Xác định hàm lượng Rhodamin B trong hạt dưa và gia vị bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Trong sắc ký các chất khác nhau được tách dựa trên sự phân chia khác nhau của chúng vào hai pha luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau : một pha tĩnh và một pha động.. Cho pha động chạy

Sau khi phát hiện Sudan đỏ trong các sản phẩm từ ớt bột ở Trung Quốc, mới đây, người ta lại phát hiện Rhodamin B, loại chất để nhuộm len và lụa, có trong các

sản phẩm gia vị của Trung Quốc nhập khẩu vào Tây Ban Nha

Bước đầu, cơ quan chức năng xác định chất nhuộm Rhodamin B đi vào các

sản phẩm ớt là xuất phát từ việc sử dụng thuốc trừ sâu tại các cánh đồng trồng ớt

Tận dụng đặc tính phát quang của Rhodamin B, nông dân dùng chúng để giúp kiểm

soát lượng thuốc bảo vệ thực vật phun lên cây ớt Một số loại dầu thực vật cũng pháthiện thấy hóa chất phát quang này và người ta cũng nghi chúng bị dùng để kiểm soátthuốc trừ sâu khi phun lên các loài cây lấy dầu

Ngoài ra, không chỉ với ớt bột hay các chất gia vị nói chung, chất tạo màu

Rhodamin B có nguy cơ xuất hiện trong hầu hết sản phẩm lương thực, thực phẩm đi

từ cây trồng có dùng phân bón hóa học

Lo ngại nguy cơ xâm nhập của Rhodamin B vào các loại thực phẩm, Ủy ban Gia vị châu Âu đang tìm cách ra lệnh cấm triệt để việc sử dụng Rhodamin B

trong tất cả các khâu liên quan đến quá trình sản xuất lương thực và thực phẩm

Chi tử là quả của cây dành dành

Thị trường thực phẩm Việt Nam rất đa dạng, đặc biệt chúng ta nhập rất nhiềuloại thực phẩm từ Trung Quốc Ngoài những thực phẩm nhập vào theo đường chínhthống, còn rất nhiều loại thực phẩm trôi nổi không được kiểm soát chất lượng an

hạt dưa bị nhiễm phẩm màu Rhodamin B gây ung thư đã khiến người tiêu dùng vôcùng hoang mang lo lắng Rhodamin B là một loại chất hoá học dùng để nhuộmquần áo, cấm tuyệt đối trong thực phẩm và thuốc

Trong bối cảnh đó, các kĩ thuật xác định Rhodamin B trong thực phẩm phùhợp với điều kiện phòng thí nghiệm trong nước sẽ trở thành công cụ hữu hiệu giúpcác cơ quan chức năng kiểm soát tốt hơn vấn đề đảm bảo chất lượng vệ sinh an toànthực phẩm Là cơ quan đầu ngành trong lĩnh vực an toàn vệ sinh thực phẩm, ViệnKiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã tổ chức lớp tập huấn kỹ thuật:

“Xác định hàm lượng Rhodamine B trong hạt dưa và gia vị bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

HPLC PGS Phạm gia Huệ

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-High performance liquid chromatography)còn được gọi là sắc ký lỏng cao áp, hoặc chỉ đơn giản gọi là sắc ký lỏng vì ngày nay

nó đã trở thành quá thông dụng

HPLC ra đời khi người ta sản xuất được chất nhồi cột có cỡ hạt khoảng 10

m hay nhỏ hơn (5 và 3 m), có hiệu suất tách rất cao Cỡ hạt bé đòi hỏi dùng bơm

để nén dung môi qua cột Với loại chất nhồi mới này và hệ thống máy vi tính,phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ra đời

UPLC (Ultra performance liquid chromatography) hay sắc ký lỏng siêu hiệu

năng với hạt chất nhồi cột có đường kính dưới 2 m, có hiệu suất tách cao hơn nữa Quá trình sắc ký và các đại lượng đặc trưng

1 Một số khái niệm mở đầu

1.1 Định nghĩa:

Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp Trong sắc ký các chất khác nhau được tách dựa trên sự phân chia khác nhau của chúng vào hai pha luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau : một pha tĩnh và một pha động Pha tĩnh được nhồi trên cột, pha động đi qua cột Khi hỗn hợp

cần tách được pha động kéo qua cột, chất nào có ái lực mạnh hơn với pha tĩnh sẽ dichuyển chậm hơn, vì vậy các chất có thể tách khỏi nhau

1.2 Quá trình sắc ký:

Quá trình tách sắc ký thường bao gồm 3 giai đoạn chính:

a Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh: đưa hỗn hợp lên cột.

