Nghiên cứu và thử nghiệm hạt từ nano được chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán Virus Epstein Barr

Trong số đó, các hạt nano từ tính được chức năng hóa bề mặt đã và đang được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong những năm gần đây, ví dụ như tách chiết axít nucleic ADN, ARN, phân tách

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

PHẠM THỊ TRÀ

NGHIÊN CỨU VÀ THỬ NGHIỆM HẠT TỪ NANO ĐƯỢC CHỨC NĂNG HÓA BỀ MẶT TRONG

CHẨN ĐOÁN VIRUS EPSTEIN BARR

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN

TS Nguyễn Thị Vân Anh

Hà Nội – 2011

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 TỔNG QUAN VỀ EPSTEIN BARR VIRUS (EBV) 6

1.1.1 Giới thiệu chung về EBV 6

1.1.2 Vai trò gây ung thư vòm mũi họng của EBV 10

1.1.3 Quá trình nhân lên, tàng nhiễm và khả năng gây ung thư của EBV 11

1.1.4 Các phương pháp phát hiện EBV 12

1.2 NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ HẠT NANO TỪ VÀ ỨNG DỤNG 13

1.2.1 Hạt nano từ 13

1.2.2 Các phương pháp chế tạo hạt nano từ [3] 14

1.2.2.1 Phương pháp nghiền 15

1.2.2.2 Phương pháp đồng kết tủa 15

1.2.2.3 Phương pháp vi nhũ tương 16

1.2.3 Ứng dụng hạt nano từ trong lĩnh vực y sinh 17

1.2.3.1 Phân tách và chọn lọc tế bào 18

1.2.3.2 Dẫn truyền thuốc 20

1.2.3.3 Tăng thân nhiệt cục bộ 23

1.2.3.4 Tăng độ tương phản cho ảnh cộng hưởng từ 23

1.3 VAI TRÕ CỦA VIỆC TINH SẠCH AXIT NUCLEIC 23

1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH VÀ LÀM GIÀU AXIT NUCLEIC CỦA SINH VẬT 24

1.4.1 Nguyên lý chung 24

1.4.2 Phương pháp tinh sạch axít nucleic bằng dung môi hữu cơ 25

1.4.3 Phương pháp tinh sạch axít nucleic bằng màng xốp silica 27

1.4.4 Phương pháp tinh sạch axít nucleic bằng hạt từ nano bọc silica 28

1.4.5 Điều kiện và cơ chế phân tử ADN hấp thụ lên bề mặt hạt nano từ bọc silica 29 1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG HẠT NANO TỪ BỌC SILICA TINH SẠCH AXÍT NUCLEIC 32

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 NGUYÊN LIỆU 34

2.1.1 Mẫu máu 34

2.1.2 Mồi 34

2.1.3 Các hóa chất, nguyên liệu khác 35

2.1.4 Máy móc và thiết bị 36

2.2 PHƯƠNG PHÁP 36

2.2.1 Tách chiết axit nucleic 36

2.2.1.1 Tách chiết ADN bằng MinElute Virus Spin Kit 36

2.2.1.2 Tách chiết ADN bằng kít Dynabead Myone SILANE ® 37

2.2.1.3 Tách chiết ADN bằng bộ kít Virus Magnet Nano Kit 37

2.2.2 Nhân bản đoạn gen đích đặc hiệu bằng kỹ thuật PCR 39

2.2.3 Nhân dòng sản phẩm PCR vào vector pGEM-T easy 43

2.2.4 Tinh sạch plasmid theo kít của Qiagen 44

2.2.5 Giải trình trình tự gen đã được nhân dòng 45

2.2.6 Định lượng gen đích bằng kỹ thuật PCR tại thời điểm (Real-time PCR) 46

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 48

3.1 NHÂN DÕNG ĐOẠN GEN EBNA-2 KÍCH THƯỚC 250 BP ĐẶC HIỆU CHO EBV 48

3.1.1 Nhân bản đoạn gen đặc hiệu của EBV bằng nested PCR với hai lần phản ứng PCR độc lập 48

3.1.2 Nhân bản đoạn gen đặc hiệu của EBV bằng nested PCR với một lần PCR và một chu trình nhiệt duy nhất 49

3.1.3 Kết quả nhân dòng đoạn gen EBNA-2/250 53

3.2 KẾT QUẢ NHÂN DÕNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEIN MÀNG BNRF1 p143 KHÔNG CHỨA NHÓM GLYCOSYL KÍCH THƯỚC 74 bp (EBV- 74) 57

3.2.1 Nhân bản đoạn gen EBV-74 58

3.2.2 Kết quả nhân dòng đoạn gen EBV-74 59

3.3 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN EBV BẰNG BỘ KÍT VIRUS MAGNET

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

3.4 ĐÁNH GIÁ ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA BỘ KÍT VIRUS MAGNET NANO KIT

VỚI HAI BỘ KÍT THƯƠNG MẠI BẰNG PCR 62

3.5 SO SÁNH KHẢ NĂNG TÁCH CHIẾT ADN EBV CỦA VIRUS MAGNET

NANO KIT VỚI HAI BỘ KÍT THƯƠNG MẠI BẰNG REAL-TIME PCR 64

KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT

Amp Ampicillin

BL Burkit’s Lymphoma (U lympho xương hàm trên)

bp base pair (cặp bazơ)

EBNA Epstein Barr Virus nuclear (Kháng nguyên nhân EBV)

EBV Epstein Barr Virus

EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic acid

(Xét nghiệm miễn dịch liên kết Enzyme)

Gp Glycoprotein

GuSCN Guanidine thiocyanate

IPTG Isopropyl β-D-Thiogalactopyranoside

kb kilobase

LB Luria Bertani

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

LMP Latent Membral Protein (Protein màng tiềm tàng)

PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

VCA Virus capsid antigen (Kháng nguyên vỏ capsid)

MỞ ĐẦU

Công nghệ nano ngày nay đang có những bước tiến rất quan trọng, đặc biệt là

vật liệu nano ngày càng được ứng dụng rộng rãi ở mọi lĩnh vực Một trong những

hướng đi quan trọng của công nghệ nano là ứng dụng của nó trong Y – sinh bao

gồm sử dụng vật liệu nano vào các nghiên cứu, công cụ dẫn thuốc, liệu pháp điều trị,

chẩn đoán và hỗ trợ điều trị bệnh [6, 14, 29, 33] nhằm mục đích cải thiện và nâng

cao sức khỏe của con người Trong số đó, các hạt nano từ tính được chức năng hóa

bề mặt đã và đang được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong những năm gần đây,

ví dụ như tách chiết axít nucleic (ADN, ARN), phân tách tế bào, vận chuyển thuốc,

liệu pháp trị nhiệt từ và nhiều ứng dụng khác nữa [3, 21, 26, 33]

Việc tinh sạch axít nucleic của vi sinh vật trong các mẫu bệnh phẩm là một

bước rất quan trọng vì các nghiên cứu, xét nghiệm sinh học phân tử bằng PCR,

Real-time PCR đều cần đến nguồn axit nucleic tinh sạch Vì vậy, rất nhiều phương

pháp tách chiết và tinh sạch axít nucleic đã được nghiên cứu, phát triển và ứng dụng

rộng rãi, trong đó phương pháp do René Boom và cộng sự phát minh vào năm 1990

là phương pháp được sử dụng nhiều nhất Nguyên lý của phương pháp này dựa trên

khả năng hình thành liên kết bền vững của hạt silica với axít nucleic thông qua cầu

nối cation trong môi trường có nồng độ muối cao [8, 9] Một cải tiến mang tính đột

phá của phương pháp Boom được nhiều công ty công nghệ sinh học hàng đầu trên

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

silica để tinh sạch axít nucleic, giúp nâng cao hiệu quả tách chiết và tiết kiệm thời

gian thao tác Đặc biệt, cải tiến này đã giúp chế tạo được các máy tự động tách chiết

và tinh sạch axít nucleic [27, 39] Tuy nhiên, giá thành của các bộ kít tinh sạch axít

nucleic bằng hạt nano từ bọc silica rất cao Do đó, việc nghiên cứu và phát triển bộ

kít tách chiết axit dựa trên nguyên lý hạt từ bọc silica có ý nghĩa khoa học và ứng

dụng thực tiễn cao giúp cho việc giảm chi phí trong khâu tách chiết, chủ động cung

cấp kít tách chiết axit nucleic khi cần

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xử lý hạt từ nano được chức năng hóa bề

mặt bằng silica (Silica-coated magnetic nano-particles) hay còn gọi là hạt Magsi

nano do nhóm nghiên cứu thuộc Trung tâm Khoa học Vật liệu của Trường Đại học

Khoa học Tự nhiên chế tạo và bộ đệm thích hợp (kế thừa kết quả của nhóm nghiên

cứu phòng Sinh học nano và Ứng dụng) để thử nghiệm khả năng tách chiết axit

nucleic của virus Epstein Barr trong các bệnh phẩm của bệnh nhân ghi nhiễm EBV

EBV là virus truyền nhiễm trên người, lây truyền qua đường ăn uống, tiếp xúc

EBV liên quan đến nhiều bệnh lý nghiêm trọng như: ung thư vòm họng, Burkitt

lymphoma, ung thư lymphoma và các trạng thái biến đổi tế bào lympho [1] ADN

tách chiết bởi bộ kít Virus Magnet Nano Kit bao gồm hạt Magsi nano và bộ đệm

thích hợp sẽ được sử dụng trong phản ứng PCR và Real-time PCR để phát hiện và

định lượng nồng độ EBV trong máu hay các mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm, hỗ trợ

trong công tác chẩn đoán, điều trị, tiên lượng các bệnh liên quan đến EBV

Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành: “Nghiên cứu và thử nghiệm hạt từ

nano được chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán Virus Epstein Barr’’ với các

mục tiêu sau:

1 Xây dựng phương pháp phát hiện định tính và định lượng EBV bằng PCR

và Real-time PCR

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

2 Nghiên cứu thử nghiệm khả năng tách chiết ADN của EBV trong mẫu máu

bằng bộ kít tự chế tạo (Virus Magnet Nano Kit) gồm hạt từ nano được chức năng

hóa bề mặt (cụ thể là hạt từ nano được bọc silica hay còn ký hiệu MagSi nano) và

bộ đệm kèm theo (kế thừa kết quả của nhóm nghiên cứu thuộc phòng Sinh học

Nano và Ứng dụng thử nghiệm trên đối tượng HBV, HCV)

3 So sánh khả năng tách chiết ADN EBV bằng kỹ thuật PCR, Real-time PCR

với nguồn ADN khuôn tách bằng ba bộ kít: MinElute ® Virus Spin Kit của hãng

Qiagen, Dynabead Myone Silane ® Kit của hãng Invitrogen, Virus Magnet Nano

Kit trong cùng điều kiện thí nghiệm

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ EPSTEIN BARR VIRUS (EBV)

1.1.1 Giới thiệu chung về EBV

Hình 1.1: Hình ảnh Epstein Barr Virus dưới kính hiển vi điện tử [47]

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

Năm 1958, Burkitt phát hiện ra khối u lympho xương hàm trên ở trẻ em Châu

Phi, từ đó bệnh này được mang tên ông: Burkitt’s Lymphoma (BL) Vào năm 1964

nhóm tác giả Epstein, Barr và Pulvertaft phân lập được loại virus ở dòng

lymphoblastes trong khối u LB (Lympho’s Burkitt) bằng kính hiển vi điện tử [15]

Từ đó virus này được mang tên là Epstein Barr Virus Năm 1975, tác giả Nadol và

cs phân lập được các hạt (virion) của EBV trong tế bào biểu mô ung thư vòm bằng

kính hiển vi điện tử Đây là lần đầu người ta quan sát được các thể virus thuộc họ

Herpesviridae trong tế bào ung thư ở người, do đó EBV bị nghi ngờ là nguyên nhân

gây ung thư ở người [1]

EBV thuộc họ virus Herpesviridae, có hệ gen thuộc loại ADN sợi đôi xoắn

kép mạch hở, kích thước hệ gen khoảng 184 kb nếu tính cả phần lặp lại ở hai đầu

Hệ gen EBV có 6 tổ hợp gen mã hóa cho các loại protein kháng nguyên nhân

(Epstein Barr Virus nuclear antigen), được ký hiệu là: EBNA-1, EBNA-2,

EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA-LB và 3 gen mã hóa cho protein màng

tiềm tàng (latent membral protein), được ký hiệu là: LMP-1, LMP-2A, LMP-2B

[13] Vai trò của sáu protein EBNA có liên quan đến quá trình nhân lên của EBV

trong tế bào lympho B ở giai đoạn đầu xâm nhiễm còn 3 loại protein LMP có liên

quan đến chu kỳ nhân lên của EBV trong tế bào lympho B

Gen mã hóa cho protein EBNA-2 là một phân đoạn cơ bản trong gen EBNA

của hệ gen EBV EBNA -2 có vai trò biệt hóa tế bào lympho B thành tế bào mầm

non hóa để EBV thực hiện quá trình gây ung thư Hơn nữa gen EBNA-2 là gen

được sao chép sớm nhất do vai trò của nó trong quá trình điều tiết sự nhân lên của tế

bào bị nhiễm EBNA-2 điều hòa quá trình sao chép gen và tổng hợp protein của cả

virus và tế bào bị nhiễm EBV, protein EBNA-2 được coi là yếu tố quan trọng trong

cảm ứng tăng sinh dòng tế bào lympho B [25]

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

Toàn bộ hệ gen EBV được chứa trong một vỏ capsid Vỏ capsid này có hình

thái đối xứng hình khối, đó là cấu trúc protein đóng kín bảo vệ nhân ADN của virus

và mang tính kháng nguyên đặc hiệu của EBV (kháng nguyên VCA), được xác định

bởi 20 mặt bên, 12 đỉnh và 3 trục đồng dạng đối xứng Vỏ capsid lại được bao bọc

bởi một vỏ bao ngoài khác gọi là vỏ ngoài (envelope) cấu trúc từ thành phần chủ

yếu là glycoprotein Vỏ bao ngoài này cũng được mã hóa bởi gen virus và cũng

mang dấu ấn miễn dịch (hình 1.2)

Hình 1.2: Cấu trúc của EBV [43]

Giữa vỏ capsid và vỏ ngoài là khoảng chứa đựng các protein đệm cấu trúc

và các enzyme của virus (Tegument) Vỏ ngoài của EBV có sự nhạy cảm với các

tác động của axit, ether, các dung dịch hòa tan sát khuẩn và đông khô [13]

EBV là loại virus truyền nhiễm gây bệnh trên người và lây truyền qua

đường tiêu hóa, tiếp xúc Do đó, virus này thường được phát hiện thấy trong chất

thải tế bào và chất tiết ở phần trên của hệ tiêu hóa và hô hấp như nước bọt, niêm

dịch vùng họng EBV có đặc tính hướng bạch huyết hấp phụ lên tế bào lympho B

thông qua tương tác của glycoprotein gp350/220 có trên bề mặt virus với thụ thể

CR2/CR21 của bổ thể CD3 trên tế bào lympho B của người (hình 1.3)

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

Hình 1.3: Sự hấp phụ của EBV lên tế bào lympho B qua thụ thể CR21 [46]

EBV ở trạng thái tiềm tan, nhiều bản sao ADN của EBV được tìm thấy trong

tế bào chất của những tế bào lympho B bị nhiễm nhưng chỉ có vài gen được sao

chép EBV có thể gây nhiễm ở dạng tiềm tan và tồn tại lâu dài trong cơ thể mà

không gây bệnh Nhưng trong những cơ thể có thể trạng hệ miễn dịch suy yếu thì

EBV có thể là nguyên nhân gây bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn

(IM-infectious mononucleosis), liên quan đến cơ chế tiến triển của một số loại ung

thư như tăng lympho B, UTVMH, Burkitt lymphoma Đặc trưng của các khối u

trong các bệnh ung thư này là trong các tế bào của khối u có chứa một lượng lớn

các bản sao hệ gen EBV và xuất hiện sự biểu hiện nhiều protein có vai trò chuyển

hóa khối u từ lành tính thành khối u ác tính [25]

Về mặt sinh bệnh học, sự nhiễm virus xảy ra đầu tiên ở vùng miệng, hầu rồi

lan vào máu, tại đây tế bào lympho B bị nhiễm Sự đáp ứng miễn dịch đầu tiên

trong nhiễm EBV là cơ thể sinh kháng thể IgM chống lại kháng nguyên VCA của

EBV, đáp ứng kháng thể IgM chỉ xuất hiện trong vài tuần đầu sau khi nhiễm, tiếp

theo là kháng thể IgG và kháng thể IgG này tồn tại suối đời người nhiễm [19] EBV

thường gây ra nhiễm trùng cấp ở vùng miệng họng, có thể hoặc không biểu hiện

triệu chứng gì Sau quá trình nhiễm đó EBV tồn tại tiềm tàng trong các tế bào biểu

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

mô hoặc lympho B Tùy theo hoàn cảnh hoặc tình trạng bệnh lý đặc biệt ở những

người bị suy giảm miễn dịch ví dụ do HIV/ AIDS, bị suy dinh dưỡng, hay người

phụ nữ nhiễm mà mang thai thì EBV tái hoạt hóa trở lại

EBV gây ra ba loại bệnh chủ yếu, khác nhau tùy theo đặc điểm dân tộc, địa lý,

điều kiện kinh tế xã hội cụ thể như: vùng Châu Phi là bệnh lympho’s Burkitt; ở

Châu âu, Mỹ, Úc là bệnh tăng bạch cầu đơn nhân; còn ở vùng Đông Nam Á chính

là bệnh NPC (Naso-pharyngeal carcinoma tức là ung thư vòm họng) Hiện nay có 2

type EBV được xác định là gây nhiễm ở người là EBV type 1 và EBV type 2 [1]

1.1.2 Vai trò gây ung thư vòm mũi họng của EBV

Biểu mô vùng vòm mũi họng là vị trí chủ yếu cho EBV tìm kiếm tế bào thích

ứng thực hiện sự nhân lên tạo ra nhiều thể virus hoàn chỉnh mới Ung thư vòm mũi

họng là một khối u ác tính xuất phát từ lớp biểu mô phủ của vòm mũi họng [38]

Vùng mũi họng còn có hệ thống dẫn lưu bạch huyết rất phong phú, nên trong ung

thư vòm mũi họng các hạch vùng cổ thường bị di căn rất sớm Ung thư vòm mũi

họng được xếp vào các khối u đường tiêu hóa và hô hấp trên Đây là một trong năm

loại ung thư phổ biến nhất của người Việt Nam và là loại hay gặp nhất trong các

ung thư vùng tai mũi họng Trên thế giới, ung thư vòm mũi họng cũng hay gặp ở

các nước Đông Nam Á và phía nam Trung Quốc Về mặt lâm sàng ung thư vòm

mũi họng có triệu chứng khá phong phú, dễ bị chẩn đoán nhầm với các bệnh thông

thường khác trong tai mũi họng Do vậy, các bệnh nhân thường đến khám và được

chẩn đoán ở các giai đoạn muộn của bệnh, điều này làm ảnh hưởng đến kết quả điều

trị bệnh [24]

Người ta đưa ra rất nhiều giả thiết về nguyên nhân của bệnh ung thư vòm họng

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

do các yếu tố môi trường, tập quán ăn uống, lối sống, hóa chất [34] Đã có rất nhiều

công trình nghiên cứu về mối liên quan giữa EBV và bệnh ung thư vòm mũi họng, các

nghiên cứu này cho thấy sự biểu lộ các kháng nguyên virus trong các giai đoạn của

bệnh và vai trò của EBV trong phát sinh bệnh [11, 17, 22, 23]

1.1.3 Quá trình nhân lên, tàng nhiễm và khả năng gây ung thư của EBV

EBV sau khi nhiễm vào cơ thể có các hướng tiến triển được minh họa ở hình

1.4 gồm hai trường hợp:

1 EBV xâm nhập trực tiếp vào tế bào biểu mô và nhân lên ((1))

Tế bào biểu mô

Virus nhân lên

Tế bào lympho B ở

họng miệng Nhiễm khởi phát

EBV nhân lên trong tế bào B

Chuyển dạng tế bào B

Ly giải tế bào

Nhiễm tiềm tàng

biểu mô

Tế bào B khác

Hình 1.4: Sơ đồ minh họa quá trình tiến triển của Epstein Barr Virus

trong cơ thể người bị nhiễm [45]

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

2 Gây nhiễm trực tiếp vào tế bào lympho B, có tiềm năng cảm ứng biến đổi tế

bào nhiễm tiến triển gây ung thư ((2) (3) (4) (5) (6) (7) (8))

- Đối với trường hợp thứ nhất, EBV tìm thấy sự thích ứng trong tế bào biểu

mô và sự nhân lên của EBV thuộc loại hình gây nhiễm sinh tan Các thể EBV hoàn

chỉnh có thể nhân lên trong tế bào biểu mô hoặc chuyển từ sơ nhiễm sang gây

nhiễm thứ cấp vào tế bào lympho B

- Trường hợp thứ hai, EBV nhiễm khởi phát vào tế bào lympho B có trong

vùng họng, thực hiện sự xâm nhập và nhân lên trong tế bào lympho B và gây

chuyển dạng tế bào này Những virus trong các tế bào lympho này tiếp tục tiến triển

theo hướng: i) EBV nhân lên hàng loạt và ly giải (sinh tan) tế bào B, các thể virus

hoàn chỉnh có thể đi theo các con đường bài tiết qua nước bọt, xâm nhiễm vào tế

bào B khác hay xâm nhiễm vào các tế bào biểu mô ((6), (7), (8)); ii) EBV tồn tại

dạng tiềm tan trong các tế bào B và gây ra đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào

Ở trạng thái tiềm tan có thể EBV thực hiện sự biến đổi tế bào lympho B, non hóa

các tế bào này và biệt hóa chúng tăng sinh và tiến triển chúng thành ung thư vòm

họng Tuy nhiên, quá trình ung thư do EBV còn chịu nhiều tác động của các yếu tố

hỗ trợ và thực chất ra thì ngày nay còn chưa rõ

1.1.4 Các phương pháp phát hiện EBV

Hiện nay có hai phương pháp phát hiện nhiễm EBV được sử dụng trong các

phòng xét nghiệm ở các bệnh viện

Phương pháp miễn dịch học: ELISA phát hiện kháng thể kháng EA (early

antigen - kháng nguyên sớm) Tuy nhiên kháng thể này chỉ xuất hiện trong khoảng

vài tuần sau khi nhiễm EBV do đó khó có thể biết được sự biểu hiện của EBV trong

cơ thể người nhiễm khi đã qua giai đoạn đầu sau khi nhiễm vài tuần Kháng thể

kháng lại VCA (kháng nguyên vỏ capsid) gồm có hai loại là IgG và IgM Tương tự

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

nên xét nghiệm ELISA đối với hai loại kháng thể kháng EA và kháng thể IgM chỉ

có giá trị khi phát hiện nhiễm EBV cấp ở giai đoạn đầu khi nhiễm Kháng thể IgG

tồi tại trong cơ thể người bệnh suốt đời sau khi nhiễm nên kết quả chẩn đoán thường

không có ý nghĩa do tỷ lệ dương tính rất cao không phân biệt được người đã từng bị

nhiễm trong quá khứ đã khỏi bệnh và người đang bị nhiễm EBV [19] Các phương

pháp miễn dịch thường không đem lại hiệu quả nhiều trong chẩn đoán và hỗ trợ

điều trị các bệnh liên quan đến EBV

Phương pháp phát hiện EBV bằng PCR/ Real-time PCR với độ chính xác, đặc

hiệu và độ nhạy cao cho phép phát hiện định tính, định lượng số lượng EBV trong

máu, các mô bệnh phẩm của người nhiễm hỗ trợ cho chẩn đoán, điều trị, tiên lượng

các bệnh do tác nhân EBV gây ra [4, 26] Trong khuôn khổ đề tài cấp nhà nước về

nghiên cứu đặc điểm cấu trúc phân tử virus Epstein Barr ở Việt Nam và qui trình

sản xuất bộ sinh phẩm chẩn đoán (KC.10.31/06-10) do TS Nguyễn Đình Phúc

(Trường đại học Y Hà nội) chủ trì đã bước đầu thành công trong việc chế tạo bộ kít

sinh học phân tử chẩn đoán EBV bằng PCR nhân bản đặc hiệu đoạn gen EBNA-1

có kích thước khoảng 0.8 kb Tác giả Van Baarle Debbie và cs sử dụng nested PCR

nhân bản đặc hiệu đoạn gen ENBA-2 kích thước 250 bp để nghiên cứu tỷ lệ

nhiễm EBV trên các đối tượng bị hội chứng suy giảm miễn dịch HIV/AIDS [32]

1.2 NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ HẠT NANO TỪ VÀ ỨNG DỤNG

1.2.1 Hạt nano từ

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

Hình 1.5: Hình ảnh TEM của hạt nano từ Fe 3 O 4

Hạt nano từ là vật liệu nano không chiều tức là cả ba chiều của nó đều có kích

thước nano (<100 nm) Hạt nano từ được dùng trong y sinh cần phải thỏa mãn ba

điều kiện sau:

- Tính đồng nhất của các hạt cao

- Từ độ bão hòa lớn

- Vật liệu có tính tương hợp sinh học cao (không có độc tính)

Tính đồng nhất về kích thước liên quan nhiều đến phương pháp chế tạo còn từ

độ bão hòa và tính tương hợp sinh học liên quan đến bản chất của vật liệu Trong tự

nhiên, sắt là vật liệu có từ độ bão hòa lớn nhất tại nhiệt độ phòng Ngoài ra sắt còn

là nguyên tố không độc, rất quan trọng đối với cơ thể và có tính ổn định trong môi

trường không khí nên các vật liệu như oxit sắt từ được nghiên cứu rất nhiều để làm

hạt nano từ ứng dụng trong y sinh học

Hạt nano từ dùng trong y sinh học thường ở dạng dung dịch nên còn gọi là

chất lỏng từ Một dung dịch gồm ba thành phần: lõi là hạt Fe3O4 có kích thước nano,

chất chức năng hóa bề mặt (chất hoạt hóa bề mặt) và dung môi Trong đó: i) lõi

Fe3O4 có kích thước nano là thành phần duy nhất quyết định đến tính chất từ của

dung dịch từ; ii) chất hoạt hóa bề mặt có tác dụng làm cho hạt nano từ phân tán

trong dung môi, tránh kết tụ với nhau, ngoài ra nó còn có tác dụng “che chở’’ hạt

nano khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch của cơ thể và tạo các mối liên kết

hóa học với các phân từ khác trong điều kiện phù hợp Dung môi là chất lỏng mang

toàn bộ hệ

1.2.2 Các phương pháp chế tạo hạt nano từ [3]

Các hạt nano từ tính có thể được chế tạo theo các phương pháp thông dụng

dưới đây

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

1.2.2.1 Phương pháp nghiền

Phương pháp nghiền được phát triển từ rất sớm để chế tạo chất lỏng từ dùng

cho các ứng dụng vật lý như truyền động từ môi trường không khí vào buồng chân

không, làm chất dẫn nhiệt trong các loa công suất cao Trong những nghiên cứu đầu

tiên về chất lỏng từ, vật liệu từ tính oxit sắt Fe3O4, được nghiền cùng với chất hoạt

hóa bề mặt (acid Oleic) và dung môi (dầu, hexane) Chất hoạt hóa bề mặt giúp cho

quá trình nghiền được dễ dàng và đồng thời tránh các hạt kết tụ với nhau Sau khi

nghiền, sản phẩm phải trải qua một quá trình phân tách hạt rất phức tạp để có được

các hạt tương đối đồng nhất Phương pháp nghiền có ưu điểm là đơn giản và chế tạo

được vật liệu với khối lượng lớn Việc thay đổi chất hoạt hóa bề mặt và dung môi

không ảnh hưởng nhiều đến quá trình chế tạo Nhược điểm của phương pháp này là

tính đồng nhất của các hạt nano không cao vì khó có thể khống chế quá trình hình

thành hạt nano Chất lỏng từ chế tạo bằng phương pháp này thường được dùng cho

các ứng dụng vật lý

1.2.2.2 Phương pháp đồng kết tủa

Phương pháp đồng kết tủa là một trong những phương pháp thường được dùng

để tạo các hạt oxít sắt Có hai cách để tạo oxít sắt bằng phương pháp này đó là

hydroxide sắt bị oxy hóa một phần bằng một chất oxy hóa nào đó và già hóa hỗn

hợp dung dịch có tỉ phần hợp thức Fe+2 và Fe+3 trong dung môi nước Cách thứ nhất

có thể thu được hạt nano có kích thước từ 30 nm – 100 nm Cách thứ hai có thể tạo

hạt nano có kích thước từ 2 nm – 15 nm [3] Bằng cách thay đổi pH và nồng độ ion

trong dung dịch mà người ta có thể có được kích thước hạt như mong muốn đồng

thời làm thay đổi điện tích bề mặt của các hạt đã được hình thành

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

1.2.2.3 Phương pháp vi nhũ tương

Hình 1.6: Hệ nhũ tương nước trong dầu và dầu trong nước

Vi nhũ tương (microemulsion) cũng là một phương pháp được dùng khá phổ

biến để tạo hạt nano Với nhũ tương “nước-trong-dầu”, các giọt dung dịch nước bị

bẫy bởi các phân tử chất hoạt hóa bề mặt (CHHBM) trong dầu (các mixen) (hình

1.6) Đây là một dung dịch ở trạng thái cân bằng nhiệt động trong suốt, đẳng hướng

Do sự giới hạn về không gian của các phân tử CHHBM, sự hình thành, phát triển

các hạt nano bị hạn chế và tạo nên các hạt nano rất đồng nhất Kích thước hạt có thể

từ 4-12 nm với độ sai khác khoảng 0.2-0.3 nm

Phương pháp vi nhũ tương cũng là một phương pháp chế tạo hạt nano đã được

thế giới ứng dụng từ lâu do khả năng điều khiển kích thước hạt dễ dàng của nó Cơ

chế cụ thể của phản ứng xảy ra trong hệ vi nhũ tương như sau (hình 1.7): Phản ứng

hóa học tạo các chất mong muốn sẽ xảy ra khi ta hòa trộn các hệ vi nhũ tương này

lại với nhau Có 2 cách để các phân tử chất phản ứng gặp nhau:

