Ứng dụng sinh học phân tử trong xác định đa dạng sinh học quần thể vi sinh vật

Ứng dụng sinh học phân tử trong xác định đa dạng sinh học quần thể vi sinh vật

SVTH: Lê Tuấn Dũng, Sầm Minh Hải,

Cao Xuân Bách , Lê Khắc Thắng

Lê Tiến Hòa

Ứng dụng sinh học phân tử trong xác định đa dạng sinh học quần thể vi sinh vật

Đặt vấn đề

Vi sinh vật quanh ta Xử lý nước thải

=>Cần phải có sự hiểu biết về đa dạng vi sinh vật

Nội dung

 Các phương pháp

 Phương pháp enzyme giới hạn

 Phương pháp giải trình tự đặc hiệu

 DNA microarray

 Các phương pháp lai

 Ứng dụng thực tiễn

Phương pháp kỹ thuật sinh học phân tử

 Dựa trên sự khác biệt về

cấu trúc DNA: kích thước,

trình tự, sắp xếp

 Giải trình tự DNA

 Phân tích plasmid, DNA

 Lai DNA trên màng

DNA(đánh dấu bằng:

huỳnh quang,phóng xạ, )

So sánh đặc điểm

 Trong thực tế, thường kết hợp cả hai

phương pháp

Phương pháp truyền

thống Phương pháp kỹ thuật sinh học phân tử

•Thời gian lâu

•Giảm rủi ro khi tiến hành trên các vi sinh vật độc hại

Phương pháp sử dụng enzym giới hạn

EcoRI: enzym đầu tiên tìm thấy

EcoRV: enzym thứ 5 tìm thấy

Các kiểu cắt của enzyme giới hạn

Phương pháp sử dụng enzym giới hạn

Các bước thực hiện

Trích AND Cắt bằng các enzym giới hạn

Tách ADN trên gel agarose

Southern blotting Phân loại đa dạng vi sinh vật

Các bước

hoặc nhận biết đa dạng vi

sinh vật trong môi trường

dựa trên sự khác biệt về các vạch điện di.

Ưu nhược điểm

• Có độ đặc hiệu và độ nhậy cao cho phép xác định nhanh chóng và chính xác có

mặt của không chỉ một loài vi khuẩn mà còn cho phép xác định và phân biệt nhiều loài vi khuẩn

• Tốn thiết bị và hóa chất, không thể hiện kết quả tại chỗ

– Không có sự trao đổi giữa các loài

– Mang tính đặc trưng cho loài

Các bước thực hiệnCác bước thực hiện

DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophorensis)

Hạn chế của phương pháp

• Độ chính xác của taq DNA

polymerase không cao.

• Không phân biệt được DNA của tế bào sống và chết trong mẫu ban

đầu.

Hạn chế của phương pháp

giống, loài.

Kết quả

DNA Microarray

DNA Microarray là gì?

Kỹ Thuật DNA array

• Về kỹ thuật

– Điều kiện lai không bao giờ tối ưu

– Tính đa dạng rất lớn của môi trường

• Về vấn đề phân tích

– Giải thích dữ liệu khó

– Cần có dữ liệu trước đó về các loài vi sinh vật

Các vấn đề khi áp dụng kỹ thuật DNA

microarray trong lĩnh vực môi trường

Khả năng phát triển kỹ thuật DNA

microarray trong quản lý môi trường

• DNA microarray thỏa mãn các yêu cầu

– Xác định đồng thời nhiều loại VSV

Các kĩ thuật lai phân tử

• Khái niệm phương pháp lai phân tử

• Cơ sở của phương pháp lai phân tử

• Các yếu tố ảnh hưởng

• Các phương pháp lai phân tử

Cơ sở của phương pháp lai phân tử

Các phương pháp lai

Lai trong môi trường lỏng Lai trên pha rắn

Lai tại chỗ (in situ) FISH

Ứng dụng sinh học phân tử trong xác định

sự đa dạng của vi sinh vật Nitrate hóa trong

ao nuôi tôm.

Ứng dụng sinh học phân tử trong xác định

sự đa dạng của vi sinh vật Nitrate hóa trong

ao nuôi tôm.

Lấy mẫu.

Đặc điểm

ao

Lấy mẫu bùn

Lấy mẫu bùn

Sau lấy

mẫu

Sau lấy

mẫu

Xác định mật số vi khuẩn nitrate hóa

2 Xác định mật số vi khuẩn Nitrobacter bằng kỹ thuật

Real-time PCR Qui trình PCR:

Qui trình RT-PCR

• Qui trình nhiệt : 40 chu kỳ;

95oC (3’); 95oC (45’’); 47oC (45’’), 72oC; (1’); 72oC (3’)

• Điện di /agarose gel 1,5%

• Qui trình nhiệt : 40 chu kỳ;

95oC (3’); 95oC (45’’); 47oC (45’’), 72oC; (1’); 72oC (3’)

• Điện di /agarose gel 1,5%

Xác định mật số vi khuẩn nitrate hóa

1 Xác định mật số VK Nitrosomonas bằng kỹ thuật

Real-time PCR Qui trình PCR:

Qui trình RT-PCR

• Qui trình nhiệt :

35 chu kỳ, 95oC (10’); 95oC (1’); 55oC (1’); 72oC (1’); 72oC (10’)

• Qui trình nhiệt :

35 chu kỳ, 95oC (10’); 95oC (1’); 55oC (1’); 72oC (1’); 72oC (10’)

Bảng 1: Biến động mật số N europaea bằng phương

pháp Real-time PCR

Bảng 2: mật số Nitrobacter bằng phương pháp RT-PCR

Xác định mật số vi khuẩn nitrate hóa

Xác định sự đa dạng quần thể vi khuẩn bằng kỹ

thuật DGGE

Hình 1: Sản phảm PCR khuếch đại với mồi 984f-GC và 1378R

Chu trình nhiệt cho PCR:

Hình 2: Cấu trúc quần thể vi khuẩn trong

bùn đáy ao nuôi tômXác định sự đa dạng quần thể vi khuẩn bằng kỹ thuật DGGE

Tài liệu tham khảo

• TS Lê Thanh Hà, Bài giảng Công nghệ sinh học môi trường, ĐHBKHN

• PGS.TS Khuất Hữu Thanh, Kỹ thuật gen nguyên lý và ứng

dụng, 2006, NXBKHKTHN

• Poursafa P , Kelishadi R, Moattar F , Rafiee L , Amin MM, Lahijanzadeh A, Javanmard SH

Genetic variation in the association of air pollutants with

a biomarker of vascular injury in children and

adolescents in Isfahan, Iran.2011, PMID: 22091301 [PubMed] PMCID: PMC3214390

enzyme analysis of the hsp65 gene in clinical isolates from patients suspected of having pulmonary tuberculosis in Teresina, Brazil 2011

PMID: 22042395 [PubMed]

• Tạp chí khoa học và công nghệ, 2011

Cảm ơn cô và các bạn đã lắng nghe!