b Cho pha động chạy qua pha tĩnh: dung môi qua cột, kéo theo các chất di

chuyển trên pha tĩnh với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau và có vị trí khác nhau trêncột tạo thành sắc đồ (sắc ký đồ) Giai đoạn này gọi là khai triển sắc ký(development)

Nếu tiếp tục cho pha động chạy thì các chất có thể lần lượt bị kéo ra khỏi cột

Đó là quá trình rửa giải (elution) và dung môi được dùng là dung môi rửa giải(eluent), dịch hứng được ở cuối cột gọi là dịch rửa giải (eluate)

Nếu các chất được tách trên pha tĩnh (sắc ký khai triển) ta có thể lấy từngphần pha tĩnh có mang chất (phân đoạn bột trên cột) đem chiết lấy chất.

Nếu các chất được tách ra ngoài pha tĩnh (sắc ký rửa giải) ta có thể hứng lấycác phân đoạn dịch rửa giải có chất

c Phát hiện các chất : các chất màu có thể phát hiện dễ dàng, các chất không

màu có thể phát hiện bằng đèn tử ngoại hay bằng các thuốc thử Trong sắc ký rửagiải có thể phát hiện các chất khi chúng đi ra khỏi cột bằng cách cho dung dịch rửagiải đi qua một bộ phận phát hiện gọi là detectơ (detector) đặt sau cột

1.3 Phân loại các phương pháp sắc ký.

-Sắc ký hấp phụ (adsorption chromatography): pha tĩnh là chất rắn có khảnăng hấp phụ Pha động có thể là chất lỏng hay chất khí

-Sắc ký phân bố (partition chromatography): pha tĩnh được giữ trên bề mặtmột chất rắn gọi là chất mang (support), chất mang phải là chất trơ, không tham giavào quá trình sắc ký Pha động có thể là chất lỏng hay chất khí

-Sắc ký trao đổi ion (ion-exchange chromatography): pha tĩnh là chất nhựatrao đổi ion (hợp chất cao phân tử có mang những ion có khả năng trao đổi với cácion cùng dấu của hỗn hợp sắc ký)

-Sắc ký theo loại cỡ (size-exclusion chromatography) còn gọi là sắc ký trêngel Các phân tử cỡ lớn sẽ được loại, các phân tử nhỏ hơn sẽ được tách theo kíchthước, phân tử bé di chuyển chậm

Các phương pháp sắc ký khác: sắc ký ái lực, sắc ký điện…

Ghi chú: Trong sắc ký khí, chủ yếu là sắc ký phân bố và sắc ký hấp phụ

2 Cơ sở lý thuyết sắc ký (Giới thiệu sơ lược):

Có hai yếu tố quyết định quá trình tách sắc ký :

- Tốc độ di chuyển của các chất: Các chất khác nhau phải có tốc độ di

chuyển khác nhau, cho các pic ở vị trí khác nhau trên sắc đồ

- Sự mở rộng dải hay sự doãng pic (band broadening, peak spreading), docác tiểu phân của cùng một chất di chuyển với tốc độ khác nhau

Hai pic ở gần nhau trên sắc đồ nếu bị doãng nhiều sẽ trùm lên nhau (xen phủ lênnhau), không tách được khỏi nhau

Ta hãy xét hai vấn đề nêu trên :

2.1 Tốc độ di chuyển của các chất:

2.1.1 Tốc độ di chuyển của một chất:

Tốc độ di chuyển của một chất có thể được mô tả bởi các đại lượng về sự lưugiữ của chất đó trên pha tĩnh (thời gian lưu, thời gian lưu hiệu chính).

a- Thời gian lưu (retention time): Trên sắc đồ, trục tung chỉ cường độ tín hiệu

của detectơ, trục hoành là trục thời gian (hoặc thể tích dung môi)

Hãy quan sát sắc đồ, trường hợp có một chất (hình 1)

Thời gian lưu tR (phút) là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫuqua cột sắc ký, tới detectơ và cho pic trên sắc đồ (tính từ lúc tiêm đến lúc xuất hiệnđỉnh của pic)

t0 : là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ (là chất di chuyển với tốc

độ của pha động) t0 thường được gọi là thời gian chết

tR càng lớn, chất tan bị lưu giữ càng mạnh và di chuyển càng chậm

b-Thời gian lưu hiệu chính t’ R được tính theo công thức:

m

Được đặc trưng bởi đại lượng thừa số chọn lọc hay hệ số chọn lọc α (selectivity factor), còn gọi là hệ số tách:

α = ' '

RA

RB

t t

Theo qui ước, B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A vì vậy α luôn luôn lớn hơn 1

α còn được gọi là độ lưu giữ tỷ đối (relative retention)

Để tách riêng hai chất, cần có α > 1, thường chọn α trong khoảng 1,05 đến 2,0 α càng lớn hai chất càng tách ra khỏi nhau, với α quá lớn thời gian phân tích sẽ kéo dài

2.2 Sự doãng píc và hình dáng píc.

Như trên đã trình bày, hình dáng của pic và sự doãng píc liên quan chặt chẽ đến

sự tách sắc ký Hình dáng lý tưởng của píc là píc đối xứng Trên thực tế píc sắc ký

thường chỉ gần đối xứng Để đánh giá tính bất đối của píc người ta dùng hệ số bất đối AF (Asymmetry Factor).

AF = b / a

h

b = phần chiều rộng phía sau của píc

a = phần chiều rộng phía trước của píc a b

w1/10 = a+b = chiều rộng của píc được 10% h

đo ở 1/10 chiều cao của píc

Hình 2

Tính bất đối của pic

Một cột được nhồi tốt sẽ có AF trong khoảng 0,9 -1,1.(xác địnhAF với píc của các chất chuẩn)

Cũng có thể dùng hệ số đối xứng SF (symmetry factor):

SF= w1/20 / 2a trong đó w1/20 được đo ở 1/20 chiều cao của pic

Sự doãng píc (peak spreading) hay sự mở rộng dải là một hiện tượng đặc biệt quan trọng trong sắc ký và được nghiên cứu qua thuyết về đĩa và thuyết động học

Sự doãng píc là kết quả của sự di chuyển nhanh chậm khác nhau của các phân

tử của cùng một chất trong khi đi qua cột sắc ký Các píc ra muộn bao giờ cũng tù

2.3 - Hiệu lực của cột và đĩa lý thuyết:

Hiệu lực của cột (column efficiency ) thường được đo bằng hai thông số: sốđĩa lý thuyết N và chiều cao đĩa lý thuyết H (hay HETP)

Ta có thể coi như cột sắc ký được chia thành N phần mỏng hay N lớp, ở mỗilớp sự phân bố chất tan vào hai pha lại đạt đến một trạng thái cân bằng mới (sắc ký

là một quá trình động, thực ra pha động chảy liên tục và thời gian không đủ để thiếtlập trạng thái cân bằng) Những phần mỏng (hay lớp)giả định này được gọi là đĩa lýthuyết (vì không có thực) Nếu cột sắc ký có chiều dài là L thì ta có biểu thức:

H = L / N

Trong đó N: là số đĩa lý thuyết của cột

L : chiều dài cột

H: là chiều cao của đĩa lý thuyết

Cột có N lớn (hay có H nhỏ) là cột có hiệu lực cao

a Chiều cao đĩa lý thuyết và sự doãng píc.

Ta có thể xác định H và N dựa vào thực nghiệm

Hình 3 Pic sắc ký (a) so sánh với đường cong phân bố chuẩn Gauss (b)

Dựa vào sắc đồ (xem hình 3a) ta có thể tính số đĩa lý thuyết N

thì Wb nhỏ (độ doãng píc nhỏ).

b Độ phân giải và các yếu tố ảnh hưởng (sự tách hai chất).

Độ phân giải (Resolution) là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc

ký Xét trường hợp tách hai chất A và B (xem hình 4)

Độ phân giải RS được địnhnghĩa như sau:

RS = 1/2( )

A B

RA RB

W W

t t





hay

RS =

A B

RA RB

W W

t t

, 2 / 1 , 2 / 1

)(

18,1





trong đó W là chiều rộng pic ởđáy và W1/2 là chiều rộng pic ở nửachiều cao

Hình 4 R S và sự tách 2 pic

Với hai pic có độ lớn tương đương thì:

Rs = 0,75 hai pic không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều

Rs = 1,0 hai pic tách khá tốt,còn xen phủ nhau 4%

Rs =1,5 hai pic tách gần hoàn toàn (chỉ xen phủ 0,3%)

2.4 Trường hợp tách nhiều chất, ảnh hưởng của thành phần dung môi và

nhiệt độ.

Khi có nhiều chất cần tách, trong sẵc ký lỏng thường có thể thay đổi thành phần dung môi để tách riêng được tất cả các chất trong hỗn hợp Có thể phải thay

đổi loại dung môi, cũng có thể chỉ cần thay đổi tỷ lệ giữa các thành phần

2.4.1 Rửa giải đẳng dòng (isocratic elution, rửa giải thường) :

Đó là cách dùng một hệ dung môi có thành phần xác định trong suốt quá trìnhphân tích Hình 5 dưới đây cho sắc đồ của 4 lần phân tích 1 hỗn hợp 5 chất, mỗi lầndùng 1 pha động có thành phần khác

Hình 5 ảnh hưởng của thành phần pha động (hỗn hợp methanol-nước) đến việc tách hỗn hợp 5 chất

Hình 5 cho thấy việc thay đổi thành phần dung môi có thể ảnh hưởng đến quá trìnhtách mạnh mẽ như thế nào (thêm một ít nước vào Methanol 60% để có Methanol50%: các pic 1, 2, 3, 4, 5 lần lượt được tách trên sắc đồ (c)

Trong 4 hệ dung môi, hệ c (50% methanol) là thích hợp nhất vì các pic đượctách tốt và chỉ cần 10 phút, hệ d tách rất tốt nhưng thời gian phân tích cần đến 20phút

2.4.2 Rửa giải gradient (gradient elution), chương trình hoá dung môi (solvent programming)

Trong nhiều trường hợp, rửa giải đẳng dòng (dùng một hệ dung môi có thànhphần không đổi) không giải được bài toán tách các chất

Trong những trường hợp này, người ta phải thay đổi thành phần dung môingay trong quá trình phân tích (chương trình hoá dung môi hay rửa giải gradient).Xem hình 6

Hình 7 Rửa giải gradient cho phép tách hỗn hợp 10 chất, hình (b)

Trên hình 7 ta thấy nếu rửa giải với một hệ dung môi có thành phần cố định(sắc đồ a) trong số 10 chất, thì 5 chất đầu không tách được (các pic quá gần nhau)trong khi 5 chất sau ra chậm và quá tù Bằng phương pháp chương trình hoá dungmôi (thành phần dung môi biến đổi dần trong quá trình chạy sắc ký, bắt đầu từ một

hệ dung môi yếu hơn và kết thúc bằng một hệ mạnh hơn so với hệ dung môi dùng ởsắc đồ a) ta có sắc đồ b ở đó các pic được phân bố đều và tách rất tốt Chương trìnhdung môi có thể chia làm nhiều đoạn với các kiểu biến đổi thành phần dung môikhác nhau

Để giải các bài toán tách nhiều chất với yêu cầu thời gian phân tích càng ngắncàng tốt, nếu không thể chọn một điều kiện sắc ký thích hợp, ta có thể dùng phươngpháp biến đổi dần dần điều kiện sắc ký theo một chương trình nào đó

Trong sắc ký lỏng, hay dùng chương trình hoá dung môi (rửa giải gradient)

3 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao:

2- Lọc dung môi 3- Bơm cao áp; 4- Bộ tiêm mẫu5- Cột sắcký;

6- detectơ ;

7 - Máy ghi tín hiệu;

8 – Bình hứng

3.1 Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi

Cần lọc loại các hạt vẩn trong dung môi và đuổi khí hoà tan trong dung môi.Khí hoà tan có thể làm biến dạng các pic và sinh bọt khí làm nhiễu đường nền làm

xuất hiện các pic lạ Có thể đuổi khí dung môi bằng nhiều cách: dùng siêu âm, đun

và khuấy, sục khí trơ như heli, lọc dưới áp suất giảm

Trong phương pháp rửa giải thường chỉ cần một bình dung môi Trong phương pháp rửa giải gradient, thường dùng 2, 3, 4 bình chứa các dung môi khác

nhau và hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp của các loại dung môi trên được trộn với tỷ

lệ biến đổi theo chương trình đã định

3.2 Hệ thống bơm:

Các đơn vị áp suất hay dùng trong HPLC: 1Pa = 1 Nm-2 ; 1 bar = 105 Pa;

1 psi = 0,4536  9,81 / 0,02542 = 6897 Pa; 1 at = 1 kg cm-2 = 1,01 bar

Trong phân tích hay dùng loại bơm dòng không đổi (constant flow) Bơm kiểu piston là loại được dùng phổ biến, để khử xung người ta dùng bơm có hai

piston bơm luân phiên Loại sau được dùng phổ biến vì có nhiều ưu điểm

3.3 Hệ tiêm mẫu:

Phương pháp phổ biến là dùng van tiêm có vòng chứa mẫu (sample

loop) với dung tích xác định và chính xác Có thể thay đổi các vòng mẫu dung tíchkhác nhau: 5 đến 500 l Loại 20l được dùng phổ biến Tiêm bằng van tiêm có độchính xác cao Hình 9 Mô tả một loại van tiêm

Van tiêm có hai vị trí của rô-to, vị trí (a) để nạp mẫu (load) vào vòng mẫu, vịtrí (b) để tiêm mẫu (inject) bằng cách cho dung môi qua vòng mẫu để đưa mẫu lêncột

3.4 Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao

Cột bằng thuỷ tinh dùng ở áp suất thấp (dưới 50 at), được bọc trong một vỏthép Cột bằng thép không gỉ được dùng phổ biến

Cột phân tích thường dài 10-30 cm có đường kính trong 4-10 mm, hạt chấtnhồi cỡ 5-10 m Với chất nhồi cỡ 3-5 m có thể dùng các cột ngắn (3-10 cm) vànhỏ (1- 4,6 mm) Loại cột này có hiệu lực rất cao, có số đĩa lý thuyết lên đến100.000 đĩa cho 1 m cột Đường kính ngoài của cột thường là 1/4 inch

Cột điều chế có thể có kích thước lớn hơn cột phân tích nhiều lần Cột bánđiều chế nhỏ nhất (để tách lấy lượng nhỏ chất để đem phân tích) thường có đườngkính trong 9-12 mm dài 50 cm hoặc hơn nữa

Chất nhồi cột thường là silicagel hoặc có bọc một lớp mỏng chất hữu cơ Bêncạnh silicagel người ta còn dùng những hạt khác: nhôm oxyt, polyme xốp, chất traođổi ion

3.5 Detector:

Hình 9 Van tiêm mẫu:

1- Vòng chứa mẫu, 2- Bình dung môi và bơm, 3- Cột sắc ký

4- Nơi nạp mẫu vào vòng chứa mẫu 5- Phần mẫu còn thừa

Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu đượcghi trên sắc đồ Các loại detector được dùng phổ biến là:

- Detector đo chỉ số khúc xạ (RI) là detector vạn năng nhưng kém nhạy.

- Detector huỳnh quang và detector điện hoá có độ nhạy độ chọn lọc cao hay

dùng trong phân tích vết và phân tích y sinh học

- Detector tử ngoại-khả kiến (UV-Vis), còn gọi là detector hấp thụ quang,

dùng đèn deuterium (đo ở 190-400 nm) và đèn wolfram (đo ở 380-600 nm), có thểlàm việc ở bước sóng tùy chọn theo tính chất hấp thụ ánh sáng của chất muốn pháthiện Loại này hiện nay được dùng nhiều nhất

- Detector chuỗi diod (mảng diod) DAD hay PDA là detector hấp thụ quang

nhưng cho phép đo đồng thời tại nhiều bước sóng (đo phổ UV) trong quá trình sắc

ký, cho phép đánh giá độ tinh khiết của pic và góp phần xác định định tính thêmchắc chắn

- Detector khối phổ Các chất sau khi được tách trên cột sắc ký, được đưa vào

máy khối phổ Tại đây phân tử các chất được bắn phá, ion hóa, cho ta các ion mảnhđặc trưng, giúp ta định tính các chất dựa vào phổ khối của chất (dựa vào khối lượngcủa phân tử mẹ và các mảnh đặc trưng) và định lượng dựa vào việc đo mật độ(abundance) của các mảnh đặc trưng Việc phân tích bằng khối phổ 2 lần liên tiếplàm tăng độ nhạy và độ chính xác của kết quả

Hệ thống sắc ký-khối phổ có thư viện phổ khối cho phép xác định nhiều chấtchưa biết

4 Các phương pháp sắc ký

4.1 Sắc ký phân bố (Partition chromatography)

Gồm 2 loại: Phương pháp sắc ký lỏng-lỏng và sắc ký pha liên kết

- Sắc ký lỏng-lỏng (LLC) pha tĩnh là chất lỏng được bao trên bề mặt của các

hạt chất mang (support) Pha tĩnh thường được dung môi hoà tan và mất dần Hiệntượng này làm cột mất dần hiệu lực (cột chảy máu) Ngày nay phương này ít đượcdùng Một ví dụ: tách thuốc trừ sâu dùng -’oxydipropionitril (ODPN) làm phatĩnh, isooctan làm pha động

- Sắc ký pha liên kết (BPC - Bonded phase chromatography) Ở đây pha tĩnh

được gắn hóa học (liên kết) với chất mang (hạt silicagel) tạo nên hợp chất siloxan:

Dẫn chất Siloxan

- Nếu R là một nhóm ít phân cực như octyl (C8), octadecyl (C18) hay phenyl và dungmôi phân cực như methanol, acetonitril thì có sắc ký pha đảo (pha ngược)

Ở đây pha tĩnh ít phân cực hơn pha động, trái với truyền thống của sắc ký trước đây

là pha tĩnh phân cực hơn pha động

- Nếu R là nhóm khá phân cực như alkylamin - (CH2)n NH2 hay alkylnitril - (CH2)n

CN và dung môi ít phân cực như hexan thì ta có sắc ký pha thuận (pha thường) Hiện nay sắc ký pha đảo được dùng hết sức rộng rãi vì nó cho kết quả tách tốtvới rất nhiều đối tượng tách