Cách thứ nhất: Các phân tử chất phản ứng thấm qua lớp màng chất hoạt hóa bề

mặt ra ngoài và gặp nhau Nhưng thực tế thì tỷ lệ sản phẩm tạo thành theo cách này

là rất nhỏ, không đáng kể

Cách thứ hai: Khi các hạt vi nhũ tương của các chất phản ứng gặp nhau, nếu

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

có đủ lực tác động thì 2 hạt nhỏ (A, B) có thể tạo thành một hạt lớn hơn (C) Các

chất phản ứng trong 2 hạt nhỏ sẽ hòa trộn, phản ứng xảy ra trong lòng hạt lớn và sản

phẩm mong muốn được tạo thành (ở đây là các hạt nano từ Fe3O4) Các hạt nano từ

Fe3O4 sau khi tạo thành sẽ bị chất hoạt hóa bề mặt bao phủ và ngăn cản không cho

phát triển thêm về kích thước

Hình 1.7: Cơ chế hoạt động của phương pháp vi nhũ tương

Cũng bằng phương pháp này, người ta có thể chế tạo hạt oxít sắt bao phủ bởi

một lớp vàng để tránh oxy hóa và tăng tính tương hợp sinh học

Ngoài các phương pháp thông dụng trên còn có các phương pháp khác chế tạo

hạt nano từ như: phương pháp phân li các tiền chất hữu cơ ở nhiệt độ cao, phỏng

sinh học, hóa siêu âm, điện hóa …

1.2.3 Ứng dụng hạt nano từ trong lĩnh vực y sinh

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

Các ứng dụng của hạt nano từ được chia làm hai loại: ứng dụng ngoài cơ thể

và trong cơ thể Chúng tôi chỉ trình bày một số ứng dụng tiêu biểu trong rất nhiều

ứng dụng đã và đang được nghiên cứu Phân tách và chọn lọc tế bào là ứng dụng

ngoài cơ thể nhằm tách những tế bào cần nghiên cứu ra khỏi các tế bào khác Tách

và làm giàu axit nucleic của các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, virus trong các

mẫu bệnh phẩm Các ứng dụng hạt nano từ trong cơ thể gồm: dẫn thuốc, nung nóng

cục bộ và tăng độ tương phản trong ảnh cộng hưởng từ [28]

1.2.3.1 Phân tách và chọn lọc tế bào

Trong y sinh học, người ta thường xuyên phải tách một loại thực thể sinh học

nào đó ra khỏi môi trường của chúng để làm tăng nồng độ khi phân tích hoặc cho

các mục đích nghiên cứu khác Phân tách tế bào sử dụng các hạt nano từ tính là một

trong những phương pháp thường được sử dụng Quá trình phân tách này được chia

làm hai giai đoạn:

i) Đánh dấu thực thể sinh học cần nghiên cứu

ii) Tách các thực thể được đánh dấu ra khỏi môi trường bằng từ trường

Việc đánh dấu được thực hiện thông qua các hạt nano từ tính Hạt nano

thường dùng là hạt oxit sắt Các hạt này được chức năng bề mặt hóa bằng cách bao

phủ bởi một loại hóa chất có tính tương hợp sinh học như là dextran, polyvinyl

alcohol (PVA), silica (SiO2) Hóa chất bao phủ không những có thể tạo liên kết với

một vị trí nào đó trên bề mặt tế bào hoặc phân tử mà còn giúp cho các hạt nano

phân tán tốt trong dung môi, tăng tính ổn định của chất lỏng từ Giống như trong hệ

miễn dịch, vị trí liên kết đặc biệt trên bề mặt tế bào sẽ được các kháng thể hoặc các

phân tử khác như các hormone, axít folic tìm thấy Các kháng thể sẽ liên kết với các

kháng nguyên Đây là cách rất hiệu quả và chính xác để đánh dấu tế bào Các hạt từ

tính được bao phủ bởi các chất hoạt hóa tương tự các phân tử trong hệ miễn dịch

nên có thể tạo ra các liên kết với các tế bào hồng cầu, tế bào ung thư phổi, vi khuẩn,

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

tế bào ung thư đường tiết niệu và thể golgi [28] Đối với các tế bào lớn, kích thước

của các hạt từ tính đôi lúc cũng cần phải lớn, có thể đạt kích thước vài trăm nano

mét Quá trình phân tách được thực hiện nhờ một gradient từ trường ngoài Từ

trường ngoài tạo một lực hút các hạt từ tính có mang các tế bào được đánh dấu Các

tế bào không được đánh dấu sẽ không được giữ lại và thoát ra ngoài

Hình 1.8: Nguyên tắc chọn lọc và phân tách tế bào bằng từ trường

(a) Nam châm được đặt bên ngoài để hút các tế bào đã được đánh dấu và loại

bỏ các tế bào không được đánh dấu; (b) Nam châm có thể đặt vào một dòng chảy có

chứa tế bào cần tách

Tách tế bào bằng từ trường đã được ứng dụng thành công trong Y-Sinh học

Đây là một trong những phương pháp rất nhạy để có thể tách tế bào ung thư từ máu,

đặc biệt là khi nồng độ tế bào ung thư rất thấp, khó có thể tìm thấy bằng các phương

pháp khác Người ta có thể phát hiện kí sinh trùng sốt rét trong máu bằng cách đo từ

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

tính của kí sinh trùng đánh dấu từ hoặc đánh dấu các tế bào hồng cầu bằng chất lỏng

từ tính

Với nguyên tắc tương tự như phân tách tế bào, hạt nano từ tính còn được

dùng để phân tách axit nucleic Có hai loại phân tách axit nucleic là phân tách đặc

hiệu và không đặc hiệu Phân tách không đặc hiệu nhằm tách axit nuclecic ra khỏi

một hỗn hợp các thành phần không cần thiết Phân tách đặc hiệu là phân tách một

loại axit nucleic quan tâm ra khỏi hỗn hợp các nucleic khác Đối với phân tách

không đặc hiệu, người ta thường dùng hạt nano từ tính có bọc silica (hạt MagSi

nano) hoặc một số nhóm chức có khả năng liên kết với các ADN Sau khi gắn kết

thì ADN được tách ra bằng từ trường ngoài Với phân tách đặc hiệu, hạt nano được

gắn với ADN dò, thông qua lai hóa ADN dò và ADN đích mà dùng từ trường để

phân tách Nguyên tắc này sẽ được trình bày chi tiết ở phần ứng dụng hạt nano từ

bọc silica trong tách chiết axit nucleic

1.2.3.2 Dẫn truyền thuốc

Hình 1.9: Mô hình hạt nano từ vận chuyển thuốc [37]

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

Hạt nano từ tính giống như một con tàu vận chuyển hàng hóa Nó bao gồm lõi

là oxit sắt; tiếp theo lõi được bao bọc bởi lớp lipid; ngoài cùng các phân tử thuốc

nằm xen kẽ giữa các phân tử axít oxalic

Một trong những nhược điểm quan trọng nhất của hóa trị liệu đó là tính không

đặc hiệu Khi vào trong cơ thể, thuốc chữa bệnh sẽ phân bố không tập trung nên các

tế bào mạnh khỏe bị ảnh hưởng do tác dụng phụ của thuốc Chính vì thế việc dùng

các hạt nano từ tính như là hạt mang thuốc đến vị trí cần thiết trên cơ thể (thông

thường dùng điều trị các khối u ung thư) Những ứng dụng này được gọi là dẫn

truyền thuốc bằng hạt nano từ tính Có hai lợi ích cơ bản là: (i) thu hẹp phạm vi

phân bố của các thuốc trong cơ thể nên làm giảm tác dụng phụ của thuốc; (ii) giảm

lượng thuốc điều trị

Hạt nano từ tính có tính tương hợp sinh học được gắn kết với thuốc điều trị

Lúc này hạt nano có tác dụng như một hạt mang Thông thường phức hệ hạt

nano-thuốc tạo ra một chất lỏng từ và đi vào cơ thể thông qua hệ tuần hoàn Khi các

hạt đi vào mạch máu, người ta dùng một gradient từ trường ngoài rất mạnh để tập

trung các hạt vào một vị trí nhất định trên cơ thể Một khi phức hệ hạt nano-thuốc

