Các quá trình CNSH cơ bản trong CÔNG NGHỆ LÊN MEN HIỆN ĐẠI

Công nghệ lên men hiện đại• Quy trình công nghệ • Sử dụng đối t ợng sinh học làm tác nhân • Thu sản phẩm sinh học có giá trị kinh tế cao hay thực hiện chuyển đổi công nghệ nhất định vi

Công nghệ lên men

hiện đại

Các quá trình công nghệ sinh học cơ bản

I Đại c ơng về công nghệ lên

men hiện đại

1.1 Điểm lịch sử công nghệ lên men công nghiệp

• 1815: Sản xuất dấm theo ph ơng pháp nhanh

• 1846: Sản xuất công nghiệp nấm men bánh mỳ

• 1881: Lên men axít lactic nhờ vi khuẩn

• 1900 : Thùng lọc sinh học để xử lý n ớc thải đô thị QMCN

• 1912 : Lên men sản xuất axít xitric

• 1914 : Sử dụng Candida để SX thức ăn gia súc từ rỉ đ ờng

• 1930 (1894): Lên men SXCN chế phẩm enzym pectinaza

• 1934 : Sản xuất vitamin C, sử dụng Acetobacter

• 1940 : Lên men sản xuất công nghiệp penicillin G

• 1954 (1959, 1960) : Lên men với tế bào thực vật

• 1966: Sử dụng tế bào bạch cầu để lên men thu Interferon

• 1980: Lên men thu -interferon interferon nhờ E coli tái tổ hợp

• 1982: Lên men thu SPTĐCTC (saponin) với tế bào thực vật

+ Về bản chất tác nhân sinh học

• Thời kỳ tr ớc 1881: Lên men bằng canh tr ờng tập trung

• 1881 : lên men bằng canh tr ờng vi sinh vật thuần khiết

• 1940: lên men thuần khiết, bằng chủng VSV đột biến

• 1954: lên men thuần khiết, bằng tế bào (mô) thực

vật

• 1966: lên men thuần bằng tế bào (mô) động vật (‘34, ‘37)

• 1980: lên men thuần bằng tế bào VSV tái tổ hợp gen

+ Khả năng phát triển

• Hiện tại: mới chỉ một số ít VSV đ ợc ứng dụng trong SXCN

• T ơng lai: u thế về sự đa dạng sinh học, năng lực chuyển

hoá và sinh tổng hợp, khả năng can thiệp vào cấu trúc gen thuận lợi ; tốc độ phát triển vũ b o của KH-CN ão của KH-CN

Ngày càng nhiều hơn các chủng VSV đ ợc ứng dụng

+ Về đặc điểm công nghệ

•Tr ớc XIX: Lên men th ờng (yếm khí, hiếu khí giản đơn)

• 1815 : lên men hiếu khí trên tháp đệm

• 1846: lên men trong thiết bị dung tích lớn (NMBM)

• 1935: lên men chìm có sục khí và ( 42)‘42) khuấy trộn cơ học

• 1956: giám sát quá trình lên men (LM metan)

• 1970: áp dụng mô hình và tối u hoá trong CNLM

• 1971: Kết nối computer để giám sát QT lên men

• 1976: điều khiển tối u QT lên men bằng computer

*** áp dụng các giải pháp công nghệ mới trong khâu chuẩn

bị lên men, xử lý dịch lên men và tinh chế thu sản phẩm

1.2 Công nghệ lên men hiện đại

• Quy trình công nghệ

• Sử dụng đối t ợng sinh học làm tác nhân

• Thu sản phẩm sinh học có giá trị kinh tế cao hay thực

hiện chuyển đổi công nghệ nhất định

(vi sinh vật,

tế bào mô thực vật, tế bào mô động vật, enzym )

V lớn, sử dụng biến chủng cao sản, giám sát và điều khiển nghiêm ngặt ở cấp độ phân tử trong suốt quá trình lên

men, tự động hoá và điều khiển tối u hoá quá trình nhờ

computer, áp dụng các kỹ thuật chuẩn bị lên men, xử lý

dịch lên men và tinh chế thu sản phẩm hiệu năng cao )

• Các mục đích khác

1.3 mục đích quá trình lên men

• Thu toàn bộ sinh khối:

• Thu sản phẩm trao đổi chất:

• Thu enzym, axit amin, vitamin

• Biến đổi cấu trúc cơ chất (biotransformation)

• Thu toàn bộ sinh khối: nhân giống, sản xuất

protein đơn bào

• Thu sản phẩm trao đổi chất: sản phẩm trao đổi

chất sơ cấp; Sản phẩm trao đổi chất thứ cấp

• Các mục đích khác xử lý chất thải, thu hồi và khai thác

kim loại quý hiếm, VSV chỉ thị

1.4 phân loại quá trình lên men

• Theo đặc tính cơ lý môi tr ờng

• lên men hiếu khí

• Lên men trên môi tr ờng rắn xốp

• Lên men với môi tr ờng lỏng (LM bề mặt, LM bề sâu )

• Theo nhu cầu về ôxy

• Lên men yếm khí

• Theo kỹ thuật vận hành

• lên men gián đoạn

• lên men bán liên tục (cấp liệu, thu dịch lên men )

• lên men liên tục

• Theo kỹ thuật đIều chỉnh động học quá trình

• Lên men th ờng

• Lên men hai pha

• Lên men định h ớng

1.5 c¬ së x©y dùng Quy tr×nh c«ng nghÖ

• X©y dùng ý t ëng c«ng nghÖ

1.5 cơ sở xây dựng Quy trình công nghệ

• Xây dựng ý t ởng công nghệ

• Tuyển chọn tác nhân sinh học cao sản (VSV)

• Xây dựng ph ơng án nguyên liệu, nghiên cứu tối

u hoá thành phần môi tr ờng lên men

• Xác định giải pháp giống và nhân giống

• Lựa chọn, thiết kế thiết bị, NC điều chỉnh QTLM

• Nghiên cứu triển khai SXCN (scale up)

Sơ đồ phân bổ đầu t

• Hình thành ý t ởng công nghệ

• Nghiên cứu quy mô phòng thí nghiệm

• Nghiên cứu xây dựng quy trình PILOT

• Kiểm tra vệ sinh và an toàn sản phẩm

• Nghiên cứu thử nghiệm

quy mô bán sản xuất

• Quản lý và vận hành quy trình CN

Năng lực tác nhân sinh học

• Vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm

men, nấm mốc, mô tế bào thực vật, động vật, enzym

• Giám sát, điều

chỉnh tốc độ phát triển

• Điều chỉnh quá

trình chuyển hoá tạo sản phẩm

+ sơ đồ tổng quát dây chuyền công nghệ

Lên men sản xuất

sản phẩm thô

xử lý an toàn chất thải

chuẩn bị, pha chế môi

tr ờng

Thanh trùng, làm nguội

tinh chế thu sản phẩm

phân x ởng lên men

phân x ởng Thành phẩm

phân

x ởng phụ trợ

II Gièng vµ nh©n gièng trong s¶n xuÊt

2.1 yêu cầu chung của chủng công nghiệp

1 Năng lực tích tụ cao sản phẩm mong muốn

2 Phát triển nhanh, tích tụ sản phẩm nhanh

5 Dễ tách khỏi dịch lên men khi xử lý thu sản phẩm

3 Có chủng thuần khiết:

4 Không độc với ng ời, động vật, thực vật và môi tr ờng

sinh thái

6 Có khả năng xử lý để tạo biến chủng hoạt tính cao hơn

3 Có chủng thuần khiết: ổn định về di truyền, giống có

thể bảo quản lâu dài; có thể nhân giống nhanh, đảm bảo cấp giống th ờng xuyên, ổn định cho sản xuất

4 Không độc với ng ời, động vật, thực vật và môi tr ờng

sinh thái (nếu có thì độc tính thấp, dễ xử lý khử độc,

hoặc mất hoạt tính nhanh ở môi tr ờng ngoài)

2.2 các b ớc chính để chọn chủng công nghiệp

1 Phân lập, tuyển chọn từ tự nhiên

2 Xử lý tạo biến chủng siêu tổng hợp sản phẩm“siêu tổng hợp” sản phẩm ” sản phẩm

5 Thử nghiệm và chọn lọc lại trên quy mô PILOT

xuất công nghiệp

3 Chọn lọc lại

4 Nghiên cứu đặc tính chủng và xác định điều kiện lên

men tối u quy mô phòng thí nghiệm

(Kiểm tra khả năng thích ứng với trang

thiết bị hiện có, nguồn cung ứng nguyên liệu, trình độ công

nghệ, khả năng đáp ứng của lực l ợng sản xuất )

(giai đoạn nghiên

cứu toàn diện nhất, bao gồm đặc tính chủng, động học sự phát triển, sự hình thành và tích tụ sản phẩm; Nghiên cứu ảnh h ởng của điều kiện môi tr ờng lên men, xác định giải pháp công

nghệ để điều chỉnh định h ớng quá trình lên men )

(phenotyp hay genotyp)

Sơ đồ xuất sứ một vài chủng

Penicillium công nghhiệp hiện nay

+ Tìm kiếm, nghiên cứu tách dòng các gen quý

+ Biến nạp gen đ tách dòng vào chủng mang lựa chọn ão của KH-CN

(Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus

niger, A oryzae )

+ Nghiên cứu điều chỉnh quá trình lên men (và xử lý dịch lên men) để thu sản phẩm mới nhờ biến chủng tái tổ hợp

2.2 Các ph ơng pháp bảo quản giống

+ Cấy chuyền lên men định kỳ

+ bảo quản giống ở nhiệt độ thấp

+ bảo quản giống ở chế độ lạnh đông

+ bảo quản giống ở chế độ siêu lạnh

+ bảo quản giống bằng kỹ thuật đông khô

+ bảo quản khô

-interferon bảo quản th ờng -interferon bảo quản trong dầu (thích hợp để bảo quả nấm sợi)

-interferon trong (hay trên) nitơ lỏng

* Mục đích Yêu cầu

** Một số ph ơng pháp bảo quản th ờng dùng

* Mục đích Yêu cầu: CT thuần khiết, ổn định; không để bị mất giống, tránh

nhiễm tạp, giảm nguy cơ xuất hiện đột biến ngẫu nhiên

+ Cấy chuyền lên men định kỳ rẻ tiền, dễ triển khai, vấn đề ổn định chất l

ợng, tốn nhân công, dễ nhiễm tạp, (phổ biến hơn với vi khuẩn)

+ bảo quản giống ở nhiệt độ thấp Đơn giản, kinh tế, tốn nhân công, vấn đề

thoái hoá giống

-interferon trong glyxerol (-interferon 50 -interferon -interferon 80 o C) Chi phí cao, tốn ít nhân lực

chi phí cao, độc, dễ trục trặc khi không đủ N 2

+ bảo quản giống bằng kỹ thuật đông khô Đầu t cao, tốn nhân công, bảo

(trong đất, cát, silicagel, giấy đơn giản, rẻ tiền, tốn ít nhân công

2.2 Các ph ơng pháp bảo quản giống

-interferon Trong các ngân hàng giống vi sinh vật, tại các viện nghiên cứu chuyên ngành, trong các tr ờng đại học và ngay trong các phòng giống của các cơ sở sản xuất

* Không có giải pháp tối u cho mọi chủng; mỗi giống th ờng đ ợc bảo quản song song bằng một số ph ơng pháp thích ứng

* Căn cứ lựa chọn: tỉ lệ sống sót, nhiễm tạp, biến đổi về di truyền (suy

giảm hoạt lực), l ợng mẫu, giá trị canh tr ờng cần bảo quản, khả năng vận chuyển và cung ứng, khả năng hoạt hoá để sử dụng, giá thành

+ Hiệu quả bảo quản

+ Nơi bảo quản giống

-interferon Địa chỉ trực tuyến một vài ngân hàng giống lớn trên thế giới:

• American Type Culture Collection, USA www.atcc.org

• World Federation for Culture Collections, JAPAN www.wfcc.info

• Deutsch Samlung von Microorganismen und Zellkulturen, Deutschland -

www.dsmz.de

•

2.3 Nhân giống phục vụ sản xuất

+ Mục đích Yêu cầu

-interferon Cấp giống ổn định và kịp thời cho sản xuất

+ Cấy chuyền nhân giống cho sản xuất

-interferon Cấp giống đủ về l ợng,đảm bảo chất l ợng (kể cả Đ/đ

yêu cầu của sản xuất

-interferon Hoạt hoá giống và nhân giống phòng thí nghiệm -interferon Nhân giống quy mô nhỏ

-interferon Nhân giống Trung gian -interferon Nhân giống sản xuất

* Môi tr ờng

* Chu kỳ cấy chuyền

III M«i tr êng lªn men

3.1 Yêu cầu

+ Đảm bảo cung cấp đủ chất dinh d ỡng để chủng

duy trì và phát triển đủ l ợng sinh khối cần thiết

+ Phù hợp với mục tiêu công nghệ để tạp ra sản

phẩm mong muốn

+ Đảm bảo các chỉ tiêu kinh tế

+ Đảm bảo chất l ợng vệ sinh công nghiệp để

hạn chế và ngăn ngừa nhiễm tạp

3.2 Khử khuẩn môi tr ờng

3.2.1 Mục đích yêu cầu

+ Ngăn ngừa nhiễm tạp, đảm bảo cho quá trình lên men xảy ra

với tác nhân mong muốn, đảm bảo năng suất và hiệu quả

chuyển hoá cơ chất

+ Ngăn ngừa suy giảm hoạt tính sản phẩm, giảm tạp chất, hạn chế tác

động tiêu cực đến chủng và hiệu quả công nghệ áp dụng

a/ Thanh trùng

* Yêu cầu

+ Tiêu diệt vi sinh vật và bào tử

+ Hạn chế biến đổi chất l ợng:

* Các yếu tố ảnh h ởng đến hiệu quả thanh trùng:

* Chế độ thanh trùng: A - B - C

t =

CĐTT

-interferon A Thời gian gia nhiệt mẫu đến nhiệt độ thanh trùng, phút

-interferon B Thời gian giữ mẫu ở nhiệt độ thanh trùng, phút

-interferon C Thời gian làm nguội mẫu xuống nhiệt độ phòng, phút

-interferon T Nhiệt độ thanh trùng, o C, o F, ( o K)

* Các yếu tố ảnh h ởng đến hiệu quả thanh trùng: L ợng

vi sinh vật trong mẫu, khả năng chịu nhiệt của các chủng, đặc tính cơ lý của mẫu, hệ số rủi ro nhiễm tạp cho phép, điều

kiện công nghệ khả thi, chi phí vận hành

+ Hạn chế biến đổi chất l ợng: phản ứng caramen, phản ứng

melanoidin, ứng thuỷ phân, các cấu tử bị phân huỷ bởi nhiệt

độ cao, biến đổi pH

+ Thanh trïng gi¸n ®o¹n

110 -interferon 121 o C, 15-interferon 30 phót

+ Thanh trïng liªn tôc 140 -interferon 146 o C, 2-interferon 3 phót

Thanh trïng m«i tr êng

Bay h¬i

Gia nhiÖt

Lµm l¹nh

Gi÷ nhiÖt

Gi÷

nhiÖt

a/ Lọc vô khuẩn môi tr ờng

* Dạng cấu trúc lọc

Axetat xenlulo, Polyetylenphthalat; nilon ;

dày 70-interferon 150m, mao quản < 10 m

(microfiltration 0,02-interferon 10 m, ultrafiltration

0,001-interferon 0,02 m, hyperultrafiltration <0,001 m);

độ rỗng 60-interferon 85%

3.3 Khử khuẩn Thiết bị và thiết bị phụ trợ

3.3.1 Mục đích yêu cầu

+ Đảm bảo cho quá trình lên men xảy ra với tác nhân mong muốn, ngăn ngừa

nhiễm tạp, đảm bảo hiệu quả năng suất và hiệu quả chuyển hoá cơ chất + Ngăn ngừa suy giảm hoạt tính sản phẩm, góp phần làm giảm tạp chất hay

giảm thiểu rủi ro phát sinh thêm trong xử lý thu sản phẩm

3.3.2 Giải pháp

+ Nhiệt độ cao, hoá chất

+ Thanh trùng tại chỗ (Clean in Place, In Situ Sterilyzation)

+ Giải pháp khả thi, đồng bộ cho cả thiết bị và hệ thống thiết bị phụ trợ và

mức phát sinh do đầu t , vận hành và bảo trì chấp nhận đ ơc

IV lªn men s¶n xuÊt

pH, O 2 ,

Thanh trùng

Tách bọt

Gia nhiệt khử khuẩn

Lọc khí thải

Sơ đồ nguyên lý

quá trình lên men

4.1 Động học quá trình lên men

4.1.1 Quá trình lên men gián đoạn

Thời gian lên men

Nồng độ sản phẩm (TĐC thứ cấp)

Nồng độ cơ chất

Mật độ tế bào

Hàm l ợng sinh khối (BM)

RNA/Unit of BM

+ Qua bốn giai đoạn: thích ứng,

phát triển luỹ tiến, cân bằng,

diệt vong

+ Hiện t ợng đ ờng cong sinh tr ởng

kép, khi có nhiều nguồn dinh d

ỡng khác nhau

+ Sản phẩm TĐC sơ cấp và SP

TĐC thứ cấp

4.1.2 Quá trình lên men bán liên tục

4.1 Động học quá trình lên men

4.1.1 Quá trình lên men gián đoạn

4.1.3 Lên men liên tục

Hệ số pha lo ng MTão của KH-CN

Nồng độ cơ chất

Năng suất

Mật độ tế bào

vùng cân bằng động

vùng bất

ổn định

vùng rửa trôi

4.1.4 Đặc điểm sinh thái pellet nấm sợi

4.2 Kiểm tra giám sát các thông số công nghệ

nhiều vị trí, đo nồng độ thấp hay

pha lo ng để đo khi nồng độ cao ão của KH-CN

b/ Đo phổ hấp phụ/phát xạ

- NADH + , NADPH + : hấp phụ 460nm, phát xạ 340-360cm

- ảnh h ởng: tình trạng phát triển, c ờng độ trao đổi chất, nồng độ chất tan trong môi tr ờng (Glucoza cao), bọt khí

4.2.1.1 Đo mật độ quang

c/ Sử dụng thiết bị đếm qua khe hẹp

4.2 Kiểm tra giám sát các thông số công nghệ

4.2.1 Nồng độ tế bào vi sinh vật

- Ph ơng pháp Twin-Type: sử dụng thiết bị đối chứng

4.2.1.1 Đo mật độ quang

4.2.1.2 Đo nhiệt l ợng

- Ph ơng pháp Different: sử dụng bộ đo cách nhiệt cục bộ Vđ thiếu dinh d ỡng O2,

- Ph ơng pháp Head-Flux: đo gián tiếp qua năng l ợng tiêu hao của thiết bị ổn nhiệt chung của hệ thống

4.2.1.3 Ph ơng pháp xác định hàm l ợng sinh khối (lọc và cân)

4.2.1.4 Ph ơng pháp đo độ nhớt dịch lên men (sử dụng thiết bị mao quản)

4.2.1.4 Ph ơng pháp đo điện trở dẫn và trở kháng (sử dụng thiết bị mao quản)

4.2.1.4 Ph ơng pháp đo điện thế (sử dụng 2 điện cực hydro, 1 có màng cách ly)

tạo thành, đô phổ cộng h ởng từ hạt nhân )

4.2 Kiểm tra giám sát các thông số công nghệ

4.2.2 nhiệt độ

- Nhiệt kế thuỷ ngân: giao tiếp thuận lợi, chính xác, khó đo xa, dễ vỡ

- Nhiệt kế điện trở (Pt100: 100 Ohm ở 0 o C - 123,4 Ohm ở 60 o C,  0,5 o C - 20-130 o C)

- Các dạng khác

4.2.3 pH môi tr ờng

năng tiêu thụ, kiển soát tạo bọt )

F

4.2.4 nồng độ ôxy hoà tan

- Anode: Zn; Pb - Catode: Au; Ag

- Cân bằng lại sau khi thanh trùng

4.2.5 l u l ợng vào -interferon ra (chênh áp qua thiết bị, l l ợng kế phao, điện từ tr ờng )

4.2.1 C«ng cô ®iÒu chØnh : B¬m, qu¹t, van, TB ®iÖn

4.4 Thiết bị lên men công nghiệp

4.4.1 Characteristics

+ Volume: depends on the

process and it operation.

+ Operating mode: batch,

semi-continuous,

continuous operation

+ Typical types: aerated and

stirred fermentor from

stainless steel, large

cylinder form closed at the

top and bottom and with

external cooling jacket;

equiped with sparger,

impeller and fitted with

various pipers and valves

4.4 Thiết bị lên men công nghiệp

4.4 Thiết bị lên men công nghiệp

4.4.3 Technological characteristics of the fermentor

- Main part of the complex system,

where the strain growth and

product formation occur.

- Made from rolled steels with rough

surface, spot of electric soldering,

connection plugs etc difficult of

sterilization

- Unequal conditions at any volume

locations, because of rheological

properties of the broth (appearing

primary flow, secondary

flow,uneffective working zones etc

during agitation)