Cơ chế tách trong sắc ký pha liên kết là khá phức tạp, còn nhiều điều tranhcãi

- Cách chọn pha: thường chọn pha tĩnh có tính phân cực giống các chất cầntách, và khác với pha động

- Thứ tự rửa giải: Trong sắc ký pha thuận các chất ít phân cực ra trước Trong

sắc ký pha đảo các chất phân cực ra trước rồi đến các chất ít và không phân cực rasau

- Ứng dụng: sắc ký lỏng phân bố hiệu năng cao được dùng trong việc tách các

chất thuộc nhiều lĩnh vực như: dược, sinh hóa, thực phẩm (Đường nhân tạo, chấtchống oxy hoá, chất phụ gia, aflatoxin), độc chất (thuốc trừ sâu, diệt cỏ)

Ghi chú: Các chất khá phân cực, các ion có khối lượng nhỏ khó bị lưu giữ trên phatĩnh ít phân cực của sắc ký pha đảo Các ion có thể tác dụng với các thuốc thử là ionđối (trái dấu) có trong pha động, tạo thành cặp ion trung hoà điện và có thể được lưugiữ trên pha tĩnh Đó là cơ sở của phương pháp sắc ký pha đảo tạo cặp ion

Là phương pháp phát triển sớm nhất và được dùng phổ biến Trong phươngpháp này chất tan bị giữ trên bề mặt pha tĩnh tức là chất hấp phụ và bị dung môi đẩy

ra (phản hấp phụ) Sắc ký hấp phụ cũng thường được gọi là sắc ký pha thuận(normal phase)

-Các pha tĩnh và động: pha tĩnh là những bột mịn, xốp, có diện tích bề mặt

riêng lớn (Spherisorb S 10W: 220 m /g) Silicagel và nhôm oxyd là những chất được2

dùng nhiều trong sắc ký hấp phụ nhưng silicagel là chất được ưa dùng hơn cả Ở đâycác chất càng phân cực càng bị lưu giữ mạnh và ra chậm khi rửa giải

Về pha động, dưới đây cho ta một dãy một số các dung môi với sức rửa giảităng dần: Hexan, benzen, cloroform, aceton, butanol, methanol

Dãy này xếp theo khả năng đẩy các chất ra khỏi chất hấp phụ Có thể dùnghỗn hợp vào dung môi theo tỷ lệ thích hợp

4.3 Sắc ký trao đổi ion:

Là phương pháp sắc ký trong đó các nhựa trao đổi ion

- Nhựa trao đổi ion (ionit) Đó là những hợp chất cao phân tử có chứa nhómchức có khả năng trao đổi ion (nhóm trao đổi)

- Nhựa trao đổi cation (cationit) có 2 loại: Cationit acid mạnh có nhóm -SO3H

và được ứng dụng rộng rãi, cationit acid yếu có nhóm - COOH

- Nhựa trao đổi anion (anionit) cũng có 2 loại: Anionit base mạnh có nhómamoni bậc 4 - N(CH3)3+ OH- và anionit yếu có nhóm trao đổi là các amin bậc 2 hay 3 Với cationit có sự trao đổi cation (ví dụ với dung dịch chứa Ca++ )

2RSO3 H- + + Ca++ (R SO3-) 2 Ca++ + 2H+ (1)

cationit (rắn) dung dịch rắn dung dịch

Với anionit, ta có ví dụ:

2R (CH3)3 OH + SO- 4 [ R (CH3)3 ]2 SO4 + 2OH (2)

-Phương pháp này được dung để tách các ion vô cơ và hữu cơ

4.4 Sắc ký lỏng trên gel (size exclusion; sk loại theo cỡ)

Sắc ký loại theo cỡ (size exclusion chromatogrphy) là một phương pháp mớiphát triển và được ứng dụng chủ yếu cho các chất có phân tử lượng lớn

- Chất nhồi cột và các pha: chất nhồi ở đây là các hạt gel.

- Chất nhồi cho sắc ký loại theo cỡ là những hạt xốp của silicagel hay polime có kíchthước nhỏ (khoảng 10 m) Pha tĩnh là dung môi nằm trong các lỗ xốp của hạt, phađộng là dung môi chảy giữa các hạt.

 Các phân tử chất tan có kích thước lớn (bằng cỡ lớn, cỡ trung bình của các lỗxốp) thì sẽ không bị lưu giữ và di chuyển theo dung môi (tức là bị loại)

 Các phân tử nhỏ hơn có thể khuếch tán vào lỗ xốp

 Các phân tử rất nhỏ so với lỗ xốp sẽ đi sâu vào các lỗ này và coi như bị sabẫy, rất khó ra Khi rửa giải các phân tử sẽ lần lượt ra theo cỡ từ lớn đến nhỏ Các gel ưa nước được dùng với pha động và dung dịch nước và phương pháp

được gọi là sắc ký lọc trên gel (gel filtration chromatography) Nếu các gel kỵ nước

thì dùng pha động là các dung môi hữu cơ không phân cực và phương pháp được gọi

là sắc ký thẩm thấu trên gel (gel permeation chromatography)

Có nhiều loại gel với các cỡ lỗ xốp khác nhau dùng để tách các phân tử thuộcdải cỡ khác nhau

5 Ứng dụng của sắc ký trong phân tích

Cần lưu ý là sắc ký chỉ là phương pháp tách, tách tinh tế và rất có hiệu quả,được dùng rất phổ biến để nghiên cứu các thành phần trong một hỗn hợp

Sau khi được tách và đi ra khỏi cột, chúng được đưa tới những detector vàđược phát hiện, được định tính, định lượng dựa trên những đặc tính khác của chúngnhư độ hấp thụ, chiết suất, độ dẫn nhiệt, khối lượng các phân tử hay các mảnh của

nó (tức là trên thực tế chúng được định tính định lượng bằng các kỹ thuật khác nhưquang phổ hấp thụ, phổ huỳnh quang, phổ khối, các phương pháp điện hoá )

5.1 Định tính và thử độ tinh khiết :

Sắc ký được dùng rộng rãi để xác nhận sự có mặt hay vắng mặt các thànhphần của hỗn hợp một số giới hạn các chất mà ta đã biết Ví dụ có thể phát hiện mộtcách khá chắc chắn hơn 30 acid amin trên một sắc đồ phân tích dịch đạm thuỷ phân

Việc định tính một chất dựa vào vị trí của pic của chất đó trên sắc đồ (tức là

dựa vào thời gian lưu tR) Nếu một pic của một chất chưa biết X trên sắc đồ trùng với

vị trí của pic của chất chuẩn A trên sắc đồ trong cùng điều kiện sắc ký, thì có thểchất X đó là A Kết luận X là A chỉ chắc chắn khi tiến hành sắc ký với nhiều hệ phatĩnh và động khác nhau về bản chất nhưng thời gian lưu của X và A luôn luôn bằngnhau

Định tính bằng sắc ký dựa vào tR không cho ta kết quả hoàn toàn chắc chắn.Việc xác nhận một chất không có mặt trong hỗn hợp (vì không có pic tương ứng trênsắc đồ) thường chắc chắn hơn xác nhận sự có mặt một chất Dù sao cũng nên nhớ làpic không xuất hiện có thể do lượng chất quá nhỏ, cũng có thể là do điều kiện đokhông thích hợp (ví dụ chọn nhầm bước sóng mà chất không hấp thụ)

Sắc ký thường được dùng để kiểm tra độ tinh khiết của mẫu thử (không được

có các pic ứng với các tạp chất)

5.2 Định lượng :

Sắc ký là phương pháp rất thuận lợi để định lượng một chất trong hỗn hợp vì

chất đó được tách khỏi các chất khác, và đồng thời được định lượng dựa vào việc đo chiều cao hay diện tích của pic.

Với các pic nhọn thì phương pháp đo chiều cao cho kết quả chính xác hơn Khi pic tù hay lệch thường đo diện tích tốt hơn

Hiện nay hầu hết các máy sắc ký đều có phần mềm cho phép đo diện tích picbằng phương pháp tích phân

Sau đây là một số phương pháp định lượng thường dùng trong sắc ký:

5.2.1 Phương pháp đường chuẩn (Calibration curve).

Phương pháp dùng phổ biến hiện nay là phương pháp đường chuẩn Pha một

số dung dịch chất chuẩn (hay chất đối chiếu) có nồng độ khác nhau đã biết Thôngthường người ta pha 4-6, có thể tới 10 dung dịch Môi trường pha dung dịch chuẩn

có thể là dung môi hay dung dịch có thành phần càng giống môi trường của mẫu thửcàng tốt Nếu môi trường ít có ảnh hưởng thì có thể pha trong dung môi tinh khiếtthích hợp hay trong dung môi pha động của phương pháp sắc ký

Đem các dung dịch chuẩn chạy sắc ký, đo chiều cao hoặc diện tích pic rồi lập

đường chuẩn tức là đường biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích hay chiều cao củapic đối với nồng độ Trên trục tung là chiều cao hay diện tích pic, trên trục hoành lànồng độ hay hàm lượng chất Thông thường người ta sử dụng các đường chuẩn códạng đường thẳng

Sau đó đem chạy sắc ký dung dịch mẫu thử Dựa vào diện tích hay chiều cao

của pic chất thử trên sắc đồ, đối chiếu với đường chuẩn có thể tìm được nồng độchất thử Không được phép ngoại suy (extrapolation), nghĩa là nồng độ dung dịchthử đem chạy sắc ký không được nằm ngoài khoảng các dung dịch chuẩn đem chạy

Trong phương pháp trên, chất chuẩn được gọi là chuẩn ngoại (external

standard) vì nó không được đưa vào trong mẫu thử khi phân tích

5.2.2 Phương pháp dùng chuẩn nội (internal standard).

Trong phương pháp dùng chuẩn ngoại, ta không thể đảm bảo là điều kiện sắc

ký mẫu chuẩn và mẫu thử là như nhau Vì vậy kết quả phân tích dựa vào sự so sánhcác sắc đồ mẫu thử và mẫu chuẩn không chắc đã chính xác Phương pháp chuẩn nộicho độ chính xác cao hơn Chuẩn nội là một chất khác với chất phân tích, cho pic có

vị trí trên sắc đồ gần với chất phân tích và tách khỏi các pic khác (RS > 1,25).Chuẩn nội được thêm vào dung dịch chuẩn ngoại và dung dịch mẫu thử

Đại lượng dùng trong phân tích ở đây sẽ là các tỷ số Se / Si và St / Si hoặc He /

Hi và Ht / Hi

trong đó: Se ,Si và St làcácdiện tích pic chuẩn nội, chuẩn ngoại và chất thử,

: He ,Hi và Ht làcácchiều cao pic chuẩn nội, chuẩn ngoại và chất thử

Phương pháp chuẩn nội có thể cho sai số thấp (có thể đạt tới 0,5 - 1%)

5.2.3 Phương pháp đường chuẩn thêm (Standard addition)

Khi cần định lượng một chất trong một môi trường phức tạp, còn gọi là cónền (matrix) phức tạp, như định lượng một chất trong thịt, người ta thường dùngphương pháp đường chuẩn thêm Trong phương pháp này, ta thêm những lượng chấtchuẩn khác nhau vào ngay trong mẫu thử rồi chạy sắc ký mẫu thử không thêm vàcác mẫu thử có thêm chuẩn Vẽ đường chuẩn diện tích (hay chiều cao) của pic thayđổi theo lượng chuẩn thêm vào Đường chuẩn kéo dài sẽ cắt trục hoành tại điểm ứngvới nồng độ chất cần xác định có trong mẫu thử (xem hình 10 ở dưới đây)

Phương pháp này cho phép loại bớt ảnh hưởng của nền đối với kết quả định lượng

Hình 10.Đường chuẩnthêm

5.2.4

Phương pháp chuẩn hoá (standardization)

Nếu các chất có pic trên sắc đồ của một hỗn hợp đều đáp ứng như nhau đốivới detector thì diện tích Si của pic một chất sẽ cho biết hàm lượng chất đó trong hỗnhợp các chất

i

S

S

trong đó S ilà diện tích pic của chất thứ i trong hỗn hợp,

NĂNG CAO HPLC 2.1 Nguyên tắc chung về phương pháp HPLC

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn vàpha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn) Mẫu phân tích được chuyển lên cột táchdưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bốliên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúcphân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác củachúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khácnhau và tách ra khỏi nhau

 Cấu tạo của hệ thống HPLC Nên chú thích tiếng việt trong hình

Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLCCũng như tất cả các thiết bị sắc ký khác, thiết bị HPLC có thể hình dung gồm 3 phầnchính:

- Phần đầu vào cấp pha động có thành phần mong muốn và mẫu phân tích

- Phần tách: là phần trung gian tâm của hệ sắc ký bao gồm cột tách, đôi khi cócột phụ trợ

- Phần phát hiện và xử lí số liệu: phần này bao gồm các detector, phần bộ phậnkhuếch đại, computer máy tính và phần mềm xử lí số liệu, bộ phận ghi tínhiệu

 Sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm nhiều phương pháp có đặc thù riêng, đó

là sắc ký hấp phụ, sắc ký lỏng pha liên kết; sắc ký trao đổi ion; sắc ký cặpion, sắc ký điện di mao quản; sắc ký phân bố lỏng-lỏng; sắc ký rây phântử Phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất là sắc ký lỏng pha liên kết

2.2 Pha tĩnh trong HPLC

Trong HPLC, pha tĩnh (stationary phase) chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụtách hỗn hợp chất phân tích Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ

3 - 7µm Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha liên

kết thường được chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha

ngược (RP-HPLC)