được tập trung tại vị trí cần thiết thì quá trình nhả thuốc có thể diễn ra thông qua cơ

chế hoạt động của các enzyme hoặc các tính chất sinh lý học do các tế bào ung thư

gây ra như độ pH, quá trình khuyếch tán hoặc sự thay đổi của nhiệt độ

Quá trình vật lý diễn ra trong việc dẫn truyền thuốc cũng tương tự như trong

phân tách tế bào Gradient từ trường sẽ giúp tập trung phức hệ hạt nano-thuốc Hiệu

quả của việc dẫn truyền thuốc phụ thuộc vào cường độ từ trường, gradient từ trường,

thể tích và tính chất từ của hạt nano Các chất mang (chất lỏng từ) thường đi vào

các tĩnh mạnh hoặc động mạch nên các thông số thủy lực như thông lượng máu,

nồng độ chất lỏng từ, thời gian tuần hoàn đóng vai trò quan trọng như các thống số

sinh lý học như khoảng cách từ vị trí của thuốc đến nguồn từ trường, mức độ liên

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

kết giữa hạt nano với các phân tử thuốc và thể tích của khối u Các hạt có kích

thước micromet hoạt động hiệu quả hơn trong hệ thống tuần hoàn đặc biệt là ở các

mạch máu lớn và các động mạch Quá trình dẫn thuốc bằng hạt nano từ tính có hiệu

quả ở những vùng máu chảy chậm và gần nguồn từ trường

Các hạt nano từ tính thường dùng là ôxít sắt bao phủ xung quanh bởi một hợp

chất cao phân tử có tính tương hợp sinh học như PVA, dextran hoặc silica Chất bao

phủ có tác dụng chức năng hóa bề mặt để có thể liên kết với các phân tử khác như

nhóm chức carboxyl, biotin, amin Nghiên cứu dẫn truyền thuốc đã đạt được những

thành công nhất định trên động vật, đặc biệt nhất là dùng để điều trị u não Việc dẫn

truyền thuốc đến các u não rất khó khăn vì thuốc cần phải vượt qua hàng rào băng

cách giữa não và máu, nhờ có trợ giúp của hạt nano từ có kích thước 10-20 nm, việc

dẫn truyền thuốc có hiệu quả hơn rất nhiều

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

Nam châm được đặt bên ngoài cơ thể với mục đích tạo ra gradient từ trường

giúp cho con tàu hạt nano từ vận chuyển thuốc di chuyển về đích theo dòng máu

1.2.3.3 Tăng thân nhiệt cục bộ

Phương pháp tăng thân nhiệt cục bộ các tế bào ung thư mà không ảnh hưởng

đến các tế bào bình thường là một trong những ứng dụng quan trọng khác của hạt

nano từ tính Nguyên tắc hoạt động là các hạt nano từ tính có kích thước từ 20-100

nm được phân tán trong các mô mong muốn sau đó tác dụng một từ trường xoay

chiều bên ngoài đủ lớn về cường độ và tần số để làm cho các hạt nano hưởng ứng

mà tạo ra nhiệt nung nóng những vùng xung quanh Nhiệt độ khoảng 42°C trong

khoảng 30 phút có thể đủ để giết chết các tế bào ung thư Nghiên cứu về kĩ thuật

tăng thân nhiệt cục bộ được phát triển từ rất lâu và có rất nhiều công trình đề cập

đến kĩ thuật này nhưng chưa có công bố nào thành công trên người Khó khăn chủ

yếu đó là việc dẫn truyền lượng hạt nano từ phù hợp để tạo ra đủ nhiệt lượng khi có

sự có mặt của từ trường ngoài mạnh trong phạm vi điều trị cho phép [28]

1.2.3.4 Tăng độ tương phản cho ảnh cộng hưởng từ

Các hạt nano siêu thuận từ được tạo thành từ oxit sắt thường được sử dụng

như các tác nhân làm tăng độ tương phản ảnh trong chụp cộng hưởng từ Sự có mặt

của chúng làm nhiễu loại từ trường địa phương nên làm thay đổi giá trị từ trường đi

rất nhiều Dựa trên đặc tính của từng mô trong cơ thể mà độ hấp thụ hạt nano mạnh

hay yếu Ví dụ, hạt nano có kích thước 30nm được bọc dextran có thể nhanh chóng

đi vào gan và lách trong khi ở các cơ quan khác thì chậm hơn Như vậy, mật độ hạt

nano ở các cơ quan là khác nhau dấn đến sự nhiễu loại từ trường địa phương cũng

khác nhau làm tăng độ tương phản trong ảnh cộng hưởng từ

1.3 VAI TRÒ CỦA VIỆC TINH SẠCH AXIT NUCLEIC

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

Axít nucleic có vai trò quan trọng, trung tâm của sinh học thực nghiệm Hầu

hết các nghiên cứu, các ứng dụng của sinh học phân tử đều cần việc tinh sạch và

làm giàu được axít nucleic

Các ứng dụng quan trọng đó có thể được kể đến như chẩn đoán và định

lượng tác nhân vi sinh vật gây bệnh trong các mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp

PCR hay Real-time PCR, xác định quan hệ huyết thống, truy tìm tội phạm và

nghiên cứu gen

Trong đó, để tiến hành phát hiện hay định lượng tác nhân vi sinh vật gây

bệnh trong các mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp PCR hay Real-time PCR thì đều

cần nguồn axít nucleic tinh sạch Do đó quá trình tinh sạch acid nucleic là rất quan

trọng do quá trình này cung cấp nguyên liệu cho phản ứng PCR, Real-PCR xác định

tác nhân gây bệnh Tùy thuộc vào từng tác nhân vi sinh vật, axít nucleic đích là

ADN hay ARN, tùy thuộc vào mẫu bệnh phẩm mà người làm xét nghiệm có thể lựa

chọn phương pháp tinh sạch và làm giàu phù hợp

Với tầm quan trọng như vậy, đã có rất nhiều phương pháp tinh sạch và làm

giàu axít nucleic không ngừng được phát triển và cải tiến

1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH VÀ LÀM GIÀU AXIT NUCLEIC

CỦA SINH VẬT

Người ta sử dụng rất nhiều phương pháp để tách chiết axit nucleic Trong phần

này chúng tôi chỉ trình bày những phương pháp thông dụng trong các phòng nghiên

cứu và xét nghiệm

1.4.1 Nguyên lý chung

Dù là tách chiết axít nucleic từ động vật hay thực vật, vi khuẩn hay virus,

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

nucleic mà không được làm đứt gãy, phân hủy Thông thường trong dịch phá vỡ mô,

tế bào, lớp vỏ protein bao giờ cũng phải có mặt chất tạo phức càng cua Ethylene

Diamine Tetraacetic Axít (EDTA) để ức chế các nuclease thủy phân axít nucleic Ở

bước tiếp theo, người ta phân hủy và loại bỏ protein bằng các enzyme như protease

K hay kết tủa chúng bằng phenol, đồng thời loại bỏ các đại phân tử sinh học không

cần thiết khác, các mảnh xác tế bào ra khỏi hỗn hợp Cuối cùng, thu riêng được axít

nucleic dưới dạng tinh sạch

Hình 1.11: Quy trình tách chiết axit nucleic chung của sinh vật

2 Loại bỏ protein, các mảnh xác tế bào ra khỏi dung dịch

1.4.2 Phương pháp tinh sạch axít nucleic bằng dung môi hữu cơ

Axít nucleic là phân tử phân cực nên khó hòa tan được trong các dung môi

hữu cơ Theo phương pháp truyền thống, dung môi hữu cơ hay được sử dụng để

loại bỏ các tạp chất ra khỏi axít nucleic là phenol và chloroform [13, 18, 37]

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

Hình 1.12: Phenol giúp loại bỏ protein ra khỏi axít nucleic [12]

Bước đầu tiên, các tác nhân có tác dụng phá hủy màng tế bào như Sodium

Dodecyl Sunfate (SDS), Triton X-100 được sử dụng để phá vỡ mô, tế bào, lớp vỏ

protein giải phóng ra axít nucleic tạo thành dịch hòa tan Hexadecyl trimethyl

amonium bromide (CTAB) cũng là sự lựa chọn ưa thích bởi khả năng kết tủa ADN

và loại bỏ polysaccharide của nó trong quá trình tách chiết axít nucleic của vi khuẩn,

thực vật [16] Ngoài ra, để ly giải tế bào đạt hiệu quả cao chúng ta có thể sử dụng

protease K phân hủy glycoprotein, lysozyme để làm tan các thành phần của thành tế

bào vi khuẩn gram dương Sau đó, dịch ly giải tế bào sẽ được xử lý bằng phenol để

loại bỏ các tạp chất, đặc biệt là protein ra khỏi axít nucleic Phenol có khả năng hòa

tan và làm biến tính protein Khi bổ sung phenol vào dung dịch đệm chứa axít

nucleic, dung dịch sẽ bị phân tách thành hai pha, pha phenol ở dưới sẽ chứa protein

ở dạng hòa tan và pha nước ở trên sẽ chứa axít nucleic Việc hút pha nước sẽ giúp

tách axít nucleic ra khỏi protein Để cô đặc axít nucleic trong pha nước chúng ta sử

dụng ethanol, isopropanol Để hạn chế tối đa protein còn sót lại, bước chiết xuất

bằng phenol có thể được tiến hành lại nhiều lần Phenol có khả năng hòa tan nhẹ

trong pha nước, nó được loại bỏ dễ dàng nhờ chloroform Nếu muốn loại bỏ ARN

để chỉ thu được ADN ta có thể sử dụng ARNase bổ sung vào dịch axit nucleic đã

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

Ưu, nhược điểm của phương pháp

Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, dễ tiến hành và giá thành rẻ

Tuy nhiên, nó có nhược điểm là tiêu tốn rất nhiều thời gian để tiến hành các bước

tinh sạch, thông thường sẽ mất từ 3-5 giờ thao tác Hơn nữa, phương pháp này độc

hại do phenol là chất gây biến tính nặng protein nên ảnh hưởng đến sức khỏe của

người làm thí nghiệm nếu hít, chạm phải Axít nucleic thu được thường lẫn các tạp

chất là các dung môi hữu cơ, chính các chất này lại ảnh hưởng đến các thí nghiệm

tiếp theo

1.4.3 Phương pháp tinh sạch axít nucleic bằng màng xốp silica

Hình 1.13: Quy trình tinh sạch axít nucleic bằng màng xốp silica

Phương pháp sử dụng màng xốp silica được phát triển bởi nhiều công ty sinh

học phân tử hàng đầu trên thế giới dựa trên nền tảng nguyên lý của phương pháp

BOOM [35, 42] Nhờ tác dụng của guanidinium thiocyanate (GuSCN) kết hợp với

protease K, màng tế bào, lớp vỏ protein bị phá hủy để giải phóng ra ADN/ARN

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

Trong môi trường có nồng độ muối GuSCN cao và sức căng bề mặt thấp, silica sẽ

liên kết bền vững với các phân tử axít nucleic Trong cùng điều kiện đó, silica

không có khả năng liên kết với protein, các đại phân tử sinh học khác Như vậy, khi

hỗn hợp gồm axít nucleic, protein và các đại phân tử sinh học khác cùng các mảnh

xác tế bào đi qua cột có gắn màng xốp silica nhờ ly tâm thì các phân tử axít nucleic

sẽ được giữ lại vì liên kết với silica, còn các thành phần khác sẽ bị rửa trôi Axít

nucleic sau đó, được tách ra khỏi màng xốp silica nhờ dung dịch đệm thích hợp

Ưu, nhược điểm của phương pháp

Axít nucleic thu được có độ tinh sạch và nồng độ cao, không bị lẫn các dung

môi hữu cơ như phenol Tiết kiệm thời gian khi tiến hành tinh sạch với số lượng

mẫu nhỏ, nhưng sẽ gặp khó khăn khi số lượng mẫu quá lớn Một hạn chế khác nữa

là phương pháp này cần phải sử dụng máy ly tâm hoặc bơm hút chân không do đó

không thể tự động hóa được quy trình tinh sạch

1.4.4 Phương pháp tinh sạch axít nucleic bằng hạt từ nano bọc silica

Hình 1.14: Qui trình tinh sạch axid nucleic bằng hạt từ nano bọc silica

sử dụng màng xốp silica Điều khác biệt là thay vì sử dụng màng xốp silica, thì

phương pháp này sử dụng hạt từ nano được chức năng hóa bề mặt bằng silica (hạt

MagSi nano), đây là một cải tiến mang tính đột phá Dùng nam châm từ thay cho

máy ly tâm tức các bước thí nghiệm không cần đến ly tâm và có thể thao tác cùng

một lúc với nhiều mẫu bệnh phẩm Các phân tử axít nucleic sau khi liên kết với hạt

nano từ bọc silica sẽ được giữ lại và tách riêng ra khỏi protein Axít nucleic sẽ thu

được dưới dạng tinh sạch khi được tách ra khỏi hạt nano từ bọc silica bằng dung

dịch đệm có nồng độ muối thích hợp hoặc bằng nước cất

Ưu, nhược điểm của phương pháp

Hiệu quả tinh sạch axít nucleic cao, không bị lẫn các dung môi hữu cơ, hạt

nano từ bọc silica làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc nên axít nucleic sẽ thu được

nhiều hơn Phương pháp này cho phép tinh sạch trên một số lượng lớn mẫu bệnh

phẩm một các nhanh chóng do có thể sử dụng pipet đa kênh và không cần dùng đến

máy ly tâm, vì vậy rất tiết kiệm thời gian và chi phí đầu tư ít Điều đặc biệt, việc sử

dụng hạt nano từ cho phép tiến hành tinh sạch một các tự động nhờ robot

Tuy nhiên, chỉ một số ít công ty công nghệ sinh học hàng đầu như Roche

Diagnostic, Promega, Qiagen nắm giữ bí mật chế tạo hạt nano từ bọc silica, nên giá

thành của bộ kít sử tách chiết axit nucleic sử dụng phương pháp này, đặc biệt là

máy tự động tách chiết axít nucleic đã thương mại hóa là rất đắt

1.4.5 Điều kiện và cơ chế phân tử ADN hấp thụ lên bề mặt hạt nano từ bọc silica

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

Hình 1.15: Công thức cấu tạo của muối Guanidinium thiocyanate

Trong dung môi nước, phân tử muối Guanidinium thiocyanate sẽ phân ly

thành cation guanidinium và anion thiocyanate (hình 1.15), còn hạt silica sẽ bị

hydrate hóa (hình 1.6)

Hình 1.16: Cấu trúc bề mặt của silica đã bị hydrate trong dung môi nước

Hình 1.17: Cation Guanidinium de-hydrate hóa bề mặt silica và thay thế các

phân tử nước hình thành liên kết hiđro với bề mặt này

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

Hình 1.18: Lực tương tác tĩnh điện giữa bề mặt silica tích điện dương với ADN

tích điện âm được hình thành (a) và bị phá vỡ (b)

Phương pháp tách chiết và tinh sạch dựa trên sự tương tác giữ phân tử axit

nucleic với bề mặt silica cần tới các điều kiện thí nghiệm được kiểm soát một

cách chặt chẽ nhằm giúp ADN hấp thụ lên bề mặt silica đạt hiệu quả cao Nhiều

nghiên cứu đã chỉ ra rằng ADN có khả năng hấp thụ tốt lên bề mặt silica trong

môi trường có nồng độ muối cao và pH < 7 [7, 20, 38] Theo như nghiên cứu của

Huijun Tian và cộng sự [20] đã chỉ ra các điều kiện tối ưu (optimized conditions)

cho sự hình thành liên kết giữa ADN và silica đạt hiệu quả cao nhất trong môi

trường muối GuSCN hoặc GuHCl 6M và pH bằng hoặc nhỏ hơn giá trị pKa của

nhóm silinol của bề mặt silica Mặc dù vậy, cơ chế liên kết giữa ADN và silica

cho tới nay còn chưa được giải thích một cách tường tận, nhưng giả thuyết được

đông đảo các nhà khoa học ủng hộ được đưa ra bởi Huijun Tian và cộng sự Các

nhà khoa học này cho rằng, nồng độ cation Guanidinium cao trong dung dịch làm

giảm hoạt động hình thành các ion hydrate của các phân tử nước, qua đó

de-hydrate bề mặt silica và thay thế các phân tử nước hình thành liên kết hidro

với silica, qua đó làm cho bề mặt silica tích điện dương (hình 1.17) Mặt khác,

dưới sự ảnh hưởng của các cation Guanidinium ở nồng độ cao, các phân tử ADN

cũng bị de-hydrate thúc đẩy ADN hấp thụ lên bề mặt silica thông qua lực hút tĩnh

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

điễn giữa điện tích dương của ion muối trên bề mặt silica với điện tích âm của

nguyên tử Oxy trong nhóm PO4

trong bộ khung phân tử ADN (hình 1.18a)

Ngược lại, lực hút tĩnh điện này sẽ bị mất đi trong dung dịch có ion muối ở nồng

độ thấp và pH>7 bởi khi đó bề mặt silica và ADN sẽ bị hydrate hóa trở lại (hình

1.18b)

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG HẠT NANO TỪ BỌC SILICA

TINH SẠCH AXÍT NUCLEIC

Ngày nay, dựa trên nguyên lý của phương pháp Boom nguyên thủy, các hãng

hàng đầu về công nghệ sinh học đã không ngừng phát triển và cải tiến phương pháp

tinh sạch axít nucleic, đem lại nhiều hiệu quả bất ngờ Cải tiến đầu tiên là thay vì

phải dùng dung dịch các hạt silica, người ta đã chế tạo các màng lọc xốp silica nhờ

vậy mà có thể tách chiết được axít nucleic bằng cách dùng máy ly tâm hay bơm hút

chân không để đẩy dịch tách chiết mẫu bệnh phẩm đi qua màng lọc xốp silica này

Có nhiều hãng đã rất thành công trong sản xuất và thương mại phương pháp dùng

màng lọc xốp silica để tách chiết axít nucleic như Promega, Qiagen, Biorad, GE

Health Care, Takara (Nhật Bản) và Bioneer (Hàn Quốc) Một cải tiến khác mang

tính đột phá, đó là chế tạo các hạt từ nano bọc silica dùng để tinh sạch axít nucleic

từ các mẫu bệnh phẩm Với cải tiến này, các thao tác tách chiết axít nucleic trở nên

đơn giản và nhanh chóng hơn nhiều so với phương pháp nguyên thủy của Boom

cũng như phương pháp dùng màng lọc silica, nhất là khi tiến hành tách chiết trên

nhiều mẫu bệnh phẩm Đặc biệt hơn nữa, chế tạo được các hạt nano từ bọc silica là

một bước nhảy vượt bậc giúp cho khâu tách chiết axít nucleic từ các mẫu bệnh

phẩm diễn ra một cách tự động bằng máy

Dựa trên nền tảng kỹ thuật này, công ty Roche Diagnostic đã chế tạo bộ kít

chẩn đoán, định lượng virus gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV), virus gây bệnh

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

hạt từ bọc silica gọi là Magnapure để tự động hoá được kỹ thuật tách chiết nucleic

axít [36] Ngoài Roche Diagnostic, Qiagen cũng đưa ra công nghệ tách chiết axít

nucleic bằng máy tự động với tên thương mại BioSprint96, kèm theo các bộ kít sử

dụng hạt nano từ bọc silica cho phép tiến hành với 1 - 96 mẫu bệnh phẩm trên đĩa

ELISA [39] Hãng Beckman Coulter cũng có hệ thống tự động tinh sạch axít

nucleic với tên thương mại Beckman Coulter Biomek ® 2000 và hãng Promega chế

một dụng cụ có tên thương mại MagnaBot96 có thể hút hạt từ trong đĩa ELISA thao

tác bằng tay trên nhiều mẫu một lúc [40] Hãng Invitrogen cũng sử dụng công nghệ

hạt nano từ bọc silica để chế tạo các bộ kít tách chiết nucleic axít nhưng chỉ hạn chế

trong phạm vi nghiên cứu [41, 42]

Tuy nhiên giá thành của các bộ kít tinh sạch axít nucleic bằng hạt nano từ

bọc silica nhập khẩu rất cao, ví dụ ở Việt Nam 5 ml hạt từ Dynabeads Myone

SILANE® của hãng Invitrogen được bán với giá khoảng 9 triệu đồng, kít tinh sạch

plasmid Wizard ® MagneSil ® Plasmid Purification System của hãng Promega có giá

khoảng 7 triệu đồng Bộ kít tách chiết axit nucleic và phát hiện HIV của hãng

Roche Diagnostic có giá là 53 triệu đồng cho 48 phản ứng Ngoài HIV, HBV và

HCV, hiện nay chưa thấy có bộ kít thương mại nào chẩn đoán các tác nhân gây

bệnh khác ví dụ như EBV, vi khuẩn lao,…, sử dụng phương pháp tách chiết bằng

hạt nano từ bọc silica

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Mẫu máu

30 mẫu máu có xét nghiệm VCA-IgG dương tính được cung cấp bởi Khoa Vi

Sinh bệnh Viện Bạch Mai 10 mẫu máu của bệnh nhân được chẩn đoán ung thư vòm

họng được cung cấp bởi Khoa Vi sinh, bệnh viện Quân Y 103

2.1.2 Mồi

Mồi được thiết kế để phát hiện EBV trong huyết thanh bằng PCR và Real-time

PCR dựa trên các trình tự đặc hiệu cho EBV và được đặt mua từ hãng Invitrogen

(Mỹ)

Bảng 2.1 Trình tự các mồi và probe trong PCR/ real-time PCR

dùng trong nghiên cứu này

hóa cho kháng nguyên nhân EBV (EBNA-2/250)

Probe

5’-(FAM)-CGC AGG CAC TCG TAC TGC TCG CT -(TAMRA)-3

2.1.3 Các hóa chất, nguyên liệu khác

- Hạt từ nano bọc silica hay còn gọi là hạt MagSi nano là hạt nano từ Fe3O4

được nhóm nghiên cứu thuộc Trung tâm Khoa học Vật liệu của Trường Đại học

Khoa học Tự nhiên chế tạo bằng phương pháp đồng kết tủa từ dung dịch có mặt của

các ion Fe2+ và Fe3+ Hạt nano từ có kích thước 20 nm, khá đồng nhất, ít bị kết tụ và

được bao bọc bởi một lớp silica có khả năng hình thành liên kết bền vững với axít

nucleic, gọi tắt là MagSi nano (Hình 2.1)

Hình 2.1: Ảnh TEM chụp hạt nano từ bọc silica

LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ

- MinElute ® Virus Spin kit của hãng Qiagen

MinElute® Virus Spin kit là kit tinh sạch và làm giàu ADN/ARN bằng màng

xốp silica được dùng làm kít đối chứng, đây là bộ kít có độ nhạy rất cao chuyên

dành cho tách chiết tách chiết axít nucleic của virus trong các mẫu bệnh phẩm là

máu, huyết thanh

- Dynabeads Myone SILANE® của hãng Invitrogen

Dynabeads Myone SILANE® là kít tách chiết axit nucleic bằng hạt từ bọc

silica, cũng được sử dụng làm kít đối chứng trong tách chiết axit nucleic của EBV

- Master Mix được đặt mua từ hãng Roche, thang chuẩn ADN được mua từ

hãng Fermentas, bộ kít nhân dòng pGEM-T easy được đặt mua của hãng promega

Các hóa chất còn lại đều đạt độ tinh khiết dùng cho nghiên cứu sinh học phân tử

2.1.4 Máy móc và thiết bị

- Hệ thống máy giải trình tự CEQ 8000 Beckman coulter, máy Real time PCR

của Biorad, máy PCR, điện di agarose, điện di polyacrylamid

Các máy còn lại đều đạt độ chính xác dùng trong thí nghiệm sinh học phân tử

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Tách chiết axit nucleic

Axit nucleic của EBV được tách chiết theo ba bộ kít từ 200 µl huyết thanh của

cùng bệnh nhân có xét nghiệm kháng thể IgG-VCA EBV dương tính hoặc có chẩn

đoán lâm sàng bị ung thư vòm họng