Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm A H5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật multiplex reverse transcription polymerase chain reacti

Protein HA còn là kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm A, kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng subtype HA, và tham gia vào phản ứng trung hòa vi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

TRẦN THỊ TÌNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NHANH VIRUS CÚM GIA CẦM A/H5N1 TRONG MẪU BỆNH PHẨM BẰNG

KỸ THUẬT MULTIPLEX REVERSE TRANSCRIPTION

POLYMERASE CHAIN REACTION

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

TRẦN THỊ TÌNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NHANH VIRUS CÚM GIA CẦM A/H5N1 TRONG MẪU BỆNH PHẨM BẰNG

KỸ THUẬT MULTIPLEX REVERSE TRANSCRIPTION

POLYMERASE CHAIN REACTION

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS LƯƠNG XUÂN HIẾN

Hà Nội – Năm 2011

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1.1.2 Hình thái và cấu trúc virus cúm A/H5N1 5

1.1.3 Hệ gen và các protein của virus A/H5N1 6

1.1.4 Chu trình tái bản của virus cúm A/H5N1 9

1.1.5 Hiện tượng biến đổi kháng nguyên của virus cúm A 11

1.1.6 Khả năng thích ứng vật chủ của virus cúm A 12

1.1.7 Độc lực và khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1 14

1.1.8 Sức đề kháng của virus cúm A 15

1.2 CHẨN ĐOÁN, ĐIỀU TRỊ VÀ DỰ PHÒNG BỆNH CÚM GIA CẦM A/H5N1 16

1.2.2 Các phương pháp xét nghiệm và chẩn đoán nhiễm cúm A/H5N1 17

1.2.3 Điều trị nhiễm cúm A/H5N1 ở người 23

1.2.4 Kiểm soát lây nhiễm và dự phòng 24

1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VIRUS CÚM A/H5N1 Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI 25

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27

2.1.1 Mẫu vật 27

2.1.2 Hóa chất 27

2.1.3 Thiết bị 28

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.2.1 Chọn mẫu 28

2.2.3 Tách chiết RNA mẫu bệnh phẩm 29

2.2.4 Thiết kế mồi 30

2.2.5 Tối ưu phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen M, HA và NA 32

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ VIRUS CÚM A/H5N1 3

1.1.1 Phân loại học và danh pháp 3

1.2.1 Triệu chứng nhiễm cúm A/H5N1 16

2.2.2 Kỹ thuật lấy mẫu , bảo quản và vận chuyển mẫu 28

2.2.7 Thử nghiệm phản ứng Multiplex RT-PCR trên mẫu bệnh phẩm 40

2.2.8 Điện di và phân tích kết quả 41

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

3.1 Thiết kế mồi 43

3.1.1 Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen M của virus cúm A 43

3.1.2 Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen HA của virus cúm A/H5N1 44

3.2 Tối ưu phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen M, HA và NA 47

3.2.1 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi 47

3.2.2 Tối ưu nồng độ mồi 49

3.2.3 Tối ưu thời gian kéo dài chuỗi 50

3.2.4 Đánh giá độ nhạy của phản ứng RT-PCR 51

3.2.5 Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng RT-PCR 53

3.3 Tối ưu phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện virus A/H5N1 56

3.3.1 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi 56

3.3.2 Tối ưu nồng độ mồi 56

3.3.4 Tối ưu số chu kỳ phản ứng 58

3.3.5 Đánh giá độ nhạy của phản ứng multiplex RT-PCR 59

3.3.6 Đánh giá đô ̣ đă ̣c hiê ̣u của phản ứng multiplex RT-PCR 59

3.4 Ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR phát hiện virus A/H5N1 trên mẫu bệnh phẩm 61

Kết luận 67

Kiến nghị 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

3.1.3 Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen NA của virus cúm A/H5N1 45

3.3.3 Tối ưu thời gian kéo dài chuỗi 57

CHỮ VIẾT TẮT

DEPC-treated water: Diethylpyrocarbonate treated water

vRNP: Viral ribonucleoprotein

DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ

Hình 1.1 Cấu trúc của virus cúm A 5

Hình 1.2 Các phân đoạn gen và các protein của virus cúm A/H5N1 6

Hình 1.3 Chu trình tái bản của virus cúm A… 10

Hình 1.4 Các vật chủ tự nhiên và khả năng lây nhiễm giữa các loài vật chủ của virus cúm A 13

Bảng 2.1: Các thành phần của phản ứng RT-PCR 33

Bảng 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR 33

Bảng 2.3: Thành phần của phản ứng multiplex RT-PCR 37

Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex RT-PCR 38

Bảng 3.1: Cặp mồi phát hiện gen M của virus cúm A 43

Hình 3.1: Đặc điểm cặp mồi phát hiện gen M của virus cúm A 43

Bảng 3.2: Cặp mồi phát hiện gen HA của virus cúm A/H5N1 44

Hình 3.2: Đặc điểm cặp mồi phát hiện gen HA của virus cúm A/H5 45

Bảng 3.3: Cặp mồi phát hiện gen NA của virus cúm A/H5N1 46

Hình 3.3: Đặc điểm cặp mồi phát hiện gen NA của virus cúm A/N1 46

Bảng 3.4: Trình tự các mồi được lựa chọn để thực hiện phản ứng RT-PCR… 47

Hình 3.4 Ảnh điện di kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen riêng biệt 49

Hình 3.5 Ảnh kết quả điện di tối ưu nồng độ mồi cho phản ứng RT-PCR 50

Hình 3.6 Ảnh điện di kết quả tối ưu thời gian kéo dài chuỗi 51

Bảng 3.5: Giá trị đo độ hấp thụ OD của RNA 3 gen M, HA và NA 51

Hình 3.7 Ảnh điện di đánh giá độ nhạy của phản ứng RT-PCR 52

Bảng 3.6: Thành phần phản ứng RT-PCR phát hiện gen M 53

Bảng 3.7: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR phát hiện gen M 54

Bảng 3.8: Thành phần phản ứng RT-PCR phát hiện gen H5 54

Bảng 3.9: Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR phát hiện gen H5 54

Bảng 3.10: Thành phần phản ứng RT-PCR phát hiện gen N1 55

Bảng 3.11: Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR phát hiện gen N1 55

Hình 3.8: Ảnh điện di tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng multiplex RT-PCR 56

Hình 3.9 Ảnh điện di tối ưu nồng độ mồi phản ứng multiplex RT-PCR 57

Hình 3.10: Ảnh điện di tối ưu thời gian kéo dài chuỗi phản ứng multiplex RT-PCR 58

Hình 3.11: Ảnh điện di tối ưu số chu kỳ phản ứng multiplex RT-PCR 59

Hình 3.12: Thử nghiê ̣m đánh giá độ nhạy của phản ứng multiplex RT-PCR… 59

Hình 3.13: Ảnh điện di đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng multiplexRT-PCR 60

Bảng 3.12: Thành phần phản ứng multiplex RT-PCR 60

Bảng 3.13: Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex RT-PCR ……….61

Hình 3.14: Kết quả thử nghiê ̣m phản ứng multiplex RT-PCR trên mẫu bê ̣nh phẩm dương tính……… 62

Hình 3.15: Kết quả thử nghiê ̣m phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1 trên một số mẫu bê ̣nh phẩm……….63

Hình 3.16: Kết quả thử nghiê ̣m phản ứng RT-PCR phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1 trên một số mẫu bê ̣nh phẩm……….…64

Bảng 3.14: So sánh kết quả xét nghiệm phản ứng RT-PCR và multiplex RT-PCR trên mẫu bệnh phẩm……… 64

Bảng 3.15: So sánh thời gian và chi phí hoá chất làm xét nghiệm giữa phản ứng multiplex RT-PCR và RT-PCR………65

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, dịch cúm gia cầm do virus A/H5N1 là vấn đề quan tâm đối với cả thế giới, đặc biệt là đối với các nước châu Á như Việt Nam, Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc Kể từ cuối năm 2003 đến nay, dịch cúm A/H5N1 đã gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm và gây tử vong cho hàng trăm người Cả thế giới đang lo sợ trước nguy cơ có thể xảy ra một đại dịch cúm trên người do virus A/H5N1 giống như các vụ đại dịch cúm đã xảy ra trong thế

kỷ 20 Các nước trên thế giới đã tiêu tốn hàng tỷ đô la cho việc chuẩn bị chống lại một đại dịch cúm H5N1 có thể xảy ra trong tương lai như mua thuốc và các thiết bị

y tế, nghiên cứu sản xuất vaccine, thực hành các phương án phòng chống dịch, thực hiện các chiến lược nhằm kiểm soát chặt chẽ đường biên giới

Ở Việt Nam, kể từ năm 2003 đến nay, dịch cúm gia cầm liên tục xảy ra ở hầu hết các tỉnh thành trên toàn quốc Mỗi năm có hàng triệu gia cầm bị chết và tiêu hủy Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, Việt Nam đang đứng thứ 2 trên thế giới (sau Indonesia) về số người nhiễm và tử vong do virus A/H5N1

Virus cúm A/H5N1 là virus có khả năng biến đổi gen nhanh chóng và hình thành nên các chủng virus mới nên việc sử dụng vaccine để dự phòng thường không đạt được hiệu quả cao Ở Việt Nam hiện nay, dịch cúm A/H5N1 vẫn liên tục xảy ra trên gia cầm và người, mặc dù mức độ không trầm trọng như giai đoạn trước đây nhưng nếu không được phát hiện và có các biện pháp dập dịch kịp thời thì dịch có thể trở nên bùng phát

Khi có dịch cúm gia cầm, một phương pháp chẩn đoán nhanh, nhạy và chính xác là cần thiết cho việc điều trị, kiểm soát và ngăn chặn kịp thời tránh lây lan rộng

ra cộng đồng Để phát hiện virus cúm A/H5N1 trong các mẫu bệnh phẩm ở người

và gia cầm, hiện nay hầu hết các phòng xét nghiệm đều áp dụng kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction) Đây là kỹ thuật sinh học phân tử, cho phép phát hiện virus với độ chính xác cao, thời gian làm xét nghiệm khoảng 4-6 giờ nếu thực hiện Realtime RT-PCR và 12-24 giờ nếu thực hiện RT-

PCR và điện di trên gel agarose Với RT-PCR thông thường, người ta phải thực hiện ba phản ứng để chẩn đoán xác định virus cúm A/H5N1, bao gồm: một phản ứng để xác định virus cúm A, một phản ứng xác định subtype H5 và một phản ứng xác định subtype N1 Để đơn giản hóa quá trình xét nghiệm, rút ngắn thời gian xét nghiệm và tiết kiệm chi phí người ta có thể ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR, cho phép chẩn đoán xác định cúm A/H5N1 chỉ với một phản ứng RT-PCR thay vì phải làm ba phản ứng RT-PCR Tuy nhiên, việc nghiên cứu thiết kế và xây dựng quy trình thực hiện kỹ thuật multiplex RT-PCR khá phức tạp nên hiện nay hầu hết các phòng xét nghiệm trong nước chưa áp dụng kỹ thuật này trong chẩn đoán cúm

A/H5N1 Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện ”Nghiên cứu xây dựng quy trình phát

hiện nhanh virus cúm gia cầm A/H5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction” tại Labo Trường

Đại học Y Thái Bình với mục tiêu:

1 Thiết kế và lựa chọn được các mồi phù hợp để thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện virus cúm A/H5N1

2 Nghiên cứu tối ưu hóa được các điều kiện của phản ứng multiplex RT-PCR: nhiệt độ và thời gian gắn mồi, nồng độ mồi,

3 Thử nghiệm được phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện A/H5N1 trên một

số mẫu bệnh phẩm thu thập từ người và gia cầm

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ VIRUS CÚM A/H5N1

1.1.1 Phân loại học và danh pháp

1.1.1.1 Phân loại virus cúm

Theo ủy ban Quốc tế về phân loại virus (ICTV - International Committee on

Taxonomy of Viruses), virus cúm thuộc nhóm V, họ Orthormyxoviridae, gồm 3

type là A, B và C Chúng là các virus có vật liệu di truyền là RNA sợi đơn âm [32]

Sự phân biệt virus cúm A, B và C dựa trên sự khác nhau về đặc tính kháng nguyên của nucleoprotein (NP) và protein nền M1 (matrix protein) Ngoài ra, hệ gen của virus cúm A và B đều có 8 đoạn RNA còn virus cúm C chỉ có 7 đoạn RNA [36]

Trong 3 type thì type A là virus có giới hạn vật chủ rất rộng, lưu hành phổ biến trên gia cầm và một số động vật có vú như lợn, ngựa, chó, mèo, hải cẩu,… và

cả con người [32] Virus cúm A là loại có độc lực mạnh nhất, có khả năng biến đổi gen rất lớn và nguyên nhân chủ yếu gây ra các vụ đại dịch cúm trong thế kỷ qua Dựa vào sự khác biệt về đặc tính kháng nguyên của hai glycoprotein là haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA), virus cúm A còn được chia thành 16 subtype HA (H1-H16) và 9 subtype NA (N1-N9) Sự tái tổ hợp giữa các subtype

HA và NA, về mặt lý thuyết sẽ tạo ra nhiều subtype khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh [2] Tất cả các subtype HA và NA đều hiện diện trên các chủng virus lưu hành ở các loài thủy cầm hoang dã Tuy nhiên, chỉ có một số subtype nhất định thường xuyên lưu hành trên người như H1N1, H1N2, H2N2, H3N2 [11] Cúm A/H5N1 là một subtype có khả năng gây nhiễm cao của virus cúm Các chủng của virus cúm gia cầm có thể xâm nhiễm vào nhiều loại động vật khác nhau như chim, lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi và con người

Virus cúm B và virus cúm C lưu hành chủ yếu trên người và chỉ gây ra các vụ dịch ở mức độ vừa và nhỏ

1.1.1.2 Phân loại virus cúm A/H5N1

Virus cúm A/H5N1 được phân biệt với các subtype virus cúm A khác dựa trên

sự khác biệt về đặc tính kháng nguyên HA và NA Do có khả năng biến đổi di truyền nhanh chóng nên các chủng virus cúm A/H5N1 đang lưu hành còn được phân chia thành nhiều clade/subclade (nhóm/phân nhóm), mỗi clade/subclade có các đặc điểm di truyền đặc trưng [2]

Các genotype của virus cúm A/H5N1

Trong những năm gần đây virus cúm A/H5N1 đã có những biến đổi di truyền

và được phân chia thành nhiều nhóm dựa vào sự khác biệt về kiểu gen (genotype) Kiểu gen của virus cúm A/H5N1 thể hiện đặc điểm di truyền của virus được hình thành do sự kết hợp của 8 phân đoạn gen Trên cơ sở gen H5 và N1 của chủng gốc Goose/Guangdong/1/96, virus A/H5N1 được phân chia thành các kiểu gen khác nhau với các đặc điểm di truyền được hình thành do sự tái tổ hợp 6 gen còn lại từ các nguồn khác nhau Các kiểu gen khác nhau của virus cúm A/H5N1 đã được xác định bao gồm A, B, C, D, E, G, V, W, X0, X1, X2, X3, Y, Z và Z+ [26] Trong số các kiểu gen này, chỉ có một số kiểu gen (B, Z, Z+, V, G, W, và X0) lưu hành được trên

2 năm, chứng tỏ chúng đã thích nghi để có thể tồn tại [22] Kiểu gen Z là kiểu gen lưu hành phổ biến ở Indonesia, Thái Lan, Việt Nam và phía nam Trung Quốc từ năm 2003 đến nay [14]

Các clade của virus cúm A/H5N1

Các tổ chức WHO (World Health Organization), OIE (Organisation for Animal Health) và FAO (Food and Agriculture Organization) đã cùng nhau xây dựng một hệ thống danh pháp thống nhất để có thể xác định các clade A/H5N1 [50].Hiện nay, hệ thống danh pháp này chia virus A/H5N1 thành 10 clade khác nhau, mỗi clade còn có thể phân thành các subclade (phân dòng) [5, 46] Hiện tại chỉ có các virus thuộc clade 0, 1, 2 và 7 là lây nhiễm cho người Clade 2 gồm một số subclade khác nhau vẫn đang lưu hành và tiếp tục hình thành các subclade mới [5]

Kể từ 2008, các clade A/H5N1 hiện đang lưu hành và gây bệnh ở người gồm có

clade 2.3.2 (Trung Quốc), 2.3.4 (Trung Quốc và Việt Nam) 2.2 (Ai Cập), 2.1 (Indonesia), 1 (Campuchia) và 7 (Trung Quốc) [51]

1.1.1.3 Danh pháp virus cúm

Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã quy định thống nhất danh pháp của virus cúm

theo thứ tự kí hiệu: type virus (A, B hoặc C), vật chủ (có thể bỏ qua nếu vật chủ là người), địa điểm phân lập virus, mã số chủng virus và năm phân lập Nếu là virus

cúm A thì phải thêm kí hiệu của kháng nguyên HA và kháng nguyên NA đặt trong dấu ngoặc đơn

Ví dụ: A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) là chủng virus cúm A ở người, phân lập ở Hong Kong, mã số chủng là 156, phân lập năm 1997, có kháng nguyên HA là H5 và kháng nguyên NA là N1

A/Chicken/Vietnam/G62/2005 (H5N1) là chủng virus cúm A phân lập ở gà tại Việt Nam năm 2005, mã số chủng là G62, kháng nguyên HA là H5 và kháng nguyên NA là N1

1.1.2 Hình thái và cấu trúc virus cúm A/H5N1

Virus cú m H 5N1 là một subtype của virus cúm A , thuô ̣c ho ̣ Orthomyxoviridea

Virus cúm A/H5N1 mang các đă ̣c điểm của virus cúm A (hình 1.1)

Hình 1.1 Cấu trúc của virus cúm A http://thefutureofthings.com/news/6684/

human-antibodies-neutralize-avian-flu.html

Virus cúm A là virus có vỏ bọc, cấu trúc dạng hình cầu với đường kính từ

80-120 nm (nanomet) hoặc hình sợi dài 200-300 nm, đường kính 20 nm Vỏ bọc của virus là lớp màng lipid kép có nguồn gốc từ tế bào vật chủ, trên màng có khoảng 500 cấu trúc hình gai nhô ra Các cấu trúc này chính là các kháng nguyên bề mặt của virus, dài khoảng 10-14 nm, đường kính 4-6 nm, bản chất là các glycoprotein HA,

NA và M2 nằm xen kẽ với nhau Sự phân bố của các kháng nguyên trên bề mặt của hạt virus không đồng đều, tỉ lệ HA/NA khoảng 4-5/1 Bên trong màng lipid được lót bởi một lớp protein nền M1 (khoảng 3000 phân tử M1) [36]

Vật chất di truyền (hệ gen) của virus cúm A là RNA sợi đơn âm (-)ssRNA,

gồm 8 phân đoạn riêng biệt mã hóa cho 10 hoặc 11 protein virus (tùy theo từng chủng virus mà có thể có hoặc không có protein PB 1-F2) Bên trong hạt virus, mỗi phân đoạn đều liên kết với nucleoprotein (NP) và 3 tiểu đơn vị của enzyme polymerase (bao gồm PB1, PB2, và PA) hình thành nên các phức hợp ribonucleoprotein (viral ribonucleoprotein - vRNP) [37]

1.1.3 Hệ gen và các protein của virus A/H5N1

H5N1 có hệ gen là RNA sợi đơn âm bao gồm 8 phân đoạn gen mang tên từ 1-8 với kích thước phân tử giảm dần hoặc gọi theo tên protein mà chúng mã hóa tổng hợp là PB2, PB1, PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2) và NS (NS1 và NEP) (hình 1.2)

Hình 1.2 Các phân đoạn gen và các protein của virus cúm A/H5N1

Đặc điểm các phân đoạn gen của virus cúm A/H5N1 như sau:

Các phân đoạn mã hóa cho các kháng nguyên bề mặt của virus (đặc trưng theo từng chủng virus):

- Phân đoạn 4 (gen HA): Có kích thước khoảng 1704-1707 bases, mang gen

mã hóa tổng hợp protein HA, là một kháng nguyên bề mặt của virus cúm có bản chất là glycoprotein Kháng nguyên này có vai trò trong việc giúp cho virus gắn với

tế bào vật chủ và vận chuyển vật liệu di truyền của nó vào bên trong tế bào vật chủ Quá trình này có thể bị chặn lại nếu có các kháng thể đặc hiệu gắn kết với các kháng nguyên trên bề mặt của virus Protein HA còn là kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm A, kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng subtype HA, và tham gia vào phản ứng trung hòa virus HA là protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus, là đích của bảo

vệ miễn dịch nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm, là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay Một đặc điểm di truyền để phân biệt giữa virus cúm gia cầm và virus cúm người là: virus cúm gia cầm chỉ gắn với thụ thể alpha 2-3 sialic acid còn virus cúm người chỉ gắn với thụ thể alpha 2-6 sialic acid trên tế bào chủ Ở một số động vật (lợn, gà ) có cả 2 loại thụ thể nên có thể bị nhiễm cả virus cúm gia cầm và cúm người [24] Người ta đã phát hiện ra sự đột biến ở một số vị trí trên gen HA làm cho virus cúm gia cầm có thể gắn với tế bào người và gây bệnh cho người [11] Một số nghiên cứu trong thời gian gần đây đã cho thấy ở người cũng có các thụ thể alpha 2-3 sialic acid với mật độ rất thấp và ở gia cầm cũng có các thụ thể alpha 2-6 sialic acid với mật độ rất thấp [28] Người ta cũng nhận thấy nếu đột biến xảy ra ở 2 vị trí trên gen HA tương ứng với axit amin

182 và 192 thì virus có thể gắn với cả thụ thể của người và gia cầm [10, 27]

- Phân đoạn 6 (gen NA): Có kích thước khoảng từ 1350-1410 bases, mang gen

mã hóa cho neuraminidase, một kháng nguyên bề mặt của virus, có vai trò là một enzyme cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của màng tế bào nhiễm với phân tử carbonhydrate của protein HA, giải phóng các hạt virus con ra khỏi tế bào vật chủ Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan

loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu Giống kháng nguyên HA, NA cũng là đích chủ yếu của cơ chế bảo vệ miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng virus đang nhễm Như vậy, hai kháng nguyên bề mặt HA và NA của virus là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện này cho người và gia cầm và hạn chế lây truyền sang người [2]

Các phân đoạn mã hóa cho các protein thành phần của enzyme polymerase của virus, có độ dài ổn định và có tính bảo tồn cao, gồm:

- Phân đoạn 1 (gen PB2) có kích thước khoảng 2431 bases, mang gen mã hóa tổng hợp protein PB2, là tiểu đơn vị thành phần trong phức hợp enzyme polymerase của virus, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus [2] Nghiên cứu thấy rằng, trên PB2 tất cả các virus cúm gia cầm đều có axit amin ở vị trí 627 là glutamine, còn PB2 ở các chủng A/H5N1 phân lập từ người mang đột biến chứa axit amin lysine ở vị trí 627 Sự có mặt của lysine ở vị trí 627 của PB2 sẽ tạo thuận lợi cho virus phát triển ở cả đường hô hấp trên và đường hô hấp dưới của động vật

có vú, là nguyên nhân làm cho A/H5N1 có độc lực cao [29]

- Phân đoạn 2 (gen PB1) có kích thước khoảng 2431 bases, mang gen mã hóa tổng hợp protein PB1 và PB1-F2 PB1 là tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enyzme polymerase, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA [5] PB1-F2 liên quan đến độc lực của virus và có thể có vai trò quan trọng trong việc xác định mức độ nguy hiểm của dịch cúm [43] Khi so sánh các chủng virus trong vụ dịch ở Hong Kong năm 1997, người

ta nhận thấy sự biến đổi axit amin asparagine ở vị trí 66 thành serine (N66S) trên PB1-F2 liên quan đến độc lực của virus Sự thay đổi axit amin N66S cũng được phát hiện trên PB1-F2 của virus cúm gây ra đại dịch cúm năm 1918 [17]

- Phân đoạn 3 (gen PA) có kích thước khoảng 2233 bases, là phân đoạn gen bảo tồn cao, mã hóa tổng hợp protein PA, là một tiểu đơn vị của enzyme polymerase chịu trách nhiệm kéo dài RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus [40]

Các phân đoạn mã hóa các protein chức năng khác của virus, chúng có kích thước tương đối ổn định giữa các chủng virus cúm A, gồm:

- Phân đoạn 5 (gen NP) có kích thước khoảng 1556 bases, mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP), chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ NP có đặc tính kháng nguyên biểu hiện theo nhóm virus, tồn tại trong các hạt virus ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA

- Phân đoạn 7 (gen M): có kích thước khoảng 1027 bases, mang gen mã hóa tổng hợp protein nền M1 và M2 của virus Các protein này kết hợp với 2 kháng nguyên bề mặt tạo nên lớp vỏ capsid của virus Hai protein này được tạo ra từ cùng một phân đoạn RNA với các khung đọc mở khác nhau Protein M1 gắn với RNA của virus và M2 có tác dụng phá vỡ vỏ bọc của virus để giải phóng các phân đoạn RNA vào tế bào chất của tế bào chủ M2 là protein xuyên màng có bản chất là một kênh ion, cần thiết cho quá trình xâm nhiễm của virus [36] Sự thay thế axit amin ở

vị trí 31 serin thành asparagine trên protein M2 của một số chủng H5N1 liên quan đến tình trạng kháng amantadin của virus [25]

- Phân đoạn 8 (gen NS) có kích thước khoảng 890 bases, chứa gen mã hóa cho

2 protein không cấu trúc của virus là NS1 và NEP (nuclear export protein) (thường được gọi là protein NS2) Độc lực của virus liên quan đến protein NS [39] NS1 là protein có vai trò trong việc ghép nối, dịch mã và vận chuyển RNA qua màng tế bào NEP có vai trò trung gian trong quá trình vận chuyển các ribonucleoprotein của virus (vRNPs) vào nhân tế bào chủ

1.1.4 Chu trình tái bản của virus cúm A/H5N1

Chu trình tái bản của virus cúm xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm (hình 1.3)

Hình 1.3 Chu trình tái bản của virus cúm A

Khởi đầu chu trình là sự gắn kết của virus với các thụ thể có chứa nhóm sialic acid trên bề mặt tế bào nhiễm nhờ kháng nguyên HA Khi virus bám gắn được với tế bào, màng tế bào lõm lại hình thành túi thực bào (endosome) Túi thực bào giảm dần pH để giúp cho quá trình hoà nhập màng virus với màng túi thực bào và giải phóng các phức hợp RNP của virus vào tế bào chất của tế bào chủ Sau đó, các phức hợp RNP được vâ ̣n chuyển vào nhân tế bào để tổng hợp sợi dương RNA Sợi dương RNA được làm khuôn để sao mã tạo mRNA và tái bản sợi âm RNA của virus mRNA được đưa ra tế bào chất để tổng hợp protein của virus Quá trình tổng hợp protein và tái bản hệ gen của virus là quá trình phức tạp được điều hoà bởi nhiều yếu tố của virus cũng như của tế bào Các protein PB1, PB2, PA và NP của virus sau khi được tổng hợp sẽ được đưa vào nhân tế bào và kết hợp với RNA virus hình thành các phức hợp RNP và phức hợp được đưa ra tế bào chất Các protein khác (HA, NA và M2) được glycosyl hoá nhờ mạng lười nội sinh chất và phức hệ golgi của tế bào Sau khi hoàn thiện, các protein này được đưa đến màng tế bào gắn vào lớp lipid kép và khi mật độ đủ lớn thì các phức hợp RNP và protein M1 cũng tập hợp lại trên màng để hình thành hạt virus thế hệ con gắn trên bề mặt tế bào nhờ liên kết giữa HA với nhóm sialic acid của glycoprotein màng tế bào Các hạt virus sau đó giải phóng khỏi màng nhờ tác dụng cắt nhóm sialic acid của enzyme

Thời gian từ khi virus xâm nhiễm tế bào đến khi hình thành thế hệ virus con trung bình khoảng 6 giờ Sự giải phóng các hạt virus mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưng các tế bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử và rơi vào quá trình chết theo chương trình (apoptosis) làm tổn thương mô của cơ thể vật chủ [48]

1.1.5 Hiện tƣợng biến đổi kháng nguyên của virus cúm A

Virus cúm A là loại virus đặc biệt nhất trong các virus đường hô hấp do có hệ gen phân thành 8 đoạn và khả năng biến đổi kháng nguyên nhanh chóng Khả năng biến đổi kháng nguyên của virus cúm A là hệ quả của các quá trình biến đổi di truyền của virus Các cơ chế biến đổi di truyền của virus bao gồm:

- Hiện tƣợng trao đổi kháng nguyên (antigenic shift): Antigenic shift là các

biến đổi di truyền lớn của virus cúm, tạo ra chủng virus mới từ các chủng virus ban đầu bằng cách sắp xếp lại hệ gen Quá trình này xảy ra khi virus cúm của các loài khác nhau đồng nhiễm trên cùng một vật chủ (ví dụ như hai chủng virus cúm người

và virus cúm gia cầm đồng nhiễm trên lợn) trao đổi hệ gen cho nhau, tạo ra các thế

hệ virus mới có các phân đoạn gen kết hợp từ các chủng ban đầu Sự trao đổi kháng nguyên có thể tạo ra các chủng virus cúm mới có khả năng lây nhiễm các loài vật chủ mới hoặc gia tăng động lực gây bệnh [2]

- Hiện tƣợng lệch kháng nguyên (antigenic drift): Antigenic drift là quá trình

tích lũy các đột biến gen trên gen mã hóa cho các kháng nguyên quan trọng của virus (kháng nguyên HA và NA) Do enzyme polymerase của virus không có cơ chế đọc sửa nên trong quá trình tái bản tần số đột biến ở virus rất cao, trung bình mỗi lần tái bản hệ gen của virus sẽ có 1 nucleotid bị biến đổi [21] Qua nhiều thế hệ virus, các đột biến này dần dần được tích lũy lại và đến một lúc nào đó sẽ làm thay đổi đặc tính kháng nguyên của virus [21] Chủng virus cúm với các đặc tính kháng nguyên mới có thể thoát khỏi hệ thống miễn dịch của cơ thể và dễ dàng lan truyền trong quần thể

- Hiện tƣợng glycosyl hóa: Glycosyl hóa (glycosylation) là sự gắn kết của

một chuỗi oligosaccharide với amino acid asparagine ở một số vị trí nhất định trong

chuỗi polypeptide HA hay NA, hay một số polypeptide khác của virus cúm Thông thường chuỗi oligosaccharide được gắn tại vị trí N-X-S/T (N = asparagine; X = amino acid bất kì, trừ proline; S/T = serine hoặc threonine) [7] Đây là những vị trí được cho là gắn kết với các kháng thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên, nhằm bảo vệ cơ thể nhiễm Hiện tượng lệch kháng nguyên sinh ra đột biến điểm hình thành bộ mã của asparagine, tạo tiền đồ cho hiện tượng glycosyl hóa xảy

ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA, làm thay đổi đặc tính kháng nguyên của HA và NA, giúp cho virus thoát khỏi tác động miễn dịch bảo vệ của cơ thể chủ

và điều hoà sự nhân lên của virus [7]

Hiện tượng lệch kháng nguyên và glycosyl hóa tạo ra những biến đổi di truyền

nhỏ nhưng diễn ra liên t ục trong quá trình lưu hành của virus trong tự nhiên Ngược

lại, hiện tượng trao đổi kháng nguyên có thể xảy ra với tất cả các chủng của virus

cúm A khi có hiê ̣n tượng đ ồng nhiễm, tạo ra các biến đổi di truyền lớn và hình thành chủng virus mới Đây cũng chính là vấn đề đáng lo ngại của virus cúm A/H5N1 hiện nay, mặc dù virus này chưa có sự thích nghi lây nhiễm dễ dàng ở người, nhưng nó có khả năng gây bệnh cho người với tỉ lê ̣ tử vong rất cao Nếu như chủng virus A/H5N1 trao đổi gen HA hay NA , hoặc cả hai gen với mô ̣t chủng virus cúm A đã thích nghi ở người (ví dụ như H 1N1 hoă ̣c H 3N2) có thể t ạo ra chủng virus mới thích ứng lây nhiễm dễ dàng ở người, là nguy cơ c ủa một đại dịch cúm mới [25]

1.1.6 Khả năng thích ứng vật chủ của virus cúm A

Vật chủ tự nhiên của tất cả các chủng virus cúm A là các loài thủy cầm hoang dã (chủ yếu là vịt trời), đây là nguyên nhân lan truyền virus trong tự nhiên rất khó kiểm soát Virus cúm A có khả năng gia tăng biên độ vật chủ của chúng trong quá trình lây truyền ở tự nhiên (hình 1.4)

Hình 1.4 Các vật chủ tự nhiên và khả năng lây nhiễm giữa các loài vật chủ của

virus cúm A

http://www.medicalecology.org/diseases/influenza/print_influenza.ht

Nhờ đặc tính luôn thay đổi kháng nguyên trong tự nhiên, virus cúm A có khả năng xâm nhiễm nhiều loài vật chủ trung gian khác nhau như gia cầm, một

số loài động vật có vú (hải cẩu, cá voi, ngựa, lợn…) và cả con người, tạo nên

tính thích ứng lan truyền “nội loài” như gà - gà, hay “ngoại loài” như gà - lợn;

gà - lợn - người Đặc điểm thích ứng vật chủ này là điều kiện thuận lợi cho virus cúm A trao đổi, tái tổ hợp các phân đoạn gen, đặc biệt là các phân đoạn gen kháng nguyên (HA và NA) giữa các chủng, tạo ra một chủng virus cúm mới có khả năng thích ứng xâm nhiễm ở loài vật chủ mới của chúng đặc biệt khi chúng

vượt qua được “rào cản loài” dễ dàng thích ứng lây nhiễm gây bệnh từ gia cầm

sang người và giữa người với người [15]

Các nghiên cứu về virus H5N1 trong thời gian gần đây cho thấy virus đã có những biến đổi để thích nghi lây nhiễm trên người Hai chủng virus H5N1 phân lập trên người năm 2003 (Hong Kong) cho thấy có hiện tượng giảm ái lực với thụ thể của gia cầm và có ái lực (mặc dù chỉ ở mức thấp) với thụ thể của người và sự thay đổi axit amin ở vị trí 227 (Ser thành Asn) là nguyên nhân làm thay đổi tính đặc hiệu với thụ thể của virus [23] Đột biến ở vị trí 182 hoặc 192 (Asn182Lys hoặc

Gln192Arg) làm cho H5N1 thay đổi đặc tính gắn thụ thể, từ dạng có ái lực với thụ thể của gia cầm chuyển thành dạng có ái lực với thụ thể của người [52]

Trong thế kỷ 20, chỉ có các chủng virus H1N1, H2N2, H3N2 và H1N2 lưu hành trên người Tuy nhiên trong những năm gần đây có nhiều subtype virus cúm gia cầm như H5N1, H7N3, H7N7, H9N2 và H10N7 đã lây nhiễm cho người

Virus cúm A/H5N1 có khả năng lây nhiễm và gây bệnh cho nhiều loài động vật có vú khác như chó, mèo, hổ, báo…

1.1.7 Độc lực và khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1

Khả năng gây bệnh của virus cúm A phụ thuộc vào độc lực và tính thích ứng vật chủ của từng chủng virus Thông thường chúng không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ giới hạn ở đường hô hấp của chim hoang dã và gia cầm, nhưng một số chủng thuộc subtype H5, H7, H1, H2 và H3 có thể gây bệnh nặng ở nhiều cơ quan trong cơ thể, gây nên dịch cúm ở gia cầm và người [52] Dựa vào khả năng gây bệnh của virus trên gia cầm, virus cúm A được chia thành 2 nhóm là nhóm có độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza - HPAI) và nhóm có độc lực thấp (Low Pathogenic Avian Influenza - LPAI) Nhóm LPAI thường chỉ gây ra các bệnh nhẹ ở đường hô hấp, giảm sức đẻ và/hoặc giảm trọng lượng, mặc dù đôi khi có thể gây bệnh với tỉ lệ cao nhưng tỉ lệ chết thường thấp Trái lại, virus HPAI thường gây chết gia cầm với tỷ lệ cao, ít nhất 75% gia cầm nhiễm đều bị chết [45] Cho đến nay, tất

cả các chủng HPAI đã biết đều thuộc subtype H5 hoặc H7, tuy nhiên không phải tất

cả mà chỉ có một số ít các chủng virus thuộc subtype H5 và H7 là HPAI Protein

HA của LPAI có đặc điểm là chỉ có một axit amin kiềm là arginine tại vị trí phân cắt và một axit amin kiềm khác ở trước vị trí phân cắt 3 hoặc 4 axit amin (tùy thuộc vào từng subtype) Do đó, protein HA của LPAI chỉ bị phân cắt bởi các protease ngoại bào (extracellular proteases) do các tế bào hoặc vi khuẩn tại vị trí xâm nhiễm (ví dụ như khí quản và ruột) tiết ra Trái lại, protein HA của HPAI lại có nhiều axit amin kiềm tại vị trí phân cắt, do đó có thể chịu tác dụng của các protease nội bào (intracellular protease) phổ biến như furin [44] Chính vì vậy mà HPAI có thể gây

bệnh ở nhiều mô, cơ quan khác nhau trên cơ thể vật chủ và gây nên các triệu chứng nặng nề và tỉ lệ tử vong cao

Độc lực và khả năng gây bệnh của virus A/H5N1 được quyết định chủ yếu bởi các protein của virus là HA, PB2, NS1 và PB1-F2: Protein HA là kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm , giúp cho virus có thể gắn với các thụ t hể sialic acid

đă ̣c hiê ̣u trên bề mă ̣t tế bào , hòa màng và xâm nhiễm tế bào chủ Vị trí phân cắt protein HA của A/H5N1 mang nhiều axit amin kiềm nên dễ dàng bi ̣ phân cắt bởi các protease, giúp virus có thể lây nhiễm và tái bản ở nhiều mô cơ quan khác nhau trong cơ thể vâ ̣t chủ và gây nên các triê ̣u chứng nă ̣ng nề Protein PB2 là một thành phần quan tro ̣ng của phức hợp RNP của virus , tham gia vào quá trình sao mã và tái bản của virus Protein NS1 có thể t ham gia điều hòa đáp ứng miễn di ̣ch ở vâ ̣t chủ ,

do đó cũng là mô ̣t yếu tố quyết đi ̣nh đô ̣c lực của virus đối với con người PB1-F2 có vai trò gây ra hiện tượng apoptosis làm tổn thương mô, cơ quan của cơ thể nhiễm

1.1.8 Sức đề kháng của virus cúm A

Virus cúm A tương đối nhạy cảm với các tác nhân vật lí hay hóa học Các hạt virus tồn tại thích hợp trong khoảng pH từ 6.5 đến 7.9 Ở pH quá acid hay quá kiềm, khả năng lây nhiễm của virus bị giảm mạnh Lớp vỏ ngoài của virus bản chất là lớp lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, dễ bị phá hủy bởi các dung môi hòa tan lipid, chất tẩy rửa và các chất sát trùng: formaldehyde, phenol, β-propiolacton, sodium hypochloride, acid loãng và hydroxylamine Virus bị bất hoạt dưới ánh sáng trực tiếp sau 40 giờ, tồn tại được

15 ngày ánh sáng thường, tia tử ngoại bất hoạt được virus nhưng không phá hủy được kháng nguyên của virus Tuy nhiên, virus cúm A dễ dàng bị tiêu diệt hoàn toàn ở 100oC và

ở 60oC/30 phút, tồn tại ít nhất 3 tháng ở nhiệt độ thấp (trong phân gia cầm), và tới hàng năm ở nhiệt độ bảo quản (-70oC) Trong phủ tạng gia cầm (40oC), virus tồn tại 25-30 ngày nhưng chỉ tồn tại 7 - 8 ngày ở nhiệt độ cơ thể người (37oC); trong nước, virus có thể sống tới 4 ngày ở nhiệt độ 30oC

1.2 CHẨN ĐOÁN, ĐIỀU TRỊ VÀ DỰ PHÒNG BỆNH CÚM GIA CẦM A/H5N1 1.2.1 Triệu chứng nhiễm cúm A/H5N1

Ở gia cầm, thời gian ủ bệnh từ vài giờ đến trên hai mươi ngày, biểu hiện các triệu chứng sốt cao, chảy nước mắt, đứng tụm một chỗ, lông xù, phù đầu và mắt, da tím tái, chân xuất huyết, chảy nước dãi ở mỏ Con vật khi sốt cao có biểu hiện không bình thường ở hệ thống tiêu hóa, hô hấp, sinh sản và thần kinh Triệu chứng chung là giảm hoạt động, giảm tiêu thụ thức ăn, gầy yếu Trường hợp nặng có biểu hiện ho, khó thở, rối loạn thần kinh, ỉa chảy, một số con có biểu hiện co giật hoặc ở

tư thế không bình thường Những triệu trứng trên có thể xảy ra cùng một lúc hoặc riêng rẽ [3, 4]

Ở người, thời gian ủ bệnh bệnh của virus cúm A/H5N1 có thể kéo dài hơn so với cúm mùa, trung bình hầu hết các trường hợp nhiễm A/H5N1 là từ 2-4 ngày, nhưng một số trường hợp có thể kéo dài hơn, 8-17 ngày [16] Các triệu chứng lâm sàng nhiễm cúm A/H5N1 có thể không biểu hiện hoặc biểu hiện các triệu chứng ở các mức độ khác nhau, từ nhẹ như bệnh cúm thông thường (khó thở, ho, sốt) cho đến biểu hiện viêm phổi nặng, hội chứng suy hô hấp cấp (ARDS- Acute Respiratory Distress Syndrome) hay hội chứng suy đa tạng (MODS- Multiorgan Disfunction Syndrome) Các nghiên cứu cho thấy một số bệnh nhân không biểu hiện triệu chứng (phát hiện qua xét nghiệm) và cũng có trường hợp biểu hiện các triệu chứng không điển hình (viêm não hoặc viêm đường tiêu hóa) [6] Không giống như cúm mùa ,

bê ̣nh nhân nhiễm A/H5N1 thường không có biểu hiê ̣n nhiễm trùng đường hô hấp trên mà thường biểu hiê ̣n tình tra ̣ng viêm phổi và nhiễm trùng đường hô hấp dưới Đặc điểm lâm sàng này có thể là do các thụ thể đ ặc hiệu với HA của virus cúm A/H5N1 có nhiều ở đường hô hấp dưới Triệu chứng cận lâm sàng thường gă ̣p là: giảm số lượng bạch cầu , đă ̣c biê ̣t là ba ̣ch cầu lympho , giảm số lượng tiểu cầu , giảm albumin huyết; tăng hàm lượng mô ̣t số protein huyết thanh như aminotransaminase , lactate dehydrogenase và creatine phosphokinase ; đường huyết tăng rõ , có thể liên quan đến viê ̣c sử du ̣ng corticosteroid và có thể tăng creatinine máu [31] Ở những

nhân ở giai đoa ̣n cuối của bê ̣nh thì hàm lượng cytokin và chemokin trong máu thường tăng cao , đă ̣c biê ̣t là các yếu tố như interleukin -6, yếu tố hoa ̣i tử u và các interferon, chứ ng tỏ hiê ̣n tươ ̣ng virus đang phát tán trong cơ thể [19] Ở những bệnh nhân tử vong, người ta đã phát hiện các kháng nguyên và/hoă ̣c RNA của virus ở hầu hết các mô trong cơ thể , bao gồm: phổi, khí quản, gan, niêm ma ̣c ruô ̣t non, ruô ̣t già, tủy xương và não

Tỉ lệ tử vong đối với bệnh nhân nhiễm cúm A/H5N1 nhập viện tương đối cao, xấp xỉ 60% [13, 16], mặc dù tỷ lệ tử vong chung có lẽ thấp hơn nhiều Trái ngược với năm 1997, khi phần lớn các ca tử vong xảy ra ở bệnh nhân trên 13 tuổi, cúm A/H5N1 hiện nay gây tỷ lệ tử vong cao ở trẻ nhỏ Ở trẻ dưới 15 tuổi, tỷ lệ tử vong

là 89% [16] Thời gian trung bình từ khi có triệu chứng đầu tiên đến khi tử vong là 9-10 ngày (thay đổi từ 6-30 ngày) và hầu hết bệnh nhân tử vong do suy hô hấp tiển triển [5, 16]

1.2.2 Các phương pháp xét nghiệm và chẩn đoán nhiễm cúm A/H5N1

Chẩn đoán lâm sàng nhiễm cúm A/H5N1 là rất khó vì triệu chứng của bệnh rất

đa dạng và tương tự như một số bệnh khác Để chẩn đoán xác định người ta thường phải dựa vào các kết quả xét nghiệm xác định sự có mặt của virus, kháng nguyên, kháng thể hoặc RNA của virus trong mẫu bệnh phẩm

1.2.2.1 Các phương pháp xét nghiệm phát hiện cúm A/H5N1

Với đặc điểm cấu tạo và khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1, kỹ thuật xét nghiệm không chỉ đòi hỏi có độ tin cậy và độ nhạy cao mà thời gian xét nghiệm phải nhanh [34] Các kỹ thuật xét nghiệm có thể áp dụng trong chẩn đoán virus cúm A/H5N1 bao gồm: phân lập virus; phát hiện kháng nguyên; phát hiện RNA của virus bằng kỹ thuật RT-PCR, realtime RT-PCR và phát hiện sự tăng hiệu giá kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân Trong giai đoạn dịch cúm A/H5N1 đang bùng phát thì việc áp dụng các kỹ thuật chẩn đoán nhanh, có thể thực hiện với nhiều mẫu bệnh phẩm cùng một lúc có vai trò hết sức quan trọng

Phương pháp phân lập virus

Hiện nay, phân lập virus là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán cúm A/H5N1 vì các chủng virus sau khi phân lập có thể được dùng trong các nghiên cứu về sau như: giải trình tự, xác định subtype, xác định clade, phân tích các đột biến và hiện tượng tái tổ hợp để tìm hiểu về khả năng tái bản, khả năng lây nhiễm của virus và hiện tượng kháng thuốc của virus Virus A/H5N1 có thể phân lập bằng cách nuôi cấy trên phôi gà SPF (specific pathogenic free) hoặc nuôi cấy trên tế bào thận chó (Mardin-Darby canine kidney - MDCK) hoặc các dòng tế bào cảm nhiễm với virus cúm khác

Phân lập từ trứng: hầu hết các virus cúm phát triển ổn định trong khoang túi

niệu hoặc túi ối của phôi gà 10-12 ngày tuổi Sau khi gây nhiễm trứng 48-72 giờ, thu dịch khoang niệu mô, xác định sự có mặt và xác định subtype virus bằng các phản ứng miễn dịch (HA, HI) hoặc RT-PCR Với chủng virus có độc lực cao, phôi

có thể bị chết trong vòng 24 giờ sau khi gây nhiễm

Phân lập từ tế bào: Khi nuôi cấy các virus cúm mùa LPAI trên tế bào MDCK,

người ta phải bổ sung trypsin để virus có thể tái bản Tuy nhiên, đối với các virus cúm A/H5N1, vì là HPAI nên virus có thể tái bản mà không cần bổ sung trypsin

Là tiêu chuẩn vàng, nhưng phân lập virus đòi hỏi phải có phòng an toàn sinh học cấp 3 (BioSafety Level 3 - BSL3) và thời gian nuôi cấy tương đối lâu, từ 2-6 ngày Ngoài ra, sau khi phân lập được virus vẫn phải thực hiện các xét nghiệm khác

để chẩn đoán xác định subtype virus

Phương pháp phát hiện kháng nguyên

Là phương pháp dùng kháng thể đặc hiệu để phát hiện kháng nguyên virus Người ta có thể phát hiện kháng nguyên của virus trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm bằng một số kỹ thuật khác nhau, tuy nhiên kỹ thuật được sử dụng phổ biến hơn do thời gian xét nghiệm nhanh là:

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (direct immunofluorescence assay):

Tế bào niêm mạc đường hô hấp được cố định trên lam kính, kháng nguyên của virus

được phát hiện bằng kháng thể đặc hiệu có gắn huỳnh quang và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang

Kỹ thuật miễn dịch gắn men (EIA: Enzyme-linhked Immunosorbent Assay):

Kỹ thuật sử dụng kháng thể đặc hiệu gắn enzyme để phát hiện kháng nguyên virus Mẫu bệnh phẩm được gắn lên thành giếng, sau khi được ủ với kháng thể có gắn enzyme thì bổ sung cơ chất phù hợp Nếu có kháng nguyên virus trong mẫu bệnh phẩm thì enzyme sẽ tác dụng với cơ chất làm đổi màu

Kỹ thuật phát hiện kháng nguyên virus nhanh, đơn giản nhưng chỉ phát hiện được các kháng nguyên bảo thủ của virus cúm như NP và M Do đó, kết quả xét nghiệm dương tính cũng chỉ có thể kết luận là nhiễm virus cúm A, không xác định được có phải là A/H5N1 hay không Độ nhạy của các kỹ thuật có thể chấp nhận được khi áp dụng trong chẩn đoán cúm mùa ở người, tuy nhiên để chẩn đoán cúm A/H5N1 thì chưa đạt yêu cầu [9, 34] Hiện nay một số bộ sinh phẩm phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của H5N1 đã được đưa ra thị trường và đang được thử nghiệm trong chẩn đoán cho gia cầm

Phương pháp phát hiện kháng thể (chẩn đoán huyết thanh học)

Là phương pháp dùng kháng nguyên chuẩn virus (virus) để phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng virus trong huyết thanh hoặc trong các dịch cơ thể Một số kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh có thể áp dụng trong chẩn đoán cúm A/H5N1:

Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI- Hemagglutinin Inhibitory): Thành

phần phản ứng bao gồm kháng nguyên virus chuẩn, kháng huyết thanh cần kiểm tra (đã loại bỏ các yếu tố ức chế và các yếu tố gây ngưng kết hồng cầu) và hồng cầu pha loãng 0.4-0.5% (hồng cầu gà, hồng cầu lợn guinea, hoặc hồng cầu người nhóm máu O) Kháng nguyên virus chuẩn được ủ với kháng huyết thanh ở các nồng độ khác nhau, sau đó bổ sung hồng cầu Mẫu dương tính là mẫu có chứa kháng thể đặc hiệu với HA, là các giếng có hồng cầu không bị ngưng kết mà lắng xuống đáy giếng Hiệu giá HI chính là tỉ lệ pha loãng huyết thanh thấp nhất có thể ức chế ngưng kết hồng cầu [33]

Phản ứng HI thường được sử dụng để phát hiện kháng thể đặc hiệu của virus cúm mùa trong huyết thanh bệnh nhân nhưng ít được sử dụng để phát hiện kháng thể kháng virus H5N1 trong huyết thanh người và động vật có vú do có độ nhạy thấp [8]

Western Blot (WB): là kĩ thuật có độ nhạy cao, được sử dụng để phát hiện

kháng thể kháng virus cúm trong các mẫu huyết thanh Kháng nguyên toàn phần của virus hoặc protein HA tinh chế được chạy điện di trên gel, sau đó chuyển sang màng nitrocellulose hoặc nylon Màng chứa kháng nguyên được cắt thành các băng nhỏ, ủ với mẫu huyết thanh pha loãng, kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh sẽ liên kết với kháng nguyên gắn trên màng Tiến hành ủ các băng nêu trên với kháng kháng thể đặc hiệu có gắn enzyme, chất chỉ thị màu (phosphatase kiềm hoặc peroxidase cải củ cay) hoặc biotin và được nhận biết bằng streptavidin-HRP Vị trí gắn kháng thể kháng virus sẽ được xác định khi ủ các băng này với cơ chất của enzyme hoặc chất tạo màu WB có độ nhạy cao, thường được sử dụng kết hợp với

kĩ thuật HI hoặc EIA để làm tăng độ nhạy và độ đặc hiệu [42]

Kĩ thuật trung hoà virus: Mẫu virus được ủ với huyết thanh bệnh nhân sau đó

hỗn hợp được sử dụng để gây nhiễm trong hệ thống phù hợp (tế bào nuôi cấy, phôi trứng) để xác định sự xâm nhiễm của virus Nếu không có sự xâm nhiễm của virus, tức là kết quả dương tính, khi đó huyết thanh có kháng thể đặc hiệu với virus Người ta đã áp dụng kỹ thuật này trong vụ dịch ở Hong Kong năm 1997 để phát hiện kháng thể kháng H5N1 trong huyết thanh bệnh nhân và có thể phát hiện được

14 ngày sau khi bệnh nhân biểu hiện triệu chứng [35] Kỹ thuật này có độ nhạy và

độ đặc hiệu cao, có thể sử dụng để phát hiện kháng thể kháng H5N1 ở người nhưng

do sử dụng mẫu virus cúm gia cầm nên cũng phải thực hiện trong phòng an toàn sinh học cấp độ 3

Kỹ thuật trung hòa vi lượng (Microneutralization - MN): là kĩ thuật trung hoà

virus được thực hiện trên tấm 96 giếng, kết quả được đọc bằng phản ứng EIA sau 18-22 giờ kể từ khi gây nhiễm Kĩ thuật MN dựa trên phản ứng trung hòa virus với

nhau và được ủ cùng một lượng virus nhất định trước khi tiến hành gây nhiễm tế bào Nếu trong huyết thanh bệnh nhân có kháng thể đặc hiệu kháng H5N1 thì kháng thể sẽ trung hòa virus và virus không thể gây nhiễm tế bào Sau khi ủ, các tế bào được gắn cố định và tiến hành xác định sự có mặt của protein NP của virus trong các tế bào nhiễm virus bằng phản ứng EIA Hiện nay, kỹ thuật MN là kỹ thuật phát hiện kháng thể kháng H5N1 tốt nhất Nhược điểm là kỹ thuật áp dụng với mẫu virus sống nên phải thực hiện trong phòng an toàn sinh học cấp độ 3 So với kĩ thuật trung hoà virus thông thường, kỹ thuật MN cho kết quả nhanh, chính xác hơn và có thể thực hiện đồng thời nhiều mẫu trên một tấm 96 giếng

Chẩn đoán huyết thanh học có vai trò quan trọng trong các nghiên cứu dịch tễ học Các kỹ thuật này đòi hỏi phải có hai mẫu huyết thanh giai đoạn cấp và giai đoạn phục hồi, do đó ít có giá trị trong chẩn đoán nhiễm H5N1 cấp mà thường chỉ được sử dụng để khẳng định chẩn đoán trên bệnh nhân đang điều trị

Giai đoạn 2: Dùng sợi đôi cDNA làm khuôn mẫu để thực hiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mong muốn

Có 2 phương pháp thực hiện RT-PCR Đó là phương pháp RT-PCR một bước

và phương pháp RT-PCR hai bước Trong phương pháp RT-PCR hai bước, phản ứng phiên mã ngược tạo cDNA thực hiện trong một tube phản ứng, sau đó lấy sản phẩm cDNA cho vào tube PCR chứa PCR mix với mồi đặc hiệu để chạy PCR khuếch đại trình tự DNA đích muốn tìm Phương pháp này sẽ có nguy cơ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại do phải mở nắp tube PCR để cho sản phẩm cDNA của giai đoạn RT vào Tuy nhiên, nguy cơ ngoại nhiễm có thể loại bỏ hoàn toàn bằng

việc cho dUTP và UNG (uracil-N-glycosylase) vào PCR mix của giai đoạn PCR Với phương pháp RT-PCR một bước, cả hai giai đoạn RT và PCR được thực hiện trong một tube phản ứng, tất cả các thành phần của 2 giai đoạn được cho vào cùng một lần Ở đây, toàn bộ sản phẩm cDNA đều tham gia vào PCR và không nhất thiết phải có mồi riêng cho RT vì chính mồi của PCR sẽ được sử dụng làm mồi cho RT RT-PCR một bước thuận tiện hơn và tránh được nguy cơ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại

Kỹ thuật RT-PCR phát hiện các trình tự gen đặc trưng cho virus cúm A (gen M) hoặc cho subtype HA và NA của virus dựa trên các cặp mồi được thiết kế đặc hiệu với từng gen, do đó có thể xác định được các subtuye virus cúm A với độ nhạy

và độ đặc hiệu cao Để chẩn đoán các trường hợp nghi nhiễm cúm A/H5N1, người

ta thường phải thực hiện vài phản ứng RT-PCR, bao gồm phản ứng xác định nhiễm cúm A và các phản ứng xác định subtype HA và NA Thời gian để thực hiện xét nghiệm bằng kỹ thuật này mất khoảng từ 12-24 giờ hoặc hơn, tùy thuộc vào từng phòng thí nghiệm Kỹ thuật realtime RT-PCR chẩn đoán A/H5N1 giúp rút ngắn thời gian xét nghiệm xuống còn 4-6 giờ, tăng độ nhạy và độ đặc hiệu đồng thời có thể xác định được mật độ virus trong mẫu bệnh phẩm [18, 41] Do không phải điện di phân tích kết quả nên kỹ thuật realtime RT-PCR hạn chế được hiện tượng dương tính giả do nhiễm sản phẩm PCR Kỹ thuật này cho kết quả nhanh và chính xác nhưng chi phí cao, tốn kém

Kỹ thuật multiplex RT-PCR: Sử dụng cả 3 cặp mồi đặc hiệu phát hiện cả 3 gen

M, HA và NA của virus cúm A/H5N1 trong cùng một phản ứng Kỹ thuật này khắc phục được nhược điểm của hai kỹ thuật trên nhưng để xây dựng được phản ứng multiplex RT-PCR thì quan trọng nhất là phải thiết kế được các mồi có nhiệt độ gắn mồi (Ta- Annaeling temperature) vào DNA đích tương đương nhau và quan trọng nữa là độ nhạy phát hiện từng tác nhân đích không bị giảm so với độ nhạy của RT-PCR đơn mồi

Kỹ thuật RT-PCR chẩn đoán cúm A/H5N1 với độ nhạy và độ đặc hiệu cao

đây đã hình thành nhiều subclade khác nhau [14] nên việc chẩn đoán A/H5N1 bằng

kỹ thuật RT-PCR đòi hỏi phải thường xuyên chuẩn hóa, thay đổi các cặp mồi cho phù hợp với sự biến đổi của virus cúm A/H5N1

1.2.2.2 Chẩn đoán

Ngày 19/08/2008, Bộ trưởng Bộ Y tế đã ra quyết định số: 30/2008/QĐ-BYT

về việc ban hành “Hướng dẫn chẩn đoán, xử trí và phòng lây nhiễm cúm A/H5N ở người” Theo đó, việc chẩn đoán nhiễm cúm A/H5N1 ở người dựa vào yếu tố dịch

tễ, các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng, trong đó tiêu chuẩn quan trọng nhất

để chẩn đoán xác định một trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 là kết quả xét nghiệm dương tính với cúm A/H5N1 bằng kỹ thuật RT-PCR

1.2.3 Điều trị nhiễm cúm A/H5N1 ở người

Hai dòng thuốc kháng virus được sử dụng để điều trị các trường hợp nhiễm virus cúm gia cầm là các thuốc ức chế neuraminidase (oseltamivir và zanamivir) và các thuốc ức chế kênh ion M2 (amantadine và rimantadine) Các thuốc ức chế NA được sử dụng phổ biến hơn do thuốc có ít tác dụng phụ và ít bị kháng thuốc hơn so với các thuốc dòng adamantane Do còn thiếu các nghiên cứu thử nghiệm nên liều lượng và thời gian điều trị của các thuốc kháng virus còn chưa được chuẩn hóa Tuy nhiên WHO khuyến cáo rằng các trường hợp có biểu hiện các triệu chứng về tiêu hóa, các trường hợp nặng hoặc điều trị ở giai đoạn muộn cần phải sử dụng thuốc với liều cao và thời gian điều trị dài hơn các trường hợp thông thường [5]

Những nguyên tắc khi điều trị bằng các thuốc kháng virus bao gồm: Bệnh nhân nghi ngờ nhiễm cúm A/H5N1 cần được điều trị ngay bằng thuốc kháng virus

mà không chờ kết quả xét nghiệm [49] Oseltamivir là lựa chọn hàng đầu, đối với những trường hợp nhiễm A/H5N1 thể nặng có thể dùng oseltamivir với liều gấp đôi (150 mg x 2 lần/ngày) và tăng thời gian dùng thuốc [49] Oseltamivir vẫn có tác dụng tốt đối với các trường hợp điều trị muộn nếu có dấu hiệu virus vẫn đang nhân lên [49, 20] Điều trị phối hợp các thuốc kháng virus với nhau hoặc phối hợp thuốc

kháng virus với thuốc kháng viêm hoặc thuốc điều trị miễn dịch cũng được áp dụng, tuy nhiên hiệu quả của các phương pháp điều trị phối hợp đều chưa được đánh giá đầy đủ Corticosteroid là thuốc được sử dụng phổ biến nhưng hiệu quả điều trị chưa

rõ ràng Thậm chí một nghiên cứu còn cho thấy trong số 7 bệnh nhân được điều trị bằng corticosteroid có tới 6 bệnh nhân tử vong [47] Rõ ràng là cần phải có những nghiên cứu tiếp theo để đánh giá về hiệu quả điều trị khi phối hợp thuốc kháng virus với các thuốc khác Ở giai đoạn toàn phát của bệnh, đặc biệt là khi bệnh nhân đã biểu hiện ARDS và/hoặc MODS, thì bệnh nhân cần phải được chăm sóc đặc biệt với sự hỗ trợ thở máy, dùng thuốc vận mạch và liệu pháp thận thay thế [16] Đối với những trường hợp viêm phổi tiến triển thành ARDS thì không nên áp dụng thở máy thông thường mà cần đặt nội khí quản ngay khi bệnh nhân có biểu hiện suy hô hấp

1.2.4 Kiểm soát lây nhiễm và dự phòng

Mỗi đợt dịch cúm HPAI H5N1 ở người thường khởi đầu bằng các vụ dịch cúm trên gia cầm Do vậy, để phòng chống sự lây lan từ gia cầm sang con người chúng ta cần tăng cường các biện pháp nhằm ngăn chặn và diệt trừ nguồn bệnh trên gia cầm Các biện pháp này bao gồm công tác tiêm chủng, tăng cường các biện pháp an toàn sinh học và tiêu hủy gia cầm khi xảy ra dịch Ở các quốc gia chưa xảy

ra dịch, công tác giám sát, các biện pháp an toàn sinh học và kế hoạch phòng chống dịch có vai trò quan trọng để ngăn chăn sự xuất hiện của virus và thiết lập tình trạng sẵn sàng trong phòng chống dịch cúm gia cầm.Các biện pháp phòng ngừa ở mức độ quốc gia có thể làm giảm nguy cơ lây lan dịch cúm gia cầm qua đường biên giới; tuy nhiên, các biện pháp phòng ngừa ở mức độ xử lý dịch có vai trò quan trọng để ngăn chặn sự lây lan dịch bệnh ở người Các biện pháp phòng ngừa này do WHO và CDC (Centers for Disease Control and Prevention) đưa ra nhằm làm giảm tỉ lệ mắc cúm gia cầm ở người bằng cách thực hiện các biện pháp bảo vệ cá nhân phù hợp tại các cơ sở y tế Hiện tại, CDC và WHO khuyến cáo sử dụng khẩu trang N-95 khi chăm sóc bệnh nhân cúm gia cầm Trong quá trình thực hiện các thủ thuật có nguy

cơ cao như soi phế quản, thông khí không xâm lấn, đặt nội khí quản, cho bệnh nhân

tiện chuyên dụng hơn như mặt nạ kín hoàn toàn hoặc mặt nạ lọc khí kết hợp với các dụng cụ bảo hộ khác như áo choàng không thấm nước, găng tay và kính bảo vệ mặt [12] Rửa tay trước và sau khi tiếp xúc với bệnh nhân bằng các dung dịch khử trùng tại bồn rửa ngay trong phòng bệnh nhân Ngay khi bệnh nhân nhập viện, cần phải tiến hành cách ly bệnh nhân trong phòng áp lực âm Các nhân viên y tế cần được tiêm phòng vaccine cúm mùa hàng năm để ngăn chặn hiện tượng đồng nhiễm virus cúm Các nhân viên y tế tiếp xúc với bệnh nhân cần được điều trị dự phòng bằng thuốc kháng virus ngay lập tức, nếu ai có biểu hiện nhiễm bệnh phải nghỉ và giám sát chặt chẽ Với các biện pháp phòng ngừa như vậy thì nguy cơ lây lan virus cúm gia cầm sẽ giảm tới mức thấp nhất, ngăn chặn nguy cơ lây nhiễm sang các bệnh nhân khác, sang người nhà và nhân viên y tế

1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VIRUS CÚM A/H5N1 Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI

Trước tình hình lây lan của dịch cúm gia cầm, thế giới và Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về phương pháp chẩn đoán, điều trị và dự phòng bệnh cúm Ngay khi di ̣ch cúm A /H5N1 xảy ra trên gia cầm vào cuối năm 2003, các phòng thí nghiệm trọng điểm của nước ta đã n hanh chóng hoàn thiê ̣n kỹ thuâ ̣t phát hiê ̣n virus cúm A/H5N1 trên mẫu bê ̣nh phẩm bằng kỹ thuâ ̣t RT -PCR đồng thời triển khai kỹ thuâ ̣t giải trình các gen của cúm A/H5N1 nhằm tìm hiểu sâu hơn về chủng virus đang lưu hành ta ̣i Viê ̣t Nam Những chuỗi gen giúp xác định subtype H5, subtype N1 và các gen cấu trúc đã được Viện Công nghệ Sinh học, Viện Pasteur TP

Hồ Chí Minh, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Viện Thú y giải mã và công bố trên Ngân hàng gen [30, 38] Trên cơ sở phân tích trình tự gen kháng nguyên H5 và N1, các tác giả khẳng định nguồn gốc của virus cúm A gây bệnh trên gia cầm và người tại Việt Nam cùng nhóm với virus H5N1 phân lập tại Trung Quốc [30] Các biến chủng H5N1 của Hồng Kông, Trung Quốc phân lập những năm 1997 - 2001 và Hàn Quốc, Đài Loan (phân lập năm 2003) đều có nguồn gốc từ chim cút và ngỗng (A/Goose/Guandong/1/96) vùng Quảng Đông (Trung Quốc), đó là các biến chủng thuộc dòng Quảng Đông [30] Như vậy, virus cúm gia cầm gây bệnh ở gia cầm và

người tại Việt Nam là cúm H5N1 type A thuộc thế hệ mới đã có biến đổi cơ bản về gen H5 và gen N1, nhưng vẫn có cùng nguồn gốc với H5N1 từ vùng địa lý Nam Trung Quốc và Hồng Kông Các chủng phân lập những năm 2004-2006 đã được nghiên cứu khá chi tiết về góc độ gen học và quan hệ phân tử với các chủng trong vùng và thế giới, kết quả khẳng định virus H5N1 vùng Nam và Đông Nam Á thuộc nhóm di truyền VTM (viết tắt: Vietnam-Thailand-Malaysia), có những đặc tính sinh học nhất định khác với các nhóm vùng Trung Quốc và Hồng Kông [15] Năm 2007, xuất hiện thêm biến chủng H5N1 dưới dòng Phúc Kiến tại Việt Nam, đã và đang làm phức tạp thêm vấn đề dịch tễ học và quan hệ kháng nguyên và miễn dịch, do tỷ

lệ tương đồng kháng nguyên HA (H5) và NA (N1) thấp so với các chủng phân dòng Quảng Đông, tuy nhiên vẫn còn có khả năng bảo vệ miễn dịch [1]

Vấn đề chẩn đoán và xây dựng phương pháp phát hiện nhanh và phân biệt cúm A với các tác nhân gây triệu chứng hô hấp khác, cũng như phân biệt các subtype HA và NA đã được các nhà khoa học Việt Nam quan tâm, kết hợp nghiên cứu với các tổ chức thế giới Phát hiện nhanh cúm A/H5N1 và các subtype khác bao gồm việc sử dụng kháng nguyên hoặc kháng thể, hoặc sinh học phân tử đã được xây dựng thành phương pháp Nghiên cứu vaccine và miễn dịch, các nhà khoa học Việt Nam cũng đã có những đóng góp nhất định về tạo chế phẩm kháng nguyên, tạo vaccine di truyền ngược hoặc vector tái tổ hợp trên nền virus cúm A/H5N1 của Việt Nam [1]

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Mẫu vật

- Để thiết kế mồi chẩn đoán virus cúm A/H5N1, chúng tôi sử dụng các trình tự gen M, HA và NA của virus cúm gia cầm đã công bố trên Ngân hàng gen (GenBank)

- Để nghiên cứu tối ưu hóa phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện cúm A/H5N1, chúng tôi sử dụng RNA virus cúm A/H5N1 do Viện Công nghệ Sinh học cung cấp Để đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng, chúng tôi sử dụng RNA virus A/H3, A/H1N1, cúm B do viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương cung cấp; RNA virus A/H5 do Trung tâm chẩn đoán Thú Y Trung Ương cung cấp

- Để thử nghiệm phản ứng multiplex RT-PCR chúng tôi sử dụng 14 mẫu dương tính với cúm A/H5N1 (Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương và Trung tâm chẩn đoán thú y Trung ương cung cấp) và 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ gia cầm bị bệnh trong các vụ dịch cúm năm 2009 ở một số tỉnh phía Bắc

2.1.3 Thiết bị

- Các thiết bị dùng thu thập mẫu bệnh phẩm từ gia cầm bị bệnh: Trang bị bảo

hộ cá nhân (găng tay các cỡ , khẩu trang N 95, kính bảo vệ mắt , ủng, quần áo bảo

hô ̣), ống falcon 1.5 ml (đựng bệnh phẩm), catheter (lấy dịch tỵ hầu hoặc hút dịch đường hô hấp dưới), tăm bông, đè lưỡi, túi nylon, pipet 1 ml, 5 ml, đĩa petri, lọ nhựa, túi đá, hộp bảo quản lạnh, phiếu thu thập bệnh phẩm…

- Thiết bị dùng trong các xét nghiệm phát hiện virus cúm A/H5N1: Máy ly tâm

(Eppendorf), pipette các loa ̣i (Eppendorf), vortex, đầu côn (filter) các loại , tube PCR (RNase free) các loại, găng tay dù ng 1 lần, máy luân nhiệt C1000 (BIORAD), Bio Safety Cabinet level 2 (BIOAIR), máy soi gel và chụp ảnh, bộ nguồn và bể điê ̣n

di, khay đổ gel , bể nhuộm gel , cốc đong 500 ml, lò vi sóng , cân điê ̣n tử , nồi khử trùng,…và các phần mềm thiết kế mồi (clustal X 2.0.11, fastPCR 5.4, BioEdit)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Chọn mẫu

Cách chọn mẫu:

Khi có di ̣c h cúm xảy ra , đối với mỗi đàn gia cầm chúng tô i sẽ cho ̣n ngẫu nhiên từ 2-3 con gia cầm chết hoă ̣c bi ̣ bê ̣nh để lấy mẫu Mẫu bê ̣nh phẩm thu thâ ̣p có thể là m ẫu mô (khí quản, phổi, ruột, lách, thận, não, gan, tim) hoặc dịch ngoáy họng, ổ nhớp Bệnh phẩm được thu thập trong vòng 3 ngày đầu sau khi gia cầm mắc bệnh vì khi đó sẽ có mật độ virus cao nhất

2.2.2 Kỹ thuật lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu

Cách lấy mẫu:

- Mẫu ngoáy họng hoặc mẫu ổ nhớp: Đưa tăm bông mềm vào vùng ho ̣ng hoă ̣c

ổ nhớp của gia cầm , ngoáy kỹ vùng định lấy mẫu Nếu lấy mẫu ngoáy ho ̣ng , cần đưa đầu tăm bông vào đến khí quản để lấy được di ̣ch trong đường hô hấp Sau đó đưa đầu tăm bông vào tu be chứa 3 ml môi trường vâ ̣n chuyển và nh úng kỹ trong môi trường vâ ̣n chuyển Nhấc đầu tăm bông lên khỏi môi trường , ép nhẹ vào thành

- Mẫu mô: Đối với gia cầm chết hoặc bị bệnh , tiến hành mổ gia cầm và thu thâ ̣p mẫu mô (phổi, khí quản, ruô ̣t ) và cho vào tu be chứa môi trường vâ ̣n chuyển virus

Bảo quản mẫu: Các mẫu bệnh phẩm sau khi thu thập được bảo quản bằng đá

lạnh và v ận chuyển về phòng thí nghiệm ngay trong vòng 48 giờ Nếu không v ận chuyển đươ ̣c mẫu về phòng thí nghiệm trước 48 giờ thì bảo quản ở -20o

C hoặc -70oC Khi vận chuyển, mẫu vẫn giữ ở trạng thái đông băng

Vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm:

Bê ̣nh phẩm trước khi vâ ̣n chuyển được đóng gói kỹ trong 3 lớp nhằm bảo vê ̣

bê ̣nh phẩm trong quá trình vâ ̣n chuyển : Vă ̣n chă ̣t nắp tube bê ̣nh phẩm , bọc kỹ miê ̣ng tube bằng giấy parafi n, bọc riêng từng tube bệnh phẩm bằng giấy thấm , đă ̣t tube vào túi nylon vâ ̣n chuyển , buô ̣c chă ̣t Tiếp tu ̣c bo ̣c bên ngoài túi vâ ̣n chuyển bằng giấy thấm hoă ̣c bông thấm nước , cho vào mô ̣t túi nylon khác và buô ̣c chă ̣t Phiếu thu thâ ̣p bê ̣nh phẩm được cho cùng với túi bê ̣nh phẩm vào lớp túi nylon thứ 3, buô ̣c chă ̣t Cho các tú i bê ̣nh phẩm đã đóng gói kỹ vào hô ̣p bảo quản la ̣nh và vâ ̣n

chuyển về phòng thí nghiê ̣m

2.2.3 Tách chiết RNA mẫu bệnh phẩm

Xử lý mẫu

- Đối với mẫu mô: Mẫu bệnh phẩm thu thâ ̣p trên gia cầm đươ ̣c cho vào tube 2

ml có nắp xoáy, bổ sung 1 ml nước tinh sa ̣ch và glass bead, lắc trên máy lắc trong 5 phút để phá vỡ tế bào và giải phóng virus Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút và thu lấy di ̣ch nổi để tách chiết RNA

- Đối với mẫu ngoáy ho ̣ng và ngoáy hậu môn được cho v ào tu be có chứa dung di ̣ch vâ ̣n chuyển virus Các mẫu được lắc kỹ bằng vortex , ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, thu di ̣ch nổi để tách chiết RNA

Tách chiết RNA

Sử du ̣ng 0.14 ml di ̣ch nổi bệnh phẩm đã xử lý để tách chiết RNA bằng bô ̣ sinh phẩm QIAamp viral RNA mini spin protocol

Trước khi tách chiết, kiểm tra và chuẩn bị các loại hóa chất theo hướng dẫn của nhà sản xuất Và các bước tách chiết như sau:

- Hút 560 μl dung di ̣ch buffer AVL/Carrier RNA vào tube ly tâm 1.5 ml

- Thêm 140 μl bệnh phẩm đã đư ợc xử lý vào tube chứa buffer AVL/Carrier RNA Trộn kỹ bằng vortex trong 15 giây

- Để ở nhiê ̣t đô ̣ phòng (15-25°C) trong 10 phút để virus bị phân giải hoàn toàn,

ly tâm nhẹ để tâ ̣p trung dung di ̣ch xuống đáy tube

- Thêm 560 μl ethanol (96-100%) vào tube, trộn bằng vortex trong 15 giây, ly tâm nhe ̣ để tâ ̣p trung dung di ̣ch xuống đáy tube

- Hút 630 μl dung dịch ở trên chuyển vào QIAamp spin column (đã đă ̣t sẵn trong tube 2 ml), cẩn thận tránh để ướt m iê ̣ng tube Đóng chă ̣t nắp và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút Nhấc QIAamp spin column ra đă ̣t column vào mô ̣t tube 2

ml mớ i và vứt bỏ tube cũ

- Hút số dịch còn lại vào QIAamp spin column rồi ly tâm và chuyển QIAamp spin column sang tube 2 ml mới

- Bổ sung 500 μl buffer AW1 và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút Đặt QIAamp spin column vào tube 2 ml khác và vứt bỏ tube cũ

- Đặt QIAamp spin colu mn vào 1 tube ly tâm 1.5 ml, vứt bỏ tube c ũ Bổ sung

60 μl buffer AVE Đóng chă ̣t nắ p, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút

RNA có thể bền vững trong vòng 1 năm khi bảo quản ở –20°C hoă ̣c –70°C

2.2.4 Thiết kế mồi

Mồi là những đoạn oligonucleotide dài khoảng 18-30 nucleotide có trình tự bổ sung với hai đầu của đoạn DNA muốn khuếch đại Mồi có vai trò khởi động enzyme DNA polyemerase để kéo dài chuỗi DNA đích và quyết định hiệu quả và

độ chính xác của phản ứng PCR

Để có thể phát hiê ̣n đươ ̣c virus trong mẫu bê ̣nh phẩm bằng kỹ thuâ ̣t RT-PCR

mồi Các mồi thiết kế phải đặc hiệu với các gen đặc trưng cho đối tượng cần xác định Để chẩn đoán virus cúm A/H5N1, chúng tôi tiến hành thiết kế 3 cặp mồi phát hiê ̣n 3 trình tự đặc hiệu trên 3 gen M, HA và NA bao gồm:

- Cặp mồi khuếch đa ̣i trình tự nucleotide đă ̣c hiê ̣u trên g en M của tất cả các subtype của virus cúm A

- Cặp mồi khuếch đa ̣i trình tự nucleotide đă ̣c hiê ̣u trên gen HA của virus cúm

A subtype H5 và không khuếch đại trình tự nucleotide tương đương với các subtype

HA khác

- Cặp mồi khuếch đa ̣i trình tự nucleotide đă ̣c hiê ̣u trên gen NA của virus cúm

A subtype N1 và không khuếch đại trình tự nucleotide tương đương vớ i các subtype

NA khác

Các cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự gen M, HA và NA của các chủng virus cúm A/H5N1 đã công bố trên Genbank theo các nguyên tắc nhất định về: kích thước mồi từ 18-30 nucleotide; nhiệt độ biến tính các mồi (Tm) tương đương nhau;

tỷ lệ GC trong mồi từ 40-60%; trình tự nucleotide của mồi đặc hiệu với khuôn; tránh bắt cặp bổ sung của 2 hoặc nhiều hơn các nucleotide tại đầu 3’ của các mồi để giảm sự hình thành primer-dimer; các nucleotide ở đầu 3’ của mồi bắt cặp hoàn toàn đặc hiệu với trình tự đích để giảm thiểu tối đa hiện tượng bắt cặp sai; tránh 3 hoặc nhiều hơn G hoặc C tại đầu 3’ liền nhau; tránh trình tự bắt cặp bổ sung bên trong mỗi mồi và giữa các mồi; chọn vị trí mồi sao cho kích thước các đoạn DNA đích nhân lên trong phản ứng multiplex RT-PCR phân biệt được trên bản điện di

Để thiết kế mồi, chúng tôi sử dụng các phần mềm chuyên dùng cho thiết kế mồi đó

là FastPCR5.4, BioEdit, Clustalx2.0.11 Các bước thiết kế các cặp mồi đặc hiệu các gen M, HA và NA như sau:

+ Mở trang web của NCBI (National Center for Biotechnology Information)

các thông tin cần thiết về: loài virus (virus cúm A), vâ ̣t chủ (bất kỳ), khu vực (bất kỳ), các gen cần download (M, HA và NA), thờ i gian lưu hành, subtype (H5N1),

+ Download các trình tự nucleotide của các gen M, HA và NA của virus đã đươ ̣c công bố trên GenB ank dưới da ̣ng FASTA file Các chủng virus chọn để thiết

kế mồi được phân lập từ nhiều đối tượng khác nhau

+ Tiến hành so sánh các trình tự nucleotide bằng phần mềm Clustal X 2.0.11 + Phân tích kết quả so sánh bằng phần mềm BioEdit , lựa chọn các đoạn trình tự có đô ̣ lă ̣p la ̣i cao để thiết kế mồi cho các gen

+ Phân tích các trình tự có đô ̣ lă ̣p la ̣i cao bằng phần mềm FastPCR 5.4 để lựa chọn các trình tự m ồi đặc hiê ̣u sử du ̣ng được trong cùng một phản ứng multiplex RT-PCR chẩn đoán cúm A/H5N1

+ Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi đã chọn bằng Primer - Blast với các trình tự DNA của virus cúm có trên ngân hàng dữ liệu gene của NCBI

Cặp mồi thiết kế phát hiện gen M được lựa chọn từ những vùng bảo tồn trên gen M của các subtype virus cúm A khác nhau Trong khi đó, các mồi phát hiện gen H5 và N1 được lựa chọn từ những vùng không thay đổi (ít bị đột biến) trên các trình

tự gen HA và NA của virus cúm A subtype H5N1

2.2.5 Tối ƣu phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen M, HA và NA

Sau khi thiết kế được các cặp mồi, chúng tôi thực hiện phản ứng RT-PCR vớ i từng că ̣p mồi riêng rẽ để xác định các điều kiện (nồng đô ̣ mồi, nhiê ̣t đô ̣ và thời gian gắn mồi, thời gian kéo dài chuỗi, số chu kỳ lă ̣p la ̣i) thích hợp nhất để phát hiện được từng gen M, HA và NA của virus cúm A/H5N1 Phản ứng RT-PCR được thực hiện với bô ̣ sinh phẩm Qiagen Onestep RT-PCR, trên máy luân nhiê ̣t C 1000 (Biorad) Theo bộ sinh phẩm này, cả hai giai đoạn phiên mã ngược tạo cDNA (phản ứng RT) và giai đoạn khuếch đại (phản ứng PCR) được thực hiện trong cùng một tube phản ứng, nghĩa là sau khi cho RNA tách chiết vào tube, phản ứng phiên mã ngược sẽ được thực hiện trước nhờ enzyme Omniscript and Sensiscrip Reverse Transcriptases và tiếp đến phản ứng PCR nhờ enzyme Hot Star Taq DNA polymerase Như vậy, tất cả các thành phần của phản ứng RT và PCR được cho vào một tube phản ứng trong cùng một lần Thể tích của mỗi phản ứng RT-PCR thử nghiệm là 50 l bao gồm các thành phần trong bảng 2.1: