Nghiên cứu tính đa hình di truyền và vai trò truyền bệnh của các thành viên trong nhóm loài Anopheles maculatus ở Việt Nam

Một số nhà khoa học chuyển h-ớng từ nghiên cứu khả năng giao phối sang nghiên cứu về nhiễm sắc thể khổng lồ, những kết quả đầu tiên đã cung cấp cho nhà nghiên cứu những bằng chứng di tru

Mục lục

Trang

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Mở đầu 1

Ch-ơng 1 : Tổng quan tài liệu 4

1.1 Đại c-ơng về vấn đề nghiên cứu các loài đồng hình 4

1.2 Đa hình di truyền và nghiên cứu đa hình di truyền ở muỗi 8

1.2.1 Đa hình enzym và ứng dụng để nghiên cứu đa hình di truyền ở muỗi 8

1.2.2 Di truyền tế bào và ứng dụng trong nghiên cứu đa hình di truyền 13

1.2.3 Đại c-ơng về PCR và ứng dụng trong nghiên cứu đa hình di truyền ở muỗi 19

1.3 Những nghiên cứu về vai trò truyền bệnh và tính -a vật chủ của các vectơ 35

1.3.1 Những nghiên cứu về vai trò truyền bệnh sốt rét của muỗi 35

1.3.2 Xác định tính -a vật chủ của vectơ 35

1.4 Những nghiên cứu về nhóm loài An maculatus 36

1.4.1 Những nghiên cứu ở n-ớc ngoài 37

1.4.2 Nghiên cứu trong n-ớc 41

Ch-ơng 2 : Đối t-ợng và ph-ơng pháp nghiên cứu 43

2.1 Đối t-ợng nghiên cứu 43

2.2 Thời gian nghiên cứu, địa điểm nghiên cứu 43

2.3 Ph-ơng pháp nghiên cứu 43

2.3.1 Ph-ơng pháp thu thập và xử lý mẫu vật tại thực địa 45

2.3.2 Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 45

Ch-ơng 3 : Kết quả nghiên cứu 60

3 1 Đa hình dấu hiệu kiểu hình của các thành viên trong nhóm loài An maculatus 60

3.1.1 Đa hình các dấu hiệu hình thái của các thành viên trong nhóm loài An maculatus 60

3.1.2 Đa hình di truyền các dấu hiệu sinh học, sinh thái học của các thành viên trong nhóm loài An maculatus 80

3.2 Đa hình di truyền tế bào và các dấu hiệu kiểu gen của các thành viên trong nhóm loài An maculatus 89

3.2.1 Đa hình các dấu hiệu di truyền tế bào của các thành viên trong nhóm loài An maculatus 89

3.2.2 Đa hình di truyền các đặc điểm điện di enzym của các thành viên trong nhóm loài An maculatus 92

3.2.3 Kết quả phân tích sự đa hình dựa vào chỉ thị PCR-RFLP ở nhóm loài

An maculatus 112

3.2.4 Kết quả đánh giá sự đa hình di truyền của các thành viên trong nhóm loài An maculatus dựa vào chỉ thị RAPD 116

3.2.5 Định loại các thành viên của nhóm loài An maculatus bằng PCR đa mồi 126

3.2.6 Kết quả đánh giá sự đa hình di truyền của các thành viên trong nhóm loài An maculatus dựa vào kết quả giải trình tự đoạn ITS2 128

3.3 Thành phần loài và phân bố của các thành viên trong nhóm loài An maculatus 135

3.3.1 Bảng định loại các thành viên đã xác định tên trong nhóm loài 135

An maculatus 135

3.3.2 Phân bố của các thành viên trong nhóm loài An maculatus 137

3.4 Vai trò truyền bệnh của các thành viên trong nhóm loài An maculatus 141

Ch-ơng 4: Bàn luận 144

4.1 Đa hình di truyền và mối quan hệ di truyền của các thành viên trong nhóm loài An maculatus 144

4.1.1.Đa hình các dấu hiệu kiểu hình của các thành viên trong nhóm loài An maculatus 144

4.1.2 Đa hình di truyền các dấu hiệu kiểu gen của các thành viên trong nhóm loài An maculatus ở Việt Nam 155

4.2 Thành phần loài và phân bố của các thành viên trong nhóm loài An maculatus 161

4.2.1 Xây dựng bảng định loại các thành viên đã đ-ợc định tên trong nhóm loài An maculatus ở Việt Nam 161

4.2.2 Phân bố của các thành viên trong nhóm loài An maculatus 162

4.3 Vai trò truyền bệnh của các thành viên trong nhóm loài An maculatus 163

Kết luận 164

Các công trình của tác giả liên quan đến luận án đã công bố 167

NHững đóng góp mới của luận án 168

tài liệu tham khảo 169

Phụ lục 189

danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

ADN: Acid Deoxyribonucleic

ALDOX: aldehyde oxidase

An : Anopheles

ATP: Adenosine triphosphate

bp: cặp bazơ (Base pair)

COI: Gen ti thể Cytochrome C oxidase I

ctv: Cộng tác viên

DN: Khoảng cách di truyền (Genetic distance)

dATP: deoxyadenosine triphosphate

EDTA: Ethylenediamine tetraacetic acid

ELISAs: Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ liên kết enzym

(enzym linked immunosorbent assay)

et al: và những ng-ời khác

EtBr: Ethidium bromide

FUM: Fumerate hydratase

GPI: Glucosephosphate isomerase

GPDH: glycerophosphate dehydrogenase

HAD: D-2- Hydroxy- Acid dehydrogenase

IGS: Intergenic space (Vùng đệm nội gen)

ITS: Internal transcripbed spacer (Vùng đệm nội phiên mã) IDH: Isocitrate dehydrogenase

IN: Hệ số t-ơng đồng di truyền (Genetic Identity)

MPI: Manosephosphate isomerase

RAPD: Đa hình các đoạn nhân bản ngẫu nhiên

(Random Amplified Polymorphic DNA ) RFLP: Đa hình các đoạn phân cắt giới hạn

(Restriction Fragment Length Polymorphism) PGM: Phosphoglucomutase

Rf: Tốc độ chuyển dịch t-ơng đối của cấu tử điện di

rARN: Acid ribonucleic Ribosome

SSCP: Đa hình cấu tạo sợi đơn

( Single Strand Conformational polymorphism) SDS: Sodium dodecyl sulfate

danh mục các bảng

Bảng 2.1: Các enzym giới hạn và trình tự giới hạn t-ơng ứng 53

Bảng 2.2: Thành phần các chất tham gia phản ứng PCR 53

Bảng 2.3: Thành phần các chất tham gia vào phản ứng giới hạn của các enzym Cfr131, Alul, XbaI, BamHI 54

Bảng 2.4: Thành phần các chất tham gia vào phản ứng giới hạn của các enzym Msp1 EcoRI, HindII, HaeII, HeaIII, HindIII 54

Bảng 2.5: Trình tự các mồi ngẫu nhiên sử dụng cho phản ứng RAPD- PCR 55

Bảng 2.6: Thành phần các chất tham gia vào phản ứng RAPD- PCR 55

Bảng 2.7: Trình tự sắp xếp mẫu trong thử nghiệm ELISA 57

Bảng 2.8: Trình tự mồi để xác định thoa trùng trong muỗi 58

Bảng 3.1: Số l-ợng mẫu vật thu đ-ợc từ các dòng gia đình để cung cấp dấu hiệu phân loại các thành viên trong nhóm An maculatus 60

Bảng 3.2: Số l-ợng mẫu vật đã thu thập trong giai đoạn 2001-2005 61

Bảng 3.3: Số l-ợng bọ gậy của các thành viên trong nhóm loài An maculatus thu thập đ-ợc ở các kiểu ổ n-ớc khác nhau 81

Bảng 3.4: Số l-ợng và tỷ lệ các loài muỗi thuộc nhóm loài An maculatus thu thập tại Quảng Bình giai đoạn 2001-2005 86

Bảng 3.5: Số l-ợng và tỷ lệ các loài muỗi thuộc nhóm loài An maculatus thu thập tại Sơn La giai đoạn 2001-2005 87

Bảng 3.6: Số l-ợng và tỷ lệ các loài muỗi thuộc nhóm loài An maculatus thu thập tại Hoà Bình giai đoạn 2001-2005 88

Bảng 3.7: Tần số các alen mã hóa enzym ODH của các thành viên nhóm An maculatus 93

Bảng 3.8: Tần số các alen mã hóa enzym LDH của các thành viên nhóm An maculatus 94

Bảng 3.9: Tần số các alen mã hóa enzym MDH của các thành viên nhóm An maculatus 96

Bảng 3.10: Tần số các alen mã hóa enzym GOT của các thành viên nhóm An maculatus 97

Bảng 3.11: Tần số các alen mã hóa enzym 6PGD của các thành viên nhóm An maculatus 100

Bảng 3.12: Tần số các alen mã hóa enzym IDH của các thành viên nhóm An maculatus 101

Bảng 3.13: Tần số các alen mã hóa enzym PGM của các thành viên nhóm An maculatus 103

Bảng 3.14: Tần số các alen mã hóa enzym MPI của các thành viên nhóm An maculatus 103

Bảng 3.15: Tần số các alen mã hóa enzym α-GPD của các thành viên nhóm An maculatus 105

Bảng 3.16: Tần số các alen mã hóa enzym MPI của các thành viên nhóm An maculatus 106

Bảng 3.17: Tần số các alen mã hóa enzym HAD của các thành viên nhóm An maculatus 107

Bảng 3.18: Hệ số t-ơng đồng di truyền (I) và khoảng cách di truyền (D) giữa các

thành viên đã định tên trong nhóm loài An maculatus dựa trên số liệu phân

tích izozym 108 Bảng 3.19: Hệ số t-ơng đồng di truyền và khoảng cách di truyền giữa các thành

viên trong toàn bộ nhóm loài An maculatus dựa trên số liệu phân tích

izozym 110 Bảng 3.20: Hệ số t-ơng đồng di truyền(I) và khoảng cách di truyền (D) giữa các

thành viên đã định tên trong nhóm loài An maculatus dựa trên số liệu

RAPD-PCR 122 Bảng 3.21: Hệ số t-ơng đồng di truyền và khoảng cách di truyền giữa các thành

viên trong toàn bộ nhóm loài An maculatus dựa trên số liệu phân tích

RAPD-PCR 124 Bảng 3.22: So sánh các dấu hiệu đa hình di truyền kiểu hình và kiểu gen của các

thành viên nhóm loài An maculatus 134 Bảng 3.23: Phân bố của các loài thành viên trong nhóm loài An maculatus 138

Bảng 3.24: Kết quả thử nghiệm ELISA đánh giá vai trò truyền bệnh của muỗi

nhóm loài An maculatus tại Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà 141

Bảng 3.25: Kết quả thử nghiệm ELISA đánh giá vai trò truyền bệnh của muỗi

nhóm loài An maculatus tại Đắc Ơ, Ph-ớc Long, Bình Ph-ớc 141

Danh mục các hình vẽ, Đồ thị

Hình 1.1 Tháp Babel phát hiện các loài đồng hình 6

Hình 1.2: Trình tự hình thái học 7

Hình 1.3: Sơ đồ ph-ơng pháp mô tả đặc điểm loài đồng hình mới 7

Hình 2.1: Thiết kế nghiên cứu đa hình di truyền và vai trò truyền bệnh nhóm loài An maculatus ở Việt Nam 44

Hình 2.2: Hình thái điện di enzym có cấu trúc monomer đ-ợc quy định bởi 2 alen đồng trội 49

Hình 2.3: Hình thái điện di enzym có cấu trúc monomer đ-ợc quy định bởi 3 alen đồng trội 50

Hình 2.4: Hình thái điện di enzym có cấu trúc dimer đ-ợc quy định bởi 2 alen đồng trội 50

Hình 2.5: Hình thái điện di enzym có cấu trúc tetramer đ-ợc quy định bởi 2 alen đồng trội 50

Hình 2.6: Hình thái điện di enzym có cấu trúc monomer đ-ợc quy định bởi 2 alen một trội một lặn 51

Hình 3.1: Đa hình hình thái muỗi tr-ởng thành của các thành viên thuộc nhóm loài An maculatus 64

Hình 3.2: Đa hình cơ quan sinh dục đực của các thành viên thuộc nhóm loài An maculatus 66

Hình 3.3: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái quăng của An maculatus 67

Hình 3.4: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái quăng của An maculatus dạng 3 67

Hình 3.5: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái quăng của An maculatus dạng 4 68

Hình 3.6: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái quăng của An maculatus dạng 5 68

Hình 3.7: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái quăng của An dravidicus 69

Hình 3.8: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái quăng của An notanandai 69

Hình 3.9: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái quăng của An.pseudowillmori 70

Hình 3.10: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái quăng của An sawadwongporni dạng 1 70

Hình 3.11: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái quăng của An sawadwongporni dạng 2 71

Hình 3.12: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái quăng của An sawadwongporni dạng 3 71

Hình 3.13: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái quăng của An willmori 72

Hình 3.14: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái bọ gậy của An maculatus 73

Hình 3.15: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái bọ gậy của An maculatus dạng 3 73

Hình 3.16: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái bọ gậy của An maculatus

Hình 3.27: Vũng n-ớc đáy suối cạn có sỏi là ổ bọ gậy thích hợp của các loài

trong nhóm An maculatus 83 Hình 3.28: ổ bọ gậy của An dravidicus ở suối có đáy đá lớn 83 Hình 3.29: ổ bọ gậy thích hợp của An dirus, An minimus đồng thời cũng bắt

đ-ợc An pseudowillmori 84

Hình 3.30: Hình ảnh bộ nhiễm sắc thể kiểu nhân của các thành các thành viên

nhóm loài An maculatus 91

Hình 3.31: Hình ảnh điện di enzym ODH của các thành viên trong nhóm loài

Hình 3.38: Sơ đồ hình cây biểu thị mối quan hệ di truyền của các thành viên

đã định tên trong nhóm loài An maculatus dựa trên số liệu phân tích

izozym 108

Hình 3.39: Sơ đồ hình cây biểu thị mối quan hệ di truyền của các thành viên trong toàn bộ nhóm loài An maculatus dựa trên số liệu phân tích izozym 111 Hình 3.40: Sản phẩm cắt đoạn ITS2 của các thành viên trong nhóm loài An maculatus bằng enzym HeaIII 112

Hình 3.41: Sản phẩm cắt đoạn ITS2 của các thành viên trong nhóm loài An maculatus bằng enzym HindII 113

Hình 3.42: Sản phẩm cắt đoạn ITS2 của các thành viên trong nhóm loài An maculatus bằng enzym HeaII 114

Hình 3.43: Sản phẩm cắt đoạn ITS2 của các thành viên trong nhóm loài An maculatus bằng enzym MspI 115

Hình 3.44: Sản phẩm cắt đoạn ITS2 của các thành viên trong nhóm loài An maculatus bằng enzym XbaI 115

Hình 3.45: Sản phẩm của phản ứng RAPD- PCR sử dụng mồi A1 117

Hình 3.46: Sản phẩm của phản ứng RAPD- PCR sử dụng mồi A5 118

Hình 3.47: Sản phẩm của phản ứng RAPD- PCR sử dụng mồi F2 119

Hình 3.48: Sản phẩm của phản ứng RAPD- PCR sử dụng mồi OPL1 120

Hình 3.49: Sản phẩm của phản ứng RAPD- PCR sử dụng mồi F4 121

Hình 3.50: Sơ đồ hình cây biểu thị mối quan hệ di truyền của các thành viên đã định tên trong nhóm loài An maculatus dựa vào số liệu RAPD-PCR 123

Hình 3.51: Sơ đồ hình cây biểu thị mối quan hệ di truyền của các thành viên trong nhóm loài An maculatus dựa vào số liệu RAPD-PCR 125

Hình 3.52: Kết quả định loại các thành viên trong nhóm loài An maculatus bằng ph-ơng pháp PCR đa mồi theo C.Walton 127

Hình 3.53: Hình ảnh giải trình tự đoạn gen ITS2 của An maculatus dạng 5 128

Hình 3.54: So sánh kết quả giải trình tự với các mẫu đã đ-ợc l-u giữ ở Genebank 129

Hình 3.55: Sự khác biệt kết quả giải trình tự của An sawadwongporni thu tại Vân Nam Trung Quốc với các mẫu An sawadwongporni l-u giữ ở Genebank 130

Hình 3.56: Kết quả t-ơng đồng về trình tự của An sawadwongporni thu tại Vân Nam Trung Quốc với các mẫu An maculatus l-u giữ ở Genebank 130

Hình 3 57: So sánh kết quả giải trình tự của các thành viên đã định tên trong nhóm loài An maculatus 131

Hình 3.58: Sơ đồ hình cây biểu thị mối quan hệ di truyền của các thành viên đã định tên trong nhóm loài An maculatus dựa vào số liệu giải trình tự đoạn ITS2 131

Hình 3.59: So sánh kết quả giải trình tự của các thành viên đã định tên trong

nhóm loài An maculatus với các trình tự của nhóm loài đ-ợc l-u trên

Genebank 132 Hình 3.60: Sơ đồ hình cây biểu thị mối quan hệ di truyền của các thành viên

đã định tên trong nhóm loài An maculatus dựa vào số liệu giải trình tự

đoạn ITS2 và các số liệu đ-ợc l-u giữ trên Genebank 133

Hình 3.61: Phân bố của các loài trong nhóm loài An maculatus 140 Hình 3.62: Kết quả thử nghiệm ELISA xác định thoa trùng P.vivax trong muỗi

An maculatus tại Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà 142 Hình 3.63: Kết quả kiểm tra các mẫu muỗi nhiễm P.falciparum tại Đắc Ơ,

Ph-ớc Long, Bình Ph-ớc bằng kỹ thuật PCR lồng 142

Mở đầu

Những nghiên cứu về các côn trùng truyền bệnh, trong đó có muỗi Anopheles,

trung gian truyền bệnh sốt rét ngày càng đ-ợc đẩy mạnh trên mọi ph-ơng diện: phân loại, phân bố, vai trò truyền bệnh, sinh học, tập tính và biện pháp phòng chống Ngày nay những nghiên cứu về hệ thống học và chủng loại phát sinh đã thâm nhập sâu vào hầu hết các lĩnh vực của sinh vật học, phân biệt các loài và quá trình phát triển của sinh giới Cùng với thời gian, sự phát triển các ph-ơng pháp mới, những kết quả về phân loại và xác định sự phát sinh chủng loại ngày càng phong phú Từ những năm 60 của thế kỷ XX trở lại đây, nhiều cuộc cách mạng về khoa học và kỹ thuật đã xảy ra đặc biệt là những cuộc cách mạng trong sinh học phân tử Các ph-ơng pháp mới xác định cấu trúc phân tử của protein, axít nucleic đã sớm đ-ợc các nhà sinh vật học áp dụng Nhiều ph-ơng pháp kỹ thuật nghiên cứu mới nhằm phân loại và xác định nguồn gốc phát sinh của sinh vật đ-ợc ứng dụng rất mạnh Nổi bật trong các ph-ơng pháp này là sự phát triển của một kỹ thuật mới đ-ợc phát hiện vào giữa thập kỷ 80 của thế kỷ tr-ớc gọi là phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction-PCR) Ph-ơng pháp nhân gen kết hợp với việc thiết kế các loại mồi khác nhau đã phát hiện một số l-ợng lớn các số liệu về biến đổi trình tự ADN trong

và giữa các loài Nhân gen cũng đồng thời tạo b-ớc khởi đầu để tiếp cận với việc phân tích dấu vân tay ADN (DNA fingerprinting), cũng nh- phân tích các tiểu vệ tinh (Microsaterllite) (Weber, May, 1989) [210] và đa hình các đoạn ADN nhân bản ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphism DNA-RAPD) [216] Cùng với sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử mới chúng ta không nên bỏ qua những

kỹ thuật phân tích sinh học cơ sở th-ờng dùng Các kỹ thuật điện di hệ enzym (allozyme) và di truyền tế bào đều là những công cụ rất tốt bổ sung cho việc phân loại [31, 120, 213] và chúng vẫn là những ph-ơng pháp rất có giá trị trong thực tiễn nghiên cứu sinh học Những ph-ơng pháp mới để phân tích ADN nh- PCR, lai ADN, phân tích đa hình các đoạn giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP), Microsaterllite, RAPD, ADN fingerprinting ,đã đ-ợc sử dụng mỗi ph-ơng pháp có điểm mạnh và điểm hạn chế riêng Nhiều loài muỗi lúc

đầu đ-ợc xác định nh- một loài đơn, nh-ng trong quá trình nghiên cứu sâu về vai trò

dịch tễ, đặc tính sinh học và bằng việc sử dụng các kỹ thuật mới, áp dụng các dấu hiệu nhận biết về di truyền, sinh hoá đã xác định chúng là những phức hợp loài

đồng hình (sibling species complex, cryptic species complex) Một trong những ví

dụ kinh điển là nhóm loài An macullipenis ở châu Âu đã đ-ợc Mayer [25, 26] dẫn

ra trong sách giáo khoa về phân loại của mình Càng về sau, ng-ời ta càng phát hiện

ra có nhiều loài đồng hình, đặc biệt ở những loài có vai trò truyền bệnh Có thể kể ra

hàng loạt các ví dụ khác nh- phức hợp Anopheles gambiae ở Châu Phi, Anopheles quandrimaculatus ở Châu Mỹ [46, 68], nhóm loài An hyrcanus, An leucosphyrus ở

Châu á [35, 36, 55, 70]

Loài muỗi Anopheles (Cellia) maculatus đ-ợc Theobald phát hiện ở Hồng Kông

Trung Quốc vào năm 1901 Sau đó một loạt các loài khác t-ơng tự đ-ợc phát hiện ở

ấn Độ, Đài Loan và đ-ợc coi là các tên đồng vật (synonym) của Anopheles

maculatus [156]

Đây là loài muỗi phân bố rộng rãi ở vùng Đông ph-ơng [2, 6-10] Từ năm 1901

đến năm 1925, nhóm loài Anopheles maculatus đã có 8 loài đ-ợc đặt tên [161]

Năm 1986 Rattanarithikul và Green đã phát hiện thêm 2 loài mới ở Thái Lan [156] Năm 1990 hai loài mới nữa ở Philippin đ-ợc Rattanarithikul và Harbach đặt tên là

An greeni và An dispar [157]

Nh- vậy cho đến nay, phức hợp An maculatus gồm ít nhất 12 loài thành viên:

An maculatus Theobald, 1901; An willmori (James, 1903); An indicus (Theobald, 1907); An dudgeonii (Theobald, 1907); An pseudowillmori (Theobald, 1910); An maculosa (James and Liston, 1911); An dravidicus Christophers, 1924; An hanabusai Yamada, 1925; An sawadwongporni Rattanarithikul and Green , 1986;

An notanandai Rattanarithikul and Green, 1986; An greeni Rattanarithikul and Harbach, 1990 và An dispar Rattanarithikul and Harbach, 1990

Nhiều thành viên trong nhóm này đã đ-ợc xác định có vai trò truyền bệnh ở Malaysia [122], Thái Lan [89-91], Nepal [151], Trung Quốc, Singapore.[122]

ở Việt Nam, tr-ớc đây, muỗi Anopheles maculatus đ-ợc xác định là một loài

đơn, phân bố rộng rãi ở vùng rừng núi toàn quốc [2, 6-10] Những nghiên cứu gần

đây về hình thái, tế bào cho thấy phức hợp loài này gồm ít nhất 6 loài đã đ-ợc định

tên và một số dạng ch-a xác định rõ vị trí phân loại [6-10, 22] Năm 1936,

Toumanoff, đã tiến hành mổ An maculatus thấy chúng có nhiễm ký sinh trùng sốt rét [196] Đến nay loài An maculatus vẫn đ-ợc coi là vectơ truyền bệnh thứ yếu ở n-ớc ta [10, 16, 17, 20-22, 21, 24] Nh- vậy việc nghiên cứu về muỗi Anopheles maculatus trên Thế giới và Việt Nam còn khác nhau Nhiều vấn đề liên quan đến

phân loại, vai trò truyền bệnh của loài muỗi này ở Việt Nam cần đ-ợc giải quyết Với những lý do nêu trên chúng tôi tiến hành đề tài :”Nghiên cứu tính đa hình di

truyền và vai trò truyền bệnh của các thành viên trong nhóm loài Anopheles maculatus ở Việt Nam” nhằm mục đích :

1 Xác định thành phần loài và phân bố của các thành viên trong nhóm loài An maculatus ở Việt Nam

2 Xác định tính đa hình di truyền và mối quan hệ di truyền của các thành viên trong nhóm loài

3 Xác định vai trò truyền bệnh của chúng nhằm góp phần vào việc phòng chống vectơ sốt rét ở n-ớc ta

Ch-ơng 1 : Tổng quan tài liệu

1.1 Đại c-ơng về vấn đề nghiên cứu các loài đồng hình

Trong nghiên cứu về côn trùng y học, các loài có vai trò truyền bệnh th-ờng thể hiện tính đa hình một cách sâu sắc Việc tồn tại các loài đồng hình và sự gối nhau về giới hạn biến dị của các loài trong một nhóm loài hay một phức hợp loài là khá phổ biến

Việc phân biệt các loài đồng hình, các loài có quan hệ họ hàng gần gũi đôi khi xuất hiện những biến dị rất khác nhau và giới hạn biến dị của chúng có thể gối lên nhau nhiều đến mức hình nh- không còn một dấu hiệu nào chuẩn tuyệt đối để phân biệt

Việc phát hiện và phân loại các loài đồng hình bằng phân tích hình thái là rất khó chính xác Do vậy, ng-ời ta phải kết hợp phân tích hình thái với nhiều ph-ơng pháp phân tích tính đa hình khác nhau

Bệnh sốt rét thực sự là một bệnh nghiêm trọng trên toàn cầu, và là một trong

những bệnh do muỗi truyền có phạm vi phân bố rộng rãi nhất Muỗi Anopheles đã

đ-ợc xác định là vectơ truyền bệnh sốt rét ở ng-ời Chỉ có một phần nhỏ các loài muỗi trong giống muỗi này đ-ợc coi là vectơ chính truyền bệnh sốt rét, tuy nhiên

các loài và dạng muỗi Anopheles truyền bệnh sốt rét trên toàn thể giới rất đa đạng và phong phú) [60, 203] Những nghiên cứu đầu tiên trên Anopheles maculipennis sau

đó là trên các loài khác bao gồm cả việc nghiên cứu về khả năng giao phối nhân tạo trong phòng thí nghiệm, các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra rằng rất nhiều loài muỗi

Anopheles, là vectơ truyền bệnh sốt rét tồn tại nh- thành viên của các phức hợp loài

trong đó có những loài truyền bệnh và những loài không có vai trò truyền bệnh

Điều khó khăn chính là, những thành viên của các phức hợp loài này th-ờng có hình thái rất giống nhau, do đó rất khó cho việc định loại hình thái nhằm chỉ ra vai trò truyền bệnh của chúng đồng thời gây khó khăn cho việc nỗ lực phòng chống [134,

195, 203] Việc không chú ý tới sự tồn tại của các phức hợp loài làm cho phân định

các vectơ phức tạp, một loài Anopheles đơn th-ờng tồn tại sự lai không đồng nhất ở

một vùng địa lý rộng lớn [30] Sự tăng c-ờng tính mềm dẻo về kiểu gen và kiểu hình này càng gây khó khăn cho việc phân loại các quần thể vectơ và các tác động tới hiệu quả của các cuộc điều tra cũng nh- các chiến l-ợc phòng chống vectơ [82] Trong giai đoạn tr-ớc đây, sự thành công trong việc chống lại bệnh sốt rét có sự

đóng góp của việc phòng chống muỗi Nh-ng trong thời điểm hiện tại chiến l-ợc này bị thất bại do một loạt các lý do bao gồm sự phát triển của tính kháng hoá chất,

sự hạn chế về điều kiện kinh tế, và khoảng trống về những hiểu biết về sinh học cơ bản của các vectơ đồng hình này (Norris, 2002) [141]

Một số nhà khoa học chuyển h-ớng từ nghiên cứu khả năng giao phối sang nghiên cứu về nhiễm sắc thể khổng lồ, những kết quả đầu tiên đã cung cấp cho nhà nghiên cứu những bằng chứng di truyền chính xác có thể sử dụng để phân biệt và nhận biết các loài (trong phức hợp loài đồng hình) và các dạng của nhiễm sắc thể [58, 194] Việc phát minh ra kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase đã tạo ra một ph-ơng tiện mới cho nghiên cứu di truyền phân tử hệ gen và các kỹ thuật mới về sau tạo điều kiện thuận lợi cho những nghiên cứu về di truyền của từng cá thể cũng nh-

ở mức độ quần thể [45] Sự đa dạng và phong phú của các chỉ thị phân tử có thể sử dụng trong nghiên cứu vectơ sốt rét đã đ-ợc công bố liên tục trong vòng 10 năm trở lại đây Các chỉ thị phân tử và tế bào từ các “công cụ truyền thống” như nghiên cứu

tế bào học, nhiễm sắc thể khổng lồ, bộ NST, các kỹ thuật về miễn dịch học, lai tạo

và phân tích isozyme [79] tới một loạt các chỉ thị phân tử Các chỉ thị hiện nay bao gồm từ cái gọi là “các chỉ thị di truyền kinh điển” (ADN ty thể và cADN) tới các ph-ơng pháp sử dụng để phát hiện và phân biệt sự đa hình của từng nucleotide (SNPs) và cuối cùng là đến những chỉ thị phân tử có tính đa hình cao (RAPD, SSR

và AFLP) Một trong những -u điểm lớn nhất của việc sử dụng một số l-ợng lớn các chỉ thị di truyền khác nhau là ng-ời nghiên cứu có thể lựa chọn sử dụng, kết hợp các chỉ thị hay các kỹ thuật để trả lời nhiều câu hỏi có liên quan đến sự lan truyền sốt rét [189] Những chỉ thị phân tử này cũng cung cấp công cụ hữu hiệu cho nhiều nghiên cứu ứng dụng khác bao gồm: phân loại phân tử, hệ thống tiến hoá, di truyền quần thể, bản đồ di truyền, và một loạt các chẩn đoán phân tử

Mặc dù một vài năm vừa qua đã phát triển nhiều kỹ thuật mới về di truyền học quần thể nh-ng không một kỹ thuật đơn lẻ nào trả lời tốt nhất cho các câu hỏi

đặt ra khi phân loại các loài đồng hình Sự kết hợp phân tích đa hình độ dài các đoạn phân cắt, điện di izozym và phân tích nhiễm sắc thể khổng lồ là một ph-ơng cách tốt

để xác định các loài đồng hình, còn phân tích trật tự ADN là cách tốt nhất cho việc nghiên cứu phát sinh chủng loại và bộ mẫu dò ADN (DNA probes) là cách tốt nhất cho việc định loại th-ờng quy các cá thể côn trùng trong các phức hợp loài đã đ-ợc nhận biết Cách sử dụng nhiều ph-ơng cách, gồm cả hình thái học và các chỉ thị phân tử là cần thiết cho việc nghiên cứu các quần thể muỗi

Hình thái học là nền tảng của phân loại học theo Aristotle cách đây hàng 2000 năm Nếu hai sinh vật trông giống nhau thì chúng cùng một loài Nếu trông chúng khác nhau thì chúng khác loài Những sự tranh cãi phân loại học tóm lại là thảo luận

về ngữ nghĩa thế nào là “giống nhau” được diễn tả theo ngôn ngữ của hình thái học Eanst Mayr đã đ-a ra khái niệm loài sinh học, xác định loài là một nhóm sinh vật

mang vốn gen chung Nh- vậy, ông đã mở rộng nền tảng ổn định của phân loại học Sau này, Cockburn đã xây dựng tháp Babel một mô hình mà loài đồng hình đ-ợc đề xuất dựa trên các kỹ thuật chuyên biệt (hình 1.1) Các quần thể đã đ-ợc xác định là các loài hình thái đơn có thể thể hiện tập tính phức tạp khác nhau ở những vùng

khác nhau Ví dụ điển hình nhất là phức hợp loài An gambiae, trong khi loài An gambiae là loài truyền bệnh chủ yếu nhất châu Phi thì loài đ-ợc xác định bằng dấu hiệu hình thái là An quandrimaculatus thậm chí lại không đốt máu ng-ời

Sẽ là thuận lợi cho nghiên cứu nếu chúng ta biết sử dụng tổ hợp các kỹ thuật khác nhau nhằm kết hợp những -u điểm của từng ph-ơng pháp, kỹ thuật trong một ch-ơng trình nghiên cứu

Có một điều mâu thuẫn khi tiến hành phân loại các loài đồng hình là các ph-ơng pháp tiến hành nhanh chóng tiết kiệm thời gian thì những thông tin cung cấp cho việc phân loại ít, trong khi đó những kết quả của ph-ơng pháp tốn nhiều thời gian và kinh phí thì lại cung cấp nhiều thông tin có giá trị cho vịêc định loại

Hình 1.1 Tháp Babel phát hiện các loài đồng hình

(Nguồn Cockburn, 1994 [59]) Một số kỹ thuật có thể hội đủ mọi điều cần thiết để cân bằng giữa tốc độ và thông tin hàm chứa Chúng gồm tế bào học nhiễm sắc thể khổng lồ, điện di izozym

và đa hình độ dài các đoạn phân cắt (RFLPs) Cả hai kỹ thuật tế bào học nhiễm sắc thể khổng lồ và điện di izozym đã đ-ợc sử dụng trong vài thập kỷ qua và đã đóng góp nhiều kết quả trong việc phát hiện các loài đồng hình Chỉ thị RFLP bao gồm ADN ty thể hoặc ADN ribosome đã đ-ợc ứng dụng trong khoảng 10 năm và cũng

có thể so sánh với hai ph-ơng pháp trên

Hình 1.2: Trình tự hình thái học

(Nguồn Cockburn, 1994 [59]) Giải trình tự ADN (hoặc ARN hoặc protein) là kỹ thuật di truyền tốt nhất thích hợp với việc phân tích phát sinh chủng loại bởi vì có đủ số l-ợng đặc điểm không hạn chế (một hệ gen của muỗi có ít nhất 100 triệu đôi bazơ nitơ) Những đặc điểm giống nhau có thể dễ dàng thu nhận từ mỗi loài bằng cách giải trình tự của các gen cùng loại Chủ yếu khi sử dụng các kỹ thuật phân tử để nghiên cứu phát sinh chủng loại, mỗi một nhà sinh học tiến hoá th-ờng dùng giải trình tự ADN Sức hấp dẫn của việc sử dụng các kỹ thuật di truyền khác nhau đối với phát sinh chủng loại cũng rất mạnh mẽ Thí dụ, ngay sau khi dấu hiệu RFLP của một loài đồng hình mới đ-ợc tìm thấy, các kiểu băng này đ-ợc đem so sánh với các loài họ hàng gần gũi và từ đó một cây chủng loại phát sinh đ-ợc hình thành Cách làm này đ-ợc sự giúp đỡ của các ch-ơng trình phần mềm chuyên dụng có thể chuyển các số liệu phân tích di truyền thành cây chủng loại phát sinh

Định loại Khẳng định Nghiên cứu

Hình 1.3: Sơ đồ ph-ơng pháp mô tả đặc điểm loài đồng hình mới

(Nguồn Rutledge và cs, 1996 [170]) Các mẫu dò ADN (DNA probes) là ph-ơng pháp tốt đ-ợc chọn cho việc định loại th-ờng quy Nhiều nhóm tác giả đã tách các mẫu dò ADN đặc tr-ng cho từng

Mẫu dò ADN

Khả năng truyền bệnh

loài muỗi nhất định nh- An gambiae [100], An dirus [143], An quandrimaculatus loài A,B,C [57], An rangeli và An aquasilis [146]

Nh- vậy rõ ràng để tiến hành phân loại các loài, đặc biệt là các phức hợp loài

đồng hình thì chúng ta phải áp dụng nhiều ph-ơng pháp khác nhau từ đơn giản đến phức tạp (hình 1.3) Mỗi một ph-ơng pháp phù hợp cho một hoàn cảnh điều kiện cụ thể

1.2 Đa hình di truyền và nghiên cứu đa hình di truyền ở muỗi

Đa hình di truyền là biểu hiện sự đa dạng của các biến dị trong một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã Đây là sự đa dạng về thành phần kiểu gen của các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau Tính đa dạng về gen

có thể di truyền đ-ợc trong một quần thể hoặc giữa các quần thể

Tính đa hình di truyền thực chất là hiện t-ợng biến dị một cách không liên tục của một kiểu gen Xét cho cùng, đa hình di truyền là biểu hiện của sự biến đổi của vật chất di truyền, biến đổi về các cặp bazơnitơ và sự tổ hợp trình tự của các cặp bazơnitơ

Tính đa hình di truyền có thể đ-ợc xác định tại mọi mức độ tổ chức bao gồm

từ số l-ợng, cấu trúc của ADN trong mỗi tế bào cũng nh- số l-ợng, cấu trúc của nhiễm sắc thể, protein, hay hình thái của mỗi loài trong các điều kiện tự nhiên khác nhau

1.2.1 Đa hình enzym và ứng dụng để nghiên cứu đa hình di truyền ở muỗi

Đa hình enzym cũng chính là một trong các hình thức biểu hiện của đa hình di truyền Thuật ngữ “izozym” xuất hiện để biểu thị các enzym có cùng chức năng nh-ng do các locut khác nhau quy định Các biến dạng t-ơng ứng của izozym là allozym Allozym là các sản phẩm của những alen khác nhau của cùng một locut Hiện t-ợng đa hình izozym trong tự nhiên là kết quả của đột biến gen cấu trúc của các locut kiểm soát việc tổng hợp các sản phẩm trên Đột biến có thể xảy ra ở nhiều mức độ khác nhau Một số axit amin có thể bị thay thế khi xảy ra đột biến ở một vài bazơ nitơ trong các bộ ba mã hóa của gen cấu trúc Thậm chí trong các gen cấu trúc

có thể xảy ra hiện t-ợng lặp đoạn, mất đoạn, chuyển đoạn của các nucleotit… [206]

Vì vậy, khi sử dụng ph-ơng pháp điện di trên gel tinh bột thuỷ phân, gel agarose hay gel polyacrilamide cùng với nhuộm hoá tổ chức ta có thể thấy đ-ợc các biến dạng khác nhau của phân tử enzym [48]

Việc sử dụng dẫn liệu đa hình di truyền của enzym đã mang lại những thuận lợi cho các phân tích di truyền học: do bản chất di truyền của các enzym là đơn giản

và có thể tiếp cận một cách trực quan do đại đa số các izozym có đặc điểm theo kiểu

đồng trội Hơn nữa trong nghiên cứu di truyền học quần thể thì số liệu về độ dị hợp của quần thể nghiên cứu là cực kỳ quan trọng Số liệu này cho phép đánh giá đ-ợc

động thái di truyền của quần thể tại thời điểm nghiên cứu Số liệu về độ dị hợp của quần thể đ-ợc sử dụng để đánh giá khả năng thích nghi của một quần thể Số liệu này còn cho phép so sánh động thái di truyền của các quần thể với nhau

Izozym là một kỹ thuật truyền thống có tính ứng dụng cao Các hạn chế của việc phân tích izozym là mẫu vật phải đ-ợc giữ t-ơi sống, hoặc giữ trong lạnh cho tới khi phân tích và quá trình sử lý mẫu vật yêu cầu một số l-ợng mẫu vật rất lớn thay cho một vài nanogram mẫu nh- việc phân tích ADN trong kỹ thuật PCR Tuy nhiên, izozym cung cấp những số liệu có giá trị làm cơ sở cho những nghiên cứu

hiện đại về Anopheles

ở muỗi, hiện t-ợng đa hình di truyền izozym lần đầu tiên đ-ợc Bianchi (1969)

đề cập khi so sánh điện di photphatase kiềm của các thành viên phức hợp loài An maculipennis Những số liệu về điện di hệ enzym ở muỗi chỉ ra rằng cũng giống nh-

các quần thể sống khác, các quần thể muỗi biểu hiện sự tồn tại đa alen rất cao ở một số quần thể muỗi, sự đa hình thể hiện ở chỗ một enzym có thể bao gồm sự biểu hiện của từ 5-7 alen [52, 54]

Một trong những nghiên cứu đầu tiên sử dụng ph-ơng pháp sinh hoá nghiên

cứu Anopheles albimanus, đã công bố những số liệu đáng tin cậy về tính đa hình của

các chủng muỗi trong phòng thí nghiệm, những số liệu này sau này còn đ-ợc sử dụng để nghiên cứu bản đồ liên kết gen [140] Những nghiên cứu kỹ l-ỡng và việc

sử dụng kỹ thuật này đã phát hiện ra vị trí các locut gen của allozyme trong các

quần thể hoang dại trùng vùng phân bố ở muỗi Anopheles quandrimaculatus A và B

và cho phép sử dụng những ph-ơng pháp này để nghiên cứu di truyền quần thể ở mức độ rộng hơn [98] Công cụ này cũng đ-ợc sử dụng để xây dựng khoá định loại

nhị phân phân biệt 3 loài trong phức hợp An.quandrimaculatus [140] và đ-ợc sử dụng để tách biệt 2 loài đồng hình trong phức hợp An minimus ở Thái Lan [185]

Những dấu hiệu về sự đa hình di truyền đã đ-ợc phát hiện ở hầu hết các loài

Anopheles Những số liệu này đã chỉ ra sự khác nhau và những biến đổi phức tạp

của các loài đồng hình Sáu locut ( Est-1, Est-2, Est-3, Est-5, Odh, Xdh) trong số 30 enzym đ-ợc thử nghiệm chỉ ra có sự khác nhau về các alen điện di có thể dùng để

phân biệt Anopheles gambiae và Anopheles arabiensis (trong phức hợp Anopheles gambiae) với khoảng cách di truyền là 0,15 [48-49] Khi phân biệt các loài đồng

hình ng-ời ta cần phân tích khoảng 15 locut gen trở lên Khoảng cách di truyền và

hệ số t-ơng đồng di truyền của các loài đồng hình thuộc cùng một nhóm loài cũng nh- các nhóm loài là rất khác nhau

Năm 1992 A.C Green và V Baimai đã tiến hành nghiên cứu 8 hệ enzym của

An dirus và nhận thấy hầu hết chúng đều đa hình

Trên đối t-ợng Anopheles pseudopunctipennis thuộc 42 quần thể thu thập ở Trung và Nam Mỹ, Sylvie Manguin et al (1999) [130] nhận thấy có sự khác bịêt về

tần số alen của 3 locut enzym (glycerol dehydrogenase, 6- phosphogluconate dehydrogenase và phosphoglucomutase) trong tổng số 33 locut phân tích Dựa vào những số liệu thu đ-ợc về sự đa hình izozym, các tác giả đã xếp các nhóm quần thể

Anopheles pseudopunctipennis theo 3 vùng địa lý khác nhau: nhóm 1 trải dài từ

miền nam n-ớc Mỹ qua Mexico đến Guatemala Nhóm 2 phân bố từ Bắc đến Nam

Mỹ qua Trung Mỹ đến Brazil và nhóm 3 có ở Đông Guatemala và Nam Brazil

Choochote et al, (1998) [54] phân tích 10 hệ enzym (esterase-EST, aldehyde

oxidase- ALDOX, fumerate hydratase-FUM, glucosephosphate isomerase-GPI, glycerophosphate dehydrogenase--GPDH, hexokinase-HK, lactate dehydrogenase-LDH, malic enzym- ME, xanthine dehydrogenase- XDH, và amylase- MY) ở cả bọ

-gậy và muỗi tr-ởng thành của 2 dạng Anopheles sinensis (dạng A và B) ở Thái Lan,

kết quả chỉ ra rằng: phần lớn các izozym đều có sự khác biệt về tần số các alen ME,

HK, và Fum có các băng đa hình ở bọ gậy và muỗi tr-ởng thành của cả 2 dạng A

và B Những enzym khác cũng mang các băng đa hình của 2 hay 3 alen trên một locut Đi sâu phân tích enzym esterase, các tác giả thấy EST có 5 locut nh-ng chỉ có

Est5 dùng để phân biệt dạng A và B Est5 có 5 alen (96, 100, 101, 105 và 106) Dạng A có 4 alen 100, 105, 101 và 106 với alen 100 có tần số bắt gặp cao Dạng B

có 4 alen 96, 100, 101 và 105 với alen 96 chiếm -u thế Nh- vậy dạng B có alen 96

mà dạng A không có và ng-ợc lại dạng A có alen 106 với tần số thấp mà dạng B lại không có

Theo những nghiên cứu về izozym trên gel cellulose acetate của phức hợp loài

Anopheles gambiae ở Tây Nam Burkina Faso của Coosemans et al, (1998) [66] thì

tất cả các loài trong phức hợp có thể phân biệt đ-ợc với nhau ở 2 locut ODH và MPI mặc dù chúng có thể có 1 số alen chung ở 2 locut này Phân tích đa hình của 13

locut giữa các loài trong phức hợp Anopheles gambiae cho thấy sự khác biệt quan

trọng giữa những mẫu thu thập ở thành phố và mẫu thu thập ở vùng nông thôn về tần

số alen, về tần số kiểu gen của enzym isocitrate dehydrogenase I, malate dehydrogenase I và tần số alen Mpi

Anopheles sundaicus đ-ợc xác định là vectơ truyền bệnh sốt rét chủ yếu ở

vùng ven biển các n-ớc ở Đông ph-ơng [10, 20] Bằng nghiên cứu di truyền tế bào các nhà khoa học nhận thấy đây là một phức hợp loài gồm 3 dạng nhiễm sắc thể

khác nhau (dạng A, B, và C) ở Indonesia và Thái Lan Vào năm 1999, Sukowati et

al, đã tiến hành nghiên cứu izozym của 3 dạng A, B, C này thu thập từ 6 quần thể

địa lý khác nhau ở Indonesia M-ời hai hệ enzym với tổng số 15 locut đ-ợc nghiên cứu và kết quả là hầu hết các enzym đều đa hình trong hay giữa các quần thể của

phức hợp An sundaicus Tần số alen của enzym Mpi (Mannose phosphate isomerase) cho phép phân loại mỗi dạng Anopheles sundaicus khác nhau Dựa vào

dữ liệu thu nhận đ-ợc từ nghiên cứu trên, các tác giả đã thiết lập mô hình cây chủng loại phát sinh của 3 dạng này, qua đó thấy dạng A có quan hệ gần gũi hơn với dạng

C, còn dạng B có khoảng cách di truyền xa hơn đối với hai dạng trên, Nh- vậy,

những kết quả này càng củng cố và khẳng định An sundaicus ở Indonesia là phức

hợp gồm 3 loài đồng hình [186]

Những bằng chứng về sự đa hình di truyền của Anopheles nuneztovari đã đ-ợc

Scarpasa và Tadel công bố dựa vào việc phân tích izozym của các mẫu thu thập ở 6 quần thể khác nhau (4 quần thể rừng Amazon- Brazil và 2 quần thể Colombia) Các enzym ME và XDH là những enzym đơn locut ở tất cả các quần thể, trong khi đó

EST và LAP lại có số locut nhiều hơn EST có 5 locut và LAP có 4 locut IDH có 3 vùng bắt màu và có sự khác biệt di truyền ở locut Idh I giữa các quần thể ở rừng Amazon- Brazil MDH đa hình cao ở tất cả quần thể nghiên cứu ở quần thể Sitromela, locut enzym ACON thể hiện có 4 alen còn các quần thể còn lại chỉ có 3 alen PGM do một locut xác định nh-ng lại có sự đa hình cao ở các quần thể rừng Amazon Những enzym này là chỉ thị quan trọng cho thấy sự đa hình trong các

quần thể Anopheles nuneztovari [174]

Khoảng cách di truyền giữa các loài Anopheles rangeli, loài Anopheles nuneztovari và loài Anopheles dunhami ở rừng Amazon- Brazil đ-ợc tính toán bằng

sử dụng kết quả điện di izozym Ba loài này thuộc cùng phân nhóm Oswaldoi, phân giống Nyssorhynchus M-ời ba enzym với tổng số 22 locut của các loài trên đã

đ-ợc nghiên cứu và đ-a đến những kết luận: Anopheles nuneztovari và Anopheles rangeli khác nhau ở các locut Gpi1, Hk1, Me1 đặc biệt rõ rệt ở locut Mdh Năm locut (Mdh, Gpi1, Hk1, Gpd và Me) dùng phân biệt hai loài An.rangeli và An.dunhami trong khi đó chỉ có 1 locut Gpd mới phân biệt đ-ợc An.nuneztovari và An.dunhami Khoảng cách di truyền cao nhất giữa An.rangeli và An.dunhami (0,28)

và thấp nhất giữa An.nuneztovari và An.dunhami (0,072) Khoảng cách di truyền giữa Anopheles nuneztovari và Anopheles rangeli là 0,237 Các tác giả đ-a ra nhận

định rằng An.dunhami và An.nuneztovari là loài chị em có mối quan hệ gần gũi và

có thể đ-ợc tách ra từ một nhánh tổ tiên chung [174]

Bằng cách so sánh phổ điện di 12 hệ enzym của các thành viên trong phức hợp

loài Culex pipiens L ở California và Nam phi, Cornel, Collins (2003) nhận thấy ở Nam phi có sự khác biệt giữa loài Cx pipiens và Cx quinquefaciatus ở các locut

Ao, 6-Pgdh, Mdh2 và Pgm Ng-ợc lại, tại California, toàn bộ các quần thể Cx pipiens đều có sự cân bằng phù hợp với định luật Hardy Weinberg ở tất cả các locut enzym thử nghiệm Những kết quả trên đây chỉ ra rằng ở Nam Phi hai loài Cx pipiens và Cx quinquefaciatus có khoảng cách di truyền khác biệt giữa các quần thể

và có thể chúng là các loài riêng biệt, trong khi đó ở California lại có sự t-ơng đồng

di truyền giữa hai quần thể này, chúng đ-ợc coi nh- loài duy nhất [69]

ở Việt Nam, việc phân tích đa hình izozym ở muỗi cũng đã đ-ợc tiến hành từ giữa những năm 80 của thế kỷ tr-ớc Một trong những nhóm loài truyền bệnh sốt rét

chính ở Đông Nam á cũng nh- ở Việt Nam đ-ợc nghiên cứu khá rõ là nhóm loài

An minimus Những nghiên cứu về An minimus ở Việt Nam chỉ ra rằng izozym

Octanol dehydrogenase (ODH) ở loài muỗi này biểu hiện tính đa hình ở các quần

thể khác nhau Các quần thể muỗi An minimus C phân bố chủ yếu ở những sinh

cảnh thích hợp đó là sinh cảnh rừng rậm, rừng nguyên sinh đ-ợc đặc tr-ng bởi Odh134 và Odh146 Các quần thể An minimus A phân bố rộng rãi ở vùng rừng núi

trong toàn quốc chúng mở rộng vùng phân bố tới vùng bán sơn địa có 2 alen đặc tr-ng là Odh100 và Odh114 Hai dạng muỗi này có tập tính và thời gian sinh sản đặc tr-ng khác nhau [1, 3, 11, 13]

Năm 2000, các cán bộ của Viện SR- KST- CT TƯ đã phân tích 4 hệ izozym,

đó là: glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD), phosphoglucomutase (PGM),

Isocitrate dehydrogenase (IDH) của phức hợp loài An maculatus ở Việt Nam, các

tác giả nhận thấy có sự đa hình di truyền rõ rệt và thể hiện là các thành viên khác nhau trong phức hợp loài Do vậy có thể sử dụng hệ izozym này để nhận biết các thành viên trong phức hợp [22]

1.2.2 Di truyền tế bào và ứng dụng trong nghiên cứu đa hình di truyền

Ph-ơng pháp di truyền tế bào là ph-ơng pháp tập trung vào nghiên cứu nhiễm sắc thể của tế bào: thông th-ờng là nghiên cứu nhiễm sắc thể khổng lồ (polytene chromosome) và nghiên cứu hình thể bộ nhiễm sắc thể ở kỳ giữa nguyên phân (karyotype)

Làm tiêu bản nhiễm sắc thể là sử dụng các tác động cơ học và hoá học làm cho nhiễm sắc thể dàn đều trên bề mặt của lam kính và nhuộm màu Từ đó, ta có thể quan sát số l-ợng, hình dạng và các băng đặc tr-ng trên nhiễm sắc thể Dựa vào những đặc điểm quan sát đ-ợc ta có thể xác định những nét đặc tr-ng của các loài cần nghiên cứu, phân tích các chuyển đoạn, đảo đoạn, trình tự sắp xếp của các băng trên nhiễm sắc thể từ đó có thể xác định mối quan hệ và nguồn gốc phát sinh của các loài

Nghiên cứu di truyền tế bào là một h-ớng nghiên cứu cơ bản và quan trọng nhằm củng cố và tăng c-ờng sự hiểu biết về sinh học loài Những công trình nghiên

cứu di truyền tế bào các quần thể muỗi thuộc giống Anopheles giúp chúng ta hiểu rõ

hơn về bộ máy di truyền của chúng ở mức độ tế bào và mối quan hệ tiến hoá giữa các loài trong họ muỗi

Di truyền tế bào gồm có nghiên cứu kiểu nhân của nhiễm sắc thể khổng lồ, đây

là một trong những công cụ sớm nhất đ-ợc sử dụng để nghiên cứu di truyền ở muỗi

Anopheles Một trong những nh-ợc điểm của kỹ thuật này ở muỗi Anopheles là

nhiễm sắc thể khổng lồ phải đ-ợc chuẩn bị từ mô tế bào nuôi trứng hoặc ở bọ gậy tuổi IV Điều này hạn chế là chúng ta chỉ có thể sử dụng mẫu vật là các muỗi cái no máu hoặc là giai đoạn cuối của bọ gậy Thêm vào đó, có rất ít ng-ời có kinh nghiệm

và đ-ợc đào tạo để phân tích kết quả nhiễm sắc thể, đặc điểm này không cung cấp nhiều, có khi lại rất ít thông tin ở một số loài (Lounibos, Conn, 2000) [124] Mặc dù

có những hạn chế trên, nh-ng ph-ơng pháp này vẫn tồn tại không thể thiếu cho những nghiên cứu hiện nay

Trong những năm gần đây, nghiên cứu di truyền tế bào muỗi sốt rét Anopheles

ngày càng đ-ợc quan tâm và mở rộng đặc biệt trong việc phân biệt các loài đồng hình trong các phức hợp loài Các nhà khoa học đã đi sâu nghiên cứu kiểu nhân và nhiễm sắc thể khổng lồ Ng-ời tiên phong trong lĩnh vực này là G Frizzi và

Kitzmiller trên đối t-ợng An maculipennis (1954) Tiếp đó, năm 1969, Coluzzi đã phát hiện thấy nhiễm sắc thể khổng lồ ở tế bào nuôi trứng của muỗi cái Anopheles

tr-ởng thành Nhiễm sắc thể khổng lồ ở tế bào nuôi trứng rất hữu ích trong việc

phân biệt các loài đồng hình trong phức hợp loài An gambiae [58, 85], An culicifacies và An maculatus [186]

Di truyền tế bào cung cấp những thông tin vô cùng hữu hiệu để phân biệt các loài cùng vùng phân bố và các dạng nhiễm sắc thể khác nhau Trên thực tế di truyền

tế bào đ-ợc coi là công cụ duy nhất đáng tin cậy để phân biệt sự khác nhau giữa các

dạng nhiễm sắc thể của An gambiae s.s [59] và cho đến tận ngày nay nó cũng là công cụ đáng tin cậy để phân biệt 9 thành viên của nhóm loài Anopheles funestus [103] Sharakhov et al, (2001) [176] đã phát triển một bản đồ nhiễm sắc thể khổng

lồ của An.funestus và so sánh nó với cấu trúc di truyền tế bào của An gambiae

Ngoài ra, tần số của những đảo đoạn nhiễm sắc thể có thể sử dụng để nghiên cứu cấu trúc quần thể và -ớc l-ợng về tác động của kích cỡ quần thể [107, 148, 188]

Các đảo đoạn NST cũng có thể đ-ợc sử dụng để nghiên cứu quá trình tiến hoá, tìm ra cấu trúc ban đầu, việc duy trì và đan xen các đảo đoạn NST tồn tại ở nhiều

quần thể và các bậc phân loại trùng vùng phân bố ở nhiều nhóm loài Anopheles

[60] Những thông tin nh- thế đã đ-ợc sử dụng nh- những bằng chứng về sự tiến hoá di truyền và những biến đổi để thích nghi của nhiễm sắc thể giữa hai loài đồng

hình, An gambiae s.s và An arabiensis T-ơng tự, Caccone et al, (1998) [50] và Powell et al, (1999) đã phát hiện ra các h-ớng tiến hoá thông qua các đảo đoạn nhiễm sắc thể đ-ợc chia sẻ giữa các thành viên của phức hợp An gambiae Cũng

nh- vậy, việc so sánh về sự chia sẻ các băng trên nhiễm sắc thể khổng lồ cũng đ-ợc

tìm thấy ở các loài muỗi Anopheles ở vùng Tân thế giới [147] Trong cả hai tr-ờng

hợp trên, các nhà nghiên cứu đều phải kiểm tra những dấu hiệu khác để có một kết luận chính xác về những sự t-ơng đồng này [186]

ở vùng Đông ph-ơng, công trình nghiên cứu đầu tiên trên 6 loài muỗi thuộc 2

phân giống Cellia và Anopheles do Avirachan et al, (1968) [28] tiến hành.Tiếp đó

là công trình của V Baimai nghiên cứu An balabacencis và rất nhiều công trình khác trên các đối t-ợng An dirus, An minimus [35,36…]

Theo nhiều tài liệu và kết quả đã đ-ợc công bố, các tác giả đều kết luận rằng

kiểu nhân của tất cả các loài Anopheles đã nghiên cứu đều có số nhiễm sắc thể

l-ỡng bội 2n=6 gồm 3 đôi: hai đôi nhiễm sắc thể th-ờng, và một đôi nhiễm sắc thể giới tính (XX ở con cái và XY ở con đực) Hai đôi nhiễm sắc thể th-ờng là tâm cân hoặc tâm cận giữa, đôi nhiễm sắc thể giới tính có hình thái khác nhau giữa con đực

và con cái và ở các loài khác nhau thì nhiễm sắc thể giới tính khác biệt nhau

Các kiểu nhân phân biệt với nhau trên cơ sở sự sai khác về hình dạng kích th-ớc, cũng nh- sự phân bố vùng dị nhiễm sắc trên nhiễm sắc thể th-ờng và nhiễm sắc thể giới tính Những nét khác biệt này thấy cả trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau

Theo những nghiên cứu của V Baimai (1988) [35], có ít nhất 7 loài đồng hình

trong phức hợp loài An dirus ở Đông Nam á là A, B, C, D, E, F và An takasagoensis Các loài này đ-ợc phân biệt dựa vào khối dị nhiễm sắc ở tâm động

trên nhiễm sắc thể giới tính trong kiểu nhân nguyên phân

Khi đi sâu nghiên cứu riêng loài An dirus A ở Thái Lan, Baimai đã nhận thấy

rằng các nhiễm sắc thể giới tính ở loài này không ổn định về kích th-ớc và có điểm sai khác về cấu trúc các vùng dị nhiễm sắc trên chúng

Năm 1985, Green và những ng-ời khác đã phát hiện các loài An maculatus B

và C, mỗi loài có 2 loại nhiễm sắc thể X khác nhau về hình dạng và kích th-ớc [85]

Trên đối t-ợng An minimus ở Thái Lan, Sucharit đã chỉ ra có 2 loài An minimus khác nhau, dựa vào sự khác nhau của nhiễm sắc thể Y [185]

Năm 1991, Xu Shubi và Qu Fengyi [219] đã tiến hành nghiên cứu kiểu nhân

của 13 loài muỗi Anopheles ở Trung Quốc: 5 loài thuộc phân giống Cellia là An maculatus, An dirus, An kochi, An splendidus, An minimus, 8 loài thuộc phân giống Anopheles là An barbirostris, An meseae, An crawfordi, An kunmingensis,

An kweiyanensis, An hyrcanus, An sinensis và An anthropophagus, kết quả cho

Kiểu nhân của 8 loài thuộc nhóm Maculatus có sự khác biệt về số l-ợng và sự

phân bố cấu trúc từng vị trí nhiễm sắc trên nhiễm sắc thể giới tính và vùng tâm động trên nhiễm sắc thể th-ờng [32]

Bên cạnh những công trình nghiên cứu kiểu nhân còn có rất nhiều công trình nghiên cứu về nhiễm sắc thể khổng lồ

Năm 1968, Coluzzi đã phát hiện ra nhiễm sắc thể khổng lồ ở tế bào nuôi trứng của muỗi cái tr-ởng thành [186] Trên tiêu bản nhiễm sắc thể khổng lồ, d-ới tác dụng của thuốc nhuộm đặc tr-ng chỉ có phần đồng nhiễm của nhiễm sắc thể X và 4 vai nhiễm sắc thể th-ờng đ-ợc quan sát thấy Sơ đồ và trình tự các băng trên mỗi vai nhiễm sắc thể khổng lồ là tiêu chuẩn để nhận diện đặc điểm của các loài hay cá thể

Sự khác biệt nổi trội giữa các loài là sự sắp xếp lại các đảo đoạn gần tâm trên nhiễm sắc thể [211]

Danh pháp các vai nhiễm sắc thể của Anopheles đ-ợc chuẩn hoá bởi Green và

Hunt (1980) Toàn bộ bộ nhiễm sắc thể khổng lồ gồm 3 cặp tiếp hợp: 1 cặp nhiễm sắc thể giới tính ngắn nhất (nhiễm sắc thể số 1) và 2 cặp nhiễm sắc thể th-ờng dài hơn, chia làm 4 vai: 2R/2; 2L/3; 3R/4; 3L/5 Green và Hunt (1980) đã xây dựng bản

đồ nhiễm sắc thể khổng lồ chuẩn của An funetus và nhận thấy có 10 đảo đoạn không cố định (ngẫu nhiên) Các tác giả nhận thấy An parensis khác với An funetus

bởi các đảo đoạn cố định trên vai 2, 3 và 1 trao đổi đoạn ngẫu nhiên trên vai 2 Dựa vào sự khác nhau giữa các băng, đặc biệt trên nhiễm sắc thể khổng lồ, 6

loài đồng hình trong phức hợp loài An gambiae ở châu Phi đã phân biệt đ-ợc

(Coluzzi, Sabatini 1967, 1968, 1969) ( theo WHO,1975 ) [218]

Khi nghiên cứu An culicifacies tại một làng nhỏ gần Delhi, Green và Miles

(1980) đã phát hiện thấy 23 mẫu đồng hợp tử nhiễm sắc thể chuẩn và 3 mẫu đồng hợp tử có trao đổi đoạn trên nhiễm sắc thể X Sự vắng mặt dạng dị hợp tử có trao đổi

đoạn đã chứng minh sự tồn tại của 2 loài sinh học (loài A và loài B) ở vùng này

Trên đối t-ợng An dirus ở Đông Nam á, V Baimai đ-a ra kết luận: An dirus

B và C là đơn hình trật tự băng trên nhiễm sắc thể khổng lồ ở tuyến n-ớc bọt; An dirus A có sự đa hình trao đổi đoạn tâm cận trên nhiễm sắc thể X ở một số quần

thể

Sự sắp xếp các loại băng trên nhiễm sắc thể X (Xa) ở An dirus A cũng thấy xuất hiện ở An dirus D Chứng tỏ An dirus A và D có chung trao đổi đoạn trên

nhiễm sắc thể Xa

Bên cạnh đó, ở An dirus D tồn tại sự đa hình nhiễm sắc thể với 4 trao đổi đoạn

tâm cận ở tất cả các nhiễm sắc thể th-ờng [33]

Vào năm 1987, Kaisen và Seawright đã cung cấp bản đồ nhiễm sắc thể khổng

lồ ở tế bào nuôi trứng của An quandrimaculatus

ở Việt Nam, nghiên cứu di truyền tế bào bắt đầu muộn hơn so với thế giới

Vào những năm 80 của thế kỷ 20, đối t-ợng Aedes aegypti đ-ợc nghiên cứu tại

phòng thí nghiệm của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng và Côn trùng và phòng thí nghiệm của bộ môn Di truyền học, khoa Sinh học, tr-ờng Đại học Tổng hợp Hà Nội Kết quả đã thăm dò đ-ợc các liều l-ợng phóng xạ và liều l-ợng chiếu xạ thích hợp,

phân lập đ-ợc một số dòng chuyển đoạn và nghiên cứu sử dụng chất gây đột biến ở

muỗi Aedes aegypti

An sinensis là đối t-ợng muỗi sốt rét đầu tiên đ-ợc nghiên cứu về di truyền tế

bào tại Việt Nam Chiều dài các nhiễm sắc thể đã đ-ợc xác định chính xác Bộ

nhiễm sắc thể khổng lồ và quá trình giảm phân ở An sinensis đã đ-ợc quan sát, mô

di truyền tế bào và có thể xem đây là kiểu nhân chuẩn của loài An minimus Việt

Nam, làm cơ sở để so sánh với các kiểu nhân khác phát hiện ở nơi khác [15]

Trên đối t-ợng An jeyporiensis ở Hoà Bình, Phạm Văn Lập, Lê Văn Sơn (1992) đ-a ra nhận định: Kiểu nhân An jeyporiensis Hoà Bình là kiểu nhân

maculipennis điển hình, hình dạng và kích th-ớc của các nhiễm sắc thể trong bộ đã

đ-ợc mô tả, ch-a phát hiện thấy sự đa hình nhiễm sắc thể hay kiểu nhiễm sắc thể khác biệt ở địa bàn nghiên cứu [15]

Nghiên cứu của Phạm Văn Lập (1993) đã chỉ ra có hiện t-ợng đa hình về

nhiễm sắc thể giới tính tồn tại trong loài An minimus, có ít nhất 4 loại nhiễm sắc thể

X và 3 loại nhiễm sắc thể Y đã đ-ợc phát hiện Theo tác giả: nhiễm sắc thể X1 là phổ biến nhất và X2, X3, X4 xuất hiện từ X1 do bị mất đi một phần nhánh dài Riêng

sự hình thành X4 cần có thêm một đảo đoạn mang tâm, dẫn đến sự biến mất của vùng dị nhiễm sắc khỏi nhánh ngắn Y1 phổ biến nhất, Y2, Y3 có thể đ-ợc hình thành từ Y1 do mất đoạn nhiễm sắc thể trên nhánh dài

Bản đồ nhiễm sắc thể khổng lồ An minimus cũng đã đ-ợc nghiên cứu Nó gồm

5 nhánh: vai ngắn nhất là nhiễm sắc thể X, dài nhất là 2R Các nhánh 2L, 3R và 3L

có kích th-ớc xấp xỉ bằng nhau Nhiễm sắc thể X chia làm 6 vùng

Qua sự nghiên cứu nhiễm sắc thể các loài đồng hình trong phức hệ An maculipennis, Frizzi (1947, 1948, 1957, 1959) đã rút ra đ-ợc 4 -u điểm chính khi sử

dụng di truyền tế bào Sau đó, nó đ-ợc ứng dụng trong nghiên cứu muỗi Anopheles

trên nhiều lĩnh vực

Mỗi loài có một bộ nhiễm sắc thể đặc tr-ng cho riêng mình Các loài đồng hình với nhau cũng có sự khác nhau về các đặc điểm hình dạng của nhiễm sắc thể Mức độ khác biệt phụ thuộc vào mối quan hệ gần gũi giữa chúng Dựa vào các đặc

điểm sai khác đó, có thể phân biệt đ-ợc chính xác các loài đồng hình

Di truyền tế bào còn đ-ợc áp dụng trong việc nghiên cứu sự t-ơng quan giữa

áp lực chọn lọc và tần số đảo đoạn của nhiễm sắc thể

1.2.3 Đại c-ơng về PCR và ứng dụng trong nghiên cứu đa hình di truyền

ở muỗi

Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction- PCR)

Kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR) đ-ợc K.B Mullis phát minh năm

1985 Đây là ph-ơng pháp in vitro để nhân nhanh một đoạn ADN nào đó với sự xúc tác của enzym ADN polymerase bằng việc kéo dài các mồi oligonucleotit (primer)

bổ trợ với đầu 3’ của đoạn ADN kép cần được tổng hợp

Kỹ thuật PCR có những ứng dụng hết sức rộng rãi, một trong những lĩnh vực

áp dụng kỹ thuật này hết sức hiệu quả là nghiên cứu tiến hoá ở mức độ phân tử, xác

định chính xác quan hệ tiến hoá của các loài

Kỹ thuật PCR có một -u thế nổi bật so với các ph-ơng pháp tr-ớc đây là nó có thể phân biệt đ-ợc các loài dựa vào những đoạn trình tự ADN đặc tr-ng mà ở đó các loài muỗi chỉ có những khác biệt rất nhỏ ở một vài cặp bazơ nitơ Số l-ợng các họ ADN lặp lại khác nhau trong hệ gen của muỗi là một mục tiêu tốt để sử dụng trong phân loại Những họ ADN lặp lại này rất phổ biến ở hệ gen ty thể, lạp thể những hệ gen nhân có sự lặp lại nh- trong histon, gen 5S ARN, và ARN của ribosome (rRNA) ADN ribosome (rDNA) mã hoá rRNA cũng là một trong những mục tiêu tốt Cả rRNA và các gen gốc mã hoá nó đều có tính bảo thủ rất cao (bền vững, đặc tr-ng), do đó rRNA đ-ợc sử dụng nh- là một công cụ quan trọng trong nghiên cứu

hệ thống học nhất là nghiên cứu phân loại Có những vùng của rRNA có những biến

đổi thậm chí là giữa các loài có quan hệ gần gũi với nhau Những vùng có nhiều biến đổi th-ờng tập trung ở các khoảng trình tự trống (không mã hoá), đây là nguồn

cung cấp các công cụ hữu hiệu nhất cho cả việc phân loại các loài và xác định mối quan hệ họ hàng giữa các loài gần gũi nhau [62]

Những đoạn trình tự sao chép lặp lại cách nhau bởi các vùng đệm nội gen (intergenic spaces-IGS) và nối tiếp nhau thành một dãy dài Một đơn vị sao chép cơ bản bao gồm vùng mã hoá các tiểu đơn vị rRNA (ở côn trùng là 3 tiểu đơn vị 18S; 5,8S và 28S) và một vài vùng phụ (vùng sao chép bên ngoài-external transcribed spacer, EST và 2 vùng sao chép bên trong-internal transcribed space ITS1 và ITS2)

là những vùng ch-a biết rõ chức năng

Các loài riêng biệt khác nhau ở trình tự ADN ribosome có thể dễ đàng phát hiện nhờ phản ứng PCR bằng thiết kế ra các mồi có thể gắn vào và nhân lên một sản phẩm đặc tr-ng từ ADN khuôn Cách đơn giản nhất là tạo ra các mồi đặc hiệu để phân biệt các loài

Một thí nghiệm thiết kế mồi dựa có thể gắn vào đoạn trình tự ở đầu 5’ của

đoạn IGS đã đ-ợc tiến hành để phân biệt các loài trong phức hợp Anopheles gambiae [175] Phản ứng PCR sử dụng 5 mồi khác nhau: một mồi chung gắn vào

đoạn trình tự ở đầu 5’ của đoạn IGS có thể phát hiện ra tất cả các loài trong phức hợp và 4 mồi nhỏ, mỗi một mồi đặc tr-ng cho một loài trong phức hợp (có một mồi

có thể phát hiện đ-ợc 2 loài là Anopheles merus và Anopheles melas, là những loài

không trùng vùng phân bố) Quá trình kéo của mồi chỉ xảy ra ở đầu các mồi nhỏ đó

là các mồi gắn vào những vị trí đặc tr-ng và tạo ra những đoạn ADN có chiều dài

đặc tr-ng cho từng loài

Ph-ơng pháp này đã đ-ợc thử nghiệm với các mẫu đ-ợc thu từ thực địa và nó phù hợp hoàn toàn (100%) với các kỹ thuật khác đ-ợc dùng nh- Southern blot

(Taylor et al, 1993), phân tích di truyền tế bào (Fontenille et al, 1993) và phân tích

điện di izozym (Paskewitz et al, 1993) Mức độ biến đổi của vùng IGS càng cao thì

tính đặc hiệu để phân loại các loài càng tốt Tuy nhiên, độ dài chung và độ dài của

đoạn IGS làm cho vùng này rất khó đ-ợc nhân bản bằng kỹ thuật PCR hiện nay Do

đó hiện nay ng-ời ta sử dụng phổ biến mồi đ-ợc thiết kế để nhân đoạn ADN ngắn hơn và nói chung ít đa hình hơn là trình tự ITS

Để phân biệt các loài trong phức hợp Anopheles gambiae phản ứng PCR cũng

đ-ợc thiết kế t-ơng tự nh- với mồi IGS

Vùng ITS2 đại diện cho các loài Anopheles ở phân giống Cellia, Anopheles và Nyssorhynchus đã đ-ợc thử nghiệm theo cách trên [85, 144, 150]

Thông tin thu đ-ợc từ những thử nghiệm trên đã phát hiện ra 2 điểm đặc biệt

quan trọng của vùng ITS2 ở muỗi Anopheles là mục tiêu để phát triển kỹ thuật PCR

phân loại các loài Đầu tiên là, những vùng này t-ơng đối ngắn (th-ờnng ngắn hơn 1kb) sản phẩm PCR nhân bản là vùng xen giữa ITS2 và vùng rìa Vùng trình tự ITS2

ngắn hơn đ-ợc tìm thấy ở An hermsi (305 bp) trong khi đó tìm thấy vùng ITS2 dài hơn (khoảng 700 bp) ở một số loài trong phức hợp An farauti Hơn nữa, những biến

đổi trong loài của vùng ITS2 thấp hơn những biến đổi giữa các loài, điều này cho phép phát triển phản ứng PCR chẩn đoán dựa vào vùng này Ví dụ, chỉ có một biến

đổi đ-ợc quan sát thấy trong 9 dòng ITS2 khác nhau đ-ợc thu thập từ 4 quần thể địa

lý của An freeborni [150] Mức độ biến đổi trong loài thấp nh- vậy cũng đ-ợc quan sát thấy ở trình tự ITS2 của các loài trong phức hợp An quandrimaculatus [62] Trong phức hợp An gambiae, mức độ biến đổi trong loài của vùng ITS2 biến đổi từ 0,07% ở An arabiensis đến 0,43% ở An gambiae trong khi đó biến đổi giữa các loài biến đổi từ 0,4 đến 1,6% [145] Mặt khác Frizt et al, (1994) [85] đã nhận thấy

độ dài đoạn ITS2 biến đổi tới 2% ở vùng có các nucleotide đôi lặp lại ở các quần thể

địa lý khác nhau của An.nuneztovari vùng Nam Mỹ Những quần thể này có biểu

hiện đặc điểm của những loài đồng hình hơn là những quần thể địa lý

Năm 1993 Scott [175] đã thiết kế ra 5 mồi để định loại các loài trong nhóm

loài đồng hình An gambiae trong đó có 1 mồi chung cho tất cả các loài và 4 mồi để

phân biệt 4 loài trong phức hợp Độ dài của đoạn nucleotid đ-ợc nhân bản giữa mồi

chung và mỗi đặc tr-ng cho các loài nh- sau: 153 nucleotid cho An quandriannulatus; 315 nucleotid cho An arabiensis và 464 nucleotid, 466 nucleotid cho An merus và An melas Hai loài sau, không cùng vùng phân bố, sử dụng cùng một mồi để phân loại nh-ng đoạn ADN đặc tr-ng cho An merus dài hơn An melas

2 nucleotid

Năm 1997, Jian Nong Xu và Feng Yi Qu [191] đã tiến hành kỹ thuật PCR

chẩn đoán để phân loại 2 loài An dirus trong phức hợp An dirus ở Trung Quốc dựa

vào sự khác nhau của đoạn trình tự ITS2 và nhận thấy rằng: trình tự của đoạn ITS2 ở

2 loài An dirus ở Trung Quốc (loài A ở đảo Hải Nam và loài D ở Vân Nam) có sự

khác biệt Đoạn trình tự ITS2 của hai loài A và D có chiều dài t-ơng ứng là 716

nucleotid và 710 nucleotid, dài hơn đoạn trình tự này ở phức hợp An punctulatus (khoảng 650 nucleotid), An gambiae (426 nucleotid), phức hợp An nuneztovari (363-369 nucleotid), phức hợp An quadrimaculatus (287-329 nucleotid) Tỷ lệ GC của vùng ITS2 ở An dirus chiếm 69% cao hơn ở các loài đã đ-ợc ghi nhận tr-ớc đó (50-60%) ở những phức hợp loài Anopheles đ-ợc nghiên cứu tr-ớc đó mức độ khác nhau về trình tự ADN giữa các loài trong cùng phức hợp khoảng 0,4-1,6% ở An gambiae đến 18,5-28,7% ở An quadrimaculatus Sự khác nhau giữa hai loài An dirus A và D là 5,4% giống với sự khác biệt ở hai loài đồng hình An freeborni và An.hermsi (4,9%) trong phức hợp An maculipennis Jian Nong Xu và Feng Yi Qu

đã tập trung vào nghiên cứu sự khác nhau về trình tự của đoạn ITS2 giữa 2 loài An dirus Tỷ lệ khác biệt giữa 2 loài của đoạn ITS2 là 5,4% trong khi đó tỷ lệ biến đổi

trong loài D là 0,14% Dựa vào sự khác biệt trình tự ITS2 giữa 2 loài này đã phát triển một kỹ thuật ADN chẩn đoán để phân biệt 2 loài: nhân bản các đoạn gen đặc biệt có tính chất bảo thủ và có sự khác biệt giữa 2 loài dựa vào 3 mồi (một mồi chung và 2 mồi riêng sử dụng cho 2 loài) Kết quả thu đ-ợc đoạn ADN đặc tr-ng cho loài A có kích th-ớc 374 nucleotid và loài D là 663 nucleotid

Ma Yajun, Qu Fengyi, Xu Jiannong và Zheng Zheming (1998) [126] đã nghiên cứu sự khác biệt trình tự của đoạn ITS2 và dựa trên đó để xây dựng kỹ thuật

PCR chẩn đoán phân biệt An sinensis và An anthropopharus ở Trung Quốc Các tác giả đã nhận thấy: đoạn gen đ-ợc nhân bản ở An sinensis và An anthropophagus

có chiều dài t-ơng ứng là 563 đôi bazơ nitơ (bp) và 547 bp Trong đó chiều dài đoạn mã hoá tiểu đơn vị 5,8S và 28S là 73 bp và 22bp Chiều dài của đoạn ITS2 là 468 bp

ở An sinensis và 452 bp ở An anthropophagus Tỷ lệ GC trong vùng ITS2 ở An sinensis là 44,8% và ở An anthropophagus là 49,2% Tỷ lệ khác biệt về trình tự

đoạn ITS2 ở hai loài là 28,8% Tỷ lệ biến đổi trong loài là 0,22% Dựa trên sự khác biệt về trình tự ITS2 đã thiết kế ra mồi để sử dụng trong PCR chẩn đoán, đoạn nhân

bản có chiều dài 425 bp ở An sinensis và ở An anthropophagus là 253 bp

Elizabeth P Torres, Desmond H Foley, và Allan Saul (2000) đã nhận thấy

đoạn trình tự ITS2 và D3 có thể dùng để phân biệt hai loài An dispar và An.greeni trong phức hợp loài An maculatus ở Philippine Đoạn ITS2 ở An dispar và

An.greeni có chiều dài t-ơng ứng là 320 bp và 318 bp có 13 biến đổi giữa các loài

Tỷ lệ GC là t-ơng đ-ơng nhau (60 và 59%) Đoạn D3 ở cả hai loài có kích th-ớc

367 bp có 9 (2,5%) biến đổi giữa các loài, không ghi nhận đ-ợc những biến đổi giữa các loài và tỷ lệ GC cũng t-ơng đ-ơng nhau (59,4 và 58,5%) [195]

Sự khác nhau về trình tự của đoạn ITS2 của các thành viên trong phức hợp An hyrcanus ở Hàn Quốc đã đ-ợc Ma Ya-jun, Qu Feng-yi và Song Guan-hong (2000) ghi nhận nh- sau: chiều dài của đoạn ITS2 ở An sinensis là 468 bp; 451 bp ở An lesteri và 453 ở An yatsushiroensis Tỷ lệ GC trong vùng ITS2 t-ơng ứng là

44,87%, 46,2%, 45,7% Sự khác biệt trình tự các nucleotid trong đoạn này là từ 12,16% đến 30,97% Những biến đổi về trình tự trong đoạn ITS2 giữa các loài xảy

ra theo 4 h-ớng khác nhau: chèn thêm, loại bỏ, đảo vị trí và đảo đoạn Tỷ lệ khác

biệt giữa An sinensis và An lesteri là 12,6; giữa An sinensis và An yatsushiroensis là: 30,74%; giữa An lesteri và An yatsushiroensis là 29,96% Biến đổi trong loài chỉ ghi nhận đ-ợc ở An yatsushiroensis

Năm 2002, nhóm loài An funestus cũng đã đ-ợc Koekemoer, L Kamau, R H

Hunt và M Coetzee phân loại bằng ph-ơng pháp PCR Sau khi nhân bản đoạn ITS2

của nhóm loài này có chiều dài sản phẩm PCR nh- sau: An funestus: 704 bp; An vaneedeni: 681 bp; An leesoni: 398 bp; An rivulium: 380 bp; và An parensis: 463

bp [117]

Một nghiên cứu t-ơng tự đã đ-ợc tiến hành với nhóm An funetus ở Cameroon (2003), Anna Cohuet, Frederic Simard và những ng-ời khác, đã thu đ-ợc những kết

quả giống với nghiên cứu trên ngoài ra nhóm còn thiết kế thêm một mồi cho dạng

giống nh- An rivulium có kích th-ớc của sản phẩm PCR là 313 bp

Cùng một ph-ơng pháp nghiên cứu này, các tác giả Helge Kampen, Anja

Sternberf và những ng-ời khác (2003) [97], đã phân biệt đ-ợc 2 loài đồng hình An claviger và An petragnati

Một dạng ADN đ-ợc sử dụng nhiều trong nghiên cứu muỗi sốt rét là ADN ở

hệ gen ty thể Hệ gen ty thể th-ờng xuyên đ-ợc sử dụng để nghiên cứu chủng loại

phát sinh và di truyền quần thể Trình tự và cấu trúc hệ gen ty thể của An gambiae

đã đ-ợc công bố hơn một thập kỷ tr-ớc [38] Những thông tin này nhanh chóng

đ-ợc sử dụng trong những nghiên cứu trên thực địa cũng nh- trong phòng thí nghiệm dựa vào cả những đoạn có mã hoá (nh- tiểu phần NADH dehydrogenase (ND5) và tiểu phần I, II của cytochrome oxidase (COI và COII)) và không mã hoá (nh- tiểu phần 12 S và16 S RNAs) th-ờng là những gen đích cho các nghiên cứu này

Rất nhiều các nghiên cứu đã sử dụng ADN ty thể để đ-a ra các cây chủng loại

phát sinh của An gambiae s.l để trả lời các câu hỏi về cấu trúc di truyền của các

thành viên trong phức hợp loài này [44, 50, 119, 191] Những nghiên cứu về lịch sử tiến hoá phức tạp của nhóm loài này vẫn còn đang tiếp tục Sự thiếu hụt các số liệu

về ty thể giữa các quần thể và các loài trong phức hợp đã đ-a tới kết luận có sự trao

đổi dòng gen trong một vùng địa lý rộng lớn và vẫn đang có quá trình trao đổi gen giữa các loài trong phức hợp Mặc dù kết luận này là phù hợp với các số liệu về gen

ty thể thu đ-ợc từ An gambiae s.l nh-ng những số liệu thu đ-ợc từ các chỉ thị di

truyền khác của phức hợp loài này (nh- vi vệ tinh và rADN) lại cho kết luận trái ng-ợc hẳn

ADN ty thể cũng đ-ợc sử dụng t-ơng tự để phát hiện những biến đổi lớn ở

muỗi Anopheles và các phức hợp loài Anopheles Foley et al, (1998) đã sử dụng gen COII để đ-a ra cây chủng loại phát sinh của muỗi Anopheles ở úc [81] De Merida

et al, (1999) [72] cũng sử dụng ADN ty thể (ND5) và phân tích đa hình cấu trúc sợi

đơn SSCP để nghiên cứu cấu trúc quần thể của An albimanus Fairley et al, (2000)

[77] sử dụng một đoạn gen COI để tìm hiểu cấu trúc di truyền và trao đổi giòng gen

giữa các quần thể Anopheles punctipennis ở Vermont Nghiên cứu này tìm thấy có

sự khác biệt đáng tin cậy về sự đa hình di truyền trong một quần thể cũng nh- cấu trúc di truyền giữa các quần thể với nhau Điều này có thể giải thích, ít nhất là một phần sự thay đổi bất th-ờng về kích cỡ của các quần thể và các giới hạn của việc trao đổi dòng gen Ngoài ra bằng cách nghiên cứu nhiều đoạn khác nhau trên hệ gen

ty thể, ta có thể sử dụng toàn bộ hệ gen này để nghiên cứu về quần thể Conn (1999)

[65] sử dụng ph-ơng pháp RFLP để phân tích ADN ty thể của Anopheles darlingi để

chứng minh rằng các quần thể này bị cách ly theo khoảng cách địa lý và những sự cách ly này cho phép chúng ta quan sát đ-ợc sự thay đổi kiểu hình trong loài Trong những ví dụ này, ADN ty thể đ-ợc chứng minh là rất hữu ích cho việc nghiên cứu về

phát sinh chủng loại và cấu trúc quần thể ở một vùng địa lý rộng lớn, nh-ng điều

này không đúng cho tất cả các loài Anopheles (ví dụ An gambiae s.l nh- đã nêu ở

trên) ADN ty thể cũng thất bại khi sử dụng để phân biệt các loài đồng hình trong

phức hợp An maculipennis [62]

Kỹ thuật RAPD-PCR và ứng dụng RAPD- PCR trong nghiên cứu đa hình ở muỗi

Vào đầu thập kỷ 90 của thế kỷ tr-ớc, một kỹ thuật mới ra đời đó là RAPD (random amplified polymorphic DNA- tính đa hình các đoạn ADN đ-ợc nhân bản ngẫu nhiên) Kỹ thuật này vẫn dựa trên những nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR, tuy nhiên mồi đ-ợc sử dụng trong phản ứng là một mồi oligonucleotit đơn kích th-ớc từ khoảng 6-10 nucleotit có trình tự ngẫu nhiên

Sự đa hình ở các sản phẩm RAPD là do sự thay đổi điểm gắn mồi trên phân

tử ADN hệ gen Nguyên nhân của hiện t-ợng này là do các đột biến gen (đột biến

điểm) hoặc đột biến nhiễm sắc thể (mất, đảo hay thêm đoạn) dẫn đến việc thay đổi

về trình tự các nucleotit trên ADN Do vậy việc nhân bản ADN có sự khác nhau

Chỉ thị RAPD th-ờng đ-ợc dùng để phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các quần thể, loài sinh vật

Đã có rất nhiều bài báo về việc sử dụng RAPD-PCR để phân loại dựa trên sự

đa hình của các đoạn ADN (Williams et al, 1990) [216] Hầu hết đều tập trung vào

việc trả lời những câu hỏi có liên quan đến sự biến đổi di truyền của các quần thể

côn trùng bao gồm những nghiên cứu về muỗi (Kambhampati et al, 1992) [108], rệp (Black et al, 1992) [46], ruồi trắng (Gawel và Bartlett, 1993), ruồi quả (Haymer

và Mclnnis, 1994) Năm 1994, Haymer đã đ-a ra danh sách 55 mồi RAPD th-ờng

đ-ợc sử dụng trong nghiên cứu côn trùng

Wilkerson et al, (1993) [215] đã sử dụng 57 mồi trong kỹ thuật RAPD-PCR

để phân biệt 2 loài muỗi đồng hình trong phức hợp Anopheles gambiae là An gambiae và An arabiensis Kết quả thu đ-ợc 377 băng điện di, trong đó có 295

băng thể hiện sự khác biệt giữa 2 loài Dựa vào những kết quả ban đầu đó, các tác giả đã lựa chọn ra 15 mồi có sự khác biết rõ rệt nhất để tiến hành những nghiên cứu sâu hơn, và chọn ra 7 mồi làm mồi chẩn đoán để phân biệt 2 loài này

Một phức hợp loài đồng hình đ-ợc coi là trung gian truyền bệnh chính ở

châu á là An dirus cũng đ-ợc Sylvie Manguin và những ng-ời khác (2002) [129]

phân biệt nhờ sử dụng kỹ thuật RAPD Tổng số đã thử nghiệm 46 mồi (mỗi mồi có chiều dài 10 nucleotid), 42 mồi RAPD và 4 mồi microsatellites Trong số 46 mồi,

có 9 mồi (20%) có băng đẹp, tuy nhiên chỉ có 4 mồi (9%) thể hiện sự đa hình giữa các loài A, B, C và D Trong số 37 mồi còn lại, 31 mồi (67%) có tạo thành băng, nh-ng vạch không rõ nét và 6 mồi (13%) không có sự nhân bản gen

Bốn mồi RAPD có -u điểm nhất (A5, F6, F8, P14) đ-ợc lựa chọn để nghiên

cứu số l-ợng mẫu lớn hơn (63 mẫu An dirus A, 4 mẫu An dirus B, 20 mẫu An dirus C và 8 mẫu An dirus D) Với mồi A5 tạo ra 2 băng đặc tr-ng ở loài An dirus

A có độ lớn là 1620 bp và 1450 bp, ở các loài An dirus B, C và D có một băng với chiều dài t-ơng ứng là 290 bp, 700 bp và 880 bp Với mồi F6 tất cả các loài An dirus A, B, C và D đều có 1 băng có độ dài là 700 bp, 1014bp, 720 bp và 850 bp

Mồi F8 nhân bản 1 băng ở loài A và C với độ dài 1300 bp và 890 bp, loài B và D mồi loài có 2 băng: loài B là 1350 và 1830 bp; loài D là 1530 bp và 1300 bp ở mồi P14 ở loài A và C chỉ có một băng đặc tr-ng t-ơng ứng 950 bp và 600 bp; còn ở loài B có 3 băng (500 bp, 350 bp và 250 bp); loài D có 2 băng (1070 bp và 420 bp)

Năm trăm năm m-ơi t- mồi oligonucleotit đã đ-ợc dùng để phân tích tính đa

hình của 119 mẫu ADN của 3 quần thể muỗi Anopheles nuneztovari ở Colombia,

104 mồi không tạo sản phẩm, còn lại 440 mồi thể hiện sự đa hình trong đó 10 mồi tạo sản phẩm các băng đa hình cao với tổng số 65 băng ở 3 quần thể nghiên cứu, tần số các băng lựa chọn biến thiên từ 7- 92% Các băng đa hình có kích th-ớc từ 396- 1782 cặp bazơnitơ

Tiến hành nghiên cứu trên 3 dạng Anopheles gambiae khác nhau về kiểu nhiễm sắc thể, Guido Favia et al, (1997) [78] chỉ ra rằng: 4 mồi RAPD là T1, T2,

T3, T4 đều cho sự đa hình cao và cho phép phân biệt đ-ợc 3 dạng muỗi này với nhau

Nghiên cứu đa hình di truyền của 4 loài đồng hình trong phức hợp Anopheles albitaris ở Paraguay, Argentina và Brazil, các tác giả đ-a ra nhận định sau: trong số

65 mồi RAPD (có chiều dài 10 nucleotit) thì 12 mồi tạo ra 19 băng đa hình có thể dùng để phân biệt giữa các loài và 4 băng đa hình để phân biệt 2 cặp loài một.[42]

Đại c-ơng về PCR- RFLP và ứng dụng PCR- RFLP trong nghiên cứu đa hình muỗi

Phân tích chỉ thị PCR- RFLP dựa trên nguyên tắc đa hình vị trí giới hạn trong các phân đoạn ADN đ-ợc nhân bản bởi kỹ thuật PCR

Số l-ợng và kích th-ớc của các phân đoạn sẽ phản ánh sự phân bố của những

vị trí cắt trong phân tử ADN Sự hiện diện của các đoạn cắt này mang tính đặc tr-ng cho từng tổ hợp ADN/enzym giới hạn Vì thế có thể sử dụng những mảnh cắt nh- là các “dấu vân tay” đặc trưng cho từng phân tử ADN (hoặc đối với cơ thể mang phân

giới hạn về những biến đổi trong loài ở trình tự IGS trong phức hợp An gambiae,

nh-ng vùng trung gian này tồn tại cả tính đa hình trong loài và giữa các loài Phân loại bằng ph-ơng pháp RFLP cũng đang đ-ợc sử dụng để hoàn thiện bản đồ gen

của An gambiae (Kumar, 1999) ở Polynesia, RFLPs của trình tự đoạn ITS2 cũng

đang đ-ợc phát triển thành công cụ để phân biệt các thành viên của nhóm loài An punctulatus [39] Những chỉ thị này bây giờ đang đ-ợc sử dụng để nghiên cứu sự

phân bố của các loài trong nhóm này cũng nh- tính đa hình di truyền và đa dạng trong một đơn vị phân loại đơn [42]

Ph-ơng pháp PCR- RFLP lần đầu tiên đ-ợc sử dụng để phân biệt 2 loài trong

phức hợp An maculipennis ở Anh Thực chất phức hợp này ở Anh bao gồm 2 loài

An atropavus và An messeae Chúng có vùng phân bố xen kẽ nhau nh-ng An

messeae có xu h-ớng phân bố kéo dài lên trên phía Bắc hơn An atropavus là

loàtruyền bệnh chính ở nhiều vùng của Châu Âu Đoạn ADN đ-ợc nhân bản ở đây

là ITS2 và sau đó đ-ợc xử lý bằng enzym MspI Enzym này cắt đoạn ITS2 của An atropavus tại một điểm còn với An messeae tại 2 điểm

Các loài trong phức hợp loài An maculatus có thể nhận biết đ-ợc khi dùng enzym HaeII cắt đoạn ITS2: ở An dispari đoạn này đ-ợc cắt thành 2 phân đoạn nhỏ

có kích th-ớc là 173bp và 134bp, còn ở An greeni thì 2 đoạn này lại có chiều dài

263bp và 173bp [195]

Theo những nghiên cứu của G Favia et al, (1997), 3 dạng An gambiae s.s (có

kiểu nhiễm sắc thể khác nhau) đ-ợc phân biệt với nhau khi dùng 2 enzym giới hạn

Tru9I và HeaII phân cắt 1 đoạn ADN có kích th-ớc 1,3Kb (chứa phần mã hoá 28S

và 1 phần ITS) [78]

Trên đối t-ợng Anopheles funestus, các nhà khoa học đã dùng enzym MspI phân cắt vùng D3 tạo 2 dạng phổ băng M và W để nhận biết 3 nhóm trong loài An funestus Dạng M gồm mẫu thu thập ở Mandagascar, Kenya và Uganda Dạng W có

ở các mẫu vùng Tây- Trung Phi từ Senegal, Bờ Biển Ngà và Camơrun Dạng kết hợp

M và W thấy ở nhóm thứ 3 gồm các mẫu ở Angola, Malani, Mozambique và Nam Phi

Kỹ thuật sử dụng mẫu dò ADN (DNA - probe)

Cơ sở của mẫu dò là đặc tính bắt cặp bổ sung của axít nucleic Để phát hiện một trình tự xác định, ban đầu ta chỉ cần một bản sao trung thực của trình tự ấy, bản sao này đ-ợc đánh dấu để dễ nhận biết và đ-ợc gọi là mẫu dò Qua sự lai dò với trình tự bổ sung, ta có thể phát hiện, định vị đ-ợc trình tự ấy trong bất kỳ hỗn hợp axít nucleic nào

Một trong những ph-ơng pháp sử dụng mẫu dò để phân loại đ-ợc sử dụng phổ biến nhất là ph-ơng pháp Southern Blot

Southern Blot dựa trên khả năng giữ lại các đoạn ADN đã qua xử lý enzym giới hạn trên một màng mỏng đặc biệt (th-ờng là hybond-N) Màng mỏng này sau

đó đ-ợc ngâm trong dung dịch chứa gen đã cho ở dạng có đánh dấu (th-ờng là P32)

Nếu có mặt gen đã cho trong ADN trải trên màng mỏng thì các đoạn ADN của cùng gen sẽ bắt cặp (lai) theo cơ chế bổ sung và nhận biết đ-ợc qua phóng xạ tự ghi Ph-ơng pháp sử dụng mẫu dò ADN là một ph-ơng pháp đơn giản để phân loại các loài là vectơ sốt rét

Ng-ời ta đã phát triển các mẫu dò ADN để phân loại các loài trong phức hợp

Anopheles gambiae, một phức hợp có những loài là vectơ sốt rét chính ở châu Phi

Sáu loài trong phức hợp này đã đ-ợc phân loại dựa vào tính bất hợp của các thành

viên đó là: Anopheles gambiae s.s, An arabiensis, An quadriannularis, An melas,

An merus và An bwambe Hai loài đầu là vectơ truyền sốt rét chính phân bố rộng

rãi khắp châu Phi Những sự khác biệt về trình tự ADN của các loài trong phức hợp

đ-ợc l-u giữ ở ngân hàng gen cho phép tạo ra các dòng mẫu dò ADN để có thể phân

biệt đ-ợc 5 trong 6 loài thuộc phức hợp Anopheles gambiae [63]

Kỹ thuật đa hình cấu tạo sợi đơn (Single strand conformational SSCP)

polymorphism-Kỹ thuật đa hình cấu tạo sợi đơn (SSCP) để phát hiện điểm đột biến trong các

sản phẩm của phản ứng PCR đ-ợc phát triển bởi Orita et al, (1989) [142] Điểm cơ

bản của kỹ thuật này là sản phẩm PCR đ-ợc làm nóng lên tới 950C để cho hai sợi

đơn tách nhau ra, sau đó làm lạnh đột ngột trên mặt đá, các sợi đơn sẽ tự cuộn lại, mức độ cuộn phụ thuộc vào trình tự ban đầu của sợi đơn Sự linh động của mỗi sợi ADN biến đổi theo cấu tạo ban đầu do đó khi điện di ta sẽ thu đ-ợc 2 băng ở những cá thể đồng hợp tử và 4 băng ở những cá thể dị hợp tử Mặc dù SSCP là một công cụ rất hữu dụng để phát hiện điểm đột biến nh-ng nó ít khi đ-ợc sử dụng để phân loại, công trình nghiên cứu SSCP đầu tiên để phân loại do Hiss và những ng-ời khác tiến hành năm 1994 [101]

Nh- trên đã nói có ít công trình nghiên cứu SSCP để phân loại, Sharpe et al, (1999) đã miêu tả kỹ thuật này để phân loại các loài thuộc series Myzomia là An aconitus, An varuna và An minimus [177]

Một -u điểm của ph-ơng pháp SSCP là hầu hết các thông tin của đoạn đ-ợc nhân bản đều đ-ợc sử dụng để phân tích Hayashi (1991) [96] cho rằng có thể phát hiện tới 99% đột biến một bazơ nitơ ở những sản phẩm PCR có kích th-ớc 100-300

bp và 89% đột biến ở những sản phẩm có kích th-ớc 300-450 bp Do đó có thể dễ dàng phân biệt các loài nhờ ph-ơng pháp này Hơn nữa, các cá thể lai có thể đ-ợc phát hiện nhờ sự xuất hiện của những băng trung gian (kết hợp) của bố và mẹ Điểm bất lợi của ph-ơng pháp này là yêu cầu phải điện di và nhuộm gel acrylamide sau phản ứng PCR

Kỹ thuật nhân bản một alen đặc biệt (Alene-specific amplification-ASA)

Kỹ thuật nhân bản alen đặc biệt (ASA) dựa vào một thực tế là Taq ADN polymerase không kéo dài những mồi không t-ơng thích với ADN khuôn (Ugozzoli

và Wallace, 1991) Do đó ng-ời ta có thể thiết kế ra những mồi chỉ bắt cặp với một alen nhất định và alen đó đặc tr-ng cho loài Vì phải thiết kế ra những mồi đặc biệt nh- vậy nên việc phải biết đ-ợc thông tin về trình tự ADN là một yêu cầu tối cần thiết của ph-ơng pháp này Lợi ích lớn nhất của ph-ơng pháp này so với ph-ơng pháp SSCP hay RFLP là quy trình kỹ thuật chỉ cần một phản ứng PCR đơn lẻ là ta có thể phân biệt đ-ợc các loài Nếu cần sử lý một số l-ợng mẫu lớn thì đây là một ph-ơng pháp hữu hiệu hơn bất cứ ph-ơng pháp nào khác

Ph-ơng pháp ASA đã đ-ợc Walton et al, (1999) [207], Manguin et al, (2002) [129] áp dụng để nghiên cứu phức hợp loài An dirus ở Thái Lan và Đông Nam á Bằng ph-ơng pháp này đã phân biệt đ-ợc 5 loài trong phức hợp loài An dirus, ở đây

dựa vào chiều dài của đoạn ADN đ-ợc nhân bản và trên băng điện di ta cũng có thể

nhận biết đ-ợc các cá thể lai Năm loài An dirus đó là An dirus A, B, C, D và F

Các mồi đặc biệt để phân biệt các loài đ-ợc thiết kế dựa trên trình tự của đoạn ITS2

Năm 1999, Sharp et al, cũng đã sử dụng ph-ơng pháp này để phân biệt các loài

trong series Myzomyia Họ đã thiết kế mồi dự trên đoạn trình tự D3, kết quả là có

thể phân biệt đ-ợc 2 loài An minimus A và C, cả hai loài đều có thể thu đ-ợc những

đoạn ADN có kích th-ớc khoảng 380 bp, sự khác biệt giữa 2 loài là 2 bp Ngoài ra

còn thu đ-ợc đoạn nhân bản có chiều dài 275 bp ở An minimus A và An minimus

C là 75 bp, còn đối với An varuna và An aconitus thì băng không đặc hiệu và nếu

có thì dễ nhầm lẫn với An minimus A [177]