Nghiên cứu khả năng chống ung thư của các hoạt chất phân lập từ cây Vông nem (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) và cây Hậu phác (Magnolia officinalis R

Một số đặc điểm của ung thư Trong quá trình đa giai đoạn hình thành khối u, tế bào ung thư TBUT thu nhận và biểu hiện nhiều đặc điểm, trong đó có sáu khả năng sinh học nổi bật tạo nên

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƯ CỦA CÁC

HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) VÀ CÂY HẬU PHÁC (Magnolia officinalis Rehd

Et Wils, Magnoliaceae)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2012

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƯ CỦA CÁC

HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) VÀ CÂY HẬU PHÁC (Magnolia officinalis Rehd

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH MINH HỌA vi

BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về ung thư 3

1.1.1 Một số đặc điểm của ung thư 3

1.1.2 Các giai đoạn phát triển của ung thư 5

1.2 Các mô hình sàng lọc thuốc chống ung thư 8

1.2.1 Nuôi cấy cơ quan 8

1.2.2 Nuôi cấy tế bào 8

1.2.3 Nuôi cấy khối cầu đa bào ung thư (multicellular tumor spheroid)……… 10

1.2.4 Mô hình in vivo 12

1.3 Mô ̣t số dòng tế bào ung thư 14

1.3.1 Dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết ở người - HCT116 14

1.3.2 Dòng tế bào ung thư biểu mô cổ tử cung ở người - Hela 14

1.3.3 Dòng tế bào ung thư biểu mô vú ở người - MCF7 15

1.3.4 Dòng tế bào ung thư vú ở người - KPL4 16

1.4 Chế phẩm Honokiol, Magnolol, Derrone và thuốc Taxol 16

1.4.1 Honokiol (H) và Magnolol (M) 16

1.4.2 Derrone (D) 19

1.4.3 Taxol (Paclitaxel) 20

1.5 Enzyme Aurora kinaza 22

CHƯƠNG 2 – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.2 Máy móc, dụng cụ 25

2.3 Hóa chất sử dụng 26

2.4 Phương pháp hoạt hóa và nhân nuôi các dòng tế bào in vitro 27

2.5 Phương pháp thử độc tính MTS 28

2.6 Phương pháp thử độc tính trên mô hình spheroid 30

2.7 Phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang 31

3.1 Kết quả khảo sát đô ̣c tính của Honokiol , Magnolol và Derrone trên mô

hình 2D……… 33

3.1.1 Với dòng HCT116 33

3.1.2 Với dòng Hela 38

3.1.3 Với dòng MCF7 41

3.1.4 Với dòng KPL4 44

3.2 Kết quả nghiên cứu tác đô ̣ng của Honokiol trên mô hình 3D khối cầu đa bào MCF7………… 51

3.2.1 Kết quả thí nghiệm theo dõi sự tăng trưởng khối spheroid MCF7……… 51

3.2.2 Kết quả thí nghiệm kiểm tra tác động của Honokiol lên quá trình tạo khối spheroid MCF7 54

3.2.3 Kết quả thí nghiệm kiểm tra tác động của Honokiol lên sự tăng trưởng của khối spheroid MCF7 56

3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Honokiol lên hệ vi sợi actin 59

3.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Derrone lên sự phosphoryl hóa Histon H3 tại vị trí Serine 10 62

KẾT LUẬN 66

KIẾN NGHỊ 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Dụng cụ và vật tư tiêu hao 25

Bảng 2: Thiết bị sử dụng 26

Bảng 3: Hóa chất sử dụng 26

Bảng 4: Dải nồng độ cuối cùng của thuốc thử trong giếng 28

Bảng 5: Chỉ số tăng sinh A(%) của dòng HCT116 sau 48h ủ với với Honokiol, Magnolol và Taxol 35

Bảng 6: Giá trị IC 50 của Honokiol, Magnolol và Taxol với dòng HCT116 38

Bảng 7: Chỉ số tăng sinh A(%) Hela với Honokiol và Taxol 39

Bảng 8: Giá trị IC 50 của Honokiol và Taxol với dòng Hela 41

Bảng 9: Chỉ số tăng sinh A(%) của MCF7 với Honokiol và Taxol 43

Bảng 10: Giá trị IC 50 của Honokiol (H) và Taxol với dòng TBUT MCF7 44

Bảng 11: Chỉ số tăng sinh A(%) của dòng KPL4 với Honokiol, Magnolol, Derrone và Taxol 47

Bảng 12: Giá trị IC 50 của Honokiol, Magnolol, Derrone và Taxol với dòng KPL4 50 Bảng 13: Tổng hợp giá trị IC 50 và chỉ số tương quan R 2 của Honokiol, Magnolol, Derrone và Taxol 50

Bảng 14:Thể tích của khối spheroid MCF7 qua 25 ngày sau khi hạ giọt treo 52

Bảng 15: Thể tích trung bình khối spheroid MCF7 trong 15 ngày theo dõi ủ với Honokiol 58

DANH MỤC HÌNH MINH HỌA

Hình 1: Sáu đặc trưng cơ bản của ung thư 3

Hình 2: Thận chuột được sử dụng để sàng lọc thuốc 8

Hình 3: Các TBUT HeLa bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy 9

Hình 4: Mô hình cấu trúc cơ bản của khối u invivo và khối cầu đa bào ung thư 10

Hình 5: Dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết HCT116 ở người 14

Hình 6: TBUT vú MCF7 được nuôi cấy dạng đơn lớp in vitro 15

Hình 7: Cây Hậu phác bắc Magnolia officinalis Rehd Et wils (trái) và cấu trúc phân tử của hai đồng phân Honokiol và Magnolol (phải) 16

Hình 8: Cơ chế tác động của Honokiol (H) và Magnolol (M) lên con đường truyền tin dẫn đến apoptosis của tế bào 18

Hình 9: Cây vông nem Erythrina orientalis L., Fabaceae và công thức cấu tạo Derrone 19

Hình 10: Cấu trúc phân tử Taxol 20

Hình 11: Cơ chế tác động của Taxol lên tế bào gây apoptosis 22

Hình 12: Hình ảnh mô phỏng liên kết của Taxol với vi sợi tubulin 22

Hình 13: Các chất ức chế Aurora kinaza 24

Hình 14: Các dòng TBUT được bảo quản trong bình đựng Nito lỏng 27

Hình 15: Tế bào HCT116 mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x) 33

Hình 16: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Honokiol NĐ 5µg/mL (trái) và 10µg/mL (phải) (100x) 33

Hình 17: Tế bào HCT116 sau 48h ủ Magnolol ở nồng độ 5µg/mL (trái) và 50µg/mL (phải) (100x) 34

Hình 18: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Taxol nồng độ 0,003µg/mL (trái); 0,3µg/mL (giữa) và 30µg/mL (phải) (100x) 34 Hình 19: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của HCT116 với Honokiol (H)

Hình 28: Tế bào MCF7 sau 48h ủ với Honokiol ở nồng độ 5 (trái); 20 (giữa) và 50µg/mL (phải) (100x) 42

Hình 29: Tế bào MCF7 sau 48h ủ với Taxol NĐ 0,003 (trái), 0,3 (giữa), và 30µg/mL (phải) (100x) 42 Hình 30: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của MCF7 với Honokiol (H) 43 Hình 31: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của MCF7 với Taxol 44 Hình 32: Tế bào KPL4 mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x) 45

Hình 33: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Honokiol NĐ 5 (trái), 20 (giữa) và 50µg/mL (phải) (100x) 45

Hình 34: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Magnolol NĐ 5 (trái), 20 (giữa) và 50µg/mL (phải) (100x) 45

Hình 35: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Derrone NĐ 5 (trái) và 20µg/mL (phải) (100x) 46

Hình 36: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Taxol NĐ 0,003 (trái); 0,3 (giữa) và 30µg/mL (phải) (100x) 46 Hình 37: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Honokiol (H) 48 Hình 38: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Magnolol (M) 48 Hình 39: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Derrone (D) 49 Hình 40: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Taxol 49 Hình 41: Đồ thị biểu diễn sự tăng trưởng thể tích của khối spheroid MCF7 sau 25 ngày kể từ khi hạ giọt treo 52

Hình 42: Khối spheroid MCF7 trong 25 ngày quan sát kể từ khi hạ giọt treo 53

Hình 43: Khối spheroid MCF7 ở mẫu ĐCSH sau 5 (a) và 7 (b) ngày, ủ với Honokiol NĐ 5µg/mL sau 5 (c) và 7 (d) ngày và không tạo khối khi ủ Honokiol NĐ 10µg/mL (e) 55

Hình 44: Khối spheroid MCF7 mẫu ĐCSH sau 5, 9, 13 và 15 ngày hạ giọt treo 56

Hình 45: Khối spheroid MCF7 ủ với Honokiol nồng độ 10µg/mL sau 5, 9, 13 và 15 ngày hạ giọt treo (tương ứng từ trái qua phải) (400x) 56

Hình 46: Khối spheroid MCF7 ủ với Honokiol nồng độ 20µg/mL sau 5, 9, 13 và 15 ngày hạ giọt treo (tương ứng từ trái qua phải) (400x) 57

Hình 47: Các khối spheroid dưới tác động của Honokiol trở nên lỏng lẻo về mặt cấu trúc, các tế bào bên ngoài bong tróc ra khỏi khối từ ngày thứ 9 sau khi hạ giọt treo (400x) 57

Hình 48: Đồ thị tăng trưởng thể tích của khối spheroid MCF7 dưới ảnh hưởng của Honokiol (H) 58

Hình 49: Ảnh hưởng của Honokiol lên hình thái tế bào Hela Tế bào đối chứng (trái); Tế bào Hela ủ với Honokiol NĐ 10 µg/mL (phải); màu đỏ: actin; màu lam: nhân tế bào 60

Hình 50: Sự rối loạn phân bố của F-actin dưới tác động của Honokiol tại NĐ 10 µg/mL sau 48h ủ 60

Hình 51: Tế bào Hela sau 24h ủ với Honokiol tại NĐ 20µg/mL 61

Hình 52: Sự biểu hiện H3PS10 tại các kỳ khác nhau trong quá trình phân chia của

tế bào 64

Hình 53: So sánh biểu hiện của H3PS10 tại các mẫu tế bào xử lý với Derrone (b); Magnonol (c); Honokiol (d) và mẫu đối chứng (a) 65

BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT

HCT116 Human colorectal carcinoma cell line

HeLa Henrietta Lacks' 'Immortal' cell line

NST Nhiễm sắc thể

PBS Đệm phosphate saline – Phosphate buffered saline

TRAIL TNF-related apoptosis-inducing ligand

MỞ ĐẦU

Ung thư là nguyên nhân gây chết hàng đầu ở các nước có nền kinh tế phát triển và thứ hai ở các nước đang phát triển Gánh nặng ung thư ở các nước đang phát triển tăng lên do hậu quả của sự tăng dân số, già hóa dân số cũng như sự du nhập lối sống có tiềm năng gây ung thư như hút thuốc lá, ít vận động và thực phẩm

“Tây hóa” Theo Tổ chức Y tế thế giới – WHO, có khoảng 12.7 triệu ca ung thư và 7,6 triệu ca tử vong do ung thư được ghi nhận trong năm 2008, trong đó 56% số ca và 64% trường hợp tử vong là ở các nước đang phát triển Cũng theo dự báo của WHO, tới năm 2020, số người mắc ung thư trên toàn cầu có thể tăng lên đến 15 triệu ca mới mỗi năm Tỷ lệ chết do ung thư có thể chiếm 25% tổng số ca tử vong Theo số liệu công bố tại Hội thảo Quốc gia phòng chống ung thư, năm 2010 Việt Nam có 126.300 ca mắc mới Căn bệnh nan y này đang tăng nhanh so với 10 năm trước [1]

Vốn là một đất nước được thiên nhiên ưu đãi, nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có một thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng với hơn 12.000 loài thực vật bậc cao khác nhau Từ nhiều thế kỷ nay, thực vật không chỉ là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho con người mà còn là những phương thuốc chữa bệnh hết sức quý giá bao gồm thuốc chống ung thư nói riêng và các bệnh khác nói chung Bởi vậy, nghiên cứu tìm ra các hợp chất từ nguồn dược liệu thiên nhiên có khả năng chữa ung thư là một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học và thầy thuốc đầu

tư tập trung nghiên cứu trong nhiều năm nay

Trong xu hướng này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu hoạt tính kháng u của

ba chất Honokiol, Magnolol được tách chiết từ cây Hậu phác Magnolia officinalis

Rehd Et wils, Magnoliaceae và Derrone được tách chiết từ cây Vông nem

Erythrina orientalis L Murr., Fabaceae do Viện Dược liệu Trung ương cung cấp

cho nhóm Nghiên cứu Ung thư thực nghiệm, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội nhằm mục đích:

Khảo sát ảnh hưởng của ba chất Honokiol, Magnolol và Derrone lên

sự tăng trưởng của một số dòng tế bào ung thư nuôi cấy đơn lớp 2D Nghiên cứu ảnh hưởng của Honokiol lên mô hình 3D khối cầu đa bào các tế bào ung thư

Bước đầu nghiên cứu cơ chế tác động của Honokiol lên hệ thống vi sợi và tác động của ba chất lên hoạt động của enzyme Aurora kinaza ở

tế bào ung thư

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về ung thư

1.1.1 Một số đặc điểm của ung thư

Trong quá trình đa giai đoạn hình thành khối u, tế bào ung thư (TBUT) thu nhận và biểu hiện nhiều đặc điểm, trong đó có sáu khả năng sinh học nổi bật tạo nên đặc tính phức tạp về mặt tổ chức của bệnh, bao gồm: duy trì tín hiệu tăng sinh; trốn tránh các yếu tố ức chế khối u; chống lại sự chết của tế bào; cho phép nhân lên gần như bất tử; cảm ứng hình thành mạch máu và hoạt hóa quá trình xâm lấn và di căn Nguyên nhân sâu xa của những đặc điểm đặc trưng này là sự bất ổn của hệ gen trong TBUT dẫn đến những biến đổi về mặt di truyền, đồng thời cũng hỗ trợ các chức năng trên Ngoài ra, những nghiên cứu gần đây đề xuất thêm hai đặc trưng khác của ung thư bao gồm sự tái lập trình trao đổi năng lượng và sự trốn tránh hệ thống miễn dịch Tuy nhiên, cần những nghiên cứu sâu hơn để hai đặc trưng mới này được công nhận rộng rãi [14]

Về mặt hình thái, TBUT có sự thay đổi khá rõ nét so với tế bào bình thường:

 Về nhân: Nhân tăng kích thước, đa dạng, nhiều thùy, đặc biệt có những nhân khổng lồ phân chia mạnh gọi là nhân quái, nhân chia Màng nhân dày lên và đường viền không đều

 Về tỷ lệ giữa nhân và nguyên sinh chất: Nhân to lên trong khi nguyên sinh chất hẹp lại

 Về nguyên sinh chất: Có nhiều tổn thương thoái hóa như nhiều hang, hốc… Nguyên sinh chất chứa các chất chế tiết, thể vùi

 Không còn khả năng ức chế tiếp xúc nên dễ bong ra khỏi u

Về mặt chức năng, TBUT biệt hóa kém, không thực hiện được những chức năng bình thường và dễ hoại tử Đặc biệt, chúng tiết ra các chất chỉ điểm được gọi là marker như µFP, CA125 (ung thư buồng trứng), CA25 (ung thư đại tràng), HCG (ung thư nhau thai, tinh hoàn)…

Khi quan sát quần thể TBUT, các nhà khoa học đã đưa ra ba học thuyết khác nhau nhằm giải thích nguồn gốc quần thể này:

 Thuyết đơn dòng: Là quan niệm kinh điển cho rằng khối u phát sinh từ một tế bào mẹ nhân lên Ví dụ: Ở bệnh bạch cầu tủy trên phụ nữ da đen thấy đồng nhất loại tế bào thương tổn NST số 10 Các tế bào này đều tiết men Glucose-6-phosphate dehydroglubuline

 Thuyết đa dòng: Dựa trên kết quả quan sát hình thái và chức năng cho thấy tổ chức ung thư có nhiều loại tế bào nên khi chuẩn đoán tế bào học

dễ nhầm lẫn và có nhiều marker sinh học

 Thuyết về kém ổn định gen của TBUT: Có thể ban đầu là một dòng, do gen ung thư không ổn định nên có các tế bào biến dị sinh ra hàng loạt các

tế bào hỗn hợp Ví dụ: u lympho ác tính tế bào lớn, tế bào nhỏ hoặc các loại ung thư phổi thể hỗn hợp, ung thư mô liên kết thể hỗn hợp

1.1.2 Các giai đoạn phát triển của ung thư

Theo Douglas và Robert Weinberg, quá trình tiến triển của ung thư có thể chia làm 6 giai đoạn chính:

 Giai đoạn khởi phát: Các TBUT nhận được các tín hiệu thúc đẩy sự tăng sinh và phân bào Các tín hiệu này có thể xuất hiện do sự thay đổi của các yếu

tố ngoại bào hoặc do sự thay đổi bên trong hệ thống truyền tín hiệu nội bào dẫn tới sự tăng sinh và phân bào Thậm chí, trong một số trường hợp đặc biệt, các tín hiệu kích thích phân bào có thể được tạo ra từ chính các TBUT Khi đó,

tế bào được kích thích phân chia không giới hạn Quá trình này diễn ra nhanh

và hoàn tất trong một vài giây, không thể đảo ngược được Trong cuộc đời một con người, có nhiều tế bào trong cơ thể có thể trải qua quá trình khởi phát, nhưng không phải tất cả các tế bào đều phát sinh bệnh Đa số các tế bào khởi phát hoặc không tiến triển, hoặc chết đi, hoặc bị cơ chế miễn dịch vô hiệu hóa

 Giai đoạn thúc đẩy: Các tế bào trở nên “vô cảm” một cách bất thường với các tín hiệu ức chế phân bào Trong các tế bào bình thường, sự phân bào thường được kích hoạt bởi các tín hiệu nhất định; và tồn tại song song với chúng là các tín hiệu ức chế phân bào Bình thường, hai cơ chế này cùng tồn tại và phối hợp với nhau ở mức cân bằng, vì vậy sự phân bào diễn ra ổn định

và có tổ chức Ở các TBUT thì sự ngăn cản phân bào bị tê liệt, khi đó tế bào sẽ luôn được chuyển từ pha G1 sang S để tiến hành sao chép ADN và bước vào một chu trình tế bào mới bất kể các sai hỏng ADN có được khắc phục hay không Các tế bào sau giai đoạn tăng trưởng này sẽ tiếp tục phát triển thành các khối u ác tính

 Giai đoạn chuyển biến: Như ta đã biết, protein p53 giữ vai trò quan trọng trong quá trình bảo vệ cơ thể chống lại sự tích lũy sai hỏng ADN có thể gây nguy hiểm cho cơ thể Khi p53 bị mất chức năng này thì con đường apoptosis của tế bào không hoạt động Vì vậy tế bào hỏng có thể sống và tiếp tục nhân

có mức độ sai hỏng còn cao hơn chính nó Hậu quả là mỗi tế bào con hình thành đều có nguy cơ chuyển thành các TBUT Như vậy có thể nói, khả năng thoát khỏi cơ chế chết theo chương trình là “cột mốc” quan trọng để một TBUT phát triển thành khối u ác tính

 Giai đoạn lan tràn: Các TBUT có khả năng sao chép vô tận Ở người, mỗi

tế bào soma thường chỉ có khả năng sao chép trung bình khoảng 60 – 70 lần Tuy nhiên các TBUT có thể vượt quá số lần phân bào này nhờ việc ADN phần đầu mút nhiễm sắc thể được kéo dài nhờ hoạt động mạnh của enzyme ADN telomeraza Khi các TBUT đạt đến giai đoạn này, chúng được gọi là các tế bào bất tử Giai đoạn này có thể ngắn vài tháng hoặc cũng có thể kéo dài vài năm Trong giai đoạn này, khối u bành trướng, gia tăng có thể từ 100 đến 1 triệu tế bào nhưng vẫn còn quá nhỏ để các phương pháp khoa học phát hiện được

 Giai đoạn củng cố: Các tế bào phát triển hệ thống tự nuôi dưỡng Các mô trong cơ thể đa bào đều cần một hệ thống mạch máu cung cấp chất dinh dưỡng Các tế bào khối u tiền ác tính thường tăng trưởng chậm do chúng được nuôi dưỡng bởi hệ tuần hoàn bình thường Nhưng ở các TBUT, khi khối u phát triển đến một mức nhất định thì xuất hiện sự hình thành mạch máu mới Lúc này các khối u được nuôi dưỡng và phát triển rất mạnh Đây là một bước

“củng cố” các TBUT ác tính hình thành mạch máu mới nuôi dưỡng các khối u, giúp khối u phát triển mạnh mẽ và gây nguy hiểm cho cơ thể

 Giai đoạn xâm lấn và di căn: Ở giai đoạn này, các TBUT có khả năng xâm lấn vào các vùng mô khác và hình thành khối u mới Hơn 90% số bệnh nhân bị ung thư đều chết vào giai đoạn khi các TBUT đã di căn tới các phần khác nhau của cơ thể Khi các khối u di căn, các TBUT rời khỏi khối u nguyên phát và di chuyển dọc theo đường máu hoặc đường bạch huyết tới các vị trí khác nhau trong cơ thể trước khi chúng trú ngụ ở vị trí mới và hình thành khối ung thư mới Di căn theo đường bạch huyết thường gặp nhiều trong ung thư biểu mô, có thể lan tràn theo đường bạch huyết tại chỗ và đôi khi làm tắc, rồi

lan đến mạch bạch huyết vùng Trong phương thức di căn theo đường kế cận, các TBUT đi theo mạch máu và thần kinh, theo lối ít khi bị cản trở như ung thư dạ dày lan qua lớp thanh mạc vào ổ bụng, đến buồng trứng… Di căn theo đường máu thường gặp nhiều ở ung thư mô liên kết Khi đó, tế bào kết thúc ở mao mạch và tăng trưởng ở đó Như vậy kết quả di căn là sự hình thành các khối u thứ cấp ở vị trí có thể cách rất xa vị trí khối u nguyên phát ban đầu Khi ung thư đã tiến triển đến giai đoạn này thì sự kiểm soát và điều trị cực kỳ khó khăn Đây là giai đoạn cuối cùng và nguy hiểm nhất trong quá trình phát triển của ung thư Với khối u lành tính, giai đoạn này không xảy ra Các tế bào trong khối u lành tính sinh sản chậm và bám vào các mô liên kết tại chỗ, khối

u có ranh giới rõ ràng và không gây cảm giác đau cho người bệnh nếu kích thước khối u không quá to hay chèn ép vào dây thần kinh Do đó khối u lành không gây nguy hiểm cho người bệnh và dễ chữa trị [14, 32, 36]

Kể từ khi ung thư xuất hiện, lịch sử loài người đã sử dụng và phát triển nhiều phương pháp khác nhau để chống lại căn bệnh này như giải phẫu, vật lý trị liệu, hóa trị liệu, miễn dịch trị liệu, điều trị hướng đích…

Trước đây, thuốc chống ung thư được đưa vào nhóm phương pháp hóa trị liệu, trị liệu hóc môn và miễn dịch trị liệu Trong đó, hóa trị liệu lại bao gồm nhiều nhóm khác nhau tùy theo cấu trúc hóa học và cơ chế tác động như nhóm alkyl hóa, nhóm kháng sinh, nhóm chống chuyển hóa, nhóm ức chế topoisomeraza I và II, nhóm ức chế phân bào, các hợp chất platinum và các hợp chất khác Tuy nhiên, nhóm cuối cùng này vẫn đang ngày càng mở rộng nên các nhà khoa học đã đề xuất cách thức phân loại mới dựa trên đích tác động Cụ thể, các nhà khoa học cho rằng thuốc chống ung thư có thể tác động ở nhiều mức độ khác nhau: TBUT, nội mô, chất nền ngoại bào hay hệ thống miễn dịch TBUT có thể trở thành đích tác động ở mức độ ADN, ARN hay protein Hầu hết các tác nhân hóa trị liệu tương tác với ADN của TBUT trong khi các kháng thể đơn dòng và các phân tử nhỏ được thiết kế

để tác động ở mức độ protein, mức độ nội mô và mức độ chất nền ngoại bào Dù ở

trải qua một quá trình sàng lọc nghiêm ngặt trên nhiều đối tượng cũng như quy mô khác nhau Trong lịch sử phát triển lĩnh vực sàng lọc thuốc, đã có một số mô hình được sử dụng như:

1.2 Các mô hình sàng lọc thuốc chống ung thư

1.2.1 Nuôi cấy cơ quan

Đây là loại mô hình được sử dụng từ những năm 1950 Các cơ quan được

tách ra khỏi cơ thể, đem nuôi cấy in vitro Sau đó chúng được tương tác với các hợp

chất cần thử Ưu điểm của mô hình này là duy trì được tính nguyên vẹn của mô cũng như mối quan hệ giữa tế bào với tế bào, nhờ vậy mà nó có tính tương đồng cao

với điều kiện in vivo Tuy nhiên, do những khó khăn trong khác biệt về mẫu mà

việc đánh giá hiệu quả của thuốc có nhiều sai số, do vậy việc sử dụng mô hình này

bị hạn chế, và khó để áp dụng vào sàng lọc thuốc quy mô lớn [4]

Hình 2: Thận chuột được sử dụng để sàng lọc thuốc 1.2.2 Nuôi cấy tế bào

Như ta đã biết, các thử nghiệm độc tính ban đầu được tiến hành trên sinh thiết khối u nuôi cấy nhân tạo trong môi trường có thành phần không xác định, do vậy quá trình định lượng rất khó khăn Năm 1950, nhờ sự phát triển của công nghệ nuôi cấy tế bào thành dạng đơn lớp 2D trong đĩa Petri thủy tinh hoặc nhựa, kết hợp

với sự phát triển của môi trường có thành phần xác định về mặt hóa học nên quy trình sàng lọc thuốc được tiến hành đơn giản hơn trên các tế bào nuôi cấy 2D này

Sử dụng các loại thuốc nhuộm protein sẽ cho phép chúng ta xác định được mối quan hệ đáp ứng liều giữa các dòng tế bào khác nhau với các nồng độ thuốc thử khác nhau [39]

Các tế bào khi được phân lập đem nuôi cấy in vitro thường phát triển thành

dạng hoặc trôi nổi, hoặc bám dính, hoặc hỗn hợp cả 2 loại Các loại TBUT sống trôi nổi như tế bào u lympho, TBUT máu hay tế bào ung thư mô liên kết Sarcoma-180 Các tế bào này phát triển giống những hòn đảo nhỏ trôi nổi trong môi trường nuôi cấy Nhiều tế bào sống ở dạng bám dính như nguyên bào sợi, TBUT cổ tử cung HeLa, TBUT vú KPL4… Một số tế bào sống ở dạng hỗn hợp cả bám dính, cả trôi nổi như TBUT biểu mô phổi 3LL [11, 27, 39]

Hình 3: Các TBUT HeLa bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy

Sử dụng mô hình tế bào 2D có nhiều ưu điểm như thời gian sàng lọc ngắn, cho phép thao tác với nhiều dòng tế bào, nhiều hợp chất khác nhau và dải nồng độ rộng cùng một lúc Tuy nhiên, mô hình này có nhược điểm là tương tác giữa TBUT với hợp chất chỉ theo một chiều, thiếu sự tương tác giữa TBUT với hệ miễn dịch

cũng như của hệ miễn dịch với hợp chất Như vậy mô hình này không mô phỏng

được điều kiện in vivo của cơ thể [39]

1.2.3 Nuôi cấy khối cầu đa bào ung thư (multicellular tumor spheroid)

Mô hình nuôi cấy khối cầu đa bào ung thư, gọi tắt là mô hình spheroid, là một khối hình cầu được tạo nên từ TBUT Để tạo được mô hình này người ta tiến hành nuôi cấy giọt treo các TBUT Dưới tác dụng của trọng lực cùng với các liên kết giữa các tế bào, các TBUT tập trung lại và liên kết với nhau tạo nên các khối cầu nhỏ Sau đó các khối cầu nhỏ này được đưa vào các đĩa nuôi cấy chứa môi trường nuôi cấy tương ứng, đã phủ một lớp giá đỡ bên dưới [11, 39]

Hình 4: Mô hình cấu trúc cơ bản của khối u invivo và khối cầu đa bào ung thư

Cấu trúc của một khối spheroid bao gồm:

 Lớp vòng ngoài: Gồm khoảng từ 2-3 lớp tế bào sống, phân chia mạnh xếp khít nhau Độ dày mỏng của lớp này tùy thuộc từng dòng tế bào khác

nhau, tùy điều kiện môi trường và tùy nguồn tế bào ban đầu dùng để tạo spheroid

 Lớp trung gian: Gồm những tế bào vẫn sống nhưng đã ngừng phân chia Các tế bào của vùng này có thể hòa nhập để thành những tế bào của vòng ngoài hoặc vòng trong tùy thuộc điều kiện nuôi cấy (có mạch máu hoặc không, nồng độ glucozơ, pH…) Vai trò của vùng này khá quan trọng trong các thí nghiệm điều trị ung thư bằng hóa chất, xạ trị

 Lớp trong cùng: là lõi hoại tử, bao gồm những tế bào đã chết, có nhân kết đặc lại nên ánh sáng quang học không thể xuyên qua được, vì vậy lớp này có màu đen khi quan sát dưới kính hiển vi Độ dày mỏng của lớp này tùy thuộc vào từng giai đoạn khác nhau của quá trình sinh trưởng khối spheroid [34]

So với mô hình nuôi cấy tế bào đơn lớp thì cấu trúc của spheroid gần giống

với hệ thống in vivo hơn Các nghiên cứu gần đây cho thấy các tế bào được nuôi cấy

trong mô hình 3D biểu hiện các đặc tính khác so với khi nuôi cấy 2D Những sự khác biệt này được coi như là yếu tố giúp mô hình 3D phản ánh tốt hơn sự tương tác

giữa các TBUT với môi trường in vivo như:

 Về đặc điểm hình thái: Các TBUT nuôi cấy 2D có hình thái trải rộng không tự nhiên còn các TBUT nuôi cấy 3D có sự liên kết chặt chẽ ba

chiều, co cụm giống với khối u in vivo

 Về tốc độ tăng trưởng: Các TBUT nuôi cấy 3D phát triển chậm hơn so với khi nuôi cấy 2D Tốc độ phát triển ở mô hình 3D phản ánh các mô

hình toán học, động học của khối u in vivo tốt hơn so với mô hình 2D

 Các TBUT trong mô hình 3D cũng biểu hiện quá trình đường phân nhiều hơn và có sự khác biệt trong biểu hiện ở các gene chịu trách nhiệm trong quá trình tăng sinh mạch máu như VEGF (vascular endothelial growth factor), chemokine, IL-8 và các gene chịu trách nhiệm trong quá trình di

nhập và xâm thực của tế bào bao gồm Rho GTPase và FAK (focal adhesion kinaza)

 Các TBUT được nuôi cấy 3D thể hiện tính kháng mạnh hơn hoặc nhạy cảm hơn với một số liệu pháp hóa trị so với khi nuôi cấy 2D, tùy thuộc vào loại tế bào và loại thuốc Sự khác biệt trong độ nhạy này ở mô hình 3D có thể đặc trưng cho phương thức các TBUT đó đáp ứng với các

phương thức hóa trị liệu ở mức độ in vivo [24]

Như vậy, các khối cầu nhỏ này sẽ là mô hình tốt hơn để đánh giá độc tính, bởi lẽ chúng có cấu trúc ba chiều và mô phỏng được sự khuếch tán thuốc vào các

mô Spheroid còn cho phép đánh giá quá trình xâm nhập của thuốc vào các khối u không có mạch máu, đồng thời cũng đánh giá được tác động của O2, CO2 và sự xâm nhập của các chất dinh dưỡng trong môi trường vào các mô này Gần đây, các nhà khoa học đã tiến hành đồng nuôi cấy 3D các TBUT với các tế bào bình thường cũng

có mặt trong vi môi trường của khối u Khi đó, các tác động của thuốc lên các tế bào lành xung quanh khối u có thể được kiểm chứng Hầu hết các nghiên cứu được thực hiện trên spheroid cũng được thực hiện trên các dòng tế bào [24, 28, 30, 39, 47]

1.2.4 Mô hình in vivo

Thực nghiệm cho thấy rằng các TBUT của khối u ác tính trên cá thể này có thể cấy truyền cho các cá thể khác cùng dòng và các TBUT này cũng có khả năng phát triển và giết chết vật chủ mới Tất cả các tế bào bình thường của động vật có xương sống trưởng thành và các tế bào ở khối u của thực vật, giun tròn, động vật da gai và các dạng sống thấp khác không có khả năng này Chỉ có các dạng sống tổ chức cao như cá, lưỡng cư, bò sát, chim và động vật có vú có khả năng bị khối u ác tính Rõ ràng ung thư là một căn bệnh cổ đại, các nhà khoa học đã tìm thấy bằng chứng ung thư mô liên kết xương ở xương khủng long từ hơn bảy mươi triệu năm trước Do đó, việc sử dụng các mô hình động vật để thay thế con người trong việc nghiên cứu ung thư và sàng lọc thuốc là điều hoàn toàn có cơ sở khoa học [39]

Có nhiều loài động vật được sử dụng để xây dựng mô hình in vivo như thỏ,

mèo, chuột, cá, gà… Trong số đó, chuột được sử dụng rộng rãi hơn cả do sự tương đồng về mặt di truyền với con người cũng như sự tiện lợi khi nuôi và chăm sóc trong phòng thí nghiệm Chuột dễ sinh sản và đặc biệt là có sự ổn định khi dùng để gây tạo khối u thực nghiệm

Mô hình in vivo có ưu điểm nổi bật là đánh giá được chính xác tác động của

thuốc lên khối u cũng như lên cơ thể do sự tương tác của cả ba yếu tố: hệ miễn dịch, khối u và thuốc quyết định Tuy nhiên, quá trình sàng lọc trên mô hình này tốn nhiều thời gian hơn so với các mô hình khác và cần có sự theo dõi chặt chẽ, thường xuyên của người làm thí nghiệm [40]

Như vậy, có thể thấy dù sử dụng bất kì mô hình nào cũng sẽ có những ưu

nhược điểm riêng Nhưng dễ thấy rằng, mô hình nuôi cấy tế bào 2D in vitro có khả

năng tự động hóa cao, có thể sử dụng nhiều máy móc thay thế cho người làm thí nghiệm đồng thời rút ngắn được thời gian thao tác trên nhiều dòng tế bào với nhiều hợp chất khác nhau Do vậy, mô hình này rất phù hợp để sử dụng cho sàng lọc thuốc quy mô lớn, nhất là với sự phát triển một lượng lớn các thuốc có độc tính như hiện nay Mặt khác, sau quá trình sàng lọc quy mô lớn chúng ta sẽ thu nhận được các hợp chất có độc tính như mong muốn Lúc này, mô hình 3D đóng vai trò như

mô hình trung gian cho phép tiến hành các thử nghiệm mô phỏng môi trường in vivo trong cơ thể với chi phí rẻ hơn, dễ dàng tiến hành ở điều kiện phòng thí

nghiệm, quan sát được rõ ràng và nhanh hơn cơ chế thâm nhập và tác động của thuốc vào mô hình khối u mà lại tránh được các vấn đề về đạo đức trên các thử

nghiệm động vật Sau đó, mô hình in vivo sẽ trở thành một mô hình sàng lọc thứ cấp

cho phép ta đánh giá chính xác tác động của thuốc lên khối u trong cơ thể Việc sử

dụng mô hình in vitro như mô hình sàng lọc sơ cấp sẽ cho phép chúng ta tiết kiệm

thời gian cũng như kinh phí khi sàng lọc một số lượng lớn, lựa chọn ra những hợp

chất tiêu biểu có tác dụng để tiến hành thử in vivo

1.3 Mô ̣t số dòng tế bào ung thư

1.3.1 Dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết ở người - HCT116

HCT116 là dòng ung thư biểu mô ruột kết của người, sống ở trạng thái bám

dính khi nuôi cấy in vitro HCT116 có phản ứng dương tính với keratin khi nhuộm

immunoperoxidase, có một đột biến ở codon 13 ở proto-oncogene ras và có thể sử dụng như đối chứng dương trong phản ứng PCR kiểm tra đột biến ở codon này Dạng lưỡng bội của HCT116 có 45 NST, chiếm 62% và dạng đa bội chiếm 6.8% Kết quả phân tích nhuộm G-band cho thấy 50% số tế bào HCT116 thiếu NST Y

Hình 5: Dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết HCT116 ở người 1.3.2 Dòng tế bào ung thư biểu mô cổ tử cung ở người - Hela

Hela là dòng tế bào ung thư biểu mô cổ tử cung ở người (Cervix adenocarcinoma), được tách từ khối u ung thư cổ tử cung của một phụ nữ da đen ba mươi mốt tuổi Hela có các marker đặc hiệu và sống bám dính trong điều kiện nuôi

cấy in vitro 98% tế bào Hela có chứa một nhiễm sắc thể tâm giữa nhỏ và 100% là

aneuploidy Thời gian nhân đôi của Hela là 23h

Tính đến nay, đã có bốn marker nhiễm sắc thể (NST) điển hình của Hela được ghi nhận, bao gồm: M1 – là một vùng tái sắp xếp giữa cánh dài và tâm động của NST số 1 và cánh dài của NST số 3; M2 – là một tổ hợp của cánh ngắn NST số

3 và cánh NST số 5; M3 – là một NST tương tự (isochromosome) của cánh ngắn NST số 5; M4 - gồm cánh dài NST số 11 và một cánh của NST số 19 Nhuộm băng

G cho thấy tế bào Hela có một bản sao của M1, một bản sao của M2, bốn đến năm bản sao của M3 và hai bản sao của M4 Hela có phản ứng dương tính với keratin khi nhuộm immunoperoxidase và có chứa trình tự di truyền của virus u nhú 18 của người (human papilloma virus 18 – HPV-18); biểu hiện p53 thấp và pRB (retinoblastoma suppressor) ở mức bình thường

1.3.3 Dòng tế bào ung thư biểu mô vú ở người - MCF7

Hình 6: TBUT vú MCF7 được nuôi cấy dạng đơn lớp in vitro

MCF7 là dòng tế bào ung thư biểu mô vú, thu từ dịch màng phổi (vị trí di căn) của một phụ nữ sáu mươi chín tuổi, có đặc tính bám dính với thời gian nhân

đôi là 29h trong điều kiện in vitro MCF7 có một số đặc tính của biểu mô động vật

có vú đã biệt hóa bao gồm khả năng xử lý estradiol thông qua các thụ thể estrogen trong tế bào chất và khả năng tạo khối cầu MCF7 bị ức chế sinh trưởng bởi TNF-α

Về mặt kiểu nhân, thông thường số lượng NST điển hình của MCF7 là 82, có thể dao động từ 66 – 87 NST Dòng tế bào này có khoảng 29 – 34 marker NST, trong

đó 24 – 28 marker là xuất hiện thường xuyên ở khoảng 30% tế bào

1.3.4 Dòng tế bào ung thư vú ở người - KPL4

KPL4 là dòng tế bào ung thư vú ở người được phân lập từ dịch màng phổi ác tính của một bệnh nhân ung thư vú đã di căn sang ung thư da dạng viêm Dòng tế bào này biểu hiện Erb B-1, Erb B-2 và Erb B-3 KPL4 có khả năng gây u ở chuột sạch miễn dịch KPL4 được đánh giá là hữu dụng trong việc phát triển các chiến lược chống lại bệnh ung thư vú có biểu hiện quá mức các thụ thể họ Erb B

1.4 Chế phẩm Honokiol , Magnolol, Derrone và thuốc Taxol

1.4.1 Honokiol (H) và Magnolol (M)

Vỏ cây và rễ của các loài thuộc họ Ngọc lan Magnoliaceae đã được sử dụng như một phương thuốc cổ truyền ở Hàn Quốc, Trung Quốc và Nhật bản để điều trị nhiều chứng bệnh khác nhau bao gồm chứng lo âu, đột quỵ do tăng huyết áp, sốt thương hàn, trầm uất, đau đầu và các chứng liên quan đến thần kinh khác Trong số các hợp chất tách chiết được từ các loài cây này, các nhà khoa học đặc biệt chú ý đến hai chất Honokiol và Magnolol Đây là hai đồng phân của một hợp chất chứa

gốc phenol được tách chiết từ vỏ cây Hậu phác Magnolia officinalis Rehd Et wils,

còn gọi là Hậu phác bắc

Hình 7: Cây Hậu phác bắc Magnolia officinalis Rehd Et wils (trái) và cấu trúc phân tử

của hai đồng phân Honokiol và Magnolol (phải)

Honokiol (3,5'-diallyl-4,2'-dihydroxybiphenyl) chiếm khoảng 1-5% trọng lượng vỏ cây và Magnolol (5,5'-diallyl-2,2'-dihydroxybiphenyl) chiếm khoảng 2-

10% đều có công thức cấu tạo là C18H18O2 với trọng lượng phân tử M = 266,33 Theo các nhà khoa học, hoạt tính của hai chất này có được là nhờ các nhóm chức hydroxyl và allylic

Magnolol thường được sử dụng để điều trị đau cấp tính, ho, chứng lo lắng và các chứng liên quan đến dạ dày Các kết quả khoa học đã công bố cho thấy Magnolol có hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hóa, chống ung thư, bảo vệ tế bào thần kinh vỏ khỏi điều kiện thiếu oxy (hypoxia) Trong khi đó, Honokiol - đồng phân của Magnolol - khác với Magnolol ở cách sắp xếp của một nhóm chức allyl trên vòng phenol Đây là một điểm quan trọng quyết định hoạt tính sinh học của Honokiol Các nhà khoa học cũng phát hiện thấy Honokiol có dược tính rộng như kháng viêm, chống đông máu, chống rối loạn nhịp tim, bảo vệ thần kinh, chống oxy hóa Các nghiên cứu khác cũng cho thấy Honokiol có thể sử dụng như tác nhân chống stress, chất ức chế ung thư tiềm năng và các hư hỏng do oxy hóa gây ra Magnolol gây apoptosis ở nhiều dòng TBUT như ung thư phổi CH-27, HL-60, ung thư dạ dày COLO 205, ung thư gan HepG2 trong khi Honokiol gây apoptosis ở các dòng TBUT buồng trứng SKOV3, ung thư máu Molt 4B, tế bào ung thư ruột kết RKO, TBUT phổi CH27, tế bào nội mô chuyển dạng SVR và có hoạt

tính chống ung thư da và ung thư mô liên kết mạch SVR in vivo trên mô hình chuột

nhắt [3, 17, 21, 45, 46]

Thực hiện các nghiên cứu chuyên sâu hơn về cơ chế cảm ứng apoptosis của Magnolol, các nhà khoa học đã chỉ ra rằng, dưới tác động của Magnolol, Fas được

hoạt hóa và cytochrome c được chuyển từ ty thể ra tế bào chất thông qua chênh lệch

nồng độ ion Ca2+ tự do trong bào tương và quá trình điều hòa âm của Bcl-2 (B-cell

lymphoma 2) Thông qua sự hoạt hóa Fas và sự giải phóng cytochrome c, caspase-8

và caspase-9 được hoạt hóa, từ đó kéo theo chuỗi phản ứng xuôi dòng của các caspase và dẫn đến apoptosis Xử lý tế bào với ZB4 (tác nhân làm gián đoạn cơ chế đáp ứng Fas) cũng làm giảm tác động của caspase-8 cảm ứng bởi Magnolol, từ đó làm giảm xác suất xảy ra apoptosis Tuy nhiên, đến nay các nhà khoa học vẫn chưa

trả lời được liệu Magnolol hoạt hóa Fas trực tiếp hay nó kích hoạt hoạt động của một phối tử Fas rồi sau đó phối tử này mới hoạt hóa Fas [22, 38, 46]

Hình 8: Cơ chế tác động của Honokiol (H) và Magnolol (M) lên con đường truyền tin dẫn

đến apoptosis của tế bào

Trong khi đó, Honokiol được chứng minh là có tác động điều hòa âm c-FLIP (FLICE-like inhibitory protein, còn gọi là cFLAR) ở TBUT, dẫn đến làm TBUT mẫn cảm hơn với các con đường apoptosis cảm ứng bởi cả TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) và Fas Chỉ sử dụng Honokiol sẽ ức chế ở mức độ vừa phải sự tăng trưởng của các TBUT phổi ở người trong khi nếu kết hợp với TRAIL,

nó sẽ làm giảm mạnh mẽ khả năng sống của tế bào và cảm ứng apoptosis tốt hơn so với chỉ sử dụng TRAIL Quá trình apoptosis cảm ứng bởi Fas khi Honokiol được sử dụng kết hợp với một phối tử Fas hoặc một kháng thể kháng Fas cũng có kết quả tương tự

Trong tất cả các protein liên quan đến quá trình apoptosis đã được kiểm tra thì c-FLIP là protein duy nhất được điều hòa âm nhanh chóng bởi Honokiol ở tất cả các dòng tế bào Điều này cho thấy điều hòa âm c-FLIP là một bước chủ chốt của quá trình tác động của Honokiol dẫn đến apoptosis cảm ứng bởi thụ thể chết [2, 12,

15, 46] Cấu trúc 2 vòng phenol chứa 2 nhóm allyl giúp tăng ái lực của Honokiol với các tế bào nội mô; nó hoạt động như tác nhân chống oxy hóa ức chế sự oxy hóa của lipoprotein có tỷ trọng thấp và quá trình apoptosis cảm ứng bởi glucose ở tế bào nội mô của người nhờ các hoạt tính mạnh trong việc làm sạch các gốc tự do [5-8,

20, 19, 22, 23, 25, 26, 33, 38, 42, 44]

1.4.2 Derrone (D)

Cây Vông nem còn được gọi bằng nhiều tên g ọi khác là cây lá Vông , Hải

đồng bì, Thích đồng bì , có tên khoa học là Erythrina orientalis L Murr., thuộc họ

Đậu Fabaceae Loài này phân bố rộng từ Ðông Á tới châu Phi Ở châu Á, loài này phổ biến ở Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Campuchia, Lào, Việt Nam, Malaixia, Indonesia và Philippin Đây là một trong những vị thuốc dân gian ở Việt Nam và nhiều nước khác trên thế giới, có tác dụng an thần , hạ huyết áp , kháng khuẩn và chống loãng xương

Hình 9: Cây vông nem Erythrina orientalis L., Fabaceae và công thức cấu tạo Derrone

Derrone (5,4-dihydroxy-7,8-(2,2-di- methylpyrano)isoflavone) có công thức hóa học là C20H16O5, M = 336,1 là hợp chất được tách chiết từ cây Vông nem

Erythrina orientalis (L.) Murr., Trong công trình nghiên cứu được công bố vào

tháng 6 năm 2012, Hayet Edziri và cộng sự đã chứng minh Derrone có tác động

kháng khuẩn với vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa và Escherichia coli với nồng

độ trong khoảng từ 7,81 – 15,62 µg/mL Ngoài ra, Derrone cũng thể hiện tính kháng nấm mạnh với các loài thuộc họ Candida ở nồng độ 7,81 µg/mL và có tính độc với dòng tế bào ung thư gan HepG2 Tuy nhiên, các cơ chế chuyên sâu về tác động của Derrone lên tế bào vẫn còn chưa được biết rõ [10, 18]

1.4.3 Taxol (Paclitaxel)

Taxol (C47H51NO14, M = 853,906 g/mol) lần đầu tiên được đề cập đến với tên gọi Caltuvocus – cây Thủy tùng từ thời La Mã cổ đại Một số bài thuốc dân gian cũng sử dụng các dịch chiết này như là chất độc hoặc thuốc chữa bệnh Lịch sử hiện đại nghiên cứu về Taxol bắt đầu từ năm 1962, khi tiến sĩ Arthur S Barclay thu thập

vỏ của Taxus brevifolia và một trong số các mẫu của loài này thể hiện độc tính với

tế bào Năm 1967, Monroe E Wall và Mansukh C Wani thuộc Viện ung thư Hoa

Kỳ tách chiết được chất này từ vỏ cây Taxus brevifolia và đặt tên là Taxol Sau này,

khi được phát triển thành thương phẩm bởi Bristol-Myers Squibb (BMS), Taxol được đổi tên thành Paclitaxel

Hình 10: Cấu trúc phân tử Taxol

Năm 1971, cấu trúc phân tử của Taxol được phát hiện nhờ các phân tích tinh thể bằng tia X bởi chính Monroe và Wani Năm 1979, tiến sĩ Horwitz và cộng sự công bố các phát hiện của họ về tương tác giữa Taxol với các vi ống: nó có khả

năng thúc đẩy quá trình hình thành vi ống bằng cách bám và làm bền vi ống, từ đó thay đổi lịch trình đã định sẵn của quá trình phân bào, gây ra sự chết cho TBUT lẫn

tế bào bình thường Các thử nghiệm lâm sàng với Taxol bắt đầu từ tháng 4 năm

1984 và cho đến nay, Taxol đang được sử dụng để điều trị ung thư phổi, ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư chuyển dạng Kaposi sarcoma [29, 35]

Các nghiên cứu chuyên sâu cho thấy Taxol có khả năng tiêu diệt TBUT thông qua các con đường độc lập với p53; tác động này sẽ được tăng cường hiệu quả với các tế bào bị đột biến p53 hơn là với các tế bào có kiểu gen p53 dại Ngoài

ra, Taxol có xu hướng cảm ứng chặn tế bào đi từ G2 sang M trong chu trình tế bào

và gây ra apoptosis ở các tế bào bị chuyển dạng, nhưng chỉ gây ra dừng ở G1 với các tế bào không bị chuyển dạng Tất cả các đặc tính này giúp Taxol có thể tác động biệt hóa với các TBUT mà vô hại với các tế bào thường [35, 43]

Về cơ chế tác động lên tế bào dẫn đến apoptosis, cũng như các tác nhân cảm ứng apoptosis khác, cơ chế của Taxol cũng liên quan đến họ protein Bcl-2 Taxol có thể điều chỉnh biểu hiện của các thành viên trong họ protein này và gây ra biến đổi sau dịch mã của các phân tử Bcl-2 Taxol điều hòa âm Bcl-XL và điều hòa dương Bak và Bax Ngoài ra, Taxol cũng cảm ứng sự phosphoryl hóa Bcl-2 từ đó cảm ứng apoptosis Các nghiên cứu gần đây cũng cho thấy sự phosphoryl hóa Bcl-2 chỉ xuất hiện ở các tế bào đã được dừng ở phase G2/M sau khi xử lý với Taxol Điều này gợi cho thấy sự phosphoryl hóa Bcl-2 chỉ xuất hiện như là hệ quả của sự dừng phân bào

tế bào Các nhà khoa học cũng chỉ ra rằng, hoạt hóa JNK/SAPK cần cho giai đoạn sớm của quá trình apoptosis khởi phát bởi Taxol Ngoài ra, Taxol cũng cảm ứng apoptosis xuất hiện sau khi ngừng phân bào với cơ chế xuôi dòng sự ổn định các vi sợi tubulin mà hiện nay vẫn chưa được biết rõ [35, 43]

Hình 11: Cơ chế tác động của Taxol lên tế bào gây apoptosis

Hình 12: Hình ảnh mô phỏng liên kết của Taxol với vi sợi tubulin

1.5 Enzyme Aurora kinaza

Aurora kinaza thuộc nhóm những protein điều khiển quá trình phân bào Chúng bao gồm ba protein thành viên có tên gọi Aurora A, Aurora B và Aurora C Các protein này liên quan đến quá trình hình thành và phân chia trung thể, quá trình liên kết các kinetochore với các vi sợi (microtubule) và sự sắp xếp của thoi vô sắc

Vì vậy, những protein này đóng một vai trò quan trọng trong quá trình phân chia

của nhiễm sắc thể và sự ổn định về nhân tế bào [41] Sự quan tâm đến các protein này tăng lên khi các nhà khoa học nhận thấy sự tương quan giữa sự biểu hiện quá mức của các protein này trong rất nhiều loại ung thư với sự bất thường của bộ nhiễm sắc thể [2] Gen quy định Aurora A nằm trên nhiễm sắc thể 20 của người tại

vị trí 20q13 Sự biểu hiện quá mức của protein này lần đầu tiên được phát hiện ở ung thư ruột nguyên phát Đây chính là bằng chứng đầu tiên cho thấy mối liên quan giữa Aurora và ung thư Aurora hoạt động như gen gây ung thư khi chuyển nhiễm vào các dòng tế bào nguyên bào sợi Rat1 ở chuột cống hay NIH3T3 ở chuột nhắt Gen Arora A không những được tăng cường trong nhiều dòng tế bào mà còn ở 52% ung thư trực tràng nguyên phát và 12% ung thư phổi nguyên phát [13]

Aurora B cũng biểu hiện quá mức ở các dòng tế bào tách từ ung thư ruột [9] Hơn nữa, sự biểu hiện quá ngưỡng của Aurora B trong tế bào nuôi cấy kích thích sự phân chia nhiễm sắc thể một cách bất thường Những tế bào hình thành sẽ là những

tế bào nhân quái (aneuploidy) và có thể thúc đẩy sự hình thành ung thư ở chuột [31] Tại kỳ giữa và kỳ sau của quá trình phân bào, Aurora B tạo thành phức hợp với các protein khách (passenger proteins) như Survivin, INCENP, TD60 và Borealin Những protein này cũng biểu hiện vượt mức ở một số loại ung thư như ung thư trực tràng, ung thư ruột, ung thư vú… và một số dòng tế bào chuyển dạng Các nghiên cứu đã chứng tỏ rằng Survivin và INCENP là cơ chất cho hoạt tính enzym của Aurora B đồng thời chúng cũng là tác nhân kích thích hoạt tính của protein này [37] Như vậy, trong các dòng tế bào ung thư, hoạt tính của Aurora B phụ thuộc vào sự biểu hiện của chính bản thân nó và các protein liên quan

Aurora C biểu hiện quá mức ở ung thư tuyến tiền liệt và một số dòng tế bào ung thư khác [41] Điều đó chứng tỏ rằng nó có thể có vai trò trong ung thư tế bào soma Mặc dù vậy, sự hiểu biết về chức năng của protein này vần còn rất nghèo nàn

Những điều trên chứng tỏ Aurora kinaza là một mục tiêu trong điều trị ung thư và do vậy việc tìm kiếm các chất ức chế hoạt tính của Aurora kinaza là rất cần thiết Một vài chất ức chế đã được nghiên cứu và công bố như ZM447469 (2003),

Hesperadin (2004), VX-680 (2004) and PHA-680632 (2006), Benzo[e]pyridoindole

(2008) (Hình 13) Trong số đó, VX680 có tác dụng ức chế sự phát triển ung thư in vivo và hiện nay đang được xem xét để thử nghiệm lâm sàng Tuy nhiên những chất

ức chế này có một số tác dụng phụ và tính đặc hiệu chưa cao VX680 là một chất có nhiều triển vọng nhất hiện nay trong việc ức chế hoạt tính của Aurora, nhưng đồng thời nó cũng ức chế FLT-3, LcK và kinaza đột biến BcrAbl T315I Mặt khác, hoạt tính của chất này còn phụ thuộc vào p53 Hơn nữa, trong quá trình phát triển u thường xuất hiện các đột biến xung quanh các vị trí (sites) điều khiển hoạt tính kinaza Do vậy, việc nghiên cứu và tìm kiếm các chất ức chế đặc hiệu hơn là rất cần thiết [16]

Hình 13: Các chất ức chế Aurora kinaza

(a): các dạng khung cấu trúc của các chất ức chế; (b): các chất ức chế đã công bố

CHƯƠNG 2 – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Các dòng TBUT HCT116, Hela, MCF7 và KPL4 do Nhóm nghiên cứu Ung thư thực nghiệm – Bộ môn Tế bào, Mô, Phôi và Lý sinh – Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội cung cấp

- Mẫu Honokiol (H), Magnolol (M) và Derrone (D) do Viện Dược liệu Trung ương cung cấp, dạng dung dịch đồng nhất lưu trữ ở nồng độ 20.000µg/mL trong dung môi DMSO

- Đối chứng dương Taxol, dạng thương phẩm 30mg/5mL, tương đương 6.000µg/mL

2.2 Máy móc, dụng cụ

Bảng 1: Dụng cụ và vật tư tiêu hao

Đĩa nuôi cấy tế bào 35, 100mm Corning, Mỹ

Pipet nhựa 1mL, 2mL, 5mL, 10mL Corning, Mỹ

Bảng 2: Thiết bị sử dụng

Kính hiển vi huỳnh quang Axio Plan 2 Carl Zeiss – Đức

Kính hiển vi laser quét LSM 510 Carl Zeiss – Đức

Kính hiển vi soi ngƣợc Axiovert 40 CFL Carl Zeiss – Đức

Anti-Histon H3PS10 Antibody Invitrogen, Mỹ

Non-Radioactive Cell Proliferation Assay

Promega, Mỹ

2.4 Phương pháp hoạt hóa và nhân nuôi các dòng tế bào in vitro

 Tế bào được cất giữ trong Nito lạnh, đem rã đông trong tủ ổn nhiệt 37ºC Chuyển dung dịch chứa tế bào vào ống falcon 15 mL đã có chứa dung dịch PBS, ly tâm 1000 rpm trong 5 phút, bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào

Hình 14: Các dòng TBUT được bảo quản trong bình đựng Nito lỏng

 Phân tán tế bào lắng vào 5-7 mL môi trường nuôi cấy thích hợp, sục đều rồi cho vào đĩa petri 100 mm hoặc chai nuôi cấy T25 ủ trong tủ ấm 37ºC, 5% CO2 Kiểm tra hàng ngày, thay môi trường 2 ngày/lần, khi tế bào mọc kín

75-90% bề mặt đĩa thì thu hoạch hoặc tiến hành cấy chuyển tế bào sang đĩa nuôi cấy mới

 Thu tế bào từ đĩa nuôi cấy bằng cách ủ với dung dịch Trypsin-EDTA 1X trong 5 phút ở 37ºC, 5% CO2 Trung hòa Trypsin bằng cách bổ sung với môi trường nuôi cấy đã bổ sung FBS, hút dịch vào ống ly tâm, đem ly tâm 1000 rpm trong 5 phút

 Kiểm tra tỷ lệ tế bào chết bằng cách nhuộm với Blue trypan trong 3-5 phút rồi đếm trên buồng đếm tế bào Nếu tỷ lệ chết < 10% tổng số tế bào thì tế bào được xem là đủ khỏe mạnh dùng để cấy chuyển tiếp tục hoặc dùng cho các mục đích thí nghiệm tiếp theo

2.5 Phương pháp thử độc tính MTS

Nguyên lý:

MTS (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) – 5 - (3-carboxymethoxyphenyl) – 2 - (4-sulfophenyl) - 2H - tetrazolium) khi có mặt PMS (phenazine methosulfate) sẽ được tế bào chuyển hóa, tạo ra một sản phẩm formazan tan trong môi trường nuôi cấy tế bào, hấp thụ ánh sáng tối đa ở bước sóng 490-500 nm trong đệm PBS Lượng formazan tạo ra sẽ được định lượng bằng lượng ánh sáng ở bước sóng 490nm bị hấp thụ và tỷ lệ thuận với lượng tế bào sống trong môi trường nuôi cấy đó Phương pháp MTS thường được coi là phương pháp MTT 1 bước, có tính tiện lợi cao do chỉ cần

bổ sung thẳng chất vào môi trường nuôi cấy tế bào mà không cần bất kỳ bước rửa hay chuẩn bị nào khác

 Chuẩn bị tế bào: Với mỗi dòng tế bào, chuẩn bị dung dịch tế bào sao cho

có 5.000TB/180 µL/giếng trên đĩa 96 giếng Trộn nhẹ để tế bào phân tán đều trong các giếng, quan sát kiểm tra dưới KHV đảo chiều, ủ ở 37o

C, 5% CO2 trong 24h để tế bào ổn định và bám vào bề mặt đĩa

 Chuẩn bị dung dịch thuốc trung gian và ủ chất: Pha dung dịch trung gian tương ứng có nồng độ cao gấp 10 lần nồng độ cuối cần thử trong giếng

Bổ sung 20 µL dung dịch trung gian tương ứng rồi lắc nhẹ để thuốc phân

bố đều trong giếng, ủ 48h ở 37oC, 5% CO2, quan sát và ghi lại hình ảnh hàng ngày

 Ủ MTS và đo mật độ quang học: Chuẩn bị dung dịch MTS/PMS với tỷ lệ 1PMS:20 MTS Thêm 30 µL hỗn hợp trên vào mỗi giếng đang chứa 200

µL dung dịch môi trường nuôi cấy đã được bổ sung thuốc và ủ với tế bào trong 48h Ủ hỗn hợp trên trong 3h ở điều kiện 37oC, 5% CO2 rồi tiến hành đo mật độ quang học ở bước sóng 490nm Dùng phần mềm Excel

để xử lý số liệu, tính chỉ số IC50 – Là giá trị nồng độ chất thử tại đó chất thử có khả năng gây chết 50% tế bào

 Chỉ số IC50 của một chất với một dòng tế bào được tính từ nghiệm phương trình hồi quy biểu diễn tương quan giữa x là nồng độ hoặc log nồng độ chất thử đó và y là chỉ số tăng sinh A (%) của dòng tế bào đó khi được ủ với chất thử ở các nồng độ khác nhau, khi y = 50 (%)

 A (%) được tính theo công thức:

o A (%) = V/V h x 100%

V: Chỉ số OD đo được ở trong giếng thí nghiệm

Vh: Chỉ số OD đo được ở trong giếng đối chứng dung môi