Nghiên cứu khả năng tạo chất diệt khuẩn Enterocin P tái tổ hợp nhằm ứng dụng trong bảo quản thực phẩm202238

Đây là các peptide hoặc protein do vi khuẩn sinh ra, có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt nhiều loại vi sinh vật gây bệnh và gây hư hỏng thực phẩm dù ở nồng độ rất thấp nhưng lại an toàn đố

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Phạm Thùy Linh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO CHẤT DIỆT KHUẨN ENTEROCIN P TÁI TỔ HỢP NHẰM ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Phạm Thùy Linh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO CHẤT DIỆT KHUẨN ENTEROCIN P TÁI TỔ HỢP NHẰM ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM

Chuyên ngành : Vi sinh vật học

Mã số : 62 42 40 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS Trương Nam Hải

2 GS TS Phạm Văn Ty

Hà Nội – 2011

O157:H7 [53] Các vi khuẩn này phát triển ngay cả ở nhiệt độ thấp (4-6o C), trong thịt ướp lạnh, thịt nguội, phô mai chưa tiệt trùng gây ra những rối loạn tiêu hóa, mất cân bằng điện giải, kiệt sức Trường hợp nặng có thể dẫn đến tử vong nếu không chữa trị đúng cách và kịp thời Trong những năm gần đây, tình trạng ngộ độc

thực phẩm có liên quan đến L monocytogenes đã bùng phát tại nhiều nước trên thế giới Với đặc điểm dịch tễ học phức tạp, Listeria đã được Tổ chức Y tế Thế giới

(World Health Organization – WHO) xếp vào nhóm tác nhân sinh học có nguy cơ

cao trong lĩnh vực an toàn vệ sinh thực phẩm Listeria phân tán rộng rãi trong môi

trường đất, nước, phân gia súc nên rất dễ lây nhiễm qua thực phẩm Tác hại của loại

vi khuẩn này không chỉ dừng lại ở việc gây ra ngộ độc thực phẩm mà chúng còn gây ra các bệnh lý nguy hiểm đặc biệt cho thai phụ như gây nhiễm trùng phôi thai, sẩy thai, viêm não, nhiễm trùng máu [99]

Một nguyên nhân khác gây ngộ độc thực phẩm là do chính những chất phụ gia bảo quản hoặc chất tạo màu, tạo mùi trong quá trình xử lý, chế biến Thực phẩm hiện nay được bảo quản chủ yếu dựa vào các phụ gia tổng hợp hóa học hoặc qua các chu trình xử lý nhiệt độ, áp suất Điều này khiến người tiêu dùng lo ngại về những tác động lâu dài có hại đến sức khỏe cũng như đặt ra yêu cầu ngày càng tăng về độ

“tự nhiên”, giảm tối đa quy trình xử lý của thực phẩm Bởi vậy, song song với vấn

đề vệ sinh an toàn thực phẩm, nhu cầu về phương pháp bảo quản thực phẩm cũng như các chất bảo quản thực phẩm mới, các chất diệt khuẩn an toàn có nguồn gốc sinh học, không độc hại đối với sức khỏe con người đang là một nhu cầu cấp thiết ở hầu khắp các nước trên thế giới

Bacteriocin là nhóm các chất hiện đang thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trên Thế giới nhằm đưa vào ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm Đây

là các peptide hoặc protein do vi khuẩn sinh ra, có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt nhiều loại vi sinh vật gây bệnh và gây hư hỏng thực phẩm dù ở nồng độ rất thấp nhưng lại an toàn đối với người sử dụng do dễ bị bất hoạt và phân hủy dưới tác động của các protease trong hệ tiêu hóa Trong số đó, enterocin P (EntP) được sinh

tổng hợp từ chủng Enterococcus faecium P13, có phổ kháng khuẩn tương đối rộng

đối với các vi khuẩn Gram dương gây bệnh thường được phát hiện trong thực phẩm

như C perfringens, C botulinum, S aureus và đặc biệt là L monocytogenes

EntP khá bền nhiệt, có thể đảm bảo hoạt tính sau khi xử lý ở 100o C trong 60 phút hoặc ở 121o C trong 15 phút Hoạt tính này ổn định trong một thời gian dài khi được bảo quản ở - 20o C hoặc 4o

C [21] EntP còn có khả năng hoạt động trong khoảng

pH rộng, từ 2 đến 11 Tuy nhiên, các chủng vi khuẩn Enterococcus có khả năng sản

sinh enterocin lại thường sinh ra các độc tố nên việc lên men, thu hồi enterocin ở dạng sạch, đủ tiêu chuẩn sử dụng trong thực phẩm gặp nhiều khó khăn Với mục tiêu tổng hợp EntP theo con đường tái tổ hợp nhằm chủ động điều khiển sinh tổng hợp enterocin hiệu suất cao, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tinh sạch sản

phẩm, ứng dụng vào bảo quản thực phẩm, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng tạo chất diệt khuẩn enterocin P tái tổ hợp nhằm ứng dụng trong bảo quản thực phẩm”

Công trình được thực hiện tại phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và được hỗ trợ kinh phí thực hiện

từ đề tài cấp nhà nước do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn chủ quản

“Nghiên cứu công nghệ sản xuất và sử dụng chất diệt khuẩn sinh học (nisin và enterocin) dùng trong bảo quản nông sản thực phẩm”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN

1.1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BACTERIOCIN

Trong quá trình đấu tranh sinh tồn, vi sinh vật thường tiết ra những chất có khả năng kìm hãm, ức chế và tiêu diệt các vi sinh vật khác có sự cạnh tranh với chúng về nơi sống và nguồn dinh dưỡng như các axit hữu cơ, diacetyl, acetoin, peroxide hidro, reuterin, reutericyclin, các peptide kháng nấm [36, 54, 55, 72],

trong số đó phổ biến nhất là bacteriocin

Bacteriocin là peptide hoặc protein do vi khuẩn tổng hợp, có hoạt tính kháng khuẩn [25, 34, 43] Bacteriocin đầu tiên được Gratia phát hiện vào năm 1925 với

tên gọi là principe V do một chủng E coli sinh ra Năm 1946, Gratia và Fredericq

đã đổi tên bacteriocin này thành “colicin” Thuật ngữ bacteriocin được Jacob và cộng sự đề xuất từ năm 1953 [17, 86, 87] Tương tự “ase” sử dụng trong enzyme, tiếp tố “in” hoặc “cin” dùng để biểu thị các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn Tiếp

tố này được viết thêm vào tên chi hoặc tên loài Ví dụ, bacteriocin tiết ra từ E coli được gọi là colicin, từ Bacillus subtilis được gọi là subtilin Các chữ cái đứng sau

tên bacteriocin chỉ thứ tự bacteriocin được tìm ra ở cùng một loài Ví dụ, lactacin F

là bacteriocin thứ 6 được tìm ra từ loài thuộc chi Lactobacillus [53]

Bacteriocin được phát hiện ở hầu hết các loài vi khuẩn, đặc biệt một số loài

có khả năng tiết hàng chục bacteriocin khác nhau [86] Vi khuẩn cổ (Archaea) cũng

có khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn giống bacteriocin gọi là archaeocin, điển

hình là họ halocin sinh ra bởi vi khuẩn cổ thuộc chi Halobacterium [87, 92] Cho tới nay đã có hàng trăm bacteriocin được phát hiện và nghiên cứu Chúng rất đa dạng

về chủng sản sinh, kích thước phân tử, tính chất vật lý hóa học, độ bền, phổ kháng khuẩn và cơ chế tác động [31] Tập hợp gen cấu trúc và gen điều hòa sinh tổng hợp bacteriocin ở vi khuẩn cũng rất đa dạng, có thể nằm trong hệ gen (plantaracin A và sackacin 674), trong plasmid (pediocin) [91], hoặc thậm chí nằm trong các

transposon như nisin được sinh ra từ L lactis [83] Mặc dù vậy, cho tới nay, trong

số hàng trăm bacteriocin được phát hiện và nghiên cứu, mới chỉ có nisin là bacteriocin duy nhất được Tổ chức Nông lương (Food and Agriculture Organization – FAO) và Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) công nhận là chất bảo quản thực phẩm từ năm 1969 và được sử dụng rộng rãi tại hơn 50 quốc gia trên Thế giới [17]

Cùng có hoạt tính kháng khuẩn tuy nhiên bacteriocin hoàn toàn khác biệt với chất kháng sinh dùng trong y học Đa phần các bacteriocin có phổ kháng khuẩn không rộng, chủ yếu ức chế hoặc tiêu diệt các vi khuẩn khác có mối quan hệ gần gũi hoặc tương đồng, có sự cạnh tranh trực tiếp về nơi sống và nguồn dinh dưỡng [67]

So sánh bacteriocin và các kháng sinh dùng trong y tế [25]

Tùy thuộc phương thức hoạt động

Yêu cầu tương tác Đôi khi cần cắt ngắn phân tử Đích đặc hiệu

Phương thức hoạt động Hầu hết là tạo lỗ trên màng tế

bào chất (một số ít có thể ảnh hưởng đến sinh tổng hợp thành

1.1.2 PHÂN LOẠI BACTERIOCIN

Bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn đa dạng và phong phú, được tiết ra bởi

nhiều chủng vi khuẩn khác nhau, đươ ̣c chia thành hai nhóm lớn là bacteriocin của vi khuẩn Gram âm và bacteriocin của vi khuẩn Gram dương Vi khuẩn gram dương có quá trình điều hòa sinh tổng hợp bacteriocin đặc hiệu, trong khi các bacteriocin từ vi khuẩn Gram âm được tổng hợp chỉ phụ thuộc vào hệ thống điều hòa thông thường của tế bào chủ trong những điều kiện bất lợi Quá trình tiết bacteriocin ở vi khuẩn Gram dương không giết chết bản thân vi khuẩn chủ, trong khi đó bacteriocin của vi khuẩn Gram âm thường được giải phóng thông qua quá trình tiêu bào [85]

1.1.2.1 Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm

Vi khuẩn Gram âm sản sinh một loạt các bacteriocin rất đa dạng về kích

thước và phương thức hoạt động, được đặt tên theo chi (như klebicin của Klebsiella pneumoniae) hay theo loài của vi khuẩn sản xuất (như colicin của E coli, marcescin của Serratia marcescens, alveicin của Hafnia alvei, cloacin của Enterobacter cloacae ) Tính riêng ở E coli, các nhà khoa học đã phát hiện được hơn 30 loại

bacteriocin Tuy nhiên, đến nay các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp bacteriocin và sự đa dạng của chúng vẫn chưa được hoàn toàn sáng tỏ Việc nghiên cứu những thông tin này là rất cần thiết, không chỉ giúp phân loại các quần thể vi khuẩn trong môi trường tự nhiên mà còn tìm ra các bacteriocin có đặc tính mới cho nghiên cứu [87]

Bacteriocin từ vi khuẩn Gram âm được phân thành ba nhóm dựa vào kích thước: Nhóm 1: bacteriocin dạng colicin (colicin-like bacteriocin - CLB) kích thước lớn (25-80 kDa), nhóm 2: các microcin kích thước nhỏ hơn (<10 kDa) và nhóm 3: bacteriocin dạng đuôi phage (phage tail-like bacteriocin) gồm các tiểu đơn vị peptit lắp ghép

Colicin cũng như các CLB được sinh ra từ các vi khuẩn thuộc họ

Enterobacteriaceae, có phổ kháng khuẩn hẹp, đặc hiệu với các vi khuẩn Gram âm

Colicin là các bacteriocin đầu tiên được phát hiện và mô tả đặc tính Chúng có kích thước lớn (25-80 kDa), hoạt động thông qua tương tác với thụ thể đặc hiệu trên màng tế bào của vi khuẩn đích, ngăn chặn tổng hợp thành tế bào, tăng tính thấm của màng tế bào đích và hình thành lỗ trên màng tế bào (các bacteriocin có kích thước

449 đến 629 amino axit) hoặc thể hiện hoạt tính nuclease đối với DNA, rRNA hoặc tRNA đích (các bacteriocin có kích thước 178 đến 777 amino axit) [68, 87] Yếu tố

di truyền của colicin là các cụm gen phân bố trên plasmid và được sắp xếp thành gen colicin mã hóa cho protein gây độc, gen miễn dịch mã hóa cho protein chịu trách nhiệm miễn dịch đặc hiệu với tế bào sản xuất (bằng cách gắn và làm bất hoạt protein độc), và gen phân giải mã hóa cho protein tham gia vào việc giải phóng colicin thông qua phân giải tế bào chủ [26] Quá trình sinh tổng hợp của một số bacteriocin thuộc nhóm này được điều khiển bởi cơ chế gây chết cho chính tế bào chủ [87]

Microcin có cấu trúc tương tự như bacteriocin lớp II của vi khuẩn Gram dương: Đó là các peptide có kích thước nhỏ (<10 kDa), được tổng hợp nhiều nhất khi tế bào ở pha cân bằng Hai đại diện thuộc nhóm này là colicin V (được coi là một microcin vì có kích thước phân tử là 6 kDa) và microcin C7 (peptide kháng khuẩn có kích thước nhỏ nhất, 1,177 kDa, đã được mô tả cho đến nay) [87]

Bacteriocin dạng đuôi phage là các hạt hình que đề kháng với nuclease và protease tương tự như đuôi của thể thực khuẩn (bacteriophage), tiêu diệt tế bào vi khuẩn nhạy cảm thông qua tác động lên màng tế bào Các bacteriocin này được cho

là những phage khiếm khuyết hoặc có nguồn gốc từ phage tiến hóa theo hướng tạo

nên bacteriocin Điển hình như pyocin R2 (do Pseudomonas spp sinh ra) có thể là

phần còn lại của phage P2, còn pyocin F2 thì tương đồng với phage lambda [85, 87]

1.1.2.2 Bacteriocin của vi khuẩn Gram dương

Các bacteriocin do vi khuẩn Gram dương tiết ra phong phú và đa dạng hơn nhiều so với vi khuẩn Gram âm Theo Klaenhammer, bacteriocin của vi khuẩn Gram dương có thể được chia thành bốn nhóm dựa trên các đặc điểm về di truyền

và sinh hóa như sau [67]:

Bảng 1.1 Phân loại bacteriocin của vi khuẩn Gram dương

Lớp I Các lantibiotic (chứa

lanthionine và 

-lanthionine)

Ia (phân tử mạch thẳng, kích thước phân tử < 4 kDa)

Ib (phân tử hình cầu, kích thước phân tử từ 1,8 – 2,1 kDa)

Nisin A Nisin Z Subtilin Epidermin Mersacidin Actagardin Mutacin II Lớp II Các bacteriocin bền

nhiệt, không bị biến đổi

Bảng 2

Plantaricin EF Plantaricin JK Lactococcin 972 Lớp III Các bacteriocin có kích

thước phân tử > 30 kDa

Helveticin J Millericin B Lớp IV Các bacteriocin có bản

chất là glycoprotein hoặc

lipoprotein

Lactocin 27 Lacstrepcin

Lớp I: Lantibiotic

Lớp này gồm các peptide có kích thước nhỏ (< 5 kDa), có thành phần amino acid bị cải biến mạnh sau khi dịch mã Điểm khác biệt cơ bản của lantibiotic với các lớp bacteriocin khác là có chứa các amino acid hiếm như lanthionine (Lan), - methyllanthionine (MeLan), dehydroalanine và dehydrobutyrine [73] Dựa vào đặc điểm về cấu trúc, điện tích và cơ chế kháng khuẩn, lớp I còn được chia nhỏ thành hai phân lớp [45, 75]:

- Phân lớp Ia: Gồm các lantibiotic có cấu trúc thẳng, tích điện (+) Chúng tác động

đến các vi khuẩn đích bằng cách hình thành nên các lỗ trên màng tế bào chất thông qua sự tương tác không đặc hiệu với màng Một số đại diện cho phân lớp này là nisin A và Z, subtilin, epidermin

- Phân lớp Ib: Trái với phân lớp Ia, phân lớp Ib gồm các lantibiotic nhỏ, hình cầu,

tích điện (-) hoặc không tích điện như mersacidin, actagardin, cinnamycin và

mutacin A Hoạt tính kháng khuẩn của chúng dựa trên sự ức chế hoạt động của các enzyme đặc hiệu, từ đó ức chế quá trình sinh tổng hợp ở thành tế bào vi khuẩn

Bateriocin nổi bật nhất trong nhóm I là nisin Được sinh ra từ các chủng

Lactococcus lactis subsp lactis phân lập từ sữa và các thực phẩm từ rau [50, 56] và chủng L lactis BB24 phân lập từ xúc xích lên men khô Tây Ban Nha [21, 22], nisin

là bacteriocin có phổ kháng khuẩn rộng đối với một loạt các vi khuẩn Gram dương

trong đó có S aureus và L monocytogenes Thêm vào đó, nisin ngăn chặn sự phát triển của bào tử Bacillus spp và Clostridium spp Cho tới nay, nisin là bacteriocin

được nghiên cứu tường tận nhất và là bacteriocin duy nhất được toàn Thế giới công nhận là chất bảo quản thực phẩm sinh học dùng cho pho – mát, các sản phẩm sữa và

đồ hộp [33]

Lớp II

Lớp II gồm các peptide bền nhiệt có kích thước <10 kDa và không chứa lanthionine (non-lantibiotic) Các peptide này có trình tự amino acid không bị cải biến sau dịch mã Phần lớn chúng tác động lên tế bào đích bằng cách tạo lỗ trên màng sinh chất, gây thất thoát các nội chất của tế bào ra ngoài môi trường Những peptide này được chia thành ba phân lớp:

- Phân lớp IIa: gồm các bacteriocin có cấu trúc dạng pediocin (có một trình

tự bảo thủ –Tyr-Gly-Asn-Gly-Val-Xaa-Cys– ở đầu N) Phân lớp IIa bao gồm các

peptide có hoạt tính kháng Listeria mạnh với kích thước nhỏ (<10 kDa), gồm từ 37-

48 amino acid, bền nhiệt và các amino acid không bị cải biến sau dịch mã Bacteriocin thuộc phân lớp này có sự tương đồng cao (40 - 60%) về cấu trúc và trình tự các amino acid, tiêu diệt tế bào đích bằng cách tác động lên màng sinh chất Các peptide này tích điện (+) ở pH trung tính, điểm đẳng điện pI dao động trong khoảng từ 8 đến 10 [34] Hiện nay, đây được coi là nhóm chất kháng khuẩn sinh học hứa hẹn nhất về khả năng ứng dụng trong công nghệ bảo quản thực phẩm và trong y học Chúng có thể ức chế sự sinh trưởng của nhiều loại vi khuẩn Gram

dương gây hư hỏng thực phẩm và các vi khuẩn gây bệnh như B cereus, C perfringens, S aureus, và L monocytogenes [25, 34] Một số bacteriocin đại diện

cho nhóm này như pediocin AcH/PA1, mesentericin Y 105, sakacin A, sackacin P, carnobacteriocin B2 được tổng kết ở bảng 1.2 [37]

Bảng 1.2 Một số bacteriocin thuộc phân lớp IIa

Loài Chủng

Carnobacteriocin B2

Curvacin A

Divercin V41

Divergicin M35

Enterocin P

Enterocin A

Leucocin A

Leucocin C

Mundticin

Mesentericin Y105

Plantaricin 423

Pediocin PA-1

Pediocin AcH

Pediocin SJ-1

Piscicolin 126

Sakacin P

Sakacin A

Carnobacterium piscicola LV17 Lactobacillus curvatus LTH1174 Carnobacterium divergens V41 Carnobacterium divergens M35 Enterococcus faecium P13 Enterococcus faecium CTCA92/T136 Leuconostoc gelidum UAL 187 Leuconostoc mesenteroides TA33a Enterococcus mundtii ATO6 Leuconostoc mesenteroides Y105 Lactobacillus plantarum 423

Pediococcus acidilactici PAC 1.0 Pediococcus acidilactici AcH Pediococcus acidilactici SJ-1 Carnobacterium piscicola JG126 Lactobacillus sakei 674

Lactobacillus sakei 706

- Phân lớp IIb: là các bacteriocin đa thành phần, chủ yếu gồm hai chuỗi peptide

Hoạt tính kháng khuẩn của chúng phụ thuộc vào hoạt động bổ trợ lẫn nhau của hai chuỗi Hầu hết các peptide riêng rẽ vẫn có hoạt tính kháng khuẩn, nhưng hoạt tính này mạnh hơn khi có mặt chuỗi peptide thứ hai (enterocin L50A và L50B) [9, 23] Trường hợp ngoại lệ là hai peptide lactococcin G và lactococcin M không còn khả năng kháng khuẩn khi đứng riêng lẻ một mình

- Phân lớp IIc: là các bacteriocin còn lại của lớp II Các bacteriocin thuộc nhóm này

gồm hai loại chính là có chứa cysteine (đại diện là thiolbiotic và cystibiotic) và không có chứa cysteine (đại diện là lactococin A và acidocin B)

Lớp III

Lớp III gồm các bacteriocin có khối lượng phân tử lớn (>30 kDa), dễ bị phân

hủy dưới tác động của nhiệt độ Phần lớn các peptide nhóm này được tiết ra bởi các

chủng thuộc chi Lactobacillus Điển hình như helveticin J do L helveticus tiết ra hay lactacin B do chủng L acidophilus sinh ra Các bacteriocin thuộc lớp này vẫn

chưa được nghiên cứu rộng rãi [17, 80]

Lớp IV

Lớp IV bao gồm các bacteriocin có cấu tạo phức tạp, có bản chất là glycoprotein (lactocin 27) [94] hoặc lipoprotein (lacstrepcin) [69] Hoạt tính sinh học của các bacteriocin này cần có sự tham gia của thành phần carbohydrate hoặc lipid trong cấu trúc

Gần đây, Kemperman đã bổ sung thêm một lớp bacteriocin mới (lớp V), gồm các bacteriocin có cấu trúc dạng vòng Đây là các peptide được biến đổi sau dịch

mã, hình thành liên kết cộng hóa trị nội phân tử giữa đầu N và đầu C tạo cấu trúc vòng cho peptide trưởng thành [66] Các thành viên thuộc nhóm này là enterocin

AS-48 (tiết ra bởi E faecalis), circularin A (tiết ra bởi C beijerinckii ATCC25752), gassericin A (tiết ra bởi L gasseri LA39)

1.1.3 PHỔ KHÁNG KHUẨN CỦA BACTERIOCIN

Bacteriocin từ vi khuẩn Gram âm được xem là những chất kháng khuẩn phổ hẹp, chủ yếu tác động tới những vi khuẩn có quan hệ gần gũi trong cùng nơi sống, gây chết tế bào đích bằng cách tạo lỗ trên màng sinh chất hoặc bằng phân cắt axit nucleic (DNA, rRNA và tRNA) [86]

Bacteriocin từ vi khuẩn Gram dương có phổ kháng khuẩn vô cùng đa dạng,

từ lactococcin A, B và M là các bacteriocin được sinh ra từ các chi Lactococcus và Lactobacillus, chỉ có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn Lactococcus, cho tới nisin A,

có khả năng tiêu diệt một loạt các vi khuẩn bao gồm các chi: Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Gardnerella, Lactococcus, Listeria, Micrococcus, Mycobacterium, Propionibacterium, Streptococcus, và thậm chí cả một số vi khuẩn Gram âm như: Campylobacter, Haemophilus, Helicobacter và Neisseria [76, 86] Klaenhammer đã chỉ ra rằng bacteriocin từ vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn đa dạng, không chỉ đối với các loài có quan hệ gần gũi hay

cạnh tranh về nơi sống [67] Quan sát hoạt tính của các bacteriocin phân tử lượng thấp các nhà nghiên cứu đã nhận thấy: (i) một số chủng trong cùng một loài nhất định có thể mẫn cảm trong khi các chủng khác lại đề kháng với cùng một loại bacteriocin; (ii) một chủng mẫn cảm với một bacteriocin có thể có một vài tế bào trong quần thể đề kháng được với bacteriocin đó; (iii) một chủng có thể mẫn cảm với một bacteriocin trong khi lại đề kháng với một bacteriocin dạng tương tự; (iv) các tế bào của chúng sản sinh bacteriocin này có thể mẫn cảm với một bacteriocin khác; (v) bào tử của chủng mẫn cảm với một bacteriocin có thể đề kháng với bacteriocin đó và chỉ trở nên mẫn cảm khi nảy mầm, (iv) dưới các điều kiện thông thường, vi khuẩn Gram âm không mẫn cảm với các bacteriocin từ vi khuẩn Gram dương, vi khuẩn Gram âm chỉ bị ức chế bởi các bacteriocin tinh chế từ vi khuẩn lactic (lactic acid bacteria – LAB) dưới những điều kiện làm suy yếu thành tế bào (như các axit hữu cơ, EDTA ) hay dưới áp lực môi trường như pH, đông lạnh, gia nhiệt nhẹ hay áp suất hơi nước cao [59, 63, 64]

Nhiều tác giả cho rằng, hàm lượng cystein có liên quan tới phổ kháng khuẩn của các LAB-bacteriocin bởi việc hình thành liên kết thiol giữa các gốc cysteine có thể đóng vai trò sinh học tương tự như sự hoạt hóa gốc thiol của độc tố sinh ra từ vi khuẩn Gram âm Bởi vậy, tác giả cho rằng các cystibiotics, thiolbiotics và bacteriocin không chứa cysteine sẽ có hoạt tính kháng khuẩn tương ứng là rộng, trung bình và hẹp [59] Mặc dù chưa được xác định đầy đủ, nhiều nghiên cứu đã chỉ

ra rằng sự hình thành cầu disulfide trong các bacteriocin dạng pediocin PA1, enterocin A, enterocin P và divercin V41 có thể là thiết yếu đối với khả năng kháng khuẩn của các non - lantibiotic này [13, 19]

Dựa theo phổ kháng khuẩn, bacteriocin cũng có thể được chia thành 3 nhóm: (i) nhóm bacteriocin phổ hẹp: chỉ kháng lại các chủng cùng loài với chủng sản xuất (lactococcin A, caseicin 80) hoặc các loài trong cùng một chi (lactocin 27, lactacin B); (ii) nhóm bacteriocin phổ trung bình: có khả năng ức chế các chi khác của vi khuẩn lactis và vi khuẩn Gram dương bao gồm cả các chủng gây ngộ độc thực

phẩm L monocytogenes, S aureus, C perfringens, C botulinum Đại diện cho

nhóm này có lacticin F, lacticin 481, plantaricin C, plantaricins S và T; và nhóm bacteriocin phổ rộng, có khả năng ức chế một dải rộng các vi khuẩn Gram dương,

bên cạnh các chi đã được kể ở trên còn có thêm Propionibacterium spp và Bacillus

spp Nisin, pediocin AcH/PA-1, leucocin S và enterocin L50 là các bacteriocin tiêu biểu thuộc nhóm này [22, 24, 50, 56]

1.1.4 ỨNG DỤNG CỦA BACTERIOCIN

Đối với vi sinh vật, bacteriocin là vũ khí để cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống giữa các loài, giúp cân bằng sinh thái vi sinh vật [91] Đối với con người, các peptide kháng khuẩn này cũng có tiềm năng ứng dụng rất lớn trong bảo quản thực phẩm, trong nông nghiệp, trong lĩnh vực y tế cũng như chăm sóc sức khỏe cho con người [88]

1.1.4.1 Ứng dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm

Thực phẩm hiện nay được bảo quản chủ yếu dựa vào các chất phụ gia tổng hợp hóa học hoặc các chu trình xử lý nhiệt độ, áp suất Điều này khiến người tiêu dùng lo ngại về những ảnh hưởng có hại đến sức khỏe cũng như đặt ra yêu cầu ngày càng tăng về độ “tự nhiên” của thực phẩm Vì vậy, một giải pháp có nhiều tiềm năng hiện nay là sử dụng các chất kháng khuẩn sinh học để ức chế hay tiêu diệt các

vi sinh vật không mong muốn Bacteriocin, đặc biệt là các bacteriocin từ vi khuẩn lactic có nhiều đặc tính thích hợp để được ứng dụng làm chất bảo quản: đây là các hợp chất an toàn, không hoạt động và không gây độc trên tế bào người, dễ dàng bị bất hoạt bởi các protease trong hệ tiêu hóa, rất ít ảnh hưởng tới hệ khuẩn chí đường ruột, bền nhiệt và ổn định trong các pH, có phổ kháng khuẩn khá rộng đối với nhóm các vi khuẩn gây ngộ độc và hư hỏng thực phẩm Phương thức kháng khuẩn của bacteriocin là hoạt động trên màng sinh chất của vi khuẩn Bacteriocin không có hiện tượng kháng chéo với các chất kháng sinh, các yếu tố di truyền được quy định trên plasmid, thuận lợi cho việc thao tác di truyền [43] Các bacteriocin đã biết tới ngày nay hầu hết đều được phát hiện trong những thực phẩm như thịt và các sản phẩm sữa, nơi thường có mặt vi khuẩn lactic Trên thực tế, vi khuẩn lactic đã được con người sử dụng từ xa xưa để chế biến và bảo quản thịt, sữa, các loại rau củ

Nghiên cứu 40 chủng L lactis dạng dại, các tác giả đã phát hiện 35 chủng trong số

Thịt lên men đã được dùng phổ biến từ xa xưa ở khắp thế giới, trong đó có các loại xúc xích lên men bán khô (semidry sausage) với những nhãn hiệu nổi tiếng như Chorio, Summer và lên men khô như Peperoni, Salami Để sản xuất, người ta

thường dùng các vi khuẩn lactic như L plantarum, L pentosus, L sake, L curvatus,

L pentosaceus, L acidilactic với chức năng axit hóa, chống oxi hóa, đặc biệt là

sinh tổng hợp bacteriocin để tránh nhiễm trùng, đảm bảo được chất lượng và vệ sinh

an toàn thực phẩm, nhiều loài còn tạo hương thơm đặc trưng

Bacteriocin được sử dụng rất phổ biến trong công nghệ đóng hộp hoa quả Khi khử trùng các hộp hoa quả, nếu tăng nhiệt độ lên cao sẽ làm nhũn cũng như mất

đi màu sắc và hương vị tự nhiên của hoa quả, nhưng nếu thêm một lượng nhất định bacteriocin thì có thể làm giảm nhiệt độ khử trùng mà vẫn giữ được chất lượng sản phẩm

Có ba phương pháp thường được sử dụng trong việc bảo quản thực phẩm bằng bacteriocin [17]:

- Ủ thực phẩm với giống bảo vệ (thường là vi khuẩn lactic) để tạo bacteriocin tại

chỗ (in situ) Trong trường hợp này, khả năng sinh trưởng và tạo bacteriocin của

LAB trong sản phẩm là yếu tố quyết định

- Bổ sung bacteriocin tinh chế hoặc bán tinh chế vào thực phẩm như một chất bảo quản

- Sử dụng thành phẩm của quá trình lên men trước đó với chủng sinh bacteriocin như là một thành phần trong qui trình chế biến thực phẩm

Sử dụng chủng sinh bacteriocin làm giống khởi động

Thông thường giống khởi động (Starter cultures) là hỗn hợp các loài vi sinh vật có vai trò tạo màu, tạo mùi thơm, hương vị đặc trưng, làm giảm độ pH, ngăn cản

sự phát triển của vi khuẩn có hại trong thực phẩm Khi được sử dụng như một chủng trong giống khởi động, chủng sinh bacteriocin phải tạo được lượng bacteriocin đủ lớn để chống lại các vi khuẩn khác mà không làm ảnh hưởng đến chức năng của giống khởi động ban đầu Do đó, giống khởi động phải kháng với bacteriocin Các giống khởi động nuôi cấy cùng bacteriocin thường được sàng lọc bằng cách nuôi cấy phụ lặp lại, với nồng độ bacteriocin tăng dần để chọn lọc các

giống thích nghi hay bằng biến đổi gen Ví dụ, chủng Enterococcus sinh enterocin

AS-48 được sử dụng làm giống nuôi cấy kết hợp với một giống khởi động thương mại trong sản xuất phomat không làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của giống khởi động hay đặc tính hóa sinh của phomat tạo ra đồng thời lượng bacteriocin được tạo

ra trong phomat đủ đảm bảo ức chế B cereus [32, 53]

Sử dụng chủng sinh bacteriocin làm probiotic

Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về probiotic tăng lên nhanh chóng Nhiều sản phẩm probiotic đã xuất hiện trên thị trường dưới dạng viên bọc, bột, sữa chua làm giàu và nhiều loại thực phẩm khác Thuật ngữ probiotic bắt nguồn

từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là vì sự sống, theo tiếng Việt là trợ sinh Theo đó, probiotic là “những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể một lượng đủ lớn sẽ tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [40] Vi sinh vật sử dụng cho các sản phẩm

probiotic là nấm men, vi khuẩn (đặc biệt là nhóm LAB) Ví dụ, L acidophilus là

LAB lên men đồng hình được tìm thấy trong đường tiêu hóa của người và động vật Chúng được bổ sung vào các sản phẩm sữa lên men thương mại như sữa chua

acidophilus Những vi khuẩn này có tác động tích cực đến sức khỏe con người nhờ

khả năng sinh bacteriocin – giúp ức chế hay tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh Probiotic từ LAB ngăn ngừa hiệu quả sự rối loạn hệ khuẩn chí đường ruột và thường được sử dụng để điều trị tiêu chảy do các nguyên nhân khác nhau Bacteriocin giúp vi sinh vật có lợi cạnh tranh với vi sinh vật bản địa cũng như hệ vi

khuẩn đường ruột gây bệnh như Helicobacter pylori, E coli và Salmonella [44, 53]

1.1.4.2 Ứng dụng bacteriocin trong y tế và chăm sóc sức khỏe

Sự gia tăng nhanh chóng và lan tràn của các vi sinh vật kháng đa thuốc trong những năm gần đây đang đặt ra những yêu cầu về một giải pháp thay thế trong cuộc chiến điều trị các bệnh nhiễm trùng Một trong những hạn chế của việc sử dụng các chất kháng sinh phổ rộng là tiêu diệt hầu hết các loài vi khuẩn không kháng thuốc

Vì vậy, bên cạnh hiện tượng kháng đa thuốc đang ngày càng lan rộng trong các quần thể vi khuẩn gây bệnh còn là sự mất cân bằng của quần thể các vi sinh vật hội sinh Bacteriocin hứa hẹn là các chất diệt khuẩn thế hệ mới với nhiều ưu điểm vượt trội có thể giải quyết thế lưỡng nan này Với phổ kháng khuẩn hẹp, tính đặc hiệu tế bào đích cao, bacteriocin được xem là các “dược phẩm thiết kế” (designer drugs), là giải pháp cho vấn đề kiểm soát các bệnh nhiễm trùng đang đặt ra nhiều thách thức hiện nay [81, 86]

1.1.4.3 Ứng dụng bacteriocin trong nông nghiệp

Hàng năm trên thế giới các bệnh ở cây trồng đã gây thiệt hại từ 12-15% tổng giá trị mùa màng Phần lớn các bệnh này là do vi khuẩn có hại gây ra Hệ vi khuẩn sống trên thực vật vô cùng phong phú và đa dạng Nơi sống và phương thức sống của chúng cũng rất khác nhau Chúng có thể ký sinh trên lá hoặc rễ, hay nhiễm vào trong các mô của thực vật như các vi khuẩn kí sinh, cộng sinh hoặc vi khuẩn gây bệnh Trong quá trình sống, nhiều vi khuẩn đã tiết ra bacteriocin nhằm cạnh tranh không gian sống và nguồn dinh dưỡng, tuy nhiên mới chỉ có một số ít bacteriocin từ những vi khuẩn này được nghiên cứu, mô tả đặc tính di truyền và hóa sinh Dựa trên

cơ sở này, các nhà khoa học đã đề xuất một phương pháp kiểm soát bệnh cây trồng

do vi khuẩn gây ra bằng cách sử dụng các chủng sinh bacteriocin hoặc sử dụng trực tiếp các bacteriocin đã điều chế Hiện nay, một số bacteriocin nhóm này đã được sản xuất và bán trên thị trường, điển hình là agrocin K48, một bacteriocin do

Agrobacterium radiobacter K48 sinh ra, có khả năng kháng Agrobacterium tumifaciens gây bệnh mụn cây (crown gall disease) cho nhiều loại cây trồng [65]

Ngoài vi khuẩn gây bệnh, nấm cũng là một mối đe dọa lớn đối với cây trồng

Magnusson (2003) đã nghiên cứu các vi khuẩn lactic (LAB) phân lập từ nhiều môi trường khác nhau và thấy rằng 10% các chủng vi khuẩn này sinh ra bacteriocin có

khả năng ức chế Aspergillus fumigatus và 4% tiết bacteriocin có hoạt tính kháng

loại mốc này rất mạnh [71] Một ví dụ khác là syringomycin E và G do

Pseudomonas syringae 508 tiết ra có thể tiêu diệt bào tử của V inaequalis [27]

1.2 ENTEROCIN P

1.2.1 CÁC Enterococcus: VI KHUẨN SINH TỔNG HỢP ENTEROCIN

Enterococcus được mô tả lần đầu tiên năm 1899, là một chi lớn thuộc nhóm LAB Enterococcus gồm các cầu khuẩn Gram dương, kỵ khí tùy tiện, thường tồn tại

dưới dạng cặp và chuỗi, lên men đồng hình tạo L(+)LA (axit lactic đồng phân hình học dạng L) Hiện nay, các nhà khoa học đã xác định được hơn 26 loài thuộc chi

Enterococcus, phân thành 8 nhóm loài (species section) dựa trên quan hệ phát sinh loài, trong đó, E faecalis và E faecium là hai loài chiếm ưu thế [38] Enterococcus

có nguồn gốc từ đường tiêu hóa của người và động vật máu nóng, phân bố rất rộng rãi trong không khí, nước, chất thải, đất [71] Đa số các chủng vi khuẩn thuộc

nhóm Enterococcus có khả năng sinh ra bacteriocin Bacteriocin này được gọi là

các enterocin và hầu hết đều thuộc lớp II Phần lớn các enterocin được tinh chế và

xác định đặc tính di truyền nhiều năm nay đều từ E faecalis và E faecium

Enterococcus có ý nghĩa lớn trong vi sinh vật học môi trường, thực phẩm và

y học Chúng giữ vai trò quan trọng trong quá trình chín, tạo kết cấu mùi vị thực phẩm lên men như pho mat, xúc xích , tăng cường giá trị dinh dưỡng thực phẩm

[71] Một số chủng của Enterococcus, điển hình là E faecium SF68 đã được nghiên

cứu và sử dụng như một probiotic ở người, đặc biệt là trong điều trị tiêu chảy [93]

Enterococcus có vai trò bảo quản quan trọng trong các thực phẩm chế biến từ thịt

nhờ khả năng tạo ra một loạt các enterocin khác nhau, một số chủng thậm chí có khả năng sinh ra nhiều loại enterocin Trong số đó, đáng chú ý là các enterocin có

hoạt tính kháng Listeria spp – nguyên nhân chính gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm

và các bệnh lý nguy hiểm ở người trong thời gian gần đây Hoạt tính kháng Listeria

có thể được giải thích bởi thực tế Enterococci và Listeria có quan hệ gần gũi về mặt

phát sinh Một ưu điểm nữa là enterocin có khả năng chịu nhiệt và khoảng pH dao

động rộng Do vậy, tiềm năng ứng dụng của các enterocin từ Enterococcus là rất lớn

[53]

Tuy nhiên, một số chủng của Enterococcus sinh độc tố và không có khả năng

tổng hợp mạnh enterocin Thâ ̣m chí, một số loài phân lập từ thức ăn có thể chứa các

yếu tố gây độc, trong đó E faecalis chứa nhiều rủi ro tiềm ẩn Một vấn đề đáng chú

ý nữa là tính kháng kháng sinh của một số chủng, đặc biệt là các chủng kháng vancomycin gây khó khăn trong điều trị bệnh nhiễm trùng [53, 87] Do vậy việc sử

dụng Enterococcus như là các probiotic cần được nghiên cứu và kiểm tra kỹ lưỡng

Đồng thời, việc tạo enterocin tái tổ hợp ứng dụng trong bảo quản thực phẩm và y tế được xem là giải pháp tối ưu

1.2.2 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA ENTEROCIN P

Enterocin P (EntP) là một bacteriocin dạng pediocin, thuộc lớp IIa, do chủng

E faecium P13 (phân lập lần đầu tiên từ xúc xích lên men khô Tây Ban Nha) sinh

ra EntP có phổ kháng khuẩn rộng, có khả năng ức chế mạnh các vi khuẩn gây gây

thối hỏng và ngộ độc thực phẩm như S aureus, C perfringens, C botulinum và đặc biệt là L monocytogenes

Dựa vào cấu trúc gen, EntP thuộc nhóm IIa [20] Mặt khác, peptide này cũng được một số tác giả xếp vào phân lớp IIc do nó được tiết ra ngoại bào theo cơ chế của bacterocin phân lớp IIc Do vậy mà ở một số bài báo, tùy theo quan điểm phân loại của từng tác giả mà EntP thuộc phân lớp IIa hay IIc

Phân tử EntP ban đầu được tổng hợp tại ribosome gồm 71 amino acid, trong

đó 27 amino acid đầu tiên là peptit tín hiệu dẫn có vai trò đưa peptide ra ngoài môi trường Sau khi được tiết ra ngoài, đoạn peptide này bị cắt bỏ để tạo EntP dạng hoạt động gồm 44 amino acid, có khối lượng phân tử 4493 Da

Bảng 1.3 Hoạt tính kháng khuẩn của enterocin P tinh sạch từ dịch nuôi chủng

E faecium P13 [21]

(ng/ml)

Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 - E faecalis TNO EF 238

L fermentum ATCC 9338 1 Clostridium sporogenes TNO C22/10 4

L helveticus ATCC 15009 - C tyrobutyricum TNO 3,5CT

Pediococcus acidilactici ASCL50

ASC 347

69 L monocytogenes NCTC 7973

FVM LI5sv1/2 NCTC5105 FVM LI1sv4 FVM Scott A

Enterococcus faecium ASC T136 2

EntP khá bền nhiệt, hoạt tính kháng khuẩn của EntP có thể duy trì ở 100o

C trong 60 phút hoặc ở 121o C trong 15 phút Hoạt tính này ổn định trong một thời gian dài khi đƣợc bảo quản ở - 20o C hoặc 4o C EntP còn có khả năng hoạt động

trong khoảng pH rộng, từ 2 đến 11 Trong dịch tiêu hóa của người và động vật, cũng như những bacteriocin khác, EntP rất dễ bị phân hủy bởi các protease EntP là bacteriocin dạng pediocin phụ thuộc tiết (sec-dependent pediocin-like bacteriocin) đầu tiên được xác định tới cấp độ hóa sinh phân tử [21]

1.2.3 CẤU TRÖC KHÔNG GIAN CỦA ENTEROCIN P

Cấu trúc không gian của enterocin P cũng như các bacteriocin lớp IIa được xác định bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR [40, 50] Qua đó , người ta nhận thấy rằng trong môi trường nước bacteriocin không mang cấu trúc đặc thù trong khi ở môi trường gần giống màng tế bào (membrane-mimicking environment) với sự có mặt của micelle và liposome thì chúng lại có cấu trúc rõ ràng [34] Cấu trúc này chia thành hai vùng: Vùng đầu N và vùng đầu C (Hình 1.1)

Hình 1.1 Cấu trúc không gian của bacteriocin phân lớp IIa

Vùng đầu N tích điện (+) chứa nhóm YGNGV bảo thủ cao Vùng này chứa hai gốc cystein tham gia vào việc hình thành nên cầu nối disulfide Ngược lại, vùng

C của bacteriocin có tính bảo thủ kém hơn Trong môi trường có mặt micelle và liposome, vùng N tạo nên cấu trúc phiến gấp nếp  Trong khi đó ở đầu C lại hình

Vùng N với cấu trúc gấp nếp 

Khớp nối

Vùng C với cấu trúc kẹp tóc

Bề mặt màng

Vùng ngoài ưa nước

Vùng kị nước của màng

thành một hoặc hai cấu trúc xoắn , theo sau là đuôi C với chiều dài có thể thay đổi

[34] Ở hầu hết các bacteriocin lớp IIa, đuôi C này sẽ gập vào vùng C trước nó, hình thành nên cấu trúc kẹp tóc Vùng C và vùng N được nối với nhau bởi một khớp nối

[60] Khớp nối này làm cho cấu trúc của bacteriocin không những trở nên linh động hơn mà còn giúp cho vùng C đi vào phần kị nước của tế bào dễ dàng hơn [34, 60]

Mối tương quan giữa cấu trúc và cơ chế kháng khuẩn của bacteriocin cho đến nay vẫn chưa được hiểu biết tường tận Ở đầu N, các amino acid tích điện (+) tham gia vào việc hình thành nên mối tương tác tĩnh điện với phần tích điện (-) ở trên màng Vùng C có vai trò quan trọng quyết định tính đặc hiệu với tế bào đích [34] Để biết được điều này, người ta đã tiến hành thí nghiệm với các bacteriocin lai được tạo ra bằng cách thay thế đầu C và đầu N của các bacteriocin khác nhau Kết quả là bacteriocin lai thể hiện tính đặc hiệu với tế bào đích tương tự như các bacteriocin có vùng C tương ứng [42]

Trong nghiên cứu với leucocin A, Yan và cộng sự [97] cho rằng bacteriocin thấm qua màng bằng cách tương tác với thụ thể gắn trên màng Các thụ thể này có thể là các enzyme permease vận chuyển mannose (mannose permease) [19, 34, 80, 52] Dưới đây là sơ đồ giả định về cơ chế tác động hai bước của bacteriocin lớp IIa lên tế bào đích:

Hình 1.2 Cơ chế tác động hai bước của bacteriocin phân lớp IIa

AB, C, D: Các protein IIAB, IIC, IID trong hệ thống vận chuyển đường mannose ở vi

khuẩn (mannose phosphotransferase system - man-PTS)

Bước 1: Bacteriocin gắn vào các thụ thể trên màng Các thụ thể này có thể là các protein trong hệ thống vận chuyển đường mannose ở vi khuẩn (man - PTS)

Bước 2: Sau khi nhận ra được tế bào đích, bacteriocin gắn lên màng nhờ tương tác tĩnh điện giữa vùng tích điện (+) của nó và phần tích điện (-) trên màng tế bào Vùng kị nước (đầu C) trên bacteriocin đi vào vùng kị nước trong màng tế bào, từ đó

lỗ trên màng tế bào đích được hình thành và gây chết tế bào do sự rò rỉ thất thoát các chất tan có trong tế bào [80]

Sử dụng các mẫu dò huỳnh quang để xác định điện thế màng, năng lượng

ATP nội bào và gradien pH trên màng tế bào vi khuẩn đích E faecium T136 khi có

mặt EntP, Herranz và cộng sự đã chỉ ra rằng: với bản chất là một peptide phân cực, tích điện dương, EntP có thể đã tương tác với màng sinh chất tích điện âm của vi khuẩn nhạy cảm, phá vỡ điện thế màng, làm giảm grandien pH, qua đó làm tiêu hao động lực proton, ATP nội bào, hình thành lỗ trên màng làm thất thoát nội chất và gây chết tế bào [52] Nghiên cứu của Herranz còn chỉ ra rằng: hoạt tính của EntP có thể không hoàn toàn phụ thuộc mối tương tác giữa EntP và thụ thể protein trên màng sinh chất của vi khuẩn đích mà chính các thành phần có bản chất protein trên màng sinh chất hay trên bề mặt tế bào hoặc thậm chí toàn bộ cấu tạo màng có thể là

Bacteriocin lớp IIa

1 Bacteriocin tương tác với protein thụ thể trên màng

2 Thấm qua màng

nhân tố làm tăng hoạt tính của EntP, khiến bacteriocin này có phổ kháng khuẩn rộng như vậy

Hình 1.3 Cơ chế tác động của bacteriocin phân lớp IIa trên màng tế bào [80]

1.2.5 CƠ CHẾ TỰ BẢO VỆ CỦA TẾ BÀO CHỦ

Quá trình sinh tổng hợp bacteriocin luôn đi kèm với quá trình sinh tổng hợp protein miễn dịch giúp tế bào chủ có thể kháng lại với peptide kháng khuẩn mà chúng vừa tiết ra Mặc dù đã có khá nhiều nghiên cứu được thực hiện nhưng cho đến nay, cơ chế bảo vệ tế bào chủ của các protein miễn dịch này vẫn chưa được hiểu biết tường tận và vẫn chỉ là những giả thiết Hình 1.4 mô tả một giả thuyết về

cơ chế bảo vệ tế bào chủ của các protein miễn dịch

Các tác giả đã chỉ ra rằng tuy cấu trúc không gian có phần giống nhau nhưng protein miễn dịch lại thể hiện tính đặc hiệu khá mạnh với bacteriocin mà chúng kháng lại [15] Một số nghiên cứu cho rằng vùng cấu trúc kẹp tóc ở đầu C gắn trên màng được nhận ra bởi phần C trên protein miễn dịch [60] Cũng theo nghiên cứu này, bacteriocin và protein miễn dịch của nó nằm ở hai phía đối nhau của màng nhưng lại không thấy sự liên kết trực tiếp nào giữa hai phân tử này [19] Do đó, người ta cho rằng màng tế bào hoặc hợp chất đặc hiệu nào đó sẽ đóng vai trò trung

gian cho hai chất này Khi đó protein miễn dịch có thể tương tác với lỗ màng vừa

được tạo ra và vì vậy có thể ngăn không cho các chất nội bào đi ra ngoài môi

trường Ngoài ra, từ nghiên cứu này người ta cũng đưa ra một khả năng khác rằng

protein miễn dịch có thể tương tác với thụ thể trên màng và ức chế hoạt động của nó

bằng cách thay đổi cấu tạo hoặc giấu đi vị trí gắn bacteriocin của các thụ thể này

[96] Các protein vận chuyển mannose trên màng được giả định là các thụ thể đặc

hiệu dành cho bacteriocin lớp IIa [37] Tuy nhiên với cả hai giả thiết trên, rất khó để

giải thích được tính đặc hiệu miễn dịch xảy ra như thế nào

Hình 1.4 Cơ chế bảo vệ của tế bào chủ [35]

- Hình A: Bacteriocin bám vào màng tế bào đích nhờ thụ thể là tiểu đơn vị IIC và IID

của hệ thống vận chuyển đường mannose trên màng tế bào Sau khi thấm qua màng,

bacteriocin hình thành lỗ xuyên qua màng, gây thất thoát các chất nội bào và làm chết

tế bào

- Hình B: Trong tế bào tạo bacteriocin, peptide miễn dịch (I) kết hợp chặt chẽ với các thụ

thể của bacteriocin (IIC, IID), ngăn chặn sự hình thành lỗ xuyên màng, qua đó bảo vệ

được tế bào chủ

AB, C, D: các tiểu đơn vị IIAB, IIC, IID trong hệ thống vận chuyển đường mannose trên

màng tế bào vi khuẩn; I: protein miễn dịch

Thành tế bào

Màng sinh chất

taacaatgattttttattgccattatgctttcaaaacaactgtttatgatataattatca

aatttttctaaaaatcatttataattattttagaaaaaggaggtattgatttatgagaaa

10 M R K aaaattatttagtttagctcttattggaatatttgggttagttgtgacaaattttggtac

K L F S L A L I G I F G L V V T N F G T aaaagttgatgcagctacgcgttcatatggtaatggtgtttattgtaataatagtaaatg

K V D A A T R S Y G N G V Y C N N S K C ctgggttaactggggagaagctaaagagaatattgcaggaatcgttattagtggctgggc

W V N W G E A K E N I A G I V I S G W A ttctggtttggcaggtatgggacattaatactatgaaaagtaataaatctttcaacaaag

S G L A G M G H * M K S N K S F N K V ttctagaattaactgaaacagcattagccaccccagaaattaaaaaagataaaaatctat

L E L T E T A L A T P E I K K D K N L C gtgaaattttagaaaaagtaaaagctagtgctgctaaaggtgaattttattatgattaca

E I L E K V K A S A A K G E F Y Y D Y K agaaagaatttcaacctgcaattagtggattcactattagaaacggcttttccacaccga

K E F Q P A I S G F T I R N G F S T P K aggttttattggagttgcttgctgaagtaaaaactcccaaagcatggtcgggactttgag

V L L E L L A E V K T P K A W S G L * ttatgataagtgccattctattttttgtaagagtatctaattgagttttaaggaacatat

ggaatatagaaattaaaatgttacaatatatttgg

Hình 1.5 Trình tự gen và amino acid tương ứng của gen entP và gen miễn dịch [102]

Đoạn gạch chân -10 và -30 : trình tự promotor giả thiết; RBS vị trí nhận biết của ribosome

trong quá trình dịch mã, mũi tên chỉ vị trí phân cắt tiền bacteriocin

Khung đọc đầu tiên là gen cấu trúc entP (structural gene) mã hoá cho chuỗi

peptide tiền EntP gồm 71 amino acid 27 amino acid đầu tiên là đoạn peptide tín hiệu đầu N đặc thù kị nước, 44 amino acid tiếp theo là EntP trưởng thành Đoạn peptide tín hiệu sẽ bị cắt bỏ tại vị trí sau nhóm amino acid Val-Asp-Ala để tạo ra

EntP trưởng thành có hoạt tính sinh học gồm 44 amino acid có khối lượng phân tử tính theo lý thuyết là 4,493 kDa

Khung đọc mở thứ hai (orf2) là gen miễn dịch (immunity gene) mã hoá cho

protein có nhiệm vụ bảo vệ tế bào chủ khỏi bị tác động của chính EntP Protein này gồm 88 amino acid có khối lượng phân tử được tính toán là 9,886 kDa [21]

1.2.7 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG ENTEROCIN P TRONG

NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI

Từ những lợi ích thiết thực của enterocin trong việc bảo quản nhiều loại thực phẩm, các nhà khoa học đã tìm cách để thu được lượng lớn peptide này để đưa ra

ứng dụng như một thương phẩm Thông thường, các chủng vi khuẩn Enterococcus

có khả năng sản sinh enterocin lại thường tiết ra các độc tố Vì thế, việc lên men, thu hồi enterocin ở dạng sạch đủ tiêu chuẩn sử dụng trong thực phẩm gặp nhiều khó khăn Để khắc phục, gần đây có nhiều công trình nghiên cứu đã tập trung tạo enterocin tái tổ hợp nhằm chủ động điều khiển sinh tổng hợp enterocin cũng như chủ động việc tinh sạch enterocin cho ứng dụng

Từ năm 2005, hàng loạt các công trình nghiên cứu biểu hiện gen entP trong

nhiều hệ biểu hiện khác nhau đã được công bố Nhóm nghiên cứu ở Hà Lan đã nhân

gen mã hoá cho pre-EntP từ hệ gen E faecium P13 và đưa vào vector pHLP5 để biểu hiện trong tế bào L lactis NZ9000 Kết quả, gen entP đã được biểu hiện và tiết

tốt ra ngoài môi trường Tuy nhiên mức độ biểu hiện đã không được nêu rõ [16]

Nhóm nghiên cứu ở Tây Ban Nha cũng đưa gen mã hóa cho pre-EntP từ hệ gen của

E faecium P13 vào biểu hiện trong bốn hệ biểu hiện khác nhau là E coli Tuner (DE3), Methylobacterium extorquens, L lactis và nấm men P pastoris với mong

muốn tìm ra được chủng biểu hiện enterocin tốt cho nghiên cứu ứng dụng Kết quả

nghiên cứu cho thấy, enterocin được tổng hợp với hiệu suất rất thấp trong tế bào E coli Tuner (DE3) [47] Trong hệ biểu hiện M extorquens ATCC 55366, là chủng

có khả năng sinh tổng hợp nhiều protein tái tổ hợp rất tốt khi sử dụng methanol như

nguồn cacbon cho sinh trưởng, gen entP được biểu hiện mạnh gấp 25 lần so với trong hệ E coli, nhưng lượng EntP được tổng hợp tối đa chỉ đạt 155 ng/ml và hoạt

tính kháng khuẩn E faecium T136 chỉ được phát hiện khi EntP tái tổ hợp được tinh

sạch và cô đặc [46] Gutierrez và cộng sự lại tiếp tục đưa gen entP vào biểu hiện trong nấm men P pastoris vì đây cũng là một hệ biểu hiện mạnh, có khả năng tiết

rất tốt protein tái tổ hợp ra ngoài môi trường, protein tái tổ hợp thu được thường ở dạng sạch và điều đặc biệt quan trọng là chủng nấm men này không sinh độc tố nên

có thể sử dụng được trong thực phẩm và y học Gen mã hoá cho EntP trưởng thành

đã được đưa vào vector pPICZA và biến nạp vào chủng nấm men P pastoris X33 Kết quả là khi nuôi cấy trong môi trường giàu, chủng nấm men tái tổ hợp có thể tạo

ra EntP với hàm lượng gấp 3,7 lần so với chủng tự nhiên Đồng thời điểm đáng

nhấn mạnh ở đây là hoạt tính kháng khuẩn của EntP được tổng hợp từ P pastoris đã

tăng gấp 16 lần so với hoạt tính của EntP tự nhiên Các tác giả đã đưa ra kết luận là cần tối ưu lên men để thu enterocin này cho ứng dụng [48] Gutierrez và cộng sự

cũng đưa gen entP vào biểu hiện trong L lactis bằng nhiều cách khác nhau Kết quả

là tất cả các chủng tái tổ hợp thu được đều có khả năng sinh tổng hợp EntP tốt, gấp

3 đến 5 lần EntP được tạo ra từ chủng gốc và hoạt tính kháng khuẩn tăng 14 lần

[49]

Ở Việt nam, việc nghiên cứu tìm kiếm chất bảo quản thực phẩm có nguồn gốc sinh học - bacteriocin đã bắt đầu từ nhiều năm qua tại nhiều viện nghiên cứu và trường đại học trên cả nước như Viện Công nghệ sinh học, Viện cơ điện Nông nghiệp và công nghệ Sau thu hoạch, Viện Di truyền và Công nghệ sinh học Nông nghiệp, Viện Công nghiệp thực phẩm, trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh… Bước đầu tập trung vào hướng tìm kiếm, tuyển chọn, xác định đặc tính chủng giống và bacteriocin của chúng, Phạm Ngọc Lan và cộng sự đã phân lập được chủng Tn 143

có tác dụng ức chế sự phát triển của B subtilis, B cereus, Samonella Phan Khánh Hoa đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp nisin từ vi khuẩn L lactis [99] Nhóm

tác giả Phạm Văn Ty đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của loài

Lactobacillus plantarum L24 [5] Nhóm nghiên cứu của tác giả Lê Thanh Bình đã

xác định hoạt tính sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic và nâng cao hoạt

tính sinh tổng hợp bacteriocin của các chủng Lactococcus bằng cách chọn tế bào

kháng nisin [2, 4] Ngoài ra một số nghiên cứu mở rộng tác động của nisin đối với các vi sinh vật thuộc nhóm Gram âm, nấm men và nấm mốc, sử dụng nisin chế tạo các màng bao gói thực phẩm, thay thế phương pháp bổ sung trực tiếp nisin vào thực phẩm, hay nghiên cứu ứng dụng nisin do nước ngoài sản xuất để bảo quản một

số thực phẩm như sữa, nước mắm, cá, trứng…[6, 99] Nhìn chung, những công trình đã công bố hiện nay chủ yếu tập trung vào phân lập, tuyển chọn và tối ưu nuôi cấy các chủng sinh bacteriocin tự nhiên có năng suất cao

1.3 VECTOR TÁCH DÒNG pJET1

Hình 1.6 Sơ đồ cấu trúc plasmid pJET1 [57]

Vector pJET1 là một plasmid thương mại được cung cấp từ hãng Fermentas, với nhiều ưu điểm đặc biệt phù hợp cho mục đích tách dòng Vị trí vùng đa nối

MCS (multiple cloning site) được thiết kế nằm trong gen eco47IR là gen độc, có tác dụng gây chết đối với tế bào E coli Khi gen ngoại lại được chèn vào vùng đa nối sẽ phá vỡ cấu trúc gen eco47IR, và như vậy, cùng với gen bla mã hóa cho enzyme beta

lactamase, chỉ những tế bào chứa plasmid mang gen ngoại lai mới có thể sinh trưởng được bình thường, tạo thành khuẩn lạc trên môi trường có chứa ampicillin Ngoài ra pJET1 còn được thiết kế để gắn với các đoạn DNA đầu bằng

1.4 VECTOR BIỂU HIỆN pTWIN VÀ HỆ BIỂU HIỆN E coli

1.4.1 VECTOR BIỂU HIỆN pTWIN

pTWIN1 là một vector thuộc hệ IMPACT-TWIN - kết quả nghiên cứu của New England Biolabs (hãng Biolabs) Đây là một hệ thống biểu hiện và tinh sạch protein mới, sử dụng hoạt tính tự phân cắt của các protein dung hợp, đó là các intein (một đoạn bên trong của protein) để phân tách protein khỏi đuôi ái lực

Vector pTWIN1 (7375 bp) đƣợc sử dụng để tạo dòng và biểu hiện protein tái

tổ hợp trong E coli Ƣu điểm quan trọng nhất của hệ vector này là có trình tự DNA

mã hóa cho 2 protein intein có thể dung hợp với protein đích là intein 1 (Ssp DnaB mini-intein) và intein 2 (Mxe GyrA mini-intein) [78] Việc dung hợp này rất cần

thiết khi biểu hiện những đoạn peptide ngắn, tránh đƣợc hiện tƣợng phân cắt của protease nội bào, nhờ đó tăng sản lƣợng của protein ngoại lai [92]

Hình 1.7 Sơ đồ biểu hiện và tinh sạch protein sử dụng vector pTWIN1

(a): Dung hợp protein đích với intein 1, việc thu hồi protein đích dựa trên cơ sở sự phân cắt protein dung hợp tại đầu C của intein trong điều kiện pH thích hợp

(b): Dung hợp protein đích với intein 2, việc thu hồi protein đích dựa trên sự phân cắt protein dung hợp tại đầu N của intein khi có mặt MESNA hoặc DTT

Intein1 là protein đƣợc mã hóa từ gen dnaB của Synechocystis sp Đây là intein nhỏ (mini-intein) gồm 154 amino acid, đƣợc biến đổi từ Ssp DnaB intein có

Gen đích

Tách dòng và biểu hiện

và biểu hiện

chiều dài 492 amino acid Phần hoạt tính được cải biến bằng cách thay thế amino

acid Cys đầu N của Ssp DnaB intein bằng một Ala để ngăn cản sự ghép nối protein

và hoạt động phân cắt đầu N của nó Sự phân cắt protein dung hợp sẽ diễn ra tại đầu

C của intein trong điều kiện phụ thuộc pH Phản ứng phân cắt này diễn ra ở pH thích hợp nhất là 6,0 -7,5, nhưng bị ngăn cản ở pH dưới 5,5 và trên 8,0

Intein2 trên pTWIN1 cũng là một intein nhỏ, gồm 198 amino acid có nguồn

gốc từ gen gyrA của M xenopi Intein này được tạo ra bằng cách thay thế amino acid Asn 198 đầu C của Mxe GyrA intein bằng Ala Sự phân cắt protein dung hợp

sẽ diễn ra tại đầu N của intein khi có mặt axit 2-mercaptoethanesulfonic (MESNA)

hoặc 1,4 -Dithiothreitol (DTT) Mxe GyrA mini-intein trên các vector như pTXB1,

pTXB3 hay pTWIN1 được sử dụng trong quá trình biểu hiện các protein gây độc cho tế bào vi khuẩn

Ngoài ra, vector pTWIN1 còn được thiết kế gồm các nhân tố di truyền được sắp xếp hợp lý nhằm điều khiển tối ưu cả quá trình phiên mã và dịch mã tổng hợp nên protein từ gen ngoại lai [78]:

- Vector pTWIN1 sử dụng promoter T7 (có nguồn gốc từ thực khuẩn thể T7)

để điều khiển quá trình phiên mã gen ngoại lai Đây là một promoter hoạt động rất

mạnh trong tế bào E coli và có tính đặc hiệu cao Quá trình phiên mã được điều hòa bởi protein LacI- sản phẩm của gen lacI

- Trên vector pTWIN1 có gen lacI cho phép điều hòa quá trình phiên mã ngay cả khi chủng E coli thiếu gen lacI nội sinh

- Vùng đa nối bao gồm các trình tự nhận biết của các enzyme hạn chế thông thường, giúp cho quá trình đưa đoạn gen ngoại lai vào vector biểu hiện trở nên dễ dàng hơn

- Tâm tái bản DNA từ thực khuẩn thể M13 cho phép sự tạo thành DNA sợi đơn sử dụng thực khuẩn thể hỗ trợ (M13K07 Helper Phage)

- Vector pTWIN1 mang gen chọn lọc AmpR (gen bla) truyền tính kháng

ampicilin sang tế bào chủ, tạo thuận lợi cho việc nhận biết các dòng tế bào mang plasmid

- Việc phát hiện và tinh chế protein đích dễ dàng nhờ cấu trúc CBD - chitin binding domain - gắn ở đầu mỗi intein

Như vậy, hệ vector pTWIN1 không những thuận lợi cho việc biểu hiện mà còn cho quá trình tinh sạch protein ngoại lai

1.4.2 CHỦNG VI KHUẨN BIỂU HIỆN E coli ER2566

E coli là vi khuẩn Gram âm, kị khí tùy tiện và không sinh bào tử Chúng có

bộ máy di truyền tương đối đơn giản, thành phần di truyền sơ cấp chỉ là một nhiễm

sắc thể đơn với khoảng 5 triệu cặp bazơ (bằng 1/600 hệ gen người) Tế bào E coli

có khả năng sinh sản với tốc độ rất nhanh trên những môi trường nuôi cấy đơn giản,

trung bình 22 phút chúng lại phân chia một lần Đặc biệt, E coli có khả năng thu

nhận rất nhiều các yếu tố di truyền từ môi trường ngoài như plasmid, phage… với

khả năng sao chép DNA rất lớn Chính vì vậy E coli đã được cải biến để sử dụng

như một vật chủ hữu hiệu trong kĩ thuật tách dòng cũng như trong biểu hiện gen [1]

Trong quá trình biểu hiện protein ngoại lai thường xảy ra hiện tượng các protein sau khi được biểu hiện bị các protease nội bào phân giải Để hạn chế hiện tượng này người ta đã tạo các chủng biểu hiện mang các gen đột biến làm mất khả

năng tổng hợp các protease Chủng biểu hiện E coli ER2566 là một chủng đột biến như vậy Tế bào E coli ER2566 chứa đột biến lon protease (một protease nội bào)

và ompT protease (một protease ngoại bào) nên hạn chế khả năng thuỷ phân protein

Ngoài những đặc điểm trên thì trong DNA hệ gen của E coli ER2566 có

chứa gen mã hoá cho T7 RNA polymerase Đây là gen có nguồn gốc từ

bacteriophage T7 được đưa vào hệ gen của E coli ER2566 đặt dưới sự điều khiển của promoter lac cảm ứng với IPTG T7 RNA polymerase rất đặc hiệu với promoter

của phage T7 nên có khả năng phiên mã hoàn toàn bất kỳ trình tự DNA nào nằm dưới

sự điều khiển của promoter T7 Đây còn là một enzyme hoạt động rất mạnh, có tốc

độ kéo dài chuỗi nhanh gấp 5 lần so với các RNA polymerase khác có nguồn gốc từ

E coli Do đó, sự có mặt của T7 RNA polymerase giúp tổng hợp một lượng lớn

protein ngoại lai dưới sự điều khiển của promoter T7 Chính nhờ những cải biến này

mà E coli ER2566 đã trở thành vật chủ hữu hiệu trong việc biểu hiện gen ngoại lai

[78]

Pichia pastoris

1.5.1 VECTOR BIỂU HIỆN pPIC9 và pPICZA

Tất cả các vector biểu hiện trong P pastoris đều là plasmid được thiết kế phù hợp để có thể biến nạp cả vào tế bào E coli và P pastoris Những plasmid này đều

chứa một điểm khởi đầu sao chép Ori và một gen kháng kháng sinh để có thể chọn

lọc trong tế bào E coli

1.5.1.1 Vector biểu hiện pPIC9

Vector biểu hiện pPIC9 được thiết kế có chứa gen kháng ampicillin dùng cho

chọn lọc trong tế bào E coli và gen his4 (histidinol dehydrogenase) dùng làm dấu chuẩn chọn lọc trong tế bào nấm men P pastoris Plasmid pPIC9 là một vector biểu

hiện protein ngoại lai mạnh Trên vector có một số điểm của enzyme hạn chế như

XhoI, EcoRI, NotI, SnaBI, AvrII nằm trong vùng đa nối để tạo điều kiện thuận lợi

cho việc đưa gen ngoại lai vào vector Ngoài ra, vector này còn chứa một trình tự

tiết α-MF prepro được gắn với promoter AOX1 để protein ngoại lai được tiết ra môi

trường nuôi cấy

Để gen ngoại lai có thể hoạt động và tồn tại bền vững trong chủng biểu hiện, vector biểu hiện được tích hợp vào hệ gen của vật chủ nhờ trao đổi chéo giữa các vùng tương đồng của vector biểu hiện và hệ gen của nấm men Thông thường,

vector được mở vòng bằng một số enzyme hạn chế như SalI, StuI nằm trong trình tự gen HIS4 để định hướng vector tích hợp hiệu quả vào gen his4 bị đột biến trong hệ gen Đồng thời gen his4 được sử dụng như là dấu chuẩn chọn lọc các thể tái tổ hợp Chủng nấm men được sử dụng trong nghiên cứu này là chủng P pastoris GS115 đã

bị đột biến khuyết dưỡng histidine, do vậy chỉ những dòng nấm men tái tổ hợp đã tích hợp vector biểu hiện mới có khả năng phát triển trên môi trường không có histidine [57, 61] Cơ chế tích hợp của vector pPIC9 vào hệ gen nấm men được thể hiện trên hình 1.9

Hình 1.8 Sơ đồ cấu trúc plasmid pPIC9 [57]

Hình 1.9 Cơ chế tích hợp vector biểu hiện pPIC9 vào hệ gen P pastoris [57]

HIS4: gen HIS4 không bị đột biến nằm trong vector biểu hiện; his* : gen his4 bị đột biến

nằm trong hệ gen của nấm men

1.5.1.2 Vector biểu hiện pPICZA

Với thiết kế tương tự như plasmid pPIC9 nhưng gọn nhẹ hơn, vector pPICZA có chứa gen kháng kháng sinh zeocin sử dụng làm dấu chuẩn cho chọn

lọc trong cả tế bào E coli và tế bào nấm men P pastoris Các thành phần khác như

trình tự một số enzyme hạn chế trong vùng đa nối, trình tự tín hiệu tiết, vùng khởi

Gen ngoại lai

Gen ngoại lai

* đột biến

đầu phiên mã hoàn toàn tương tự như ở plasmid pPIC9

Hình 1.10 Sơ đồ cấu trúc plasmid pPICZA [58]

Hình 1.11 Cơ chế tích hợp của vector biểu hiện pPICZA vào hệ gen P pastoris [46]

Để có thể hoạt động và tồn tại bền vững trong chủng biểu hiện, vector pPICZA cũng cần được tích hợp vào hệ gen của tế bào nấm men nhờ trao đổi chéo giữa vùng 5’AOX1 của vectơ với 5’AOX1 trên hệ gen và cài vào vị trí sau promotor AOX1 Thông thường, để định hướng vector tích hợp hiệu quả vào hệ gen

pPICZ  A 3.6 kb

của nấm men P pastoris, vector biểu hiện được cắt mở vòng bằng enzyme hạn chế SacI hoặc PmeI hoặc BstI nằm trong trình tự 5’ AOX1 Hình 1.11 mô tả cơ chế tích

hợp của vector pPICZA vào hệ gen nấm men

1.5.2 CHỦNG BIỂU HIỆN NẤM MEN P pastoris GS115 và P pastoris X33

Trong số 4 hệ biểu hiện gen thường được sử dụng là E coli, Bacillus, nấm

men và tế bào động vật thì nấm men được xem là hệ biểu hiện hiệu quả nhất đặc biệt là trong biểu hiện các protein có nguồn gốc từ eucaryot Nấm men có tốc độ

sinh trưởng nhanh và lợi thế về thao tác di truyền thuận tiện như E coli đồng thời

lại có môi trường nhân chuẩn, thực hiện được rất nhiều cải biến protein sau dịch mã như cắt bỏ các trình tự tín hiệu, bao gói, cuộn xoắn, tạo cầu disulfide, glycosyl hóa khiến protein ngoại lai có tính tan tốt, giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo

hoạt tính sinh học, vấn đề thường bị hạn chế khi biểu hiện trong E coli Lợi thế của

nấm men so với hệ biểu hiện tế bào động vật là sinh trưởng rất nhanh (trung bình

1-3 giờ/thế hệ so với nuôi cấy mô tế bào 1 ngày/thế hệ), các trang thiết bị, môi trường nuôi cấy, kỹ thuật xử lý, đặc biệt là quá trình tinh sạch protein tái tổ hợp đơn giản

một promoter mạnh lấy từ promoter điều khiển phiên mã gen alcohol oxidase (AOX1) dùng cho phiên mã gen ngoại lai Gen này được điều khiển chặt chẽ và bị

ức chế trong điều kiện sinh trưởng không có methanol Trong môi trường có methanol, promoter được cảm ứng để khởi đầu phiên mã gen ngoại lai đồng thời nấm men sử dụng methanol làm nguồn carbon cho sinh trưởng Khi nấm men sinh

trưởng trong môi trường có glucose hay ethanol thì gen AOX1 không được biểu

hiện trong tế bào Vì vậy, ta có thể dễ dàng điều khiển sự tổng hợp gen ngoại lai trong chủng nấm men này

Để được tiết ra ngoại bào, trình tự amino acid của protein tái tổ hợp đòi hỏi phải có một tín hiệu tiết ở đầu N để giúp cho các protein có thể đi qua màng tế bào

Các vector dùng cho biểu hiện gen ngoại lai trong P pastoris có chứa tín hiệu tiết được thiết kế sẵn, thông thường là α-MF prepro Đây là tín hiệu có nguồn gốc từ nấm men S cerevisiae Tín hiệu này gồm khoảng 89 amino acid giúp protein đi qua

màng của mạng lưới nội chất dễ dàng Trong khi chuyển vào lưới nội chất, trình tự

tiết α-MF prepro của protein sẽ được loại bỏ khỏi sản phẩm dịch mã sơ cấp và

protein được tiết ra môi trường là các protein hoàn chỉnh Đồng thời, trong khi đi vào lưới nội chất, protein ngoại bào còn trải qua sự biến đổi khác như quá trình glycosyl hóa Sau đó protein sẽ được vận chuyển đến thể Golgi Tại đây chúng được bao gói trong các túi tiết và dung hợp với màng tế bào để tiết ra ngoài [30, 61]

P pastoris sinh trưởng tốt ở khoảng nhiệt độ 28o – 30o C Nhiệt độ môi trường nuôi cấy cao hơn 32o C sẽ ảnh hưởng tới quá trình tiết protein, thậm chí dẫn đến chết tế bào [58, 61] P pastoris không lên men mạnh như S cerevisiae và vì vậy, các chủng P pastoris tái tổ hợp có thể dễ dàng nuôi cấy đến mật độ tế bào 100

g/lít hoặc thậm chí lớn hơn Điều này có ý nghĩa đặc biệt khi biểu hiện các protein

tiết bởi nồng độ protein tái tổ hợp được sinh ra tỷ lệ thuận với hàm lượng tế bào P pastoris không sinh ra các liposaccharide gây dị ứng, các chất gây sốt hay độc tố

Các thành phần trong môi trường nuôi đều được xác định rõ ràng (chỉ chứa một nguồn cacbon, methanol hoặc glycerol, biotin, muối) tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tinh sạch protein sau biểu hiện gen [30, 61]

Hiện nay, nhiều chủng P pastoris cùng với các vector biểu hiện được thiết

kế tương ứng đã được thương mại hóa và được sử dụng để tạo ra rất nhiều protein của người, động thực vật, nấm sợi, vi khuẩn Chủng GS115 là chủng nấm men bị

bất hoạt gen histidine dehydrogenase (his4), sau khi được tích hợp vector biểu hiện

tương ứng (ví dụ vector pPIC9 có chứa gen HIS 4) sẽ cho phép chọn lọc các dòng tái tổ hợp dựa trên khả năng sinh trưởng trên môi trường không chứa histidine Chủng X33 là chủng nấm men dạng dại, có sức sống tốt, thường được sử dụng cùng dòng các vector biểu hiện pPICZ và pPICZ Các dòng tái tổ hợp được chọn lọc

dựa trên khả năng sinh trưởng trên môi trường có chứa kháng sinh zeocin giúp giảm thiểu tối đa hiện tượng tạp nhiễm giống [30, 58] Cả 2 chủng GS115 và X33 đều có chứa gen alcohol oxidase 1 (AOX1), chịu trách nhiệm chuyển hóa 85% methanol tiêu dùng bằng enzyme alcohol oxidase và vì vậy có kiểu hình dạng dại (methanol utilization – Mut+)

Toàn bộ các vector và chủng vi sinh vật dùng cho biểu hiện gen entP của

Kích thước 7375 bp, được thiết kế trình tự DNA mã hóa cho cho 2

protein intein có thể dung hợp với protein đích là intein 1 (Ssp DnaB mini-intein) và intein 2 (Mxe GyrA mini-intein) Protein đích được thu

hồi nhờ cơ chế phân cắt protein dung hợp bởi pH hoặc DTT

Được sử dụng để tạo dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp trong E coli

Được sử dụng làm vector biểu hiện trong nấm men

E coli ER2566 Chứa gen mã hóa cho T7-RNA polymerase

Mang các đột biến mất khả năng tổng hợp một số protease

P pastoris GS115

Mang gen his4 làm mất khả năng tổng hợp histidine và gen AOX1

(alcohol oxidase) giúp nấm men sinh trưởng trên môi trường chứa methanol là nguồn cacbon duy nhất

P pastoris X33 Mang gen AOX1 giúp nấm men sinh trưởng trên môi trường chứa

methanol là nguồn cacbon duy nhất

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

R(mcr Chủng vi khuẩn B subtilis ATCC 6633, S aureus ATCC 13709 (Viện Hóa học R(mcr Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), L plantarum JCM1149, L plantarum A88 JCM1048, L algilis Lp A17, L salivarius Lp B33, L fermentum Lp B14,

E faecium JCM5804, E faecium B650, S Thermophilus Str Thermo , E coli,

B cereus, L monocytogenes ATCC 35152 (Phòng Kỹ thuật Di truyền - Viện

Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) được sử dụng làm sinh vật chỉ thị để đánh giá khả năng kháng khuẩn của EntP tái tổ hợp

- Chủng nấm men P pastoris GS115 [his4] và P pastoris X33 của hãng

Invitrogen được sử dụng làm chủng biểu hiện

2.1.1.2 Plasmid

Plasmid pJET1/blunt (Fermentas) được sử dụng làm vector tách dòng Hệ vector pTWIN1 (BioLabs), pPIC9 và pPICZA (Invitrogen) được sử dụng làm vector biểu hiện Trình tự gen mã hóa cho EntP được lấy trên ngân hàng Gen quốc

tế (Genbank) với ký hiệu AF005726.1

2.1.1.3 Các trình tự DNA mồi

Mồi dài xuôi (ký hiệu entP-F1, bảng 2.1) gồm 91 nucleotide mang trình tự từ

nucleotide thứ 1 đến nucleotide thứ 75 của gen entP với 2 nuclceotide được cải biến

là T thay cho G và T thay cho C tại vị trí 6 và 48 nhằm tránh bộ ba hiếm trong chủng biểu hiện mà vẫn đảm bảo trình tự amino acid trong protein sau dịch mã Mồi dài ngược (ký hiệu entP-R1, bảng 2.1) gồm 90 nucleotide mang trình tự từ

nucleotide thứ 54 đến nucleotide cuối cùng (135) của gen entP Hai mồi có một

đoạn trình tự 18 nucleotide (đoạn gạch chân) có thể bắt cặp bổ sung ở nhiệt độ gắn mồi

Bảng 2.1 Trình tự các mồi dùng trong luận án

STT Ký hiệu

1 entP-F1 tcttctcgaggacccggctactcgttcatatggtaatggtgtttattgt

Mồi ngắn, xuôi entP-pastoris F3/XhoI, được thiết kế vị trí nhận biết bởi XhoI

và trình tự cắt Kex2 ngay trước đầu 5’ của gen entP nhằm bảo đảm trình tự hoàn