Nghiên cứu quy trình công nghệ tách chiết và tinh chế Mangostin trong vỏ quả măng cụt Garcinia Mangostnan L. làm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư

làm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư” được thực hiện với mục tiêu: tách chiết và tinh chế -mangostin từ vỏ quả măng cụt và nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của ... Một số nghiên cứu c

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

MAI THỊ HIÊN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ TÁCH CHIẾT

VÀ TINH CHẾ MANGOSTIN TRONG VỎ QUẢ MĂNG CỤT

GARCINIA MANGOSTANA L LÀM THUỐC HỖ TRỢ

ĐIỀU TRỊ UNG THƯ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

MAI THỊ HIÊN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ TÁCH CHIẾT

VÀ TINH CHẾ MANGOSTIN TRONG VỎ QUẢ MĂNG CỤT

GARCINIA MANGOSTANA L LÀM THUỐC HỖ TRỢ

ĐIỀU TRỊ UNG THƯ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐỖ THỊ TUYÊN

Đề tài được thực hiện tại phòng CNSH Enzyme, Viện CNSH

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC HÌNH v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

1.1 Giới thiệu cây măng cụt 2

1.1.1 Sự phân bố của cây măng cụt 2

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây măng cụt 2

1.2 Các hợp chất xanthone có trong vỏ quả măng cụt 3

1.2.1 Cấu trúc hợp chất xanthone 3

1.2.2 Một số dẫn xuất xanthone quan trọng trong vỏ quả măng cụt 4

1.3 Hoạt tính sinh học của mangostin và các dẫn xuất xanthone khác 6

1.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn 6

1.3.2 Hoạt tính kháng nấm 7

1.3.3 Hoạt tính kháng viêm 7

1.3.4 Hoạt tính chống oxi hóa 8

1.3.5 Hoạt tính chống ung thư 8

1.4 Peroxidase 10

1.5 Peroxy hóa lipid 12

1.6 Giới thiệu một số vi sinh vật gây bệnh ở người 13

1.6.1 Staphylococcus aureus 13

1.6.2 Pseudomonas aeruginosa 13

1.6.3 Candida albicans 14

1.7 Tình hình nghiên cứu mangostin 15

1.7.1 Trên thế giới 15

1.7.2 Ở Việt Nam 17

1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2 CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18

2.1 Nguyên liệu và hóa chất 18

2.1.1 Nguyên liệu 18

2.1.1.1 Chủng vi sinh vật 18

2.1.1.2 Động vật thí nghiệm 18

2.1.1.3 Nguyên liệu thực vật 18

2.1.2 Hóa chất 18

2.2 Các thiết bị thí nghiệm 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Tách chiết -mangostin và xác định cấu trúc 20

2.3.2 Tối ưu điều kiện tách chiết 21

2.3.2.1 Tối ưu dung môi 21

2.3.2.2 Tối ưu tỷ lệ dung môi chiết 21

2.3.2.3 Tối ưu thời gian tách chiết 22

2.3.2.4 Tối ưu nhiệt độ tách chiết 22

2.3.3 Các phương pháp tinh sạch 22

2.3.3.1 Tinh sạch bằng tách phân đoạn 22

2.3.3.2 Tinh sạch bằng sắc kí cột 22

2.3.4 Sắc kí bản mỏng 23

2.3.5 Xác định làm lượng malondialdehyde 23

2.3.6 Xác định hoạt độ peroxidase 24

2.3.7 Định lượng protein 24

2.3.8 Xác định khả năng ức chế vi sinh vật 25

2.3.9 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa của  -mangostin……… 26

2.3.9.1 Phương pháp thử nghiệm trên chuột 26

2.3.9.2 Phương pháp lấy mẫu gan 27

2.3.10 Xử lý số liệu 27

3.1 Tách chiết và tinh sạch -mangostin từ vỏ quả măng cụt 28

3.1.1 Tối ưu điều kiện tách chiết 28

3.1.1.1 Tối ưu dung môi chiết 28

3 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1.1.2 Tối ưu tỷ lệ dung môi 29

3.1.1.3 Tối ưu thời gian chiết 29

3.1.1.4 Tối ưu nhiệt độ tách chiết 30

3.1.2 Tinh sạch -mangostin 31

3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của -mangostin 33

3.2.1 Hoạt tính kháng S aureus 33

3.2.2 Hoạt tính ức chế sự sinh trưởng của P aeruginosa 34

3.2.3 Hoạt tính ức chế Candida albicans 34

3.3 Hoạt tính chống oxi hóa của -mangostin 35

3.3.1 Trọng lượng cơ thể chuột ở các nhóm nghiên cứu 35

3.3.2 Khả năng bảo vệ gan của α-mangostin dưới tác dụng của CCl4 37

3.3.3 Ảnh hưởng của -mangostin lên hoạt độ peroxidase trong gan chuột……… 39

3.3.4 Ảnh hưởng của -mangostin lên hàm lượng MDA trong gan chuột………… 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC 48

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Quả măng cụt 2

Hình 1.2 Cấu trúc khung xương của phân tử xanthone 4

Hình 1.3 Cấu tạo hóa học của một số xanthone từ vỏ quả măng cụt 5

Hình 1.4 Cơ chế xúc tác phản ứng của peroxidase 10

Hình 1.5 Cấu trúc nhân hem của peroxidase 11

Hình 1.6 Hình dạng vi khuẩn Staphylococcus aureus 13

Hình 1.7 Hình dạng vi khuẩn P aeruginosa 14

Hình 1.8 Hình dạng nấm C albicans 14

Hình 2.1 Qui trình tách chiết và tinh chế -mangostin 21

Hình 2.2 Đường chuẩn peroxidase 24

Hình 2.3 Đường chuẩn Bradford với BSA làm chuẩn 25

Hình 3.1 Tối ưu dung môi chiết 28

Hình 3.2 Tối ưu tỷ lệ dung môi chiết 29

Hình 3.3 Tối ưu thời gian chiết 30

Hình 3.4 Tối ưu nhiệt độ tách chiết 30

Hình 3.5 Kiểm tra độ sạch của sản phẩm -mangostin tinh sạch 31

Hình 3.6 Hoạt tính kháng S aureus của -mangostin 33

Hình 3.7 Hoạt tính ức chế sinh trưởng P aeruginosa 34

Hình 3.8 Hoạt tính ức chế nấm C albicans của -mangostin 35

Hình 3.9 Sự thay đổi trọng lượng cơ thể chuột trong quá trình thí nghiệm 36

Hình 3.10 Hình ảnh thể gan ở các nhóm chuột nghiên cứu 37

Hình 3.11 Sự thay đổi trọng lượng gan chuột ở các nhóm nghiên cứu 38

Hình 3.12 Hoạt độ peroxidase trong gan chuột dưới tác dụng của -mangostin 39

Hình 3.13 Sự thay đổi hàm lượng MDA trong gan dưới tác động của -mangostin 41

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Danh sách hóa chất chính được sử dụng trong thí nghiệm 19

Bảng 2.2 Thành phần các loại đệm và dung dịch 19

Bảng 2.3 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 19

Bảng 2.4 Các thiết bị thí nghiệm 20

Bảng 2.5 Các nhóm chuột xử lí hóa chất 26

Bảng 3.1 Tỷ lệ sản phẩm tách chiết so với nguyên liệu thô 32

Bảng 3.2 Trọng lượng chuột trước và sau thí nghiệm 36

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của -mangostin lên tỷ lệ trọng lượng gan/trọng lượng cơ thể 38

Bảng 3.4 Hoạt độ peroxidase trong gan chuột 39

Bảng 3.5 Hàm lượng MDA trong gan chuột dưới tác dụng của -mangostin 41

SDS Sodium dodecyl sulfate

SOD Superoxide dismutase

MỞ ĐẦU

Ung thư là mối nguy hiểm không thể kiểm soát của xã hội loài người hiện nay Cuộc chiến chống ung thư được chính thức bắt đầu cách đây hơn 40 năm Cho đến nay, Viện ung thư quốc gia Mỹ đã dùng đến 90 tỉ USD cho cuộc chiến phòng chống ung thư [11] Theo dự đoán của Tổ chức Y tế Thế giới, từ năm 2007 đến 2030 số ca

tử vong sẽ tăng từ 7,5 triệu người lên đến 11,5 triệu người, số người mới mắc ung thư trong giai đoạn này sẽ tăng từ 11,3 triệu người lên đến 15,5 triệu người

Ở Việt Nam, tỷ lệ người mắc ung thư khá cao Theo Nguyễn Bá Đức và cộng sự, trong giai đoạn từ 1/1/2001 đến 31/12/2004 có 32,944 ca ung thư mới mắc được ghi nhận tại 5 tỉnh: Hải Phòng, Hà Nội, Thái Nguyên, Thừa Thiên Huế, Cần Thơ (http://benhvienk.com)

Hiện nay, các nhà khoa học đã và đang tập trung nghiên cứu, tìm các hợp chất

có khả năng ngăn chặn tác dụng của các tác nhân gây ung thư, giúp loại bỏ nguy cơ ung thư Trong đó, các hợp chất từ tự nhiên, chủ yếu từ thực vật đang được quan tâm đặc biệt nhờ ưu điểm ít gây tác dụng phụ như các hợp chất hóa học tổng hợp Các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên như vinblastine từ lá cây dừa cạn

(Catharanthus roseus), taxol của cây thông đỏ (Taxus brevifolia), colchicine từ cây tỏi độc (Colchicum autunale), scutebalcaletone từ cây bán chi liên (Scutellaria barbata), một số hoạt chất từ lá cây chè xanh (Camellia sinensis), đã

được sử dụng để điều trị cho các bệnh nhân ung thư Trong khi đó, măng cụt

Garcinia mangostana L là cây ăn quả được trồng khá nhiều ở miền Nam, Việt

Nam Theo kinh nghiệm dân gian, vỏ quả măng cụt còn có thể được dùng để điều trị nhiều loại bệnh nhiễm trùng Tuy nhiên việc khai thác và ứng dụng các hoạt chất sinh học từ vỏ cây măng cụt ở nước ta vẫn chưa được quan tâm nhiều

Xuất phát từ thực tế đó đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệ tách chiết và tinh chế mangostin trong vỏ quả măng cụt Garcinia mangostana L làm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư” được thực hiện với mục tiêu: tách chiết và tinh chế -mangostin từ

vỏ quả măng cụt và nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của 

1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu cây măng cụt

1.1.1 Sự phân bố của cây măng cụt

Măng cụt có tên khoa học là Garcinia mangostana L thuộc họ Bứa

(Clusiaceae), là loại cây ăn quả được trồng ở các vùng khí hậu nhiệt đới, đặc biệt phổ biến nhất ở vùng Đông Nam Á, Ấn Độ, Sri Lanka Ở Việt Nam măng cụt chủ yếu được trồng ở vùng đồng bằng sông Cửu Long với tổng diện tích lên tới

4900 ha, cho sản lượng khoảng 4500 tấn Theo dự án phát triển sản xuất và xuất khẩu rau, hoa quả tươi của Việt Nam, dự kiến phát triển diện tích trồng măng cụt ở vùng đồng bằng sông Cửu Long lên khoảng 11300 ha, cho sản lượng 24000 tấn Trong đó tập trung trồng chủ yếu tại các tỉnh Bến Tre, Vĩnh Long, Trà Vinh và Bình Dương Măng cụt đòi hỏi điều kiện thổ nhưỡng khắt khe, khí hậu nóng và ẩm Do

đó, cây măng cụt chỉ phân bố ở các vùng có khí hậu ấm áp, không tiến xa ra vùng khí hậu lạnh phía bắc mà chỉ dừng lại ở Huế

Hình 1.1 Quả măng cụt

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây măng cụt

Măng cụt thuộc loại thân gỗ vừa có chiều cao 12-25 m, thân có nhiều nhánh đối chéo nhau và nằm ngang, nhựa cây màu vàng Thân non màu xanh lục, thân già màu nâu đen sẫm, sần sùi có nhiều rãnh nứt dọc, tiết diện tròn Lá đơn, mọc đối, không có lá kèm Phiến lá bóng, dày và dai, hình elip thuôn dài, gốc gần tròn, mũi

nhọn, màu xanh lục mặt trên đậm hơn mặt dưới, bìa nguyên, dài 19-22 cm, rộng 8-10 cm Gân lá hình lông chim, gân chính nổi rõ ở hai mặt, gân phụ dày đặc có khoảng 40-50 cặp song song khít nhau Cuống lá hình trụ phẳng ở mặt trên và hơi phình ở đáy, có nhiều sọc ngang lồi lõm, màu xanh, dài 2-2,5 cm Hoa mọc riêng rẽ hoặc 2-3 hoa ở nách lá hay đầu cành Hoa đều, lưỡng tính, có màu trắng hoặc hồng nhạt Cuống hoa ngắn hơi phình ở gốc, màu xanh, mặt ngoài có nhiều khía dọc, tiết diện đa giác, dài 0,8-1 cm Quả hình cầu có đường kính khoảng 4-7 cm, vỏ ngoài màu đỏ tím dày cứng, trong đỏ tươi như rượu vang, dày xốp, phía dưới có lá đài, phía đỉnh có đầu nhụy Trong quả có từ 6-10 hạt, quanh hạt có áo ăn được Măng cụt thường ra hoa vào khoảng tháng hai đến tháng năm, tạo quả từ tháng năm cho đến tháng tám Cây lớn rất chậm, sau hai, ba năm cây chỉ cao đến đầu gối, chỉ bắt đầu cho quả sau 10-15 năm

