-MS: Gas Chromatography – Mass Spectrometry (Sắc ký khí ghép khối phổ)

Global GAP: Global Good Agriculture Practice (Thực hành nông nghiệp tốt toàn cầu) HLB: Hydrophilic-Lipophilic Balanced (Cân bằng dầu nước)

HPLC: High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

HPLC-ICPMS: High Performance Liquid Chromatography - Inductively Coupled

KPH: Không phát hiện

LC: Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng)

LC-ESI/MS: Liquid Chromatography – Electrospray Ionisation-Mass Spectrometry (Sắc

ký lỏng ghép khối phổ nguồn ion hóa phun điện tử)

LC-MS/MS: Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng ghép khối phổ - Khối phổ)

LLE: Liquid–Liquid Extraction (Chiết lỏng – lỏng)

LoD: Limit Of Detection (Giới hạn phát hiện)

LoQ: Limit Of Quantification (Giới hạn định lượng)

MDL: Method Detection Limit (Giới hạn phát hiện của phương pháp)

MSPD: Matrix Solid-Phase Dispersion (Phân tán nền phase rắn)

PLE: Pressure Liquid Extraction (Chiết lỏng áp suất)

RE: Relevant Error (Sai số liên quan)

RSD: Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) = CV (Coefficient of

Variation)

SD: Standard Deviation (Độ lệch chuẩn)

SPME: Solid-Phase Micro-Extraction (Vi chiết phase rắn)

SPE: Solid-Phase Extraction (Chiết phase rắn)

SWV: Square Wave Voltammetry (Von-ampe sóng vuông)

UPLC: Ultra Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng siêu năng)

UV/VIS: Ultra Violet / Visible (Tử ngoại / khả kiến)

Viet GAP: Viet Nam Good Agriculture Practice (Thực hành nông nghiệp tốt Việt Nam)

TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Một trong những vấn đề bức xúc về vệ sinh an toàn thực phẩm ở nước ta hiệnnay là dư lượng kháng sinh trong vật nuôi, dư lượng kháng sinh trong thực phẩm vượtquá mức cho phép ảnh hưởng tới sức khỏe của người tiêu dùng và uy tín hàng xuấtkhẩu của chúng ta

Tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii), cá rô phi (Oreochromis niloticus)

được xem là 2 trong số các loài thủy sản nước ngọt có giá trị kinh tế cao và quan trọng

ở Việt Nam, đặc biệt là ở Đồng Bằng Sông Cửu Long Chúng được nuôi ở dạng thâmcanh, luân canh, xen canh trong ruộng lúa, trong mương vườn, kênh rạch ven sông,nuôi bán công nghiệp hoặc công nghiệp Nhu cầu tiêu thụ nội địa và xuất khẩu ngàycàng cao đã thúc đẩy người nuôi nuôi với quy mô lớn, mật độ dày và thức ăn côngnghiệp được tăng cường sử dụng Vì lẽ đó mà dịch bệnh là điều không thể tránh khỏi ởnhững mô hình không được kiểm soát như thế

Do tính chất kháng khuẩn mạnh của erythromycin từ lâu nó đã được dùng để

phòng và trị bệnh trên tôm cá Do nông dân trong quá trình nuôi tôm càng xanh và cá

rô phi có sử dụng erythromycin và không tuân thủ thời gian ngưng thuốc trước thuhoạch nên để lại sản phẩm có dư lượng vượt mức cho phép

Theo quy định của Codex, WHO/FAO, EU, Mỹ, Canada, Australia, v.v thì dưlượng erythromycin trong sản phẩm thủy sản nhìn chung phải nhỏ hơn 30 ppb Theothông tư số 15/2009/TT-BNN ngày 15/03/2009 của Bộ Nông Nghiệp và Phát TriểnNông Thôn Việt Nam, erythromycin thuộc nhóm kháng sinh hạn chế sử dụng, với mức

dư lượng tối đa cho phép là 200 ppb

Hiện đã có nhiều phương pháp xác định dư lượng kháng sinh erythromycin trongcác sản phẩm thủy sản như ELISA, LC-MS/MS Tuy nhiên các phương pháp này đòihỏi trang thiết bị đắt tiền, thời gian phân tích kéo dài, chi phí hóa chất dùng trong

chuẩn bị mẫu đo khá tốn kém…Mục tiêu và nội dung thứ nhất đặt ra là phải tìm được

phương pháp phân tích dư lượng kháng sinh trong sản phẩm thủy sản với chi phí thấp,nhanh, độ tin cậy và tính chính xác cao, có khả năng tái khẳng định erythromycin

Việc lấy mẫu phân tích dư lượng xem có đạt hay không đạt giới hạn cho phép chỉ

là giải pháp tình thế (bị động) Việc hướng đến một nguồn nguyên liệu thực phẩm antoàn là phải chủ động kiểm soát ngay từ đầu trong khi nuôi, cụ thể là sử dụng khángsinh mức liều lượng nào và thời gian ngưng thuốc trước thu hoạch bao lâu là phù hợp.Xét thấy chưa có bất kỳ nghiên cứu nào được công bố về quá trình đào thải, chuyểnhóa, thời gian ngưng kháng sinh erythromycin trước thu hoạch trên đối tượng tôm

càng xanh, cá rô phi Vậy nên mục tiêu và nội dung thứ hai trong đề tài này sẽ tiến

hành là nghiên cứu thời gian đào thải, chuyển hóa của erythromycin trong cơ thịt tômcàng xanh và cá rô phi nhằm rút ra được quy luật và ước lượng được thời gian ngưngthuốc trước thu hoạch an toàn

Từ hai yêu cầu trên, chúng tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu định lượng kháng sinh Erythromycin trong tôm, cá bằng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm và khả năng đào thải” nhằm tìm 1 hướng đi mới trong kiểm soát dư lượng

kháng sinh góp phần đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Một là, trên thiết bị ANALYZER SQF 505 do Việt Nam sản xuất xây dựng

được phương pháp phân tích erythromycin bằng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trêncực giọt chậm đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm quốc tế đồng thời đạt yêu cầuphân tích nhanh, đơn giản và giảm chi phí phân tích

Hai là, nghiên cứu đào thải, chuyển hóa của erythromycin trong cơ thịt thủy sản

(tôm càng xanh, cá rô phi), từ đó xác định được quy luật về thời gian thu hoạch an toànkhi sử dụng erythromycin

Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN

 Ý nghĩa khoa học:

1 Lần đầu tiên ở Việt nam và trên thế giới tiến hành nghiên cứu khả năng sử dụng kỹthuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm để phân tích định tính và địnhlượng kháng sinh eythromycin trong các đối tượng mẫu thủy sản là cá rô phi vàtôm càng xanh

2 Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng trong dung dịch đệm vùng kiềm nhẹ,erythromycin cho một sóng khử rõ và ổn định ở vùng thế khoảng -1,4 V Có thểdùng sóng này cho mục đích phân tích định tính và định lượng erythromycin trongcác đối tượng mẫu khác nhau Sự xuất hiện của sóng này là do sự khử của nhóm C

= O thứ hai trong phân tử erythromycin liên kết với nhóm ái điện tử chứa nguyên

tử oxi bên cạnh Quá trình khử là không hoàn toàn thuận nghịch với sự trao đổi haiđiện tử

3 Phát hiện trong điều kiện thích hợp có sự hấp phụ của erythromycin trên bề mặtgiọt thủy ngân Có thể dùng hiệu ứng này để tiến hành phân tích erythromycin ởcác nồng độ rất thấp bằng kỹ thuật stripping hấp phụ trên cực giọt chậm hay cựcngồi, cực treo

4 Đã nghiên cứu và chọn được dung dịch nền thích hợp, các thông số chạy máy tối

ưu, quy trình chuẩn bị mẫu đo hợp lý để phân tích erythromycin trong các mẫu tômcàng xanh, cá rô phi có kết quả tin cậy Các số liệu đã được so sánh với kỹ thuậtphân tích truyền thống LC-MS là có sự tương đồng

5 Erythromycin A khi vào cơ thể tôm cá có sự chuyển hoá sinh học sang các dẫnxuất khác như erythromycin C, E, F Từ đây đưa ra được giả thuyết giải thích cơchế chuyển hoá sinh học erythromycin trong tôm càng xanh, cá rô phi khi nuôi

 Ý nghĩa thực tiễn:

1 Đã nghiên cứu xây dựng thành công quy trình phân tích định tính và định lượngerythromycin trong tôm càng xanh và cá rô phi bằng kỹ thuật sóng vuông quétnhanh trên cực giọt chậm với máy ANALYZER SQF-505 do Việt Nam sản xuấtvới chi phí phân tích rẻ hơn, thao tác dễ dàng hơn các kỹ thuật khác của nước

ngoài Các số liệu đã được kiểm chứng với các kết quả phân tích bằng các phươngpháp hiện đại khác.

2 Kết quả này có thể giúp các nhà sản xuất kinh doanh ở các địa phương có phươngtiện để kiểm soát kháng sinh từ gốc (thức ăn, môi trường, hóa chất, tôm cá trongquá trình thu mua, chế biến,…) nhằm tạo ra các sản phẩm có uy tín quốc tế

3 Sự thành công bước đầu này có thể mở ra một hướng nghiên cứu mới sử dụng kỹthuật sóng vuông quét nhanh đơn giản, không quá tốn kém để phân tích nhiềukháng sinh khác trong các đối tượng thủy sản khác nhau nhằm giúp các địaphương tự giám sát tốt vấn đề này

4 Cũng nhờ kỹ thuật này chúng tôi có thể nghiên cứu được quá trình đào thải củaerythromycin của tôm càng xanh và cá rô phi, từ đó rút ra thời gian ngưng thuốcthích hợp trước khi thu hoạch để bảo đảm có được sản phẩm an toàn

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Tồn dư kháng sinh đối với an toàn thực phẩm

1.1.1 Thực trạng tình hình sử dụng kháng sinh trong thú y, chăn nuôi, thuỷ sản

a) Dùng kháng sinh để điều trị và phòng bệnh cho gia súc, gia cầm và thuỷ sản

b) Những kháng sinh được bán trên thị trường không ít loại không đảm bảo hàm lượng

và chất lượng cho nên việc điều trị và phòng bệnh ít hiệu quả Người chăn nuôi phảidùng nhiều loại kháng sinh khác nhau để phòng và chữa bệnh Phần lớn phác đồ trịliệu là do kinh nghiệm hoặc do sự quảng cáo của các nhà sản xuất và nhà phân phối

Người nuôi đã biết cách chuyển hướng sử dụng kháng sinh, từ kháng sinh cấm sử

dụng sang kháng sinh hạn chế sử dụng Vì vậy đã gây nên sự lạm dụng kháng sinh và

do đó dễ dẫn đến sự kháng thuốc của một số vi khuẩn gây bệnh

Trên thị trường thuốc thú y, thuỷ sản hiện nay đang lưu hành rất nhiều loại khángsinh được bào chế dưới nhiều dạng khác nhau như thuốc tiêm, thuốc uống, thuốc bột

bổ sung vào thức ăn và nước uống Phần lớn các cơ sở chăn nuôi đều sử dụng khángsinh trong một thời gian tương đối ngắn trong một liệu trình từ 2-5 ngày, nhưng cũng

có cơ sở sử dụng kháng sinh liên tục trong một thời gian khá dài Điều này do ý thức

tự phát, hoàn toàn không có những qui định ràng buộc nào về thời gian sử dụng và loạikháng sinh sử dụng

1.1.2 Ảnh hưởng của kháng sinh tồn dư đến chất lượng thực phẩm

Do việc sử dụng kháng sinh một cách bừa bãi, bản thân một số loại kháng sinh

có thể gây những hậu quả xấu cho năng suất chăn nuôi trong việc sử dụng kháng sinhlâu dài hoặc sử dụng quá liều lượng qui định có thể gây ra cho vật nuôi những ảnhhưởng như sau:

- Gây kháng thuốc đối với một số loài vi khuẩn gây bệnh Những nghiên cứu gần đây

cho thấy hầu hết các vi khuẩn như E.coli, Staphylococcus, Salmonella đều đề kháng

với các loại kháng sinh thông thường với mức độ khác nhau

- Sự tồn dư kháng sinh trong các sản phẩm chăn nuôi ảnh hưởng đến sức khỏe ngườidân Ở các nước tiên tiến người ta nghiêm cấm sử dụng một số loại kháng sinh dùng

để trị bệnh cho người để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Lý do nếu cho phép sử dụngcác loại kháng sinh này và nếu nó còn tồn dư trong thực phẩm nó dễ gây kháng thuốcnếu dùng các loại kháng sinh này trong trị liệu cho con người Giới hạn tối đa chophép dư lượng kháng sinh (MRL, Maximum Residue Limit) được áp dụng nhằmkhông gây ảnh hưởng lên người sử dụng.

1.1.3 Những qui định về sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi – thú y

- Ở nước ta có qui định có tính chất pháp lý đối với việc sử dụng kháng sinh nhằmmục đích như: kích thích sinh trưởng vật nuôi, tăng hiệu quả sử dụng thức ăn cũng như

sử dụng kháng sinh nhằm phòng và chống một số bệnh trên gia súc, gia cầm, thuỷ sảntheo các chương trình quản lý chất lượng thực hành nông nghiệp tốt toàn cầu (GlobalGAP) và thực hành nông nghiệp tốt Việt Nam (Viet GAP) Tuy nhiên việc giám sátcòn thiếu kiên quyết nên việc sử dụng kháng sinh để phòng và chữa bệnh cho thuỷ sảncòn có nơi, có lúc rất tuỳ tiện làm cho dư lượng vượt mức cho phép

- Ở nước ngoài: Tổ chức FAO, WHO thường xuyên tư vấn và khuyến cáo các nước vềhàm lượng kháng sinh cho phép tồn dư trong thịt, sữa và các sản phẩm có nguồn gốcđộng vật Khối Cộng Đồng Châu Âu cũng có những qui định về các loại thuốc khángsinh được phép sử dụng và không được phép sử dụng

Tóm lại, việc sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi là khó tránh khỏi vàcần thiết trong phòng, trị bệnh cho vật nuôi Tuy nhiên, phải sử dụng những khángsinh được phép và phải tuân thủ liều lượng, thời gian ngưng thuốc trước thu hoạchnhằm bảo đảm an toàn vệ sinh thực phẩm cho người tiêu dùng trong nước và đáp ứngtiêu chuẩn xuất khẩu

1.2 Erythromycin và biến đổi của erythromycin trên cơ thể thuỷ sản

1.2.1 Erythromycin

Erythromycin là nhóm kháng sinh macrolide gồm erythromycin A, B, C, D, E,

F Tất cả được tạo ra từ Sacchropolyspora erythraea bằng con đường lên men Sản

phẩm chính của quá trình lên men này là erythromycin A, còn lại là các erythromycin

cladinose gắn vào erythronolide Nó dễ dàng hút ẩm và tan ít trong nước (0,2%).Erythromycin hoạt hóa ở pH kiềm hơn là pH trung tính và không bền ở pH acid.

Bảng 1.1: Công thức phân tử và nhóm thế của các erythromycin

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của erythromycin

Erythromycin còn tồn tại ở các dẫn xuất dạng muối và ester như: erythromycinstearate (ES), erythromycin ethylsuccinate (EESC), propionyl erythromycin (PE),erythromycin estolate (EES), erythromycin lactobionate (EL), erythromycinglucoheptonate (EG), erythromycin ethyl carbonate (EEC) và erythromycin acistrate

Erythromycin có tác dụng diệt khuẩn bởi quá trình ức chế tổng hợp protein Nótác động lên quá trình dịch mã bằng cách dính kết với tiểu đơn vị ribosom 50S.Erythromycin có thể dẫn đến xuất hiện các vi khuẩn đề kháng thông qua quá trìnhmethyl hóa hoặc đột biến ở tiểu đơn vị 23S của RNA ribosom, hoặc protein của

ribosom hoặc thông qua quá trình làm sai lệch các gen mef ở các loài vi khuẩn Gram

[+] [1]

Theo nghiên cứu của Tardre và cộng sự (1969) thì erythromycin có tác dụngdiệt khuẩn tốt ở các loài vi khuẩn Gram [+] và hiệu quả trong việc chữa trị nhiễm

khuẩn Staphylococcus mà đã kháng lại Penicillin Mycoplasma, Staphylococcus,

Streptococcus, Neisseria, Haemophylus, Corynebacterium, Listeria, Pasteurella multocida, Brucella, Rickettsia, Treponema rất nhạy cảm với erythromycin [2].

Erythromycin được sử dụng rộng rãi để chữa nhiễm khuẩn ở người và động vật

Erythromycin thường dùng ở dạng estolate, ethylsuccinate, gluceptate, lactobionate vàstearate Trong thú y, erythromycin được dùng chữa lâm sàng và cận lâm sàng chochứng viêm vú bò; chữa các bệnh liên quan đến tiêu hóa và hô hấp ở trâu bò, gia cầm.Erythromycin có thể được sử dụng riêng lẻ, hoặc kết hợp với các kháng sinh khác nhưpenicillin, colistin sulfate, sulfonamides và tylosin Erythromycin được đưa vào cơ thểqua nước uống, thức ăn, tiêm vào cơ thịt Liều sử dụng tối đa trong thú y là 100 mg/kgthể trọng/ngày [3].

Bảng 1.2: Mức dư lượng tối đa cho phép (MRL) của erythromycin trong sản phẩm thực phẩm

theo quy định của từng thị trường nhập khẩu

Codex (2008)

*

FAO/WHO (2006)

**

EU (2008)

***

US (2005)

****

Canada (2009)

*****

Australia (2009)

21 loài vi khuẩn gram [+] và 15 loài vi khuẩn gram [-] Kết quả thấy erythromycin B

có khả năng ức chế vi khuẩn kém hơn so với erythromycin A, khả năng ức chế vikhuẩn của erythromycin C và D chỉ bằng 50% erythromycin A [4]

1.2.2 Chuyển hóa sinh học của erythromycin bởi Saccharopolyspora erythraea

Mironov và cộng sự (2004) có nghiên cứu cơ chế chuyển hoá sinh học

erythromycin bởi Saccharopolyspora erythraea Erythromycin A (ErA) trong thành

desosamine và L-cladinose (CH3-O-3-mycarose), bám vào vòng lactone Con đường

chuyển hoá sinh học erythromycin A qua 2 giai đoạn (hình 1.2)

Hình 1.2: Chuyển hoá sinh học các dẫn xuất erythromycin EryA, EryF, EryB, EryC, EryG, và

EryK là các protein (enzymes)

Giai đoạn thứ nhất, polyketide synthase (PKS) xúc tác quá trình trùng ngưng

phần đoạn khởi đầu propionyl-CoA, với [S]-methylmalonyl-CoA, để tạo nên ketoester 6 phân tử methyl-malonyl-CoA sẽ thêm vào phân tử ketoester Trong suốtquá trình thiết lập mạch polyketide, các nhóm carboxyl tự do của methylmalonyl-CoA

β-sẽ trải qua quá trình khử carboxyl; kết quả là chỉ có các phân tử propionate được tạo ra

ở mạch cuối cùng Tại cuối mỗi chu kỳ bổ sung methylmalonyl-CoA, nhóm keto sẽ bịkhử thành 1 nhóm hydroxy (ngoại trừ nhóm keto của nhóm propionate thứ 3) Khungcarbon của đơn vị propionate thứ 4 sẽ trải qua quá trình khử triệt để, với sự tham giacủa 3 enzyme khác nhau để cấu thành PKS module 4, hoạt động theo thứ tự(dehydratase, enoyl reductase, và ketoreductase) Việc hình thành mạch polyketideđược kết thúc bằng quá trình khép vòng (được xúc tác bởi thioesterase), với việc tạo

nên 6-deoxyerythronolide B (dE-B), sản phẩm trung gian này sẽ không bám vào phức

đa enzyme của PKS

Giai đoạn thứ hai, dE-B được chuyển hoá theo 1 loạt các phản ứng được xúc

tác bởi stereospecific hydroxylases, glycosyltransferases và methyltransferases

Quá trình hydroxyl hoá các tiền chất ErA bị tác động bởi 2 hệ enzymecytochrome P-450 monooxigenase, đó là P450 eryF và P450 eryK P450 eryF là 1protein hoà tan xúc tác đặc hiệu 6-[S]-hydroxylation của dE-B thành erythronolide B(E-B) Hai phân tử đường được thêm vào E-B: thêm vào L-mycarose để hình thành 3-α-mycarosylerythronolide B (ME-B), và việc thêm vào D-desosamine để thành ME-Btham gia sản sinh sinh ra erythromycin D (ErD)

ErD chuyển hoá thành ErA bởi 2 đường hướng Đường hướng đầu tiên bao gồmquá trình O-methylation ở C-3 của mycarose, hình thành nên erythromycin B (ErB),sau đó là quá trình hydroxyl hoá ở C-12 của vòng lactone, tạo thành ErA Đườnghướng thứ hai, ErD được hydroxyl hoá đầu tiên thành erythromycin C (ErC), sau đó làmethyl hoá thành ErA Cả 2 phản ứng methyl hoá được xúc tác bởi cùng enzyme, O-methyltransferase Các phản ứng hydroxyl hoá được xúc tác bởi protein EryK [5]

1.2.3 Chuyển hóa và đào thải erythromycin trên thủy sản

1.2.3.1 Ở loài cá hồi vân (Trout) - Oncorhynchus mykiss

Nhóm nghiên cứu của Esposito (2006) đã đánh giá quá trình đào thải

erythromycin trên cá hồi vân dòng Oncorhynchus mykiss sau khi ăn thức ăn có chứa

100 mg erythromycin/kg trọng lượng/ ngày trong vòng 21 ngày, ở nhiệt độ 11,5 oC

Dư lượng erythromycin trong cơ thịt và da cá được phân tích bằng phương pháp sắc kýlỏng ghép khối phổ LC-ESI-MS/MS Kết quả cho thấy động học đào thải

erythromycin ra khỏi cơ thể cá hồi Oncorhynchus mykiss ở các thời điểm khác nhau

(bảng 1.3) Trên cơ sở đó các tác giả đã rút ra được thời gian ngưng thuốc là 255

°C_ngày sau khi được cho ăn 21 ngày với liều 100 mg erythromycin/ kg trọnglượng/ngày [6]

Bảng 1.3: Diễn biến đào thải erythromycin ra khỏi cơ thể cá hồi

Đo mẫu cơ thịt + da cá (giá trị trung bình  độ lệch chuẩn, n=10)

Thời gian Hàm lượng erythromycin trong phần cơ thịt + da cá hồi

1.2.3.2 Ở loài cá hồi (Salmon) - Oncorhynchus tshawytscha

Nhóm nghiên cứu của Moffitt (1988) đã nghiên cứu sự tích lũy và đào thải của

erythromycin thiocyanate trên cá hồi Oncorhynchus tshawytscha Các con cá hồi non

được ăn thức ăn có erythromycin thiocyanate trong 21 ngày với liều 0,05 hoặc 0,1 gerythromycin/kg thể trọng Sau đó tiến hành xác định dư lượng erythromycin tronggan, lá lách, thận, cơ thịt đỏ, cơ thịt trắng, huyết tương theo định kỳ, trong suốt thờigian dùng thuốc và sau ngưng thuốc Xét trong cùng 1 ngày kiểm tra, dư lượng trongthận là cao nhất so với các mẫu khác Dùng erythromycin 0,05 g/kg thì tích tụ trongcác mô và huyết tương là không đáng kể Trong khi dùng 0,1 g/kg thì erythromycintích lũy theo thời gian ở trong gan, thận, cơ thịt đỏ, cơ thịt trắng; vì vậy peak nồng độcực đại ở ngày cuối dùng thuốc Việc tăng đôi liều lượng erythromycin từ 0,05 lên 0,1g/kg dẫn đến làm tăng 4–10 lần nồng độ erythromycin trong các mô, và gấp 2 lầntrong huyết tương ở ngày cuối xử lý Nhưng sau khi dừng thuốc 19 ngày dư lượng chỉcòn không đáng kể ở gan và thận, trong khi ở cơ thịt thì không phát hiện [7]

Một nghiên cứu khác của Moffitt và cộng sự (1999) đã tiến hành nghiên cứu độctính, khả năng gây đột biến và hiệu quả của việc tiêm 10, 20, hoặc 40 mg

erythromycin/kg thể trọng cá hồi Oncorhynchus tshawytscha, cách 20 ngày tiêm 1 lần

và tiêm 6 lần, trước khi cá hồi phát dục Khi đối chứng là cá không được tiêm, kết quảthấy rằng: hàm lượng bilirubin tổng trong huyết tương của cả các nhóm xử lý và không

xử lý đều không tăng, mặc dù 70% nhóm cá được tiêm erythromycin có gan bị vàng.Erythromycin rất hiệu quả trong việc giảm thiểu tỉ lệ chết của cá hồi do 2 loài vi khuẩn

gây bệnh là Renibacterium salmoninarum và Aeromonas salmonicida Điều này được

kiểm chứng bằng các thử nghiệm lâm sàng và miễn dịch Cá được tiêm tích lũy chođến 50–240 mg erythromycin/kg trọng lượng thì tỉ lệ sống đạt trung bình 71,3–93,9%

và ít bị dị tật hơn (0,6–1,4%) [8]

Moffitt và cộng sự (2001) đã kiểm tra tính độc cấp tính và độc mãn tính của

erythromycin trên cá hồi Oncorhynchus tshawytscha ở 2 nhiệt độ nước khác nhau Cá

được tiêm với liều 20, 60, 160, 435, hoặc 665 mg erythromycin/kg trọng lượng cơ thể

và nuôi ở 8 °C hoặc 13 °C trong 18 ngày để đánh giá chỉ số LD50 ở 2 nhiệt độ khácnhau và đánh giá tình trạng sức khỏe của các con còn sống Kết quả thấy tỉ lệ cá chếtcao nhất ở nhiệt độ 13°C (LD50= 369 mg/kg) Trong số các con cá còn sống đến cuốithử nghiệm, chứng gan bị vàng có liên quan chặt chẽ với lượng thuốc dùng Dư lượngerythromycin trong mô, huyết tương, da, cơ thịt cá còn sống sẽ cao hơn đáng kể khi cágiữ ở 8°C hơn cá ở 13°C, nhưng erythromycin trong trứng thì đều tăng cao cho dù cótăng nhiệt độ [9]

Haukenes và cộng sự (2002) thí nghiệm tiêm erythromycin phosphate vào cá hồi

cái Oncorhynchus tshawytscha trước khi đẻ trứng Tổng số cá (N = 1,568) được tiêm 1

trong 2 liều erythromycin phosphate (20 mg/kg hoặc 40 mg/kg trọng lượng), sau 1tháng thì tiêm 1 liều 20 mg/kg Giám sát tỉ lệ cá sống sau khi tiêm và xác định nồng độerythromycin ở thận cá Sau khi tiêm lần thứ nhất, tỉ lệ chết ở cá cái được tiêm 40mg/kg cao hơn đáng kể so với cá cái được tiêm 20 mg/kg Nồng độ erythromycintrong thận của cá cái ở thời gian đẻ trứng là cao hơn nồng độ erythromycin trong thậncủa cá đực [10]

Fairgrieve và cộng sự (2005) cho cá hồi Oncorhynchus tshawytscha ăn thức ăn

có chứa azithromycin (30 mg/kg cá trong 14 ngày) hoặc erythromycin (100 mg/kg cátrong 28 ngày) Các tác giả nhận thấy nồng độ azithromycin trong cơ thịt cá tăng từ19,0 μg/g đến 44,9 μg/g và vẫn còn lưu tồn trong cơ thịt sau hơn 76 ngày ngưng dùngkháng sinh azithromycin Trong khi đó, dư lượng erythromycin trong cơ thịt còn rấtthấp khoảng 0,2 μg/g đến 10,4 μg/g Erythromycin không còn tồn dư sau khi ngưngthuốc 21 ngày Hai loại kháng sinh này đều không gây thương tổn đáng kể đến môthận và các cơ quan khác [11]

Tóm lại, những nghiên cứu trước về biến đổi của erythromycin trên cơ thể thủysản chủ yếu mới tập trung trên đối tượng cá hồi, là cá nước lạnh và cũng chỉ mới dừnglại ở việc theo dõi sự đào thải erythromycin ở cá Chưa có báo cáo về erythromycintrên thủy sản nhiệt đới và cũng chưa có báo cáo nào cho biết trong cơ thể thủy sảnerythromycin sẽ chuyển hóa thế nào, vì vậy đây sẽ là những nội dung mà đề tài nàynghiên cứu.

1.2.4 Vì sao chọn đối tượng thủy sản trong nghiên cứu này là tôm càng xanh và cá

rô phi

Đây là hai loại thủy sản được nuôi rất phổ biến ở Việt Nam và có sử dụngerythromycin Rất nhiều vi sinh vật gây bệnh trên tôm càng xanh, bao gồm protozoans

như Epistylis, Zoothamnium, và Vorticella; các vi khuẩn gây bệnh như Vibrio,

Aeromonas, Pseudomonas, Edwardsiella [12] Bệnh hoại tử là bệnh thường gặp ở tôm

trưởng thành Bệnh này còn có những tên gọi khác là “đốm đen”, “đốm nâu”, “hoạibì” Nó gây ra bởi sự xâm nhập của vi khuẩn có khả năng phá vỡ lớp vỏ chitin bên

ngoài Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviea, A sorbia và Aeromonas sp là hệ vi

khuẩn được phân lập từ các con tôm càng xanh bị bệnh hoại tử [13] Trong khi đó

Edwardsiella tarda, Pseudomonas fluorescens là 2 loài vi khuẩn được phân lập ở tôm

càng xanh [14] Hay Aeromonas sp., Pseudomonas fluorescent và Edwardsiella tarda

là hệ vi khuẩn được phân lập từ tôm càng xanh trưởng thành [15] Vi khuẩn Gram [+],

hình trứng được định danh giống như Enterococcus được phân lập từ tôm càng xanh

bệnh ở các ao nuôi tại Đài Loan Tôm càng xanh bị bệnh có dấu hiệu chậm lớn, biếng

ăn, chậm chạp, trắng đục cơ và chết Xét nghiệm mô bệnh học, các khối bướu máumàu đen được thấy ở mô liên kết xung quanh xoang máu với khối máu trong cơ thịt

bệnh [16] Hệ vi khuẩn chính trên tôm càng xanh là Aeromonadaceae,

Enterobacteriaceae và Pseudomonas Tôm càng xanh nuôi mang theo những vi khuẩn

gây bệnh như Enterococcus spp., S aureus, Aeromonas hydrophila, A veronii sobria

và Clostridium perfringens [17] Lactococcus garvieae nhiễm trên tôm càng xanh gây

đục cơ ở giai đoạn tôm nuôi 2 tháng tuổi với chiều dài 5 đến 6 cm Ở khía cạnh môbệnh học, có minh chứng cho thấy chứng phù và thương tổn “necrotic” là do sự xâm

nhiễm vào cơ thịt và gan tụy [18] Pseudomonas fluorescens được phân lập từ tôm

càng xanh trưởng thành dễ bị diệt bởi erythromycin [14] Một nghiên cứu khác về khảnăng diệt vi khuẩn gây bệnh hoại hoại tử Kết quả thấy rằng erythromycin diệt rất tốt

Aeromonas hydrophila, A caviea, A sorbia và Aeromonas sp [13] Erythromycin cũng

được cho thấy có khả năng ức chế sự phát triển của Aeromonas sp., A hydrophila, A.

sorbia và A caviea [15].

Trong khi đó các bệnh chủ yếu trên cá rô phi khi nuôi thường là Streptococcus

iniae, Aeromonas hydrophila, Trichodina, Flexibacter Columnaris, Edwardsiella [19],

[20] Phổ biến nhất là do Streptococcosis, vi khuẩn gram dương, đã gây thiệt hại nặng

nề mà chưa có vacccine nào phòng được, thậm chí trên cá trưởng thành và khỏe mạnh

Vì vậy, erythromycin cũng là kháng sinh đang được sử dụng khá phổ biến trong nghềnuôi cá rô phi ở Việt Nam

1.3 Các kỹ thuật dùng để phân tích erythromycin

1.3.1 Phương pháp ELISA định lượng erythromycin

1.3.1.1 Nguyên lý ELISA

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (EnzymeImmunoAssay) là một kỹ thuật phân tích sinh hóa dựa trên phản ứng đặc hiệu giữakháng thể và kháng nguyên Người ta tạo ra kháng nguyên từ chất cần phân tích Dùng

nó gây miễn dịch lên một động vật có xương sống Hệ thống miễn dịch của động vậtthí nghiệm này sẽ phản ứng và tạo ra kháng thể chuyên biệt để chống lại chất đích đãđược đưa vào cơ thể chúng Từ máu động vật, kháng thể đặc hiệu này sẽ được táchchiết, tinh sạch và sử dụng để chế tạo các kit ELISA dùng trong phân tích để phát hiện

và định lượng chất đích theo nguyên tắc miễn dịch

1.3.1.2 Phân tích erythromycin bằng phương pháp ELISA

Các giếng được phủ qua đêm bằng cách ủ ở 4oC với 200 µl phức BSA trong dung dịch đệm carbonate pH 9,6 (1,69 g; 2,86 g NaHCO3 trong 1000 mlnước cất) ở tỉ lệ pha loãng 1:4500, sau đó được khóa “block” trong 1 giờ ở 37 oC với

erythromycin-dung dịch có chứa 3% sữa khô pH của erythromycin-dung dịch block được điều chỉnh lại về 7,2trước khi sử dụng.

Mỗi giếng được thêm 100 µl dung dịch chuẩn hoặc mẫu (lặp lại 3 lần), tiếp theo

là thêm 100 µl Mab kháng – erythromycin được pha loãng ở tỉ lệ 1:60000 Quá trìnhcạnh tranh xảy ra trong 2 giờ ở 37oC Giữa các bước (phủ, blocking và cạnh tranh),tiến hành 3 chu kỳ rửa sử dụng 0,05% Tween 20 trong PBS Mỗi dung dịch, ngoại trừdung dịch để phủ, được chuẩn bị trong PBS Cuối cùng, 200 µl dung dịch nền (2 x 10-4mol/l TMB + 10-3mol/l H2O2) được thêm vào mỗi giếng, phản ứng enzyme được dừnglại sau 30 giây thêm 50 µl NaN35 mM [21]

1.3.1.3 Nhận xét phương pháp ELISA dùng định lượng erythromycin

- Ưu: Có thể phân tích nhiều mẫu cùng một lúc, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù

hợp trong đánh giá sàng lọc

- Nhược: Đôi khi cho kết quả âm tính giả, dương tính giả Thời gian chuẩn bị

mẫu và phân tích còn quá dài Chưa có khả năng tái khẳng định cấu trúc củaerythromycin

1.3.2 Phương pháp LC-MS/MS định lượng erythromycin

Đối với nền mẫu động vật ở dạng mật ong, mô thịt, trứng, sữa, quá trình chuẩn

bị bao gồm các bước loại protein, mỡ, đường, yếu tố gây nhiễu Tùy theo bản chất củamẫu và khối lượng mẫu (1-5 g) mà dùng các cột chiết khác nhau như SPE, LLE,MSPD Ưu điểm của cột chiết SPE là dịch chiết của mẫu được làm sạch, nên các yếu

tố gây nhiễu bị loại bỏ, các hiệu ứng nền được giảm thiểu Hơn nữa, chất phân tíchđược làm giàu đến mức đạt được độ nhạy với LoD dưới ppb Các kiểu cột SPE dùng

chiết erythromycin gồm cột HLB (cân bằng dầu – nước), Strata – X, Bond Elut C18,Bond Elut diol, Bond Elut SCX Trong đó cột HLB, được làm từ copolymer của N-vinylpyrrolidone ưa nước và divinylbenzene ưa dầu, được ưa chuộng do có thời gianlưu tốt và hiệu suất thu hồi cao đối với cả các chất phân cực và không phân cực CộtStrata – X có chức năng tương tự cột HLB, và cũng cho hiệu quả tương đương.Erythromycin được hấp thu tốt trên cột HLB và rửa giải bằng methanol 40%, hao hụterythromycin không đáng kể Nhìn chung, SPE được thao tác gián đoạn bằng cách chodịch mẫu lỏng đi qua cột (30 – 500 mg) được đặt trên 1 cột chân không Erythromycinđược giữ lại trên cột Rửa cột với nước hoặc đệm, cuối cùng rửa giải erythromycin vớivài ml dung môi hữu cơ (methanol hoặc acetonitrile) để dễ bay hơi và làm giàu đến 1thể tích phù hợp để tiêm vào LC-MS [22].

LC-MS được nối trực tiếp với SPE bằng kỹ thuật chuyển cột Mẫu thịt (1 g) saukhi được đồng hóa sẽ được loại protein bằng 5ml acetonitrile Sau ly tâm, đệm Tris(0,1 M; pH 7) có chứa 5% acetonitrile được thêm vào phần dịch nổi Hỗn hợp sau đóđược làm khô nhẹ dưới dòng khí nitơ để loại acetonitrile Dư lượng erythromycin lúc

đó được hoàn nguyên với cùng đệm Tris Sau khi loại béo bằng hexane, dịch chiết sẳnsàng đi vào cột SPE nối trực tiếp với LC-MS Phương pháp đạt được LoD ≤ 0,1 ppb.SPE trực tiếp sẽ giúp phân tích được nhiều mẫu trong thời gian ngắn Tuy nhiên là cộtgiảm dần khả năng hấp phụ, nguy cơ nhiễm chéo, nhất là sau khi chiết mẫu có nồng độerythromycin cao Ngoài ra, độ bền của chất phân tích trong dịch chiết mẫu trước khiđưa vào SPE trực tiếp cũng là điều đáng quan tâm do thời gian chờ kéo dài trong auto-sampler, một số chất như tetracyclines bị phân hủy nhanh chóng Tuy nhiên,erythromycin tương đối bền ở pH 7 nên phù hợp cho SPE trực tiếp [22]

Kết hợp SPE và LLE chiết erythromycin được cho là hữu hiệu Để phân tícherythromycin trong thịt cá hồi, đệm Amoni formate (10 mM) được ưa dùng hơn dungmôi hữu cơ để dùng trong bước đầu tiên của quá trình chiết Ở một trường hợp ứngdụng khác, đệm phosphat được thêm vào mẫu đã được xay nhuyễn, hỗn hợp đượcphân đoạn với chloroform để thực hiện chiết bằng LLE, tiếp theo là chiết bằng BondElut diol để chiết erythromycin trong mẫu thịt bò [22]

Kỹ thuật phân tán nền phase rắn (MSPD) nhìn chung là rẻ tiền và thân thiện với

và yoghurt Mẫu (1,5 mL hoặc g) được phân tán vào trong vật liệu hỗ trợ rắn (ví dụ cát5-6 g) rồi trộn Hỗn hợp được nhồi vào cột MSPD Sau đó erythromycin được rửa giảibằng nước 70oC, pH 4,6 đã được acid hóa bằng acid formic; dịch chiết sau đó đượcchỉnh về pH 6 trước khi tiêm vào LC-MS Phương pháp cho độ nhạy cao với LoD ởmức dưới ppb [22].

b) Nền mẫu sinh phẩm

Nền mẫu sinh phẩm bao gồm huyết tương, nước bọt, mô,… Có kích thước mẫutương đối nhỏ, thường 50 – 500 µL Vì thế chiết lỏng – lỏng hoặc phân đoạn là kỹthuật chiết đơn giản, nhanh và được thực tế áp dụng Mẫu trước tiên được pha loãng

với đệm natri carbonate hoặc phosphat, tiếp theo chiết thông qua LLE với methyl

tert-butyl ether, với hỗn hợp methyl tert-tert-butyl ether và hexane (50:50, v/v), ethyl axetat,hỗn hợp hexane và ethyl axetat (50:50, v/v), hỗn hợp ethyl axetat và isopropanol (95:5,v/v) Sau khi ly tâm và loại dung môi hữu cơ, dư lượng được hoàn nguyên với 1 hỗnhợp gồm nước, methanol hoặc acetonitrile để phân tích bằng LC-MS [22]

c) Nền mẫu môi trường

Do nền môi trường chứa rất nhiều tạp nên việc chiết erythromycin khá phứctạp, phải dùng đến HLB Các phương pháp chiết truyền thống như LLE được thaybằng SPE Cần phải lấy 1 lượng mẫu lớn để đạt được LoD thích hợp Mẫu được tiền

xử lý bằng cách lọc qua lưới lọc bằng sợi thủy tinh (0,2 µm), điều chỉnh pH (<7 hoặcthậm chí là tới 3), bổ sung tác nhân tạo phức trước khi vào bước SPE để tránh làm tắccột và nhằm tăng hiệu suất chiết Tuy nhiên vì erythromycin không bền ở pH acid, nó

dễ dàng bị phân hủy thành erythromycin-H2O với việc mất đi 1 phân tử nước ở pHacid Vì vậy rất nhiều nghiên cứu cho thấy erythromycin được xác định ở dạngerythromycin-H2O ở m/z 716 Erythromycin khi vào cơ thể thủy sản nuôi, đi qua hệ dạ

dày pH acid, thải ra ngoài theo phân và tồn lưu trong môi trường ở dạng

erythromycin-H2O [22]

Các mẫu môi trường dạng rắn như đất, trầm tích, bùn thì được chiết với đệmamoni hydroxide (pH 10), phosphat (pH 6) Vì mẫu đất, trầm tích, bùn rất phức tạpnên cần thêm 1 bước làm sạch [22]

Sau khi tiền xử lý, dịch chiết được cho vào cột SPE để làm sạch và làm giàu đểđạt LoD ở mức ng/L hoặc ppb Rất nhiều loại cột SPE khác nhau được dùng như HLB,

Strata-X, LiChrolute EN, LiChrolute RP-18, diol, Isolut ENV+, SAX, và Strata-X-C.Trong đó HLB được dùng nhiều nhất.

Việc sử dụng vi chiết phase rắn (SPME) là kỹ thuật tương đối mới, đơn giản,hiệu quả tiết kiệm để chiết erythromycin từ các mẫu nước thải SPME bao gồm 1 sợiquang với phase tĩnh là lỏng hoặc rắn để hấp phụ chất phân tích Chất phân tích đượcgiải hấp phụ bằng cách ngâm sợi quang vào trong dung môi hữu cơ Phương pháp đạtđược LoD 2,8 ng/L SPME tỏ ra hợp lý hơn phương pháp truyền thống SPE để địnhlượng erythromycin trong môi trường nuôi thủy sản Tuy nhiên nó có nhược điểm làLoD cao hơn và độ chính xác kém hơn là SPE [22]

1.3.2.2 Phân tích erythromycin bằng sắc ký

Phân tách erythromycin bằng sắc ký lỏng sử dụng cột sắc ký phase đảo, dùngcột silica C18 Bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép gần đây UPLC dùng cột C18 có kíchthước hạt dưới 2µm Đặc biệt khi được ghép nối với đầu dò khối phổ MS sẽ cho độphân giải, tốc độ và độ nhạy cao [22]

Thành phần, nồng độ và pH phase động rất quan trọng để ion hóa và phân táchsắc ký Acetonitrile và methanol là 2 dung môi hữu cơ phổ biến nhất được dùng làmphase động cho LC và UPLC Acid formic (0,1%) hoặc amoni axetat (10 – 20 mM)thường được làm thành phần bổ sung cho phase động Heptafluorobutyric acid(HFBA, 0,04%), trifluoroacetic acid (TFA; 0,02-0,1%) hoặc non-afluoropentanoicacid (NFPA, 1mM) được dùng để cải thiện hình dạng peack sắc ký để kéo dài thờigian lưu của chất phân tích [22]

1.3.2.3 Khối phổ

Phân tích khối phổ (phân tích “tỉ lệ khối lượng theo điện tích (m/z) của ion“) là

kỹ thuật phân tích dựa trên sự bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa thànhcác ion phân tử mang điện tích, hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc bằng cácphân tử mang năng lượng cao (như va chạm electron, ion hóa hóa học, ion hóa proton,bắn phá ion, ion hóa trường ) Ion phân tử và các mảnh ion có khối lượng -> số khốiz=m/e (khối lượng ion/điện tích)

Hai kỹ thuật ion hóa phổ biến nhất được dùng trong LC-MS là ion hóa tia điện

tử (ESI) và ion hóa bằng hóa chất ở áp suất khí quyển (APCI) ESI là quá trình mà cácion trong dung dịch được chuyển thành phase khí thông qua 1 cơ chế bốc hơi và giảihấp ion APCI là kỹ thuật ion hóa mà chất phân tích được ion hóa thông qua các phảnứng ion và phân tử, xảy ra ở áp suất không khí ESI áp dụng được cho các chất phâncực và dung môi không phân cực, có khoảng khối lượng rất rộng Mặc dù APCI đượcchứng minh giúp giảm các hiệu ứng nền, nhưng ESI vẫn được ưa chuộng hơn trongkhi phân tích erythromycin bằng LC-MS Một kỹ thuật khác tương đối mới là ion hóaquang ở áp suất không khí (APPI) Nguyên lý cơ bản của APPI cho sự hình thành 1ion mang điện là thông qua quá trình ion hóa quang học, chuyển proton và trao đổiđiện tích APPI có khoảng ion hóa tương tự như trong APCI, và được mở rộng sangvùng các chất có độ phân cực thấp Vì thế, APPI được áp dụng khá nhiều cho các chấtkhông phân cực hơn là ESI và APCI [22]

Erythromycin thuộc nhóm kháng sinh macrolides, phân tử có 1 nguyên tử nitơ

dễ bị proton hóa để thành các ion mang điện tích đơn ([M+H]+)

Hiệu ứng nền là 1 trở ngại trong phân tích định lượng bằng LC-MS, đặc biệt làkhi sử dụng ESI Nền có thể làm tăng hoặc kềm hãm quá trình ion hóa chất phân tích,thay đổi giữa mẫu này với mẫu khác Hiệu ứng nền có thể ước lượng hoặc định lượngđược bằng cách so sánh hiệu ứng của chất phân tích trong dung môi hoặc đệm với hiệuứng của chất phân tích khi có nền mẫu Chuẩn đồng phân đánh dấu bền, đường congchuẩn đã làm phù hợp nền, phương pháp thêm chuẩn là những giải pháp để giảm thiểucác hiệu ứng nền và làm tăng độ đúng của phương pháp Do thiếu các chuẩn đượcđánh dấu bằng deuterium nên phải dùng đến các đồng phân như roxithromycin làm nộichuẩn, để giảm thiểu hiệu ứng nền Phương pháp thêm chuẩn tỏ ra hiệu quả để bù chocác hiệu ứng nền Nhưng quy trình trở nên dài dòng vì đòi hỏi chuẩn bị mẫu thêm.[13C2]-erythromycin A có thể được tận dụng làm nội chuẩn Tuy nhiên có hiện tượnggây nhiễu (11,5%) từ [13C2]-erythromycin A (m/z 736) xuất hiện tự nhiên trong

erythromycin A trên diện tích peak của nội chuẩn Để giải quyết, [13C4]-erythromycin

(m/z 738) thường thấy trong [13C2]-erythromycin A, được dùng như chất tham chiếuchuẩn trong khi định lượng Bằng cách này, nhiễu trên nội chuẩn được giảm thiểu đến

mức thấp nhất của [13C4]-erythromycin A (m/z 738) trong erythromycin A (m/z 734)

[22]

Bảng 1.4: Một số công trình nghiên cứu phương pháp phân tích erythromycin

**

Thận, gan, thịt,

mỡ bò, heo, gia cầm

(propionate, base)

* ; 7,0 **

*LOD: giới hạn phát hiện , ** LOQ: giới hạn định lượng

Tổng quan tài liệu về việc nghiên cứu phương pháp xác định erythromycin(bảng 1.4), thấy rằng: Chưa có công bố nào của các tác giả trong nước nghiên cứu vềquá trình định lượng erythromycin bằng kỹ thuật cực phổ sóng vuông quét nhanh trêncực giọt chậm; Các công bố ở nước ngoài cho tới nay chủ yếu là các phương pháp ứngdụng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ; Có rất ít nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Von-

ampe để định lượng erythromycin; Chưa có bất kỳ công trình nào nghiên cứu ứngdụng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm dùng để định lượngerythromycin.

1.3.3 Kỹ thuật phân tích Von-ampe

Von-ampe là các kỹ thuật phân tích điện hóa dựa trên nghiên cứu quan hệđường Dòng - Thế khi tiến hành điện phân chất cần phân tích trong những điều kiệnđặc biệt

1.3.3.1 Các dạng von-ampe

Tùy cách đặt thế, cách đo dòng, quá trình tiến hành điện phân, hình thức cựcdùng,…mà có những kỹ thuật Von-ampe khác nhau Các kỹ thuật Von-ampe thườngđược sử dụng trong thực tế là:

 Cực phổ cổ điển

 Cực phổ xung vi phân

 Cực phổ sóng vuông

 Cực phổ sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm

 Ghép nối các kỹ thuật Stripping với các kỹ thuật trên

a) Cực phổ cổ điển:

Cực phổ cổ điện dựa trên sự nghiên cứu quan hệ dòng một chiều và thế mộtchiều khi tiến hành điện phân chất cần phân tích trong một dung dịch nền chứa cácchất điện ly thích hợp với cực làm việc là cực giọt thủy ngân và một cực so sánh cóthế trong đổi

Trong một thời gian khá dài từ nửa cuối thế kỷ XX, cực phổ cổ điển, đo quang,

và quang phổ UV/VIS là những kỹ thuật chính dùng trong nhiều phòng thí nghiệm liênquan tới việc phân tích các chất vô cơ và hữu cơ Kỹ thuật quang được dùng rộng rãihơn nhờ thao tác đơn giản, máy móc không phức tạp Người ta dùng kỹ thuật cực phổ

để giải quyết những vấn đề khi áp dụng phương pháp quang gặp khó khăn Do khôngkhắc phục được sự cản trở của dòng tụ điện nên độ phân giải và độ nhạy của cực phổ

cổ điển chưa thật cao (giới hạn định lượng 10-5M) cho nên ngày nay khi xuất hiện các

kỹ thuật cực phổ xoay chiều hiện đại, các kỹ thuật quang phổ hấp thụ nguyên tử, phát

xạ nguyên tử, sắc ký khí, sắc ký lỏng,…được hoàn thiện và giá máy có thể chấp nhậnđược thì người ta không còn dùng cực phổ cổ điển trong nghiên cứu và sản xuất nữa[40]

b) Cực phổ xung vi phân

Trong kỹ thuật cực phổ xung vi phân, ngoài thành phân thế một chiều tăng dầntheo thời gian người ta còn đặt lên cực làm việc những xung thế ở cuối giọt và tiếnhành đo dòng Faraday xoay chiều ở đầu xung và cuối xung Với cách đó chúng ta cóthể triệt tiệu được dòng tụ điện cản trở phép đo Nhờ triệt tiêu được dòng tụ điện nên

độ phân giải của kỹ thuật này cao hơn hẳn cực phổ cổ điển và quang phổ UV/VIS.Giới hạn phát hiện có thể đạt được 10-7÷ 10-8M Tất cả các máy cực phổ xung vi phânhiện nay thường có thể chạy với ba loại cực: cực giọt thủy ngân chu kỳ rơi cưỡng bức,cực giọt thủy ngân tĩnh, cực rắn quay

Nhược điểm chính của dòng máy cực phổ xung vi phân:

- Phải chạy với thủy ngân và khí trơ có độ tinh khiết cao

- Thao tác với cực thủy ngân rất phức tạp, cực hay bị tắc, không có cơ sở tái chế thủyngân

- Trước mỗi lần đo đều phải sục khí trơ đuổi ôxy nên thời gian phân tích chậm

- Tốc độ máy ghi chưa cao [40]

c) Cực phổ sóng vuông:

Trong cực phổ sóng vuông, ngoài thành phân thế một chiều tăng theo thời gianngười ta còn dùng những xung thế vuông tần số và trăm Hz đặt lên cực làm viêc vàtiến hành đo dòng Faraday xoay chiều ở đầu xung và cuối xung Về mặt lý thuyết đây

là một dòng máy có độ nhạy và độ phân giải rất cao (độ nhạy cao hơn cực phổ xung viphân, độ phân giải tương đương) và có thể phân tích được nhiều chất hữu cơ và vô cơ[40], [41]

Các máy cực phổ sóng vuông hiện đại của Mỹ có những ưu điểm sau :

- Có độ nhạy và độ phân giải rất cao (độ nhạy cao hơn cực phổ xung vi phân, độ phângiải tương đương)

- Tốc độ ghi phổ rất nhanh (vài giây)

- Cực giọt thủy ngân điều khiển bằng máy tính với hệ thống cơ khí thuận tiện cho phépchạy với cực giọt rơi theo chu kỳ tùy ý hay với cực giọt tĩnh để dùng với kỹ thuậtStripping để phân tích siêu vết.

- Cơ chế tạo giọt điều khiển bằng máy tính hiện đại cho phép dùng mao quản thủyngân đường kính lớn nên độ nhạy rất cao, mao quản ít bị tắc

- Có thể phân tích được nhiều chất hữu cơ và vô cơ

- Giá máy rẻ hơn so với sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nhược điểm chính của kỹ thuật này khi đưa vào nước ta là thiếu các dịch vụđào tạo, chuyển giao công nghệ, bảo hành, bảo dưỡng sau bán hàng Cũng vì lý do trên

mà một số máy phân tích điện hóa hiện đại nhập về nước ta không đưa vào khai thácđược hay khai thác kém hiệu quả

d) Cực phổ sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm

Trong hơn 10 năm qua các nhà khoa học Việt nam đã chế tạo thành công cácdòng máy cực phổ sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm Rất nhiều công trìnhnghiên cứu phân tích các chất hữu cơ và vô cơ tại các trường đại học lớn của nước ta

đã tiến hành thành công trên các dòng máy điện hóa của Việt nam Dòng máy mớinhất là ANALYZER SQF-505 với nguyên lý hoạt động như sau: Nhúng vào dung dịch

nền có chứa chất cần phân tích 3 điện cực: Cực làm việc (Working Electrode): là cực

giọt thủy ngân có tốc độ chảy ổn định khoảng 7 giây một giọt Nếu áp dụng kỹ thuật

stripping nhanh ta dùng cực giọt thủy ngân có tốc độ chảy trên 10 giây một giọt Cực

so sánh (Reference Electrode): dùng cực Ag/AgCl/KCl bão hòa có thế không đổi Cực

hỗ trợ (Auxiliary Electrode): dùng cực Platin [40], [41].

Đặt lên cực làm việc 2 thành phần: Thế một chiều tăng dần theo thời gian dạnghình bậc thang với các bước thế 210 mV Thế xoay chiều là các xung vuông góc có

triệt tiêu dòng tụ điện gây nhiễu cho tín hiệu cần đo, ta tiến hành ghi cường độ dòngFaraday xoay chiều ở đầu xung và cuối xung Phần mềm SQF-505 cho phép hiển thị sựbiến đổi của cường độ dòng Faraday xoay chiều theo thế một chiều Đường thu đượcgọi là phổ sóng vuông quét nhanh, có thể chứa nhiều đỉnh Mỗi đỉnh ứng với một chấthay một giai đoạn phản ứng điện hóa của một chất Thế bán sóng (E1/2) với một dungdịch nền nào đó là một giá trị đặc trưng cho mỗi chất và thường dùng cho mục đích

phân tích định tính Chiều cao của đỉnh (cường độ dòng Faraday xoay chiều) hay diệntích đỉnh (công suất tạo sóng) tỷ lệ với nồng độ chất tham gia phản ứng điện hóa trêncực làm việc nên được dùng cho mục đích định lượng [42], [43].

S: diện tích bề mặt giọt thủy ngân (mm2)

T: thời gian (miligiây)

10.000 ms

E: thế đặt trên cực làm việc

(milivolt)

Quãng thời gian đo

Thời gian ghi toàn phổ T: thời gian (miligiây) I: Cường độ dòng Faraday xoay chiều (nanoampe)

Phổ dung dịch có hai chất

E: thế một chiều (milivolt)

Hình 1.3: Nguyên lý hoạt động của mode sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm

Thiết bị ANALYZER SQF-505 có một số ưu điểm sau :

- Nhờ hoạt động theo nguyên lý đo trên giọt chậm rơi tự nhiên nên hệ thống cực giọtrất đơn giản, ít bị tắc, xử lý cực tắc rất dễ, có thể dùng với thủy ngân tinh khiết phân

- Thủy ngân dùng rất ít Tất cả thủy ngân đều nằm trong một hệ thống kín nên ít độchại.

- Máy không cần dùng khí trơ, các hóa chất khác đều thuộc loại dễ kiếm, không đắttiền

- Tốc độ ghi rất nhanh (vài giây) Các kết quả đo được xử lý thống kê tự động nên kếtquả đo có độ lặp cao

- Máy ít hỏng hóc, dịch vụ sau bán hàng rẻ và thuận tiện nhờ các cán bộ kỹ thuật ViệtNam hoàn toàn làm chủ công nghệ phần cứng và phần mềm

Nhược điểm của máy là chưa có hệ thống tạo cực giọt treo tĩnh hay cực rắnquay nên chưa thực hiện được kỹ thuật Stripping để phân tích siêu vết

e) Ghép nối kỹ thuật stripping với các kỹ thuật phân tích điện hoá

Để tăng độ nhạy cũng như loại trừ bớt ảnh hưởng của một số chất cản trở cómặt trong mẫu phân tích, người ta có thể tiến hành điện phân tích góp chất cần phântích lên bề mặt cực làm việc trước khi tiến hành điện phân phân tích

Bằng kỹ thuật trên người ta có thể phân tích nhiều siêu vết nhiều các chất vô cơ,hữu cơ trong những đối tượng khác phức tạp chỉ với những thiết bị phân tích điện hóakhông quá tốn kém

Để phân tích siêu vết kim loại nặng người ta thường điện phân tích góp dướidạng hỗn hống thủy ngân, còn với các chất hữu cơ người ta thường tích góp theo cơchế hấp phụ trên mặt cực làm việc

Các cực làm việc trong kỹ thuật này hay dùng là cực thủy ngân tĩnh, cực thủytinh các bon quay Sau quá trình tích góp người ta có thể tiến hành phân tích bằng kỹthuật cực phổ cổ diển, cực phổ xung vi phân hay cực phổ sóng vuông Kỹ thuật sóngvuông ghép nối kỹ thuật Stripping là một trong những kỹ thuật có độ nhạy cao nhấthiện nay [40], [44]

Trong luận án này chúng tôi dùng kỹ thuật Stripping sóng vuông quét nhanhtrên cực giọt chậm là một kỹ thuật phân tích điện hóa rất mới

Stripping sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm