Nghiên cứu và thử nghiệm hạt nano kim loại được chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán vi khuẩn lao

Phương pháp gắn kết hạt nano từ đã được chức năng hóa bề mặt với kháng thể kháng vi khuẩn lao .... Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu và thử nghiệm hạt nano kim l

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

    

Chử Lương Luân

NGHIÊN CỨU VÀ THỬ NGHIỆM HẠT NANO

KIM LOẠI ĐƯỢC CHỨC NĂNG HÓA BỀ MẶT

TRONG CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

    

Chử Lương Luân

NGHIÊN CỨU VÀ THỬ NGHIỆM HẠT NANO

KIM LOẠI ĐƯỢC CHỨC NĂNG HÓA BỀ MẶT

TRONG CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO

Chuyên ngành : Sinh học Thực nghiệm

LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp, tôi luôn nhận được rất

nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và chỉ dẫn tận tình

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới

PGS.TS Phan Tuấn Nghĩa, TS Phạm Bảo Yên và TS Nguyễn Thị Vân Anh đã tận

tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện

luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Bộ môn Sinh lý thực vật

và Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia

Hà Nội đã mang đến những kiến thức quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi

trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Tôi cũng xin gửi lời cảm các cán bộ viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Khoa

Vi sinh – Viện Quân Y 103 đã cung cấp mẫu cho tôi trong quá trình nghiên cứu

Qua đây, tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ và tập thể nhóm nghiên

cứu tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein đã nhiệt tình

giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn thạc sĩ

Luận văn được thực hiện dưới sự tài trợ kinh phí của đề tài mã số

2/2010/HĐ-NCCBUD do GS.TSKH Nguyễn Hoàng Lương làm chủ trì

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình, người thân

và bạn bè luôn động viên, giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Một lần nữa tôi xin trân trọng cảm ơn !

Hà Nội, ngày 21 tháng 12 năm 2012

Học viên

Chử Lương Luân

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LAO …3

1.1.1 Đặc điểm của vi khuẩn lao 3

1.1.2 Hệ gene vi khuẩn lao 4

1.1.3 Khả năng gây bệnh và tình hình bệnh lao 6

1.1.4 Các phương pháp chẩn đoán vi khuẩn lao 8

1.2 NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ HẠT NANO KIM LOẠI 11

1.2.1 Tính chất của hạt nano kim loại 11

1.2.2 Một số loại hạt nano kim loại 13

1.2.3 Ứng dụng của hạt nano kim loại trong y học 17

1.3 CHỨC NĂNG HÓA BỀ MẶT HẠT NANO TỪ, GẮN KẾT VÀ LÀM GIÀU TẾ BÀO VI KHUẨN LAO……… …… ……… 17

1.3.1 Chức năng hóa bề mặt hạt nano từ 17

1.3.2 Quá trình gắn kết hạt nano từ với kháng thể kháng lao 19

1.3.3 Làm giàu tế bào vi khuẩn lao bằng từ trường 21

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22

2.1 NGUYÊN LIỆU 22

2.1.1 Mẫu đờm lao và vaccine BCG 22

2.1.2 Hạt nano kim loại có từ tính 23

2.1.3 Mồi đặc hiệu 23

2.1.4 Các loại đệm 23

2.1.5 Các hóa chất và nguyên liệu khác 24

2.1.6 Máy móc và thiết bị 24

2.2 PHƯƠNG PHÁP 24

2.2.1 Phương pháp chấm kết tủa miễn dịch 24

2.2.2 Phương pháp gắn kết hạt nano từ đã được chức năng hóa bề mặt với kháng thể kháng vi khuẩn lao 26

2.2.3 Phương pháp làm giàu vi khuẩn lao để làm khuôn cho phản ứng PCR… …27

2.2.4 Phương pháp ly giải tế bào vi khuẩn lao thu ADN……….………27

2.2.5 Đánh giá độ bền của phức hệ hạt từ gắn kháng thể kháng lao………28

2.2.6 Nhân bản đoạn gen đích đặc hiệu bằng PCR 29

2.2.7 Điện di trên gel agarose 31

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN GẮN KHÁNG THỂ LÊN BỀ MẶT HẠT NANO TỪ TRÊN BCG 32

3.1.1 Kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng lao 32

3.1.2 Kiểm tra hiệu suất phản ứng gắn kết trong các đệm khác nhau……….……34

3.1.3 Kết quả ly giải tế bào vi khuẩn lao bằng các phương pháp khác nhau 38

3.1.4 Tối ưu hóa nồng độ BCG sử dụng 41

3.1.5 Tối ưu hóa thời gian phản ứng gắn kết 42

3.1.6 Độ đặc hiệu của phương pháp 43

3.2 THỬ NGHIỆM CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU LÊN MẪU BỆNH PHẨM 45

3.3 ĐÁNH GIÁ ĐỘ BỀN CỦA PHỨC HỆ HẠT NANO TỪ GẮN KHÁNG THỂ KHÁNG LAO 49

KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid deoxyribonucleic

AP Đệm gồm 100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, pH

9,5 APTS 3 – aminopropyl triethoxysilane

BCG Bacillus Calmette Guerin

BSA Albumin huyết thanh bò (Bovine Serum Albumin)

dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate

EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

IS Trình tự đoạn chèn vào (Insert Sequence)

PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)

PBS Muối chứa đệm phosphate (Phosphate Buffered Saline)

PBS-TBN Đệm PBS pH 7,4 bổ sung 0,01% Tween20; 0,1% BSA và 0,05

M NaN3

TAE Tris base – Acid acetic - EDTA

TET Tris-HCl – EDTA – Triton X-100

WHO Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự các mồi dùng trong phản ứng PCR 23

Bảng 2.2 Các thành phần trong phản ứng PCR với vaccine BCG 30

Bảng 2.3 Các thành phần trong phản ứng PCR với mẫu đờm lao 30

Bảng 3.1 Kết quả phân tích độ sáng của vết đốm tròn trên màng lai 33

Bảng 3.2 Thành phần và tỷ lệ các chất tham gia gắn kết 35

Bảng 3.3 Đánh giá mức độ gắn kết qua phần mềm Image J 38

DANH MỤC CÁC HÌNH

trang Hình 1.1 Vi khuẩn lao trong tiêu bản nhuộm Ziehl – Neelsen [35] 3

Hình 1.3 Một cấu trúc tinh thể từ các phân tử nano vàng [36] 14

Hình 1.4 Hình ảnh hiển vi điện tử của hạt nano từ Fe3O4 [37] 16

Hình 1.5 Hạt nano từ tính Fe3O4 được chức năng hóa bề mặt bằng nhóm

Hình 1.6 Quy trình gắn kết hạt nano được chức năng hóa với kháng thể

Hình 1.7 Nguyên tắc chọn lọc và làm giàu tế bào bằng từ trường [6] 21

Hình 2.2 Mô hình hóa phức hệ hạt nano từ đã được chức năng hóa bề mặt

Hình 3.1 Kết quả kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng lao 33

Hình 3.7 Kết quả thí nghiệm kiểm tra tính đặc hiệu 44

Hình 3.8 Quy trình ứng dụng các điều kiện tối ưu trên mẫu đờm lao 45

Hình 3.9 Kết quả thử nghiệm các điều kiện tối ưu trên 7 mẫu bệnh lao 46

Hình 3.10 Kết quả thử nghiệm các điều kiện tối ưu trên 5 mẫu bệnh lao 47

Hình 3.12 Quy trình đánh giá độ bền vững của phức hạt nano từ gắn

Hình 3.13 Kết quả đánh giá độ bền vững của phức hạt nano từ gắn kháng

Hình 3.14 Thử nghiệm độ bền vững của phức hạt nano từ gắn kháng thể

MỞ ĐẦU

Bệnh lao là một trong ba bệnh truyền nhiễm gây tử vong cao nhất thế giới,

bệnh được gây ra bởi vi khuẩn lao có tên khoa học là Mycobacterium tuberculosis

(MTB) Tổ chức Y tế thế giới (WHO) ước tính khoảng 1/3 dân số toàn cầu hiện nay

đã bị nhiễm MTB và có khoảng 1,7 triệu người tử vong do lao hàng năm, tức là

khoảng 4700 người tử vong mỗi ngày vì lao Mặc dù công tác tiêm chủng vaccine

BCG, phòng chống và phát triển thuốc chống lại vi khuẩn lao đã có những bước

tiến đáng kể nhưng cho đến nay bệnh lao vẫn là một vấn đề sức khỏe có tính thách

thức đối với toàn cầu Bệnh nhân bị nhiễm các chủng vi khuẩn lao nếu phát hiện

muộn sẽ rất khó điều trị và tăng nguy cơ lây truyền sang người lành Do đó việc

chẩn đoán sớm các chủng vi khuẩn lao sẽ góp phần đáng kể trong điều trị bệnh lao

[1, 33]

Để chẩn đoán vi khuẩn lao, hiện nay bệnh viện và các cơ sở y tế trong nước

vẫn phải dựa vào các phương pháp cổ điển như soi trực tiếp, nuôi cấy vi khuẩn…,

yêu cầu số lượng vi khuẩn lao lớn hoặc thời gian chẩn đoán lao cần ít nhất 4 – 6

tuần Với những nhược điểm như vậy sẽ khó khăn cho công tác điều trị, khó đáp

ứng yêu cầu giám sát và thanh toán bệnh lao [2, 3]

Khắc phục những nhược điểm đó, việc ứng dụng sinh học phân tử kết hợp

công nghệ nano đang tạo ra những đột phá trong chẩn đoán vi khuẩn lao cũng như

các chủng vi khuẩn khác Thời gian chẩn đoán có thể rút ngắn xuống còn vài ngày,

với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tạo điều kiện cho việc kiểm soát bệnh lao dễ dàng

hơn [23, 25]

Công nghệ nano ngày nay đang có những bước tiến quan trọng trong chẩn

đoán và hỗ trợ điều trị bệnh nhằm mục đích cải thiện và nâng cao sức khỏe của con

người Trong số đó, các hạt nano kim loại đặc biệt là hạt nano kim loại có từ tính

được chức năng hóa bề mặt đã và đang được nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi trong

những năm gần đây, ví dụ nhƣ phân tách tế bào, tách chiết acid nucleic (ADN,

ARN), gắn kết với kháng thể…[5, 27]

Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu và thử nghiệm

hạt nano kim loại đƣợc chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán vi khuẩn lao”

với các mục tiêu sau :

Xây dựng quy trình gắn kết hạt nano kim loại có từ tính đã đƣợc chức năng

hóa bề mặt với kháng thể kháng vi khuẩn lao và đánh giá khả năng làm giàu MTB

bằng hạt nano kim loại có từ tính đã đƣợc chức năng hóa bề mặt gắn anti-TB để

phát hiện MTB bằng kỹ thuật PCR

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LAO

Vi khuẩn lao do Robert Koch tìm ra năm 1882, vì vậy còn được gọi là Bacilie de Koch (viết tắt là BK) Đã hơn một thế kỷ kể từ khi phát hiện ra vi khuẩn

lao, nhờ việc áp dụng các kỹ thuật hiện đại trong hóa sinh, miễn dịch, sinh học phân

tử…cùng với kính hiển vi điện tử, người ta đã hiểu tương đối rõ về cấu trúc, đặc

điểm sinh học và khả năng gây bệnh của vi khuẩn lao Tuy nhiên, vi khuẩn lao vẫn

là đối tượng nghiên cứu của nhiều công trình khoa học vì sự tinh vi trong siêu cấu

trúc, tính chất phức tạp của các kháng nguyên, sự đa dạng trong hình thức tồn tại,

nhất là những đột biến gen khi vi khuẩn kháng thuốc [2, 3]

1.1.1 Đặc điểm của vi khuẩn lao

Tác nhân gây bệnh lao là Mycobacterium tuberculosis (MTB), tế bào MTB

dài 3-5µm, rộng 0,3-0,5µm, không có lông, hai đầu tròn, thân có hạt, tế bào đứng

riêng rẽ hoặc xếp thành hình chữ N, Y, V hoặc thành dãy phân nhánh như cành cây

trên tiêu bản nhuộm Ziehl – Neelsen, không bị cồn và acid làm mất màu đỏ của

fucsin

Hình 1.1 Vi khuẩn lao trong tiêu bản nhuộm Ziehl – Neelsen [35]

MTB là vi khuẩn hiếu khí, phân chia mỗi lần từ 16 đến 20 giờ, rất chậm so với thời gian phân chia tính bằng phút của các vi khuẩn khác (trong số các vi khuẩn

phân chia nhanh nhất là một chủng E coli, có thể phân chia mỗi 20 phút) MTB

MTB

không được phân loại Gram dương hay Gram âm vì chúng không có đặc tính hoá

học này, mặc dù thành tế bào có chứa peptidoglycan Trên mẫu nhuộm Gram, tế

bào vi khuẩn cho kết quả nhuộm rất yếu hoặc là không biểu hiện gì cả

MTB có thể chịu đựng được chất sát khuẩn yếu và sống sót trong trạng thái

khô trong nhiều tuần nhưng trong điều kiện tự nhiên, chỉ có thể phát triển trong sinh

vật ký chủ (cấy MTB in vitro cần thời gian dài để có kết quả, nhưng ngày nay là

công việc bình thường ở phòng xét nghiệm) [2, 3]

Hiện nay xu hướng phân loại vi khuẩn lao dựa vào trình tự ADN của chúng

đã được áp dụng Người ta nhận thấy đoạn IS6110 với 1361 cặp base chỉ có ở bốn

loại mycobacteria là M tuberculosis , M bovis, M africanum và M microti (gọi

chung là M tuberculosis complex) mà không có ở các mycobacteria khác [17, 31]

1.1.2 Hệ gene vi khuẩn lao

Từ năm 1998, nhờ Cole và cộng sự [16], toàn bộ trình tự của chủng MTB

H37Rv đã được giải mã và phân tích, cung cấp những kiến thức sinh học về loài vi

khuẩn sinh sản chậm này, mở ra những khái niệm mới trong can thiệp phòng và

điều trị bệnh

Toàn bộ hệ gene gồm 4411529 bp chứa khoảng 4000 gene, với tỷ lệ GC cao

khoảng 65% Điểm khác cơ bản trong hệ gene giữa MTB với những vi sinh vật

khác là phần lớn các gene mã hoá những enzyme có liên quan đến việc tổng hợp và

phân giải lipid, có 2 họ protein mới (PE và PPE) giàu glycine với cấu trúc lặp lại

MTB thường kháng ngẫu nhiên với nhiều thuốc làm cho việc điều trị lao trở

nên khó khăn Sự kháng thuốc này chủ yếu là do vách tế bào kỵ nước tác dụng như

là rào cản thấm, tuy vậy nhiều yếu tố quyết định sự kháng thuốc được mã hóa trong

hệ gene vi khuẩn như là enzyme thủy phân, enzyme biến đổi tác dụng của thuốc

như β-lactamase, aminoglycoside acetyl transferase…và nhiều hệ thống vận chuyển

thuốc ra ngoài khác

Hình 1.2 Hệ gene của chủng MTB H37Rv [16]

Vòng tròn ngoài cùng biểu hiện thang cho MTB, 0 – nơi bắt đầu sao chép Vòng

tròn đầu tiên tính từ ngoài vào cho thấy vị trí gene ARN ổn định, trình tự DR đại diện bằng

hình khối hồng Vòng tròn thứ 2 bên trong chỉ trình tự mã hoá (theo chiều kim đồng hồ -

xanh lá đậm, ngược chiều kim đồng hồ - xanh lá nhạt) Vòng tròn thứ 3 minh họa trình tự

ADN lặp (trình tự chèn – cam, họ 13E12 REP – hồng đậm, prophage – xanh dương), vòng

tròn thứ 4 chỉ vị trí họ PPE (xanh lá), vòng tròn thứ 5 chỉ họ PE (tím, ngoại trừ PGRS), và

vòng tròn thứ 6 chỉ vị trí trình tự PGRS (đỏ sậm) Biểu đồ tròn khu vực trung tâm biểu hiện

lượng GC, màu vàng chỉ ít hơn 65% GC, khu vực màu đỏ là GC cao hơn 65% [16]

Các nghiên cứu cho thấy nhóm MTB có hệ gene bảo tồn cao Các thành viên

trong họ MTB có tính đa dạng cao khi xét về kiểu hình hoặc kiểu kí chủ, đây là ví

dụ điển hình cho tính ổn định di truyền giữa các chủng, với tốc độ đột biến vô nghĩa

làm nên điểm đa hình ƣớc tính khoảng 0,01% - 0,03%, nhất là không có bằng chứng

nào cho thấy có sự di truyền ngang vật chất di truyền trong cùng thế hệ giữa các vi

khuẩn lao nhƣ các vi khuẩn khác [16]

1.1.3 Khả năng gây bệnh và tình hình bệnh lao

Về mặt dịch tễ học, tất cả những bệnh nhân lao đều có thể là nguồn lây,

nhưng mức độ lây rất khác nhau Đối với các thể lao ngoài phổi (lao màng não,

màng bụng, hạch, xương khớp…) được gọi là những thể lao “kín”, nghĩa là vi

khuẩn ít khả năng nhiễm vào môi trường bên ngoài Lao phổi là thể lao dễ đưa vi

khuẩn ra môi trường bên ngoài Bệnh nhân lao phổi khác nhau thì khả năng lây

bệnh cho người khác cũng khác nhau, tùy thuộc vào: số lượng vi sinh vật thoát ra

ngoài môi trường, mật độ vi sinh vật trong không khí, thời gian vật chủ phơi nhiễm

không khí đã bị ô nhiễm, tình trạng miễn dịch của từng cá thể Bệnh nhân nhiễm

HIV và những bệnh nhân rối loạn miễn dịch qua trung gian tế bào thì bệnh càng

trầm trọng khi bị nhiễm MTB Tuy vậy khả năng lan truyền bệnh của những bệnh

nhân này không cao [2, 3]

MTB tồn tại trong các hạt khí dung nhỏ lơ lửng ngoài không khí Khi được

hít vào, vi khuẩn sẽ đi vào phổi, đến phế nang Tại đây, vi khuẩn sẽ nhân lên hoặc bị

ức chế tuỳ thuộc vào tình trạng hệ thống miễn dịch của cơ thể Trong vòng 2-10

tuần, các đại thực bào được hoạt hoá, bao quanh vi khuẩn tạo nên lớp vỏ cứng giúp

kìm hãm và kiểm soát vi khuẩn (giai đoạn lao nhiễm) Nếu hệ thống miễn dịch của

cơ thể không thể kiểm soát được vi khuẩn, vi khuẩn sẽ nhân lên nhanh chóng và có

thể theo đường máu và đường bạch huyết tấn công vào các bộ phận khác nhau như

phổi, thận, não, xương (giai đoạn lao bệnh) [2, 3]

MTB có cơ chế đặc biệt để tấn công vào tế bào MTB có thể gắn trực tiếp

vào thụ thể mannose trên đại thực bào nhờ glycolipid đã được mannose hoá trên

vách, hoặc nhờ lipoarabinomannan, hay gắn gián tiếp nhờ thụ thể bổ thể, thụ thể Fc

Thông thường khi vật lạ bị đại thực bào bắt giữ sẽ bị cơ chế thực bào qua trung gian

chất oxy hoá tiêu diệt MTB biến đổi cơ chế gây độc này, ngăn cản sự kết hợp

phagosome với lysosome Vách MTB có loại acid mycolic là lipid chuyên biệt

nhánh alpha, những phân tử kị nước mạnh, hình thành lớp vỏ lipid bao quanh vi

sinh vật, ảnh hưởng đến khả năng thấm vật chất qua bề mặt tế bào Cho đến nay

người ta cho rằng acid mycolic là nhân tố chính quyết định độc tính của MTB, có

thể nhờ đó mà MTB tránh được các protein tích điện dương, lysozyme và các gốc tự

do trong các hốc thực bào, giúp MTB ngoại bào thoát khỏi sự tấn công của các bổ

thể trong huyết thanh Một trong những sản phẩm liên kết acid mycolic với các chất

lipid phức tạp là cord factor - yếu tố gây độc đối với tế bào động vật có vú Chủng

MTB độc tính sinh ra rất nhiều nhân tố cord factor Những lợi điểm giúp MTB gây

bệnh rất phức tạp và chưa được hiểu đầy đủ Chính vì vậy, hiện nay tình hình bệnh

lao trên thế giới cũng như ở Việt Nam đang trở nên nghiêm trọng và có những diễn

biến phức tạp [2, 13]

Theo WHO ước tính trên thế giới có khoảng 1,7 triệu người tử vong do lao

hàng năm, trong đó có khoảng 380.000 phụ nữ, tức là khoảng 4700 người tử vong

mỗi ngày vì lao Tỷ lệ tử vong do lao giảm đi khoảng 35% từ năm 1990 cho đến

nay Bệnh lao được tính là một trong 3 nguyên nhân gây tử vong nhiều nhất cho phụ

nữ tuổi 15-44 Về số người mới mắc hàng năm ước tính khoảng 9,4 triệu, trong đó

3,3 triệu phụ nữ, 1,1 triệu người có HIV dương tính Từ năm 2004, tỷ lệ mắc mới

hàng năm đã giảm đi nhưng tốc độ giảm quá chậm Thêm nữa, lao đa kháng thuốc

đang là một thách thức rất lớn đối với nhân loại, ước tính khoảng 0,5 triệu bệnh

nhân mắc lao đa kháng thuốc với tỷ lệ 3,3% trong số bệnh nhân lao mới mắc Theo

điều tra lớn nhất của WHO năm 2010, tỷ lệ lao đa kháng thuốc cao nhất ở một số

khu vực thuộc Liên Xô cũ, tới 28% số bệnh nhân lao mới và nguy hiểm hơn là bệnh

lao siêu kháng đã xuất hiện trên 58 quốc gia, trong đó có Việt Nam Nhiều quốc gia

đã triển khai kế hoạch quản lý lao đa kháng, tuy nhiên xét trên bình diện thế giới thì

còn ở mức độ rất thấp, còn cách xa yêu cầu kiểm soát bệnh lao [1, 33]

Như vậy có thể nói rằng, đã qua 130 năm sau khi Robert Kock tìm ra vi

khuẩn lao, bệnh lao mới chỉ khống chế được một phần về số người mắc nhưng lại

nguy hiểm hơn vì đã xuất hiện bệnh lao đa kháng và siêu kháng đang lan rộng trên

quy mô lớn Cần phải có phương pháp giải quyết mới trước khi quá muộn

Theo báo cáo của WHO, năm 2011 Việt Nam xếp thứ 12 trong 22 nước có số

lượng bệnh nhân lao cao nhất thế giới và thứ 14 trong 27 nước có tình hình lao đa

kháng và siêu kháng cao Hàng năm ước tính có thêm 180.000 bệnh nhân lao, trong

đó có khoảng 6000 bệnh nhân lao đa kháng và khoảng 7400 bệnh nhân lao/HIV

Tuy nhiên chúng ta mới chỉ phát hiện được khoảng 60% số bệnh nhân ước tính tức

là trên dưới 100.000 bệnh nhân mỗi năm [1, 33]

Điều này cho thấy tăng cường phát hiện tất cả các thể bệnh lao, chẩn đoán vi

khuẩn lao là một ưu tiên hàng đầu trong công tác chống lao ở Việt Nam hiện nay

1.1.4 Các phương pháp chẩn đoán vi khuẩn lao

Phát hiện được vi khuẩn lao là tiêu chuẩn quyết định để chẩn đoán bệnh lao

Chẩn đoán vi khuẩn lao đã được tiến hành từ lâu và gần đây có nhiều kỹ thuật hiện

đại được áp dụng

1.1.4.1 Các phương pháp cổ điển

Kỹ thuật nhuộm soi kính

Bệnh phẩm thường là đờm, điều quan trọng là phải hướng dẫn bệnh nhân lấy

đờm đúng để xét nghiệm Số mẫu đờm cần thiết thử cho một bệnh nhân nghi lao là

3 mẫu: một mẫu lấy tại chỗ khi bệnh nhân đến khám; một mẫu lấy vào buổi sáng

sau khi ngủ dậy (toàn bộ đờm lao ho khạc trong vòng 2 giờ); mẫu thứ ba lấy tại chỗ

khi bệnh nhân mang mẫu đờm buổi sáng đến khám Khi trong bệnh phẩm ít vi

khuẩn (thường là dịch màng phổi, màng bụng…) cần tiến hành ly tâm rồi lấy phần

cặn lắng đọng nhuộm thì khả năng tìm thấy vi khuẩn nhiều hơn

Kỹ thuật Ziehl-Neelsen là kỹ thuật cổ điển sử dụng để phát hiện vi khuẩn

lao Đánh giá kết quả đang được sử dụng ở nước ta như sau:

- Khi không có AFB (Acid Fast Bacilli) trên 100 vi trường : kết quả âm tính

- Khi có từ 1 đến 9 AFB trên 100 vi trường: dương tính (ghi cụ thể số vi khuẩn)

- Khi có từ 10 đến 99 AFB trên 100 vi trường : dương tính (1+)

- Khi có từ 1 đến 10 AFB trên 1 vi trường : dương tính (2+)

- Khi có trên 10 AFB trên 1 vi trường : dương tính (3+)

Phương pháp soi kính có ưu điểm là cho kết quả nhanh, chẩn đoán chính xác

bệnh lao và khả năng lây truyền của bệnh nhân cho những người xung quanh, kỹ

thuật và phương tiện đơn giản có thể tiến hành được ở tuyến quận, huyện Nhưng có

nhược điểm là trong 1 ml đờm phải có từ khoảng 5000 vi khuẩn trở lên mới cho kết

quả dương tính Phương pháp soi kính chỉ biết được hình thể của vi khuẩn, không

biết được vi khuẩn còn sống hay đã chết Phương pháp này cũng không cho phép

phân biệt được các chủng vi khuẩn lao [3, 18, 19]

Phương pháp nuôi cấy

Môi trường dùng nuôi cấy vi khuẩn lao là môi trường Loeweinstein – Jensen

Sau 1 – 2 tháng vi khuẩn lao phát triển thành khuẩn lạc hình súp lơ, màu trắng ngà

Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy là cho kết quả chính xác, có thể tiến hành các

phản ứng sinh học để phân loại vi khuẩn lao và làm được kháng sinh đồ giúp chọn

thuốc lao thích hợp điều trị bệnh nhân, nhất là trong những trường hợp bệnh lao có

vi khuẩn kháng thuốc Phương pháp nuôi cấy đòi hỏi phương tiện và kỹ thuật hiện

đại Hiện nay ở nước ta, ngoài các tuyến y tế chuyên khoa ở trung ương, kỹ thuật

này cũng được tiến hành ở một số bệnh viện chuyên khoa (tỉnh, thành phố) Ngày

nay người ta đã áp dụng kỹ thuật nuôi cấy cho kết quả nhanh từ 5 - 7 ngày, phục vụ

kịp thời cho điều trị bệnh nhân [3, 18, 19]

Phương pháp chụp X Quang

Chẩn đoán lao phổi bằng chụp X quang phổi thường chi phí tốn kém Tuy có

độ nhạy cao nhưng độ đặc hiệu thấp Có nhiều loại bệnh khác có thể có biểu hiện

hình ảnh tổn thương trên phim chụp phổi giống bệnh lao, thêm nữa nhiều khi bệnh

lao phổi dù đã được điều trị khỏi vẫn để lại di chứng ở phổi suốt đời Do vậy dùng

X quang rộng rãi để chẩn đoán lao phổi dễ bị nhầm và lãng phí Thực tế thường vận

dụng chẩn đoán lao phổi trong một số trường hợp: lao phổi AFB (-), ở bệnh nhân

chỉ có một mẫu xét nghiệm đờm (+), và một số trường hợp đặc biệt khác như các

loại tổn thương có tính chất tương đối đặc thù hay gặp trong lao: vị trí hay gặp ở

vùng đỉnh và hạ đòn, tổn thương thường đa dạng, phối hợp nhiều loại và tiến triển

chậm [3, 19]

1.1.4.2 Một số kỹ thuật hiện đại chẩn đoán vi khuẩn lao

Sử dụng hệ Bactec

Người ta gắn Carbon phóng xạ vào acid palmitric và acid formic trong môi

trường nuôi cấy vi khuẩn lao Khi vi khuẩn chuyển hóa sẽ lấy các acid béo này và

giải phóng ra CO2 (có carbon phóng xạ) được đo bằng máy Bactec 960 Kỹ thuật đo

phóng xạ (hệ thống BACTEC) có thể phát hiện nhanh vi khuẩn Tuy nhiên giá cả

khá đắt đỏ, không phù hợp với nguồn lực có hạn của nhiều quốc gia [3, 12]

Kỹ thuật MGIT (Mycobacterium Growth Indicator Tube)

Kỹ thuật ống chỉ thị sự sinh trưởng của vi khuẩn lao là phương pháp sử dụng

biện pháp đặc biệt để kích thích vi khuẩn lao sinh sản nhanh Vi khuẩn lao phát

triển sẽ sử dụng oxy và thải CO2 Bằng bộ phận nhạy cảm có phát quang có thể

nhận biết được CO2 Kết quả được đọc bằng chiếu tia tử ngoại, MGIT dương tính sẽ

phát quang vàng, da cam Kết quả dương tính sau 6 ngày, nếu thử kháng sinh đồ thì

dương tính sau 7 ngày Phương pháp này tốt với nhóm nguy cơ nhiễm HIV và là

phương pháp được WHO khuyến cáo sử dụng [3, 7, 19]

Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction - PCR)

Kỹ thuật PCR cho phép xác định tác nhân gây bệnh trực tiếp trong bệnh

phẩm nhờ khả năng nhận biết và sao chép để khuyếch đại về mặt số lượng đoạn

trình tự đặc hiệu trên genome của vi khuẩn Đối với MTB, kỹ thuật PCR phát hiện

trình tự 249 bp nằm trên đoạn IS6110, là trình tự gắn đặc hiệu và có khả năng tự sao

chép với số lượng lớn trong genome vi khuẩn thuộc nhóm MTB (M tuberculosis,

M microti, M bovis và M africanum)

Kỹ thuật này có ưu điểm là cho kết quả nhanh (từ 24 đến 48 giờ), cho kết quả

dương tính cả khi có ít vi khuẩn (dưới 10 vi khuẩn trong đờm vẫn phát hiện được)

và còn cho biết vi khuẩn có kháng thuốc lao hay không, vì khi kháng thuốc sẽ có

đột biến trong gen làm thay đổi cấu trúc ADN [3, 18, 19, 31]

1.2 NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ HẠT NANO KIM LOẠI

Hạt nano kim loại là một khái niệm để chỉ các hạt có kích thước nano được

tạo thành từ các kim loại Người ta biết rằng hạt nano kim loại chế tạo từ vàng, bạc

được sử dụng từ hàng nghìn năm nay Nổi tiếng nhất có thể là chiếc cốc Lycurgus

được người La Mã chế tạo vào khoảng thế kỉ thứ tư trước công nguyên và hiện nay

được trưng bày ở Bảo tàng Anh Chiếc cốc đó đổi màu tùy thuộc vào cách người ta

nhìn nó Nó có màu xanh lục khi nhìn ánh sáng phản xạ trên cốc và có màu đỏ khi

nhìn ánh sáng đi từ trong cốc và xuyên qua thành cốc Các phép phân tích ngày nay

cho thấy trong chiếc cốc đó có các hạt nano vàng và bạc có kích thước 70 nm và với

tỉ phần mol là 14:1 Tuy nhiên, phải đến năm 1857, khi Michael Faraday nghiên cứu

một cách hệ thống các hạt nano vàng thì các nghiên cứu về phương pháp chế tạo,

tính chất và ứng dụng của các hạt nano kim loại mới thực sự được bắt đầu và cho

đến nay đã có rất nhiều loại hạt nano kim loại được ứng dụng vào thực tiễn mà điển

hình là hạt nano kim loại có từ tính [5]

1.2.1 Tính chất của hạt nano kim loại

1.2.1.1 Tính chất quang học

Kim loại có nhiều điện tử tự do, các điện tử tự do này sẽ dao động dưới tác

dụng của điện từ trường bên ngoài như ánh sáng Thông thường các dao động bị

dập tắt nhanh chóng bởi các sai hỏng mạng hay bởi chính các nút mạng tinh thể

trong kim loại khi quãng đường tự do trung bình của điện tử nhỏ hơn kích thước

Nhưng khi kích thước của kim loại nhỏ hơn quãng đường tự do trung bình thì hiện

tượng dập tắt không còn nữa mà điện tử sẽ dao động cộng hưởng với ánh sáng kích

thích Do vậy, tính chất quang của hạt nano được có được do sự dao động tập thể

của các điện tử dẫn đến từ quá trình tương tác với bức xạ sóng điện từ Khi dao

động như vậy, các điện tử sẽ phân bố lại trong hạt nano làm cho hạt nano bị phân

cực điện tạo thành một lưỡng cực điện Do vậy xuất hiện một tần số cộng hưởng

phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhưng các yếu tố về hình dáng, độ lớn của hạt nano và

môi trường xung quanh là các yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất Ngoài ra, mật độ hạt

nano cũng ảnh hưởng đến tính chất quang Nếu mật độ loãng thì có thể coi như gần

đúng hạt tự do, nếu nồng độ cao thì phải tính đến ảnh hưởng của quá trình tương tác

giữa các hạt [5]

1.2.1.2 Tính chất điện

Tính dẫn điện của kim loại rất tốt hay nói cách khác điện trở của kim loại

nhỏ nhờ vào mật độ điện tử tự do cao trong đó Đối với vật liệu khối, các lí luận về

độ dẫn dựa trên cấu trúc vùng năng lượng của chất rắn

Tập thể các điện tử chuyển động trong kim loại (dòng điện I) dưới tác dụng

của điện trường (U) có liên hệ với nhau thông qua định luật Ohm: U = IR, trong đó

R là điện trở của kim loại Định luật Ohm cho thấy đường I-U là một đường tuyến

tính Khi kích thước của vật liệu giảm dần, hiệu ứng lượng tử do giam hãm làm rời

rạc hóa cấu trúc vùng năng lượng Hệ quả của quá trình lượng tử hóa này đối với

hạt nano là I-U không còn tuyến tính nữa mà xuất hiện một hiệu ứng gọi là hiệu ứng

chắn Coulomb (Coulomb blockade) làm cho đường I-U bị nhảy bậc với giá trị mỗi

bậc sai khác nhau một lượng e/2C cho U và e/RC cho I, với e là điện tích của điện

tử, C và R là điện dung và điện trở khoảng nối hạt nano với điện cực [5]

1.2.1.3 Tính chất từ

Các kim loại quý như vàng, bạc,… có tính nghịch từ ở trạng thái khối do sự

bù trừ cặp điện tử Khi vật liệu thu nhỏ kích thước thì sự bù trừ trên sẽ không toàn

diện nữa và vật liệu có từ tính tương đối mạnh

Các kim loại có tính sắt từ ở trạng thái khối như các kim loại chuyển tiếp sắt,

cô ban, ni ken thì khi kích thước nhỏ sẽ phá vỡ trật tự sắt từ làm cho chúng chuyển

sang trạng thái siêu thuận từ Vật liệu ở trạng thái siêu thuận từ có từ tính mạnh khi

có từ trường và không có từ tính khi từ trường bị ngắt đi, tức là từ dư và lực kháng

từ hoàn toàn bằng không [5]

1.2.1.4 Tính chất nhiệt

Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của vật liệu phụ thuộc vào mức độ liên kết giữa các

nguyên tử trong mạng tinh thể Trong tinh thể, mỗi một nguyên tử có một số các

nguyên tử lân cận có liên kết mạnh gọi là số phối vị Các nguyên tử trên bề mặt vật

liệu sẽ có số phối vị nhỏ hơn số phối vị của các nguyên tử ở bên trong nên chúng có

thể dễ dàng tái sắp xếp để có thể ở trạng thái khác hơn Như vậy, nếu kích thước của

hạt nano giảm, nhiệt độ nóng chảy sẽ giảm Ví dụ, hạt vàng kích thước 6 nm có Tm

= 950°C, 2 nm có Tm = 500°C [5]

1.2.2 Một số loại hạt nano kim loại

1.2.2.1 Hạt nano kim loại quý

Hạt nano vàng

Vàng là tên nguyên tố hoá học có kí hiệu Au và số nguyên tử 79 trong bảng

tuần hoàn, là kim loại chuyển tiếp (hoá trị 3 và 1) mềm, dễ uốn, dễ dát mỏng, màu

vàng và chiếu sáng khi thành khối, nhưng có thể có màu đen, hồng ngọc hay tía khi

được cắt nhuyễn Au không phản ứng với hầu hết các hoá chất nhưng lại chịu tác

dụng của hỗn hợp dung dịch HNO3 đậm đặc và dung dịch HCl đậm đặc theo tỉ lệ

1:3 để tạo thành acid cloroauric cũng như chịu tác động của dung dịch xyanua của

các kim loại kiềm Kim loại này có ở dạng quặng hoặc hạt trong đá và trong các mỏ

bồi tích và là một trong số kim loại đúc tiền, có giá trị vô cùng to lớn trong cuộc

sống của con người từ xưa tới nay

Ngày nay, nhờ vào tiến bộ trong lĩnh vực khoa học Nano, người ta có thể xác

định thêm nhiều đặc tính khác của kim loại này Khi khoa học công nghệ phát triển

và nhu cầu sử dụng trong các ứng dụng sinh - y học, thì hạt vàng có thêm ứng dụng

mới trong thực tiễn dưới dạng đặc biệt đó là đó là: hạt nano vàng

Hình 1.3 Một cấu trúc tinh thể từ các phân tử nano vàng [36]

Khi được chia nhỏ ở trạng thái phân tử có kích thước vài nm, nguyên tố này

có rất nhiều đặc tính riêng biệt Hạt nano vàng có thể được điều chế theo phương

pháp khử hoá học, phương pháp từ thực vật…có thể phân tán tốt trong các dung

môi không phân cực hoặc kém phân cực như toluene, chloroform, dichloromethane,

diethyl ether Dung dịch hạt nano vàng có màu đỏ tím đặc trưng, hấp thu tia tử

ngoại ở bước sóng 520 nm (phổ UV-Vis) Kích thước hạt đồng đều, nằm trong

khoảng 2-4 nm

Hạt nano vàng có thể được ứng dụng làm xúc tác cho các phản ứng hữu cơ,

làm sensor phân tích kim loại nặng, trong lĩnh vực thiết bị và linh kiện điện tử [28]

Hạt nano bạc

Bạc có ký hiệu là Ag, số nguyên tử 47 thuộc phân nhóm IB trong bảng tuần

hoàn các nguyên tố hóa học, bạc có khối lượng phân tử là 107,868 (đơn vị C) Ag

có số oxi hóa là +1 và +2, phổ biến nhất là trạng thái oxi hóa +1 Trong tự nhiên,

Ag tồn tại hai dạng đồng vị bền là Ag – 107 (52%) và Ag – 109 (48%) Ag không

tan trong nước, môi trường kiềm nhưng có khả năng tan trong một số acid mạnh

như HNO3, H2SO4 đặc nóng…

Ngày nay những thuộc tính quý của kim loại này được thể hiện tối đa khi

chúng được chế tạo bằng công nghệ nano Và trên thị trường cũng đã xuất hiện

nhiều sản phẩm chứa nano bạc như băng gạc y tế, nước tẩy trùng bề mặt, như tủ

lạnh, máy gặt…

Hạt nano bạc được điều chế theo phương pháp khử hoá học, phương pháp ăn

mòn laser, phương pháp hóa siêu âm… Dung dịch bạc nano có màu vàng đặc trưng,

hấp thu tia tử ngoại ở bước sóng 420 nm (phổ UV-Vis) Kích thước hạt đồng đều,

nằm trong khoảng 2-5 nm [29]

1.2.2.2 Hạt nano kim loại có tính từ (hạt nano từ)

Bất cứ vật liệu nào đều có sự hưởng ứng với từ trường ngoài (H), thể hiện

bằng độ từ hóa (từ độ - M) Tỷ số c = M/H được gọi là độ cảm từ Tùy thuộc vào

giá trị, độ cảm từ có thể phân ra làm các loại vật liệu từ khác nhau Vật liệu có c < 0

(~-10-6) được gọi là vật liệu nghịch từ Vật liệu có c > 0 (~10-6) được gọi là vật liệu

thuận từ Vật liệu có c > 0 với giá trị rất lớn có thể là vật liệu sắt từ, ferri từ [4] Ở

đây, vật liệu từ tính ngụ ý là vật liệu sắt từ, ferri từ hoặc siêu thuận từ

Ngoài độ cảm từ, một số thông số khác cũng rất quan trọng trong việc xác

định tính chất của vật liệu, ví dụ như: từ độ bão hòa (từ độ đạt cực đại tại từ trường

lớn), từ dư (từ độ còn dư sau khi ngừng tác động của từ trường ngoài), lực kháng từ

(từ trường ngoài cần thiết để một hệ, sau khi đạt trạng thái bão hòa từ, bị khử từ)

Nếu kích thước của hạt giảm đến một giá trị nào đó (thông thường từ vài cho đến

vài chục nm), phụ thuộc vào từng vật liệu cụ thể, tính sắt từ và ferri từ biến mất,

chuyển động nhiệt sẽ thắng thế và làm cho vật liệu trở thành vật liệu siêu thuận từ

Đối với vật liệu siêu thuận từ, từ dư và lực kháng từ bằng không Điều đó có nghĩa

là, khi ngừng tác động của từ trường ngoài, vật liệu sẽ không còn từ tính nữa, đây là

một đặc điểm rất quan trọng khi dùng vật liệu này cho các ứng dụng y sinh học [5]

Hạt nano từ tính có thể được chế tạo theo các phương pháp thông dụng như

phương pháp nghiền, phương pháp đồng kết tủa, phương pháp vi nhũ tương…Mỗi

phương pháp đều có những ưu nhược điểm riêng, tuy nhiên khi được dùng trong y

sinh học thì chúng cần phải thỏa mãn ba điều kiện sau:

- Tính đồng nhất của các hạt cao

- Từ độ bão hòa lớn

- Vật liệu có tính tương hợp sinh học cao (không có độc tính)

Hình 1.4 Hình ảnh hiển vi điện tử của hạt nano từ Fe 3 O 4 [37]

Tính đồng nhất về kích thước và tính chất liên quan nhiều đến phương pháp

chế tạo còn từ độ bão hòa và tính tương hợp sinh học liên quan đến bản chất của vật

liệu Trong tự nhiên, sắt (Fe) là vật liệu có từ độ bão hòa lớn nhất tại nhiệt độ phòng

(25oC), sắt không độc đối với cơ thể người và tính ổn định khi làm việc trong môi

trường không khí nên các vật liệu như ô-xít sắt được nghiên cứu rất nhiều để làm

hạt nano từ tính ứng dụng trong y sinh học

Hạt nano từ dùng trong y sinh học thường ở dạng dung dịch nên còn gọi là

chất lỏng từ Một dung dịch gồm ba thành phần: lõi là hạt Fe3O4 có kích thước

nano, chất chức năng hóa bề mặt (chất hoạt hóa bề mặt) và dung môi Trong đó: i)

lõi Fe3O4 có kích thước nano là thành phần duy nhất quyết định đến tính chất từ của

dung dịch từ; ii) chất hoạt hóa bề mặt có tác dụng làm cho hạt nano từ phân tán

trong dung môi, tránh kết tụ với nhau, ngoài ra nó còn có tác dụng “che chở’’ hạt

nano khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch của cơ thể và tạo các mối liên kết

hóa học với các phân tử khác trong điều kiện phù hợp Dung môi là chất lỏng mang

toàn bộ hệ [4, 15]

1.2.3 Ứng dụng của hạt nano kim loại trong y học

Các ứng dụng đều liên quan đến những tính chất khác biệt của hạt nano

Những ứng dụng đầu tiên như chúng ta đã biết là liên quan đến tính chất quang của

chúng Người ta trộn hạt nano vàng, bạc vào thủy tinh để chúng có các màu sắc

khác nhau Gần đây người ta đã phát hiện ra rất nhiều ứng dụng khả dĩ của hạt nano

vàng để tiêu diệt tế bào ung thư Trong đó, hạt nano vàng được kích thích bằng ánh

sáng laser xung, do hiện tượng hấp thụ cộng hưởng Plasmon mà hạt nano dao động

có nhiệt độ tăng dần, có khi lên đến nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của vàng

Quá trình tăng nhiệt này gây ra một sóng xung kích tiêu diệt tế bào ung thư trong

bán kính hàng mm Hạt nano vàng bọc bởi các nguyên tử Gd (có mô men từ nguyên

tử lớn nhất) còn được dùng để làm tăng độ tương phản trong cộng hưởng từ hạt

nhân [5, 24, 32]

Hạt nano vàng, bạc được sử dụng trong y sinh học để đánh dấu tế bào Nhờ

kích thước của hạt nano nhỏ hơn nhiều bước sóng ánh sáng chiếu vào mà xuất hiện

hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt làm cho khả năng tán xạ ánh sáng của các

hạt nano kim loại rất mạnh [32]

Các ứng dụng của hạt nano từ được chia làm hai loại: ứng dụng ngoài cơ thể

và trong cơ thể Phân tách và chọn lọc tế bào là ứng dụng ngoài cơ thể nhằm tách

những tế bào cần nghiên cứu ra khỏi các tế bào khác Các ứng dụng hạt nano từ

trong cơ thể gồm: dẫn thuốc, nung nóng cục bộ và tăng độ tương phản trong ảnh

cộng hưởng từ [27]

1.3 CHỨC NĂNG HÓA BỀ MẶT HẠT NANO TỪ, GẮN KẾT VÀ LÀM

GIÀU TẾ BÀO VI KHUẨN LAO

1.3.1 Chức năng hóa bề mặt hạt nano từ

Hạt nano từ tính có kích thước 10 nm – 20 nm được chế tạo bằng phương pháp

đồng kết tủa hai ion Fe3+

và Fe2+ bằng OH- tại nhiệt độ phòng hoặc tại 90oC trong môi trường khí N2 để tránh oxi hóa Phép đo quang phổ kế hồng ngoại cho thấy trên

bề mặt hạt nano từ tính trong nước có bao phủ một lớp –OH, đây là một nhóm chức

quan trọng trong việc tạo liên kết với các chất hoạt hóa bề mặt cần thiết cho các ứng

dụng sinh học [14, 15]

Để có thể ứng dụng trong sinh học, các hạt nano cần phải được chức năng hóa

bề mặt để gắn kết với các đối tượng sinh học như ADN, kháng thể, enzyme Các

nhóm chức thường gặp là nhóm amine, biotin, streptavidin, carboxyl, thiol Để có

được các nhóm chức trên bề mặt hạt nano, người ta sử dụng nguyên tắc thủy phân

organosilane để tạo ra một lớp polymer trên bề mặt hạt nano [6, 32]

Organosilane là các phân tử có hai nhóm chức có công thức tổng quát là

X-(CH2)n-SiRn(OR’)3-n Trong đó thì X là nhóm chức cần thiết để có thể gắn kết với

các đối tượng sinh học, (CH2)n là nhóm đệm hữu cơ, phụ thuộc vào n mà lớp đệm

này có thể dày hay mỏng SiRn là nhóm liên kết với nhóm hydroxyl của bề mặt hạt

nano

Alkoxysilane với rất nhiều nhóm chức X khác nhau đã được thương mại hóa

Trong quá trình chức năng hóa bề mặt, với phân tử organosilane, xảy ra hai phản

ứng đồng thời, đó là quá trình thủy phân các nhóm silane alkoxy n thành các nhóm

silanol hoạt tính và quá trình hóa rắn của các silanol với nhóm hydroxyl tự do trên

bề mặt của hạt nano từ tính Fe3O4 để tạo ra các liên kết Si-O-Si bền vững Điều kiện

của môi trường phản ứng có ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình chức năng hóa bề

mặt Ví dụ như ethanol thì thường làm gia tăng quá trình thủy phân và động học hóa

rắn do đó làm tăng cường quá trình chức năng hóa bề mặt, tuy nhiên cồn cũng cạnh

tranh với nhóm silane trên bề mặt bằng liên kết hydro

Có rất nhiều các nhóm chức khác nhau được tạo ra tùy theo mục đích thực

nghiệm và trong số đó thì nhóm amine được sử dụng nhiều nhất trong các ứng dụng

sinh học Hạt nano từ tính có nhóm amine (NP-NH2) thường được tạo ra bằng cách

sử dụng 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) [15, 34]

Hình 1.5 Hạt nano từ tính Fe 3 O 4 đƣợc chức năng hóa bề mặt bằng nhóm

amine sử dụng APTS [34]

1.3.2 Quá trình gắn kết hạt nano từ với kháng thể kháng lao

Phức hợp hạt nano từ với kháng thể đặc hiệu có thể đƣợc tạo ra bởi nhiều cơ

chế khác nhau Theo các nhà nghiên cứu về lĩnh vực công nghệ nano thì hiện nay có

nhiều cách để tạo ra phức hợp này là: gắn kết trực tiếp thông qua liên kết amine –

carboxyl; sử dụng SMCC (Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane -

1-carboxylate) làm xúc tác tạo cặp sulfhydryl-amine; gắn kết trực tiếp thông qua các

nhóm carbohydrate bị oxy hóa trên phần Fc của kháng thể; gắn kết không hóa trị

của hạt nano silica đƣợc bọc streptavidin với các kháng thể đƣợc biotin hóa Mỗi

kiểu gắn kết có những ƣu điểm và hạn chế riêng Nhƣng nhìn chung, nếu có từ 1

đến 3 cầu nối trung gian giữa kháng thể và hạt nano từ thì càng làm cho phức hợp

bền vững hơn và kháng thể không mất hoạt tính lâu hơn [10, 20]

Trong các cách tạo liên kết kể trên thì có thể nói việc gắn trực tiếp thông qua

liên kết amine – carboxyl là đơn giản nhƣng cũng đem lại hiệu quả khá cao Hạt từ

amine ban đầu có thể kết hợp với một số hợp chất nhƣ các hợp chất chứa aldehyde,

các glycoprotein đã bị oxy hóa hay các hợp chất hoạt hóa este nhóm

N-hydroxysuccinimide (NHS) hoặc các hợp chất biến đổi từ Iodoacetyl Tuy nhiên

hiện nay cách mà có nhiều ƣu điểm hơn cả đó là việc sử dụng gắn trực tiếp hạt từ

amine với hợp chất chứa nhóm carboxyl thông qua cầu nối trung gian

1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride

1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride hay EDC

hoặc EDAC là hợp chất carbodiimide phổ biến nhất được sử dụng để tạo cầu nối

giữa nhóm amine và nhóm carboxyl EDC là một chất tan trong nước, hoạt động tốt

trong khoảng pH 4,5 và pH 7,5 EDC cũng thường được sử dụng kết hợp với NHS

hoặc sulfo-NHS để tăng hiệu qủa gắn kết hoặc tạo ra một sản phẩm amine phản ứng

ổn định [20] Việc gắn kết giữa hạt từ amin với kháng thể thông qua cầu nối trung

gian EDC được thực hiện qua hai bước như mô tả tại hình 1.6 Hạt từ amine sẽ phản

ứng với EDC tạo ra một chất trung gian không bền (A), hợp chất này ngay lập tức

sẽ gắn kết với kháng thể thông qua liên kết giữa nhóm amine với carboxyl tạo thành

sản phẩm bền vững và phản ứng ổn định (B)

Hình 1.6 Quy trình gắn kết hạt nano được chức năng hóa với kháng thể [20]

1.3.3 Làm giàu tế bào vi khuẩn lao bằng từ trường

Nhóm chức được chức năng hóa trên bề mặt không những có thể tạo liên kết

với một vị trí nào đó trên bề mặt tế bào hoặc phân tử mà còn giúp cho các hạt nano

phân tán tốt trong dung môi, tăng tính ổn định của chất lỏng từ Giống như trong hệ

miễn dịch, vị trí liên kết đặc biệt trên bề mặt tế bào sẽ được các kháng thể hoặc các

phân tử khác như các hormone, acid folic nhận biết Các kháng thể sẽ liên kết với

các kháng nguyên Đây là cách rất hiệu quả và chính xác để đánh dấu tế bào Các

hạt từ tính được bao phủ bởi các chất hoạt hóa tương tự các phân tử trong hệ miễn

dịch nên có thể tạo ra các liên kết với các tế bào hồng cầu, tế bào ung thư phổi, vi

khuẩn, tế bào ung thư đường tiết niệu và thể golgi Đối với các tế bào lớn, kích

thước của các hạt từ đôi lúc cũng cần phải lớn, có thể đạt kích thước vài trăm nm

[27]

Quá trình chọn lọc và làm giàu tế bào được thực hiện nhờ một gradient từ

trường ngoài Từ trường ngoài tạo một lực hút các hạt từ tính có mang các tế bào

được đánh dấu Các tế bào không được đánh dấu sẽ không được giữ lại và thoát ra

ngoài

Hình 1.7 Nguyên tắc chọn lọc và làm giàu tế bào bằng từ trường [6]

(a) Nam châm được đặt bên ngoài để hút các tế bào đã được đánh dấu và loại bỏ các tế

bào không được đánh dấu; (b) Nam châm có thể đặt vào một dòng chảy có chứa tế

bào cần chọn lọc

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Mẫu đờm lao và vaccine BCG

Các mẫu đờm lao của bệnh nhân bị bệnh lao được nhận từ Viện Quân Y 103

Trước đó tất cả các mẫu đờm này đã được kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn bằng

phương pháp soi trực tiếp

Dựa trên phương pháp của Kubica và cộng sự [22], Các mẫu đờm sau đó

được khử nhiễm bằng một thể tích hỗn hợp gồm NaOH 1 M, Sodium citrate 0,1 M

và N-acetyl-L-cystein 30 mM Lắc cho đờm loãng đều trong 15 phút, chia vào các

ống falcon và sau đó ly tâm tách cặn, 12000 vòng/phút x 10 phút và cuối cùng bảo

quản trong ống eppendorf

Vaccine BCG (Bacillus Calmette Guerin) do Việt Nam sản xuất được cung

cấp bởi Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương Vaccine được cung cấp là chế phẩm dạng

đông khô (chứa 0,5 mg BCG và 3,0 mg Glutamate natri trong 1 ống) của chủng

Calmette - Guerin giảm độc lực, có nguồn gốc từ vi khuẩn Mycobacterium bovis

Hình 2.1 Vaccine BCG sản xuất tại Việt Nam

2.1.2 Hạt nano kim loại có từ tính

Hạt nano kim loại có từ tính Fe3O4 có tính chất khá đồng nhất, ít bị kết tụ,

được bao bọc bởi lớp màng silica có gắn nhóm amine (NP-NH2) có khả năng liên

kết bền vững với kháng thể đặc hiệu trong điều kiện thích hợp

Loại hạt mà nhóm chúng tôi sử dụng có kích thước khoảng 20 nm, được chế

tạo bằng phương pháp đồng kết tủa hai ion Fe3+ và Fe2+ bằng OH- trong môi trường

khí N2 tại nhiệt độ 90oC. Đây là kết quả nghiên cứu chế tạo của nhóm nghiên cứu

thuộc Trung tâm Khoa học vật liệu, Khoa Vật lý, Trường Đại học Khoa học Tự

nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

2.1.3 Mồi đặc hiệu

Đoạn mồi (primer) IS6110 được thiết kế để phát hiện vi khuẩn lao trong mẫu

vaccine BCG hay trong mẫu đờm lao bằng kỹ thuật PCR thông thường dựa trên các

trình tự bảo thủ đặc hiệu cho vi khuẩn lao và được đặt mua từ hãng Invitrogen

(Mỹ) Trình tự cặp mồi IS6110 được thiết kế như sau:

Bảng 2.1 Trình tự các mồi dùng trong phản ứng PCR

Tài liệu tham khảo

Kích thước đoạn nhân lên

Dung dịch đệm Tris-HCl – EDTA (TE: 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA)

2.1.5 Các hóa chất và nguyên liệu khác

Kháng thể đa dòng kháng vi khuẩn lao (anti-TB) của hãng Abcam, Mỹ

Chất trung gian tạo phức EDC của hãng Sigma, Mỹ

Màng Polyvinylidene fluoride (PVDF) của hãnh Bio-Rad, Mỹ

ADN Taq polymerase, ADN Dream TaqTM polymerase và thang chuẩn ADN

được mua từ hãng Fermentas, các dNTP của hãng Promega Các hóa chất khác đạt

độ tinh khiết dành cho nghiên cứu sinh học phân tử

2.1.6 Máy móc và thiết bị

Máy PCR của Bio-Rad, bộ điện di agarose, giá hút từ của Promega, máy phá

mẫu bằng sóng siêu âm Sonicator …Các máy còn lại đều đạt độ chính xác dùng

trong thí nghiệm sinh học phân tử Ngoài ra, trong nghiên cứu cũng sử dụng phần

mềm phân tích độ sáng của ảnh Image J

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Phương pháp chấm kết tủa miễn dịch

Nguyên tắc của phương pháp chấm kết tủa miễn dịch (Dot blot) là dựa

trên sự tương tác đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể tương ứng Kháng thể

sơ cấp sau khi liên kết với kháng nguyên tạo thành phức hợp KHÁNG NGUYÊN –

KHÁNG THỂ, tiếp tục được nhận biết bởi kháng thể thứ cấp có gắn enzyme

phosphatase kiềm, cuối cùng phức hợp KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG THỂ SƠ

CẤP – KHÁNG THỂ THỨ CẤP được phát hiện bằng cách cho ủ trong dung dịch

cơ chất Nhờ sự có mặt của enzyme trên kháng thể thứ cấp mà cơ chất chuyển từ

không màu thành sản phẩm có màu, dễ dàng nhận biết bằng mắt thường Nồng độ

của protein cũng như của dịch nuôi tế bào có thể được định lượng không hoàn toàn

thông qua sử dụng phương pháp Dot blot

Quy trình tiến hành :

- Màng được cắt với kích thước thích hợp, các ô vuông trên màng được kẻ

bằng bút chì có kích thước 1x1 cm Sau đó màng được ngâm trong methanol

khoảng 3 – 4 phút, rửa methanol bằng nước cất, để trên giấy thấm và mẫu được

chấm lên bề mặt được đánh dấu của màng

- Đầu côn được dùng để lấy và chấm 2µ mỗi mẫu lên bề mặt màng tại trung

tâm của ô kẻ Dung dịch mẫu thẩm thấu xuống màng thường có đường kính 3 – 4

mm

- Màng sau khi sấy khô sẽ được cố định bởi dung dịch BSA 5% trong

PBS 1X pH 7,4 có bổ sung 0,05% Tween20 bằng cách lắc nhẹ 30 phút đến 1 giờ ở

nhiệt độ phòng

- Màng được rửa 3 lần bằng đệm PBS 1X pH 7,4 có bổ sung 0,05% Tween20

để loại bỏ BSA thừa Màng sau đó được ủ với kháng thể sơ cấp, lắc nhẹ ít nhất 1

giờ ở nhiệt độ phòng

- Kháng thể sơ cấp bám không đặc hiệu trên màng được loại bỏ bằng cách

tráng rửa 3 lần trong đệm PBS 1X pH 7,4 có bổ sung 0,05% Tween20 Sau đó màng

được ủ với kháng thể thứ cấp thích hợp có gắn enzyme photphatase kiềm Kháng

thể thứ cấp bám không đặc hiệu cũng được loại bỏ bằng cách tráng rửa màng trong

đệm PBS 1X pH 7,4 có bổ sung 0,05% Tween20

- Tiếp đó, cân bằng màng bằng đệm AP (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl,

5 mM MgCl2, pH 9,5)

- Các vết chấm được hiện màu bằng cách ủ màng trong dung dịch cơ chất

p-nitro blue tetrazolium và 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT/BCIP) pha

trong đệm AP

- Phản ứng được làm ngưng trong nước cất khi vết chấm hiện rõ