1.2 Các hợp chất xanthone có trong vỏ quả măng cụt

Từ rất lâu, vỏ quả măng cụt được sử dụng làm thuốc trong y học Trung Quốc và

Ấn Độ Vỏ quả măng cụt khô được dùng để trị tiêu chảy, kiết lỵ, chữa đau bụng, làm khô vết thương, chống nhiễm trùng da [30], trị mụn trứng cá, chữa lở loét mãn tính, nước sắc vỏ quả được dùng làm dung dịch vệ sinh phụ nữ Một số nghiên cứu chỉ ra rằng các hợp chất có trong vỏ quả măng cụt còn có khả năng kìm hãm sự phát triển khối u [40], chống oxi hóa [22], có khả năng kháng lại một số vi khuẩn như

Staphylococcus aureus, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Escherichia coli, Vibrio cholerae Theo một số nghiên cứu hóa sinh thực vật, trong vỏ quả măng cụt

có chứa một số hợp chất thứ sinh như tannin, chrysanthemin, resin, garcinone, gartanin, vitamin B1, B2, C, các hợp chất có hoạt tính sinh học, và đặc biệt đáng chú ý là các dẫn xuất của xanthone [38, 46]

1.2.1 Cấu trúc hợp chất xanthone

Xanthone là hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa mạnh, thậm chí còn mạnh hơn

cả vitamin E và vitamin C Xanthone có cấu trúc dạng mặt phẳng gồm các vòng

chính của phân tử Khung xương chính này được nối với các mạch bên khác nhau tạo thành nhiều loại xanthone có đặc tính vật lý, hóa học, sinh học khác nhau

Hình 1.2 Cấu trúc khung xương của phân tử xanthone

1.2.2 Một số dẫn xuất xanthone quan trọng trong vỏ quả măng cụt

Măng cụt là loài thực vật giàu các dẫn xuất xanthone nhất được phát hiện cho đến nay Trong số hơn 200 dẫn xuất xanthone được tìm thấy ở thực vật thì có đến

60 dẫn xuất ở măng cụt, chủ yếu tập trung ở phần vỏ quả [16] Trong số các dẫn xuất xanthone có trong vỏ quả măng cụt thì -mangostin có hàm lượng cao nhất, chiếm khoảng 0,02-0,2% trọng lượng khô Tiếp đến là -mangostin và -mangostin, chiếm khoảng 0,016-0,07% Hàm lượng của các chất gacinone, đặc biệt là garcinone E chiếm khoảng 0,01-0,035%, đây là một chất có hoạt tính ức chế mạnh

sự phát triển của nhiều loại tế bào ung thư, cho nên đang được nhiều nhà khoa học quan tâm [33, 39] Hiện nay, các dẫn xuất xanthone từ măng cụt, đã và đang được các nhà khoa học quan tâm nhờ các hoạt tính sinh học quan trọng, đặc biệt là hoạt tính chống ung thư, nhằm mục đích tìm ra hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên làm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư

Hình 1.3 Cấu tạo hóa học của một số xanthone từ vỏ quả măng cụt [22]

Garcinone E

Mangostinone

Garcinone D Cudraxanthone G Garcimangosone B

8-Hydroxycudraxanthone G 8-Deoxygartanin 1-Isomangostin

Mangostingone Gartanin

Smeathxanthone A Tovophyllin A

-Mangostin -Mangostin -Mangostin

1.3 Hoạt tính sinh học của mangostin và các dẫn xuất xanthone khác

Mangostin và các dẫn xuất xanthone khác từ vỏ quả măng cụt có một số hoạt tính sinh học như kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxi hóa, kháng viêm, chống ung thư Cơ chế hoạt động của các hợp chất này đang là một lĩnh vực rộng mở cho các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu

1.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn

Mangostin và các dẫn xuất xanthone khác có trong vỏ quả măng cụt có khả năng diệt khuẩn khá mạnh Theo nghiên cứu của Pothitirat và cộng sự (2009) thì

mangostin có khả năng kháng lại P acnes, một loại vi khuẩn gram dương tồn tại

trên bề mặt da của con người với nồng độ MIC là 1,95 g/ml [34] Đây là loài vi khuẩn được biết đến như là một tác nhân góp phần gây nên triệu chứng mụn trứng

cá Ngoài ra, P acnes còn liên quan đến một số bệnh viêm nhiễm như nhiễm trùng

khớp chân, tay giả; nhiễm trùng hệ thần kinh trung ương; viêm màng trong của tim; nổi hạch ở phổi gan; viêm màng bao mắt sau phẫu thuật; viêm tủy xương; viêm phế

nang dị ứng [20] Vi khuẩn P acnes còn được tìm thấy ở tuyến tiền liệt của người

viêm tuyến này, và được dự đoán có liên quan đến nguyên nhân gây ung thư tuyến tiền liệt [13]

Mangostin có thể hạn chế sự phát triển của một số vi khuẩn kháng lại kháng sinh, những vi khuẩn này có nguy cơ gây bệnh không thể kiểm soát đối với người

đã điều trị bằng loại kháng sinh đó trong thời gian dài Iinuma và cộng sự (1996) đã

đề cập khả năng hạn chế sự phát triển S aureus kháng methicillin của mangostin,

khả năng này được tăng lên khi kết hợp với hoạt động của vancomycine [19] Trong nghiên cứu của Sakagami và cộng sự (2005) đã chỉ ra rằng mangostin có khả năng

chống lại vi khuẩn Enterococci kháng vancomycin ở nồng độ MIC là 6,25 g/ml và

chống lại S aureus kháng methicillin với nồng độ MIC 6,25-12,5 g/ml [37] Hoạt tính sinh học này của mangostin góp phần vào kiểm soát sự nhiễm trùng do

Enterococci và S aureus gây ra

Như vậy, mangostin và các dẫn xuất xanthone khác có trong vỏ quả măng cụt có

thể có khả năng giúp cơ thể người kháng lại một số bệnh do vi khuẩn, ngăn chặn nguy cơ bùng phát dịch bệnh do xuất hiện các vi sinh vật kháng kháng sinh gây ra 1.3.2 Hoạt tính kháng nấm

Các hợp chất xanthone được tách chiết từ vỏ quả măng cụt có khả năng kháng một số loại nấm gây bệnh ở thực vật, là nguyên nhân gây thiệt hại cho mùa màng

như F oxysporum, A tenuis, D oryzae [18] Ngoài ra, -mangostin còn có khả

năng kháng lại nấm C albicans, một loại nấm gây bệnh răng miệng cho người và

động vật ở nồng độ MIC 1000 g/ml và nồng độ MFC 2000 g/ml Cơ chế kháng nấm của mangostin và các dẫn xuất của xanthone hiện nay vẫn chưa được làm rõ Người ta dự đoán rằng có thể các hợp chất này đã tấn công vào cấu trúc và chức năng của tế bào nấm, đặc biệt là ergosterol, là loại lipid quan trọng nhất trong màng

tế bào nấm, mà không có ở màng tế bào động vật [10]

1.3.3 Hoạt tính kháng viêm

Bệnh viêm mũi dị ứng và bệnh hen suyễn, viêm da có liên quan đến sự đáp ứng miễn dịch, được qui định bởi kháng nguyên đặc biệt ở tế bào T-CD4, bạch cầu ái toan và các tế bào mast Các chất trung gian gây ra phản ứng viêm ở giai đoạn sớm

là histamine và serotonin, ở giai đoạn muộn là các phân tử prostaglandin, lymphokine và monokine

Trong nghiên cứu của Nakatani và cộng sự (2002), đã chứng minh rằng cao chiết xanthone từ vỏ quả măng cụt có khả năng ức chế quá trình giải phóng histamine và tổng hợp prostaglandin E2 Do đó, vỏ quả măng cụt có thể được sử dụng sản xuất thuốc chống dị ứng và kháng viêm [30] Bumrungpert và cộng sự (2010) đã chứng minh rằng -mangostin và -mangostin có thể ức chế hoạt động của LPS (lipopolysaccharide có trong plasma ở người béo phì) lên sự biểu hiện của các gen qui định protein-enzyme liên quan đến phản ứng viêm và kháng insulin ở đại thực bào Hai dẫn xuất xanthone có từ vỏ quả măng cụt này có thể làm suy giảm khả năng cảm ứng biểu hiện interleukin-6, yếu tố gây hoại tử (TFN) [12]

1.3.4 Hoạt tính chống oxi hóa

Các gốc tự do là một sản phẩm tất yếu của các quá trình sinh lý sinh hóa trong

cơ thể Sự tăng quá mức số lượng các gốc tự do làm cho hệ thống chống oxi hóa của

tế bào không đáp ứng được sẽ gây ra sự phá hủy protein, DNA, chất béo, gây tổn thương tế bào và quá trình trao đổi chất, đẩy nhanh quá trình lão hóa và gây ra ung thư

Williams và cộng sự (1995) đã chứng minh rằng mangostin có khả năng hoạt động như một chất thu dọn các gốc tự do để ngăn chặn sự phá hủy của các gốc tự do lên LDL (Low density lipoprotein) trong ống nghiệm [44] Phân tử LDL rất dễ bị tấn công bởi các gốc tự do, chuyển thành các dạng biến thể khác nhau, là nguyên nhân gây ra bệnh xơ vữa động mạch, tăng tích lũy cholesterol trong máu [41] Từ nghiên cứu này cho thấy mangostin có thể được sử dụng làm thuốc trong chống xơ vữa động mạch, giảm tỷ lệ bệnh tim mạch ở người

Trong một nghiên cứu khác, Sun và cộng sự (2009) đã chỉ ra rằng mangostin có thể trung hòa được các gốc hydroxyl tự do, superoxide anion, ức chế sự hình thành MDA (malondialdehyde) trong quá trình nuôi cấy tế bào bạch cầu [42]

1.3.5 Hoạt tính chống ung thư

Đã có rất nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng chống ung thư của mangostin

và các dẫn xuất xanthone có trong măng cụt Matsumoto và cộng sự (2004) đã nghiên cứu các cơ chế liên quan đến hoạt tính kích thích lên quá trình chết theo chu trình của tế bào ung thư máu HL60 ở người của mangostin Trong các tế bào ung thư được điều trị với mangostin, xuất hiện sự hoạt động của caspase-9 và caspase-3 (cystein-aspartate protease, là loại protein quan trọng cho quá trình chết theo chu trình của tế bào) nhưng caspase-8 thì không có Từ kết quả này, tác giả đã đưa ra giả thuyết rằng mangostin có thể có tác dụng gián tiếp lên các quá trình chuyển hóa trong ty thể để gây chết theo chu trình của tế bào Các yếu tố liên quan đến sự rối loạn chức năng của ty thể như sự căng phồng, khả năng mất màng của ty thể, suy giảm năng lượng ATP, tích tụ gốc tự do trong tế bào xuất hiện sau 1-2 giờ điều trị

bằng mangostin Mặt khác không thấy dấu hiệu cho thấy sự ảnh hưởng của mangostin lên họ protein BCL-2 và hoạt động của MAP-kinase, điều này cho thấy mangostin ưu tiên tấn công vào ty thể ở giai đoạn sớm gây ra sự chết theo chu trình của tế bào ung thư máu HL60 [25]

Nghiên cứu của Nakagawa và cộng sự (2007) đã chứng minh rằng -mangostin

có thể gây biến dạng và gây chết tế bào ung thư ruột kết DLD-1 ở nồng độ 20 mol Khi nuôi tế bào ung thư trong môi trường có chứa -mangostin tác giả đã quan sát thấy, không có sự hoạt động của các caspase trong tế bào, các endonuclease-G được giải phóng ra từ ty thể với sự giảm điện thế màng Hàm lượng phospho-Erk1/2 (MAP kinase) được tăng lên ở giai đoạn sớm (sau 1 giờ điều trị với mangostin) sau

đó giảm xuống và tăng lên ở giai đoạn muộn Ngoài ra hàm lượng phospho-Akt giảm mạnh sau 6 giờ điều trị Hàm lượng microRNA-143 điều khiển ngược âm quá trình dịch mã của Erk5 tăng dần cho đến 24 giờ điều trị [29]

Shibata và cộng sự (2011) đã chứng minh rằng mangostin từ vỏ quả măng cụt có thể gây chết một số dạng tế bào ung thư ở trong cơ thể Chuột BALB/c được gây ung thư vú bằng cách tiêm tế bào di căn BJMC3879luc2 mang đột biến p53 Sau khi được điều trị bằng -mangostin hàng ngày với hàm lượng 20 mg/kg trọng lượng cơ thể có tỷ lệ sống sót cao hơn so với chuột không được điều trị Ngoài ra, khối lượng khối u và sự da dạng của các tế bào bạch huyết di căn ở hạch bạch huyết được ức chế đáng kể Khi nghiên cứu trong ống nghiệm, α-mangostin gây ra quá trình chết theo chu trình của các tế bào ở trung kì và ngừng pha G1, ức chế pha S trong chu kỳ

tế bào Vì thế, có thể kết luận rằng, -mangostin có khả năng kích thích sự chết theo chu trình và ức chế sự phát triển, hạn chế sự di căn của tế bào ung thư Từ phát hiện này đã mở ra một hướng mới trong điều trị lâm sàng đối với các bệnh nhân ung thư,

và trong quá trình bổ sung tá dược vào thuốc điều trị ung thư [40] Như vậy, cơ chế tác động của -mangostin lên các tế bào ung thư chủ yếu là thông qua các hoạt động ở ty thể nhằm gây ra sự biến dạng và quá trình chết theo chu trình của các tế bào này

1.4 Peroxidase

Gốc tự do nội sinh là một sản phẩm tất yếu của quá trình sinh lý và sinh hóa tế bào Gốc tự do cũng là vũ khí tiêu diệt các vật thể lạ xâm nhập vào cơ thể Tuy nhiên, số lượng gốc tự do nội sinh tăng lên một cách bất thường, vượt qua sự kiểm soát của hệ thống chống oxi hóa của cơ thể sẽ dẫn đến một số bệnh nghiêm trọng Khi đó, các gốc tự do nội sinh sẽ tấn công, gây phá vỡ cấu trúc các protein, DNA của tế bào, làm rối loạn sự kiểm soát quá trình phiên mã, dịch mã, và chết theo chu trình tế bào, có thể dẫn đến căn bệnh ung thư Đối với gốc O2● được sinh ra từ O2trong chuỗi vận chuyển điện tử sẽ bị SOD phân hủy, tuy nhiên quá trình phân giải này lại tạo ra nhiều phân tử H2O2 mà nó cũng là chất độc đối với tế bào Vì vậy, việc loại bỏ H2O2 là rất cần thiết, đảm bảo các hoạt động nội bào diễn ra bình thường Peroxidase sử dụng H2O2 như là một chất nhận điện tử xúc tác cho nhiều phản ứng oxy hóa khử khác nhau trong đó H2O2 bị khử thành H2O

Peroxidase là một nhóm enzyme xúc tác các phản ứng oxy hóa khử :

Phức hợp II

Oxi hóa

(2) (3)

Hầu hết các peroxidase có cùng cơ chế xúc tác phản ứng phân giải H2O2 Peroxidase bị oxi hóa bởi các peroxide (H2O2) tạo thành phức hợp PorFe4+=O (Phức hợp I), giải phóng ra một phân tử H2O Tính đặc hiệu cơ chất của enzyme trong sự tạo thành phức hợp I rất cao Các peroxide như H2O2, methyl hydrogen peroxide, ethyl hydrogen peroxide chỉ có thể tương tác với peroxidase mới tạo thành phức hợp hoạt động (phức hợp I) Tính đặc hiệu của các phức hợp cơ chất-enzyme này đối với chất cho hydrogen ở giai đoạn 2 và 3 là khá thấp (Hình 1.4), nên chúng có thể phản ứng với nhiều cơ chất hữu cơ (AH2) khác như ferrocyanide, indophenol, aminophenol, 4-aminoantipyrine, leucodye, cytochrome C và một số amino acid tạo thành phức hợp II, sau đó giải phóng enzyme về dạng ban đầu [43]

Những peroxidase khác nhau có mức độ oligomer khác nhau, như myeloperoxidase (MPO), lactoperoxidase (LPO) là homodimer, horseradish peroxidase (HRP) là homoheptamer Tuy nhiên hầu hết các monomer của peroxidase có 10 dải xoắn  đối song và chứa một nhân hem nằm giữa đầu N và đầu C tận cùng Đầu C tận cùng mang phối tử thứ 5 liên kết với ion Fe là gốc histidine chứa vòng imidazol nằm vuông góc với mặt phẳng porphyrin heme, vòng này còn có một nguyên tử N khác tham gia hình thành liên kết hydrogen với nhóm cacboxyl của gốc aspartate (Hình 1.5)

Hình 1.5 Cấu trúc nhân hem của peroxidase

(http://chemwiki.ucdavis.edu)

Cũng như catalase và superoxide dismutase, peroxidase là enzyme chống oxy hóa quan trọng trong hệ thống sinh học Chúng có vai trò chính là giải độc tế bào bằng cách chuyển hóa H2O2 thành H2O Peroxidase còn tham gia vào những phản ứng sinh hóa quan trọng khác trong cơ thể như chuyển hóa và tổng hợp lignin, sinh tổng hợp thành tế bào và một số hormone như PG (prostaglandin), thyroxine, ethylene, tham gia vào quá trình trao đổi IAA (indole-3-acetic acid), quá trình phân hủy auxin Ngoài ra, peroxidase còn có vai trò chống lại các tác nhân gây bệnh xâm nhiễm vào tế bào và mô, đáp ứng bảo vệ những tổn thương [3]

1.5 Peroxy hóa lipid

Peroxy hóa lipid là quá trình oxy hóa các phân tử lipid có chứa nối đôi trong mạch carbon Lipid peroxide là những sản phẩm không chứa gốc tự do được dẫn xuất từ acid béo, phospholipid, glycolipid, cholesterol có chứa nối đôi trong mạch carbon Sự hình thành các sản phẩm này xảy ra trong các phản ứng oxy hóa do enzyme xúc tác hoặc phản ứng quang oxy hóa và tự oxy hóa mà không cần enzyme xúc tác, nhưng đều có liên quan đến các gốc tự do Sản phẩm peroxy hóa sơ cấp là những phân tử peroxide chứa nối đôi có thể chuyển thành dạng liên hợp Các sản phẩm này có thể bị biến đổi thành phân tử lớn hơn nhờ quá trình dimer hóa Quá trình peroxy hóa lipid bị ức chế bởi các chất chống oxy hóa: -tocopherol, ascorbate, formate, β-caroten, manitol, vitamin E, cấu trúc phân tử sẽ chuyển hóa thành sản phẩm peroxy hóa thứ cấp, hoặc là những phân tử nhỏ hơn bởi sự phân cắt liên kết C-C (hydrocarbon, aldehyde, epoxide)

MDA cũng có thể được tạo ra từ tiền chất PG (prostaglandin) bằng phản ứng xúc tác enzyme như thromboxane synthetase tổng hợp MDA từ PG endoperoxide MDA có thể tham gia phản ứng tạo thành sản phẩm cộng với amino acid tự do hay với protein để hình thành những liên kết ngang trong những phân tử protein này, khi

đó có thể cảm ứng gây biến đổi mạnh mẽ những đặc tính hóa sinh của chúng

Hiện nay MDA được coi là chất chỉ thị quan trọng để đánh giá mức độ ảnh hưởng và tốc độ phản ứng peroxy hóa lipid diễn ra trong tế bào, cũng như có thể

xác định được hàm lượng các gốc tự do, từ đó cho thấy mức độ, tính chất nguy hại của những tác nhân lạ được đưa vào cơ thể sinh vật

1.6 Giới thiệu một số vi sinh vật gây bệnh ở người

1.6.1 Staphylococcus aureus

Hình 1.6 Hình dạng vi khuẩn Staphylococcus aureus

(http://en.wikipedia.org)

Staphylococcus aureus hay tụ cầu vàng là chủng vi khuẩn bắt màu gram (+),

đứng thành đám như chùm nho, không sinh bào tử, thường không có vỏ (Hình 1.6)

Tụ cầu vàng thuộc loại dễ nuôi cấy, phát triển được ở 10-45C và nồng độ muối cao

tới 10% Sinh trưởng được trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí Trên môi trường

thạch thường, tụ cầu vàng phát triển thành khuẩn lạc S, đường kính 1-2 mm, nhẵn Sau 24 giờ ở 37C, khuẩn lạc thường có màu vàng chanh

S aureus thường gây ra mưng mủ ở da và nhiễm trùng mô mềm Sự nhiễm trùng

mô mềm do loài vi khuẩn này gây ra có thể dẫn đến sự xâm nhiễm và gây bệnh nhiễm trùng huyết Sự nhiễm trùng của loài này đối với người và động vật không kích thích sự đáp ứng miễn dịch của hệ thống miễn dịch [36] Hội chứng nhiễm

trùng do S aureus gây ra là một vấn đề đáng lo ngại trong bệnh viện, đặc biệt là

nhiễm trùng hậu phẫu, khi xuất hiện một số chủng có hiện tượng kháng lại kháng sinh

1.6.2 Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (vi khuẩn mủ xanh) là các trực khuẩn gram (-), thẳng

hoặc hơi cong, có một lông roi duy nhất ở một cực (Hình 1.7) Vi khuẩn

P aeruginosa rất dễ nuôi cấy, hiếu khí tuyệt đối, có sinh chất thơm và sắc tố gồm 2

loại: pyocarnin có màu xanh lá mạ, pyoverdin là sắc tố huỳnh quang bắt màu xanh khi chiếu tia cực tím Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng là 37C, nhưng chúng có thể mọc được trong khoảng dao động từ 5 đến 42C; pH thích hợp từ 7,2–7,5

Hình 1.7 Hình dạng vi khuẩn P aeruginosa

(http://int-prop.lf2.cuni.cz; http://lem.ch.unito.it/didattica)

P aeruginosa là một trong những nguyên nhân gây ra nhiễm trùng với phổ vật

chủ rất rộng, có thể là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến tử vong ở bệnh nhân xơ nang

P aeruginosa được phân lập với nhiều dạng biến đổi khác nhau trong phổi của

bệnh nhân bị xơ nang [26]

Nấm C albicans có thể sinh trưởng và gây nhiễm trùng trên bền mặt của khoang miệng, âm đạo và đường tiêu hóa Dạng nhiễm trùng do C albicans gây ra có hai

dạng: nhiễm trùng bề mặt như bệnh tưa miệng, nhiễm nấm ở bề mặt âm đạo; nhiễm

trùng sâu như bệnh viêm cơ tim và nhiễm trùng huyết [28] Cũng như S aureus và

P aeruginosa, C albicans là một trong những nguyên nhân chính gây ra chứng

nhiễm trùng, đặc biệt và nhiễm trùng hậu phẫu

1.7 Tình hình nghiên cứu mangostin

1.7.1 Trên thế giới

Mangostin và các hợp chất xanthone có trong cây măng cụt đã được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Năm 1930, mangostin lần đầu tiên được tách chiết

từ nhựa cây măng cụt và được miêu tả là hợp chất màu vàng [32] Năm 1958, Yates

và cộng sự đã nghiên cứu cấu trúc của mangostin [45] Từ đó cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu các tác dụng sinh học của hợp chất mangostin được công bố

Williams và cộng sự (1995), đã chứng minh rằng mangostin có khả năng bảo vệ phân tử lipoprotein có mật độ thấp (LDL) khỏi sự tấn công của các gốc tự do Nhờ

đó, có thể hạn chế được chứng xơ vữa động mạch do sự biến đổi của phân tử LDL gây ra [44]

Iinuma và cộng sự (1996) đã công bố khả năng hạn chế sự phát triển của

S aureus kháng methicillin bởi mangostin [19] Như vậy, mangostin có thể được sử

dụng làm thuốc có nguồn gốc tự nhiên góp phần vào việc hạn chế các bệnh viêm nhiễm do các vi khuẩn kháng kháng sinh gây nên, ngăn chặn tình trạng mất kiểm soát dịch bệnh

Trong nghiên cứu của Gopalakrishnan và cộng sự (1997) cho thấy các hợp chất xanthone bao gồm mangostin có thể ngăn chặn các loại nấm gây bệnh cho cây nông

nghiệp như F oxysporum, A tenuis, D oryzae [18]

Nakatani và cộng sự (2002), đã chứng minh cao chiết xanthone từ vỏ quả măng

prostaglandin E2, nhờ đó mangostin có tác dụng chống viêm và chống dị ứng [30] Matsumoto và cộng sự (2004) đã chứng minh rằng sự tác động của mangostin lên quá trình chết theo chu trình của tế bào ung thư máu HL60 ở người có liên quan đến các hoạt động sinh hóa trong ty thể Mangostin ưu tiên tấn công lên ty thể nhằm gây ra sự chết theo chu trình của các tế bào này ở giai đoạn sớm [25]

Sakagami và cộng sự (2005) đề cập đến khả năng chống lại vi khuẩn

Enterococci kháng vancomycin ở nồng độ MIC là 6,25 g/ml của mangostin Một lần nữa khẳng định lại kết quả nghiên cứu của Iinuma và cộng sự (1996) về khả

năng chống lại S aureus kháng methicillin với nồng độ MIC 6,25-12,5 g/ml [37] Nakagawa và cộng sự (2007) đã chứng minh rằng -mangotin có thể gây biến dạng và gây chết tế bào ung thư ruột kết DLD-1 ở nồng độ 20 mol Mangostin gây chết tế bào ung thư bằng cách tác động lên ty thể làm giảm điện thế ở màng ty thể [29]

Sun và cộng sự (2009) đã chỉ ra rằng mangostin có thể tham gia vào quá trình bảo vệ cơ thể khỏi các tác nhân oxi hóa bằng cách trung hòa được các gốc hydroxyl

tự do, superoxide anion, ức chế sự hình thành MDA Khả năng này của mangostin được nhận thấy trong quá trình nuôi cấy tế bào bạch cầu K562 [42]

Shibata và cộng sự (2011) đã chứng minh rằng mangostin từ vỏ quả măng cụt có thể gây chết tế bào ung thư ở trong cơ thể chuột bị gây ung thư vú bằng cách tiêm dòng tế bào di căn BJMC3879luc2 mang đột biến p53 Hoạt chất α-mangostin gây

ra quá trình chết theo chu trình của các tế bào ở trung kì, ngừng pha G1 và ức chế pha S trong chu kỳ tế bào Như thế, có thể kết luận rằng, -mangostin có thể kích thích sự chết theo chu trình, ức chế sự phát triển, và hạn chế sự di căn của tế bào ung thư [40]

Như vậy, mangostin có rất nhiều đặc tính sinh học đặc biệt như có khả năng chống oxi hóa, chống ung thư, chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm Các công trình nghiên cứu này góp phần mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng mangostin trong sản xuất thuốc phục vụ cho phòng và chữa bệnh ở người

1.7.2 Ở Việt Nam

Trong các bài thuốc dân gian, măng cụt đã được sử dụng làm thuốc trị các bệnh nhiễm trùng [5] Vỏ quả măng cụt đã được sử dụng làm nguồn nguyên liệu trong quá trình sản xuất thuốc trị bệnh đi ngoài Tuy nhiên, việc nghiên cứu, khai thác và ứng dụng các hợp chất có hoạt tính sinh học trong vỏ quả măng cụt vẫn chưa được chú trọng Cho đến nay, chỉ có một vài nghiên cứu được chính thức công bố, nhưng chỉ dừng lại ở việc tách chiết, và nghiên cứu các đặc tính kháng khuẩn, chống viêm Nguyễn Thị Mai Phương và cộng sự (2004) đã nghiên cứu thành phần polyphenol trong vỏ quả măng cụt và tác dụng ức chế sự sinh acid của vi khuẩn gây

sâu răng S mutants [8] Trương Văn Châu và cộng sự (2004) phát hiện ra các chất

phenol trong dịch chiết ethanol và methanol từ vỏ quả măng cụt có tác dụng kìm

hãm sự phát triển của vi khuẩn P aeruginosa và S aureus [1] Đào Hùng Cường và

cộng sự (2009) đã tinh sạch và xác định được năm dẫn xuất xanthone là gartanin, α-mangostin, 3-isomangostin, BR-xanthone A, garcinon D trong dịch chiết vỏ măng cụt bằng dung môi ethanol từ phổ IR và LC-MS [2] Nguyễn Thị Mai Phương và cộng sự (2010) đã tạo chế phẩm XGC gồm các xanthone có trong vỏ quả măng cụt,

và chứng minh rằng chúng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với các vi khuẩn

gram (+) là S mutans và S aureus, có hoạt tính gây độc mạnh đối với dòng tế bào

ung thư phổi và ung thư máu [7] Cũng trong năm 2010, Đỗ Thị Tuyên và cộng sự

đã tách được α-mangostin từ dịch chiết ethanol của vỏ quả măng cụt sử dụng phương pháp sắc ký cột, hoạt chất -mangostin tinh sạch có khả năng ức chế vi

khuẩn B subtilis XL62 [9]

2 CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Nguyên liệu và hóa chất

2.1.1 Nguyên liệu

2.1.1.1 Chủng vi sinh vật

Chủng P aeruginosa JN 592444.1 được cung cấp bởi Phòng Vi sinh vật đất,

Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Chủng S aureus được cung cấp bởi Phòng Vi sinh vật, Khoa Sinh học, Trường

Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Chủng nấm C albicans ATCC 10231 được mua từ bảo tàng giống chuẩn Mỹ,

10801 University Boulevard Manassas, VA 20110, USA

2.1.1.2 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng, giống đực, thuần chủng, dòng Swiss, trưởng thành, khỏe mạnh, trọng lượng 22  2 g (n = 72) được cung cấp từ Ban chăn nuôi Học viện Quân Y

2.1.1.3 Nguyên liệu thực vật

Vỏ quả măng cụt được thu thập từ các khu vực ở Hà Nội Nguyên liệu được sấy khô trong tủ ấm ở 60C, nghiền thành bột mịn Bảo quản ở điều kiện khô ráo, thoáng mát

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết, được mua từ các hãng hóa chất có uy tín Một số hóa chất chính được liệt kê ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh sách hóa chất chính được sử dụng trong thí nghiệm

Tên hóa chất Hãng sản xuất (nước)

Cao nấm men, peptone, Tris-base ICN (Mỹ)

-Mangostin chuẩn Chromadex (Mỹ)

Dichlomethane, methanol, ethanol, ethyl acetate, ether

petroleum, n-butanol, pyridin

Trung Quốc

n-hexane, silica gel, EDTA Scharlau Chemie S.A (Châu Âu) Peroxidase chuẩn, 3,3´-5,5´-tetramethyl benzidine Sigma (Mỹ)

Thiobarbituric acid Merck (Pháp)

Chloroform, acetone Merck (Đức)

Các loại đệm và dung dịch sử dụng trong thí nghiệm được pha theo các bài thực hành chuẩn có thành phần và nồng độ được tóm tắt ở bảng 2.2

Bảng 2.2 Thành phần các loại đệm và dung dịch

Dung dịch Thành phần, nồng độ

Dung dịch Bradford gốc 100 ml 95% ethanol, 350 mg serva blue G, 200 ml 88%

phosphoric acid Dung dịch cơ chất H2O2 250 M hydrogen peroxide

Dung dịch SDS 8,1% (w/v) sodium dodecyl sulfate

Dung dịch sulfuric acid 2 N sulfuric acid

Dung dịch TBA 0,8% (w/v) thiobarbituric acid

Dung dịch TMB 0,6% 3,3´-5,5´-tetramethyl benzidine trong DMSO

Đệm sodium acetate 20% sodium acetate; pH 3,5

Đệm sodium acetate 100 mM sodium acetate, 100 mM acetic acid; pH 5,5

Đệm nghiền 100 mM tris HCl; pH 7,4

Thành phần một số môi trường nuôi cấy vi sinh vật được pha theo bảng 2.3

Bảng 2.3 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Môi trường Thành phần (w/v)

Môi trường LB 1% peptone; 0,5% cao nấm men; 1% NaCl; pH 7,5

Môi trường LB đặc 1% peptone; 0,5% cao nấm men; 1% NaCl; pH 7,5; 2% agar

Môi trường MPA 0,3% cao thịt; 1% peptone; 0,5% NaCl; 2% agar

Môi trường YP 2% peptone; 1% cao nấm men

2.2 Các thiết bị thí nghiệm

Bảng 2.4 Các thiết bị thí nghiệm

Tên thiết bị Xuất xứ

Bể ổn nhiệt VS-1205CW Vision (Hàn Quốc)

Box cấy vi sinh vật Clean Bench TCV.02-1

Box cấy vi sinh vật Laminar LB-1234

Trung tâm chuyển giao công nghệ (Việt Nam)

Cân phân tích BL150S Sartorius (Đức)

Máy đo pH-827 Metrohm (Thụy Sỹ)

Máy lắc rung ProvocellTM Esco (Mỹ)

Máy li tâm lạnh CF16RXII Hitachi (Nhật)

Máy li tâm lạnh Hettich Mikro 22R Hettich (Đức)

Máy nuôi lắc Certomat® HK Sartorius (Đức)

Máy quang phổ UV 2500 Labomed (Mỹ)

Máy Voltex OSI Rotolab (Đức)

Nồi khử trùng ES-315 Tomy (Nhật)

Tủ lạnh 4C GR-N45VTV Toshiba (Nhật)

Tủ lạnh sâu -20C VCF-280 Deawoo

Tủ lạnh sâu -84C MDF-192 Sanyo (Nhật)

Tủ ổn nhiệt MIR-162 Sanyo (Nhật)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tách chiết -mangostin và xác định cấu trúc

Hoạt chất -mangostin được tách chiết theo qui trình mô tả ở hình 2.1 Vỏ quả măng cụt được rửa sạch, sấy khô trong tủ ấm 60C, nghiền thành bột mịn Bột măng cụt (100 g) được bổ sung 300 ml 96% ethanol (tỷ lệ dung môi : nguyên liệu 3:1) ủ ở

60C trong 4 giờ Dịch chiết được sấy khô chân không đến khối lượng không đổi, thu cặn, xác định hàm lượng cao chiết ethanol thu được Cao chiết được sử dụng để tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp chiết phân đoạn nhằm loại bớt các hợp chất tan trong nước, sau đó tinh sạch bằng sắc kí cột silica gel Hoạt chất -mangostin được xác định khối phổ, nhận dạng cấu trúc, nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của

-mangostin

Hình 2.1 Qui trình tách chiết và tinh chế -mangostin

2.3.2 Tối ưu điều kiện tách chiết

2.3.2.1 Tối ưu dung môi

Cân 5 g bột măng cụt xay, chiết với 30 ml dung môi phân cực như: petroleum ether, ethyl acetate, ethanol, methanol, ủ ở 50C, 5 giờ Dùng bình định mức chuẩn

về cùng thể tích 30 ml, ly tâm thu dịch Dịch chiết (5 ml) được cho bay hơi đến khối lượng không đổi, cân khối lượng cao chiết, hàm lượng -mangostin trong dịch chiết được kiểm tra trên sắc kí bản mỏng, so sánh tìm ra dung môi chiết thích hợp

2.3.2.2 Tối ưu tỷ lệ dung môi chiết

Trong quá trình sản xuất -mangostin ở qui mô công nghiệp, tỷ lệ dung môi : nguyên liệu không chỉ quyết định đến hiệu suất tách chiết mà còn liên quan

Bột vỏ quả măng cụt

Chiết trong ethanol (96%) trong 4 giờ ở 60  C theo tỉ lệ

1 g nguyên liệu : 3 ml thể tích, rút chân không

nghiên cứu sản xuất chế phẩm ở qui mô phòng thí nghiệm, trước khi sản xuất lượng lớn ở qui mô pilot

Tách chiết -mangostin với các tỷ lệ dung môi : nguyên liệu là 2:1; 3:1; 4:1 (v/w) Kiểm tra hiệu suất chiết để tìm ra tỷ lệ dung môi thích hợp

2.3.2.3 Tối ưu thời gian tách chiết

Bột vỏ măng cụt (2 g) được chiết với tỷ lệ dung môi : nguyên liệu là 3:1, thu dịch chiết theo thời gian khác nhau Dịch chiết được thu theo giờ, xác định lượng cao chiết, kiểm tra hàm lượng -mangostin bằng phương pháp sắc kí bản mỏng Từ

đó, xác định thời gian chiết tối ưu

2.3.2.4 Tối ưu nhiệt độ tách chiết

Bột vỏ măng cụt (2 g) được chiết với tỷ lệ dung môi : nguyên liệu là 3:1, ủ ở các nhiệt độ 30C, 40C, 50C, 60C Dịch chiết sau 4 giờ chiết được chuẩn về cùng thể tích 10 ml Dịch chiết (5 ml) được cho bay hơi đến khối lượng không đổi, xác định khối lượng cao chiết, hàm lượng -mangostin trong dịch chiết được kiểm tra trên sắc kí bản mỏng Xác định nhiệt độ chiết thích hợp

2.3.3 Các phương pháp tinh sạch

2.3.3.1 Tinh sạch bằng tách phân đoạn

Phương pháp này hiệu quả tinh sạch không cao, nhưng tốn ít nguyên liệu, đơn giản Đây có thể được sử dụng làm bước tinh sạch sơ bộ trước khi tinh sạch bằng sắc kí cột silica gel

Để loại bỏ các hợp chất tan trong nước, cao chiết được hòa trở lại với nước theo

tỷ lệ 1 g cao chiết : 20 ml nước Hỗn hợp được bổ sung n-hexane, lắc 24 giờ, ly tâm

5000 vòng/phút trong 15 phút, thu pha trên Pha trên được sử dụng để tinh sạch bằng cột sắc kí silica gel

2.3.3.2 Tinh sạch bằng sắc kí cột

Cột thủy tinh được nạp chất hấp phụ đến 2/3 thể tích Cột được rửa với dung môi nền là n-hexane trong 1 giờ nhằm ổn định cấu trúc Mẫu được nạp lên cột, thôi

mẫu bằng hỗn hợp dung dịch chloroform : acetone với tỷ lệ 10:1, 5:1, 0:1 Các phân đoạn thu được với tỷ lệ dung môi 5:1 được tinh sạch lần 2 bằng cột silica gel với hệ dung môi n-hexane : ethyl acetate với tỷ lệ 6:1 [19, 22] Các phân đoạn được kiểm tra độ sạch bằng sắc kí bản mỏng

2.3.4 Sắc kí bản mỏng

Quá trình phân tách hỗn hợp các chất bằng sắc kí bản mỏng xảy ra khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh Các chất hấp phụ (pha tĩnh) được trải thành lớp mỏng trên tấm kính hoặc lớp kim loại Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo một tỷ lệ nhất định Trong quá trình di chuyển pha di động kéo theo các cấu tử trong hỗn hợp mẫu di chuyển với tốc độ khác nhau tùy theo kích thước và độ phân cực của chúng, do đó tạo nên các băng vạch có giá trị Rf (Rf = khoảng dịch chuyển của cấu tử/khoảng dịch chuyển của dung môi) khác nhau trên sắc kí đồ

Trong nghiên cứu này, bản sắc kí silica gel 60 F254 được dùng làm pha tĩnh Pha động là hỗn hợp dung môi dichlomethane : methanol có tỷ lệ 96:4 Sắc kí đồ được hiện màu bằng phương pháp nhuộm iot

2.3.5 Xác định làm lượng malondialdehyde

Nguyên lý: Hàm lượng MDA được định lượng theo Ohkawa và cộng sự (1979)

[31] MDA là một trong những sản phẩm thứ cấp trong quá trình peroxy hóa lipid được gây ra bởi các gốc tự do Trong môi trường đệm phản ứng thích hợp, chất này

sẽ phản ứng với TBA (thiobarbituric acid) tạo ra hợp chất trimethine có màu hồng hấp phụ cực đại ở bước sóng 532-535 nm Đo độ hấp thụ của phức, suy ra hàm lượng MDA có trong mẫu Nếu lượng MDA giảm so với mẫu đối chứng, mẫu được xác định là có hoạt độ chống oxy hóa

Thành phần phản ứng xác định hàm lượng MDA: 300 l dung dịch 8,1% SDS;

300 µl đệm 20% sodium acetate pH 3,5; 300 µl dung dịch 0,8% TBA; 80 µl dung dịch enzyme Hỗn hợp phản ứng được đun nóng 1 giờ ở 95C, sau đó làm lạnh