Tổng hợp virút cúm mới từ virút cúm A H5N1 và A H3N2 bằng kỹ thuật di truyền ngược

Quy trình xây dựng hệ thống chuyển nhiễm plasmid có khả năng tạo virút cúm A và quy trình tổng hợp virút cúm mới từ virút cúm A/H5N1 và A/H3N2.. Các protein màng HA, NA M1 và M2 sẽ được

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS LÊ THỊ QUỲNH MAI

Nội - 2012

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG I DANH MỤC HÌNH II CÁC CHỮ VIẾT TẮT III

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Khái quát về virút cúm 3

1.2 Hệ gen của virút cúm A 4

1.3 Quá trình nhân lên của virút cúm A 9

1.4 Vai trò của hiện tượng trao đổi và tích hợp vật liệu di truyền trong các vụ đại dịch cúm trên thế giới 12

1.5 Ứng dụng kĩ thuật di truyền ngược tổng hợp virút cúm A 14

1.6 Cơ sở khoa học để thiết kế và thực hiện nghiên cứu 16

1.7 Vấn đề đạo đức và An toàn sinh học trong nghiên cứu 19

CHƯƠNG 2 - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Vật liệu nghiên cứu 20

2.2.1 Plasmid pHW2000 và hệ thống plasmid chứng dương 20

2.2.2 Sinh phẩm và hóa chất 21

2.2.3 Hệ thống cảm nhiễm virút cúm 25

2.2.4 Trang thiết bị và dụng cụ 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Lựa chọn chủng virút gốc 28

2.3.2 Chuẩn bị vector nhân dòng 28

2.3.3 Chuẩn bị ADN nhân dòng 28

2.3.4 Nhân dòng ADN đích vào plasmid pHW2000 30

2.3.5 Phản ứng xác định trình tự chuỗi nucleotide (sequence) 31

2.3.6 Chuẩn bị plasmid cho quá trình chuyển nhiễm 32

2.3.7 Chuyển nhiễm plasmid vào tế bào 33

2.3.8 Khuếch đại virút 33

2.3.9 Xác định hiệu giá virút 34

2.3.10 Xác định liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD50) 36

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 38

3.1 TỔNG HỢP VIRÚT CÚM MỚI TỪ VIRÚT A/H5N1 VÀ A/H3N2 38

3.1.1 Lựa chọn chủng virút gốc 39

3.1.1.1 Virút A/H5N1 39

3.1.1.2 Virút A/H3N2 39

3.1.2 Chuẩn bị vector nhân dòng và ADN đích 40

3.1.2.1 Chuẩn bị vector nhân dòng 40

3.1.2.2 Chuẩn bị ADN đích 41

3.1.3 Xây dựng hệ thống chuyển nhiễm plasmid tạo virút cúm 45

3.1.3.1 Nhân dòng ADN đích 45

3.1.3.2 Hệ thống chuyển nhiễm tám plasmid tổng hợp virút cúm rg-A/H5N1 50

3.1.4 Tổng hợp virút cúm rg-A/H5N1 từ hệ thống chuyển nhiễm plasmid 55

3.1.4.1.Tổng hợp virút cúm rg-A/H5N1 55

3.1.4.2 Hệ gen của virút cúm rg-A/H5N1 58

3.2 Tìm hiểu đặc tính của virút cúm rg-A/H5N1 (gia cầm – người) 61

3.2.1 Khả năng thích ứng của virút rg-A/H5N1 với tế bào MDCK và trứng gà

có phôi 61 3.2.2 Định lượng virút rg-A/H5N1 bằng kỹ thuật plaque (tạo đám hoại tử) 64 3.2.3 Khả năng gây bệnh của virút cúm rg-A/H5N1 trên động vật thí nghiệm

66

KẾT LUẬN 68

ĐỀ XUẤT 69

i

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các phân đoạn ARN và protein của virút cúm A 5

Bảng 2.1 Hệ thống mồi dùng khuếch đại các phân đoạn gen đích 22

Bảng 2.2 Hệ thống mồi dùng cho quá trình giải trình tự nucleotide 23

Bảng 3.1 Kết quả giải trình tự các đoạn ADN đích trước nhân dòng 44

Bảng 3.2 Kích thước các plasmid được kiểm tra 49

Bảng 3.3 Tám plasmid lựa chọn cho hệ thống chuyển nhiễm tạo virút cúm rg-A/H5N1 50

Bảng 3.4 Kết quả so sánh trình tự ADN đích sau nhân dòng với trình tự ADN đích trước nhân dòng 51

Bảng 3.5 Đánh giá chức năng mỗi plasmid trong hệ thống chuyển nhiễm 54

Bảng 3.6 Phát hiện virút rg-A/H5N1 tổng hợp từ hệ thống tám plasmid thông qua khả năng ngưng kết hồng cầu 56

Bảng 3.7 Mức độ tinh sạch mẫu ARN của virút rg-A/H5N1 58

Bảng 3.8 Nguồn gốc các phân đoạn gen của virút rg-A/H5N160 Bảng 3.9 Hiệu giá (HA) virút rg-A/H5N1 khuếch đại trên tế bào MDCK và trứng gà có phôi 62

Bảng 3.10 Định lượng virút rg-3 và rg-4 bằng kĩ thuật plaque 65

Bảng 3.11 Kết quả thí nghiệm xác định LD50 của virút rg-4 trên chuột Swiss 66

ii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Mô hình cấu trúc virion virút cúm 4

Hình 1.2 Chu trình nhân lên của virút cúm 10

Hình 1.3 Nguồn gốc các chủng virút cúm gây đại dịch 13

Hình 2.1 Mô hình cấu trúc vector pHW2000 21

Hình 2.2 Quy trình xây dựng hệ thống chuyển nhiễm plasmid có khả năng tạo virút cúm A và quy trình tổng hợp virút cúm mới từ virút cúm A/H5N1 và A/H3N2 27

Hình 3.1 Quy trình tổng hợp virút cúm mới rg-A/H5N1 từ virút cúm A/H5N1 và A/H3N2 bằng kỹ thuật di truyền ngược 38

Hình 3.2 Sự lưu hành các phân típ virút cúm mùa theo năm 40

Hình 3.3 Kiểm tra plasmid trên gel agarose 41

Hình 3.4 Tổng hợp ADN đích bằng PCR 42

Hình 3.5 Sản phẩm ADN đích sau tinh sạch 43

Hình 3.6 Xác định vi khuẩn chứa plasmid trên môi trường chọn lọc 46

Hình 3.7 Kiểm tra kích thước plasmid trên gel agarose 48

Hình 3.8 Kiểm tra mức độ tinh sạch mẫu ARN của virút rg-A/H5N1 59

Hình 3.9 Khả năng nhân lên của virút rg-A/H5N1 trong hệ thống cảm nhiễm 63

iii

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN DeoxyRibonucleic Acid

ARN Ribonucleic Acid

HA Haemagglutination Assay (Phương pháp ngưng kết hồng cầu)

HPAI Highly Pathogenic Avian Influenza (virút cúm gia cầm độc lực cao) MDCK Madin-Darby Canine Kidney Cells (tế bào thận chó thường trực)

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

PTN Phòng thí nghiệm

rg Reverse genetic (di truyền đảo ngược)

RNP Ribonucleoprotein (phức hệ ribonucleoprotein)

TCTTTG Tổ chức Y tế thế giới

TPCK L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone

vRNA ARN của virut

vRNP phức hệ ribonucleoprotein của virút

nguyên (antigenic shift) [3] do trao đổi và tích hợp di truyền (reassortment) giữa các

chủng virút cúm khác nhau Từ đầu thế kỷ XX đến nay đã có 5 đại dịch cúm được ghi nhận, trong đó 3 đại dịch (các năm 1957, 1968 và 2009) xảy ra do xuất hiện virut cúm mới nhờ hiện tượng trao đổi và tích hợp di truyền [2, 7, 14, 17, 25]

Trao đổi và tích hợp vật liệu di truyền (reassortment) là một trong những đặc điểm của virút cúm A Nhờ đó, khi có hai hay nhiều chủng virút, khác biệt về mặt di truyền, cùng lúc xâm nhiễm vào một tế bào sẽ tạo ra chủng virút mới có cấu trúc hệ gen pha trộn giữa hệ gen virút “bố” và “mẹ” chúng Virút mới (đặc tính kháng nguyên mới) sẽ kháng lại kháng thể đã được hình thành trong đáp ứng miễn dịch lần trước và

có khả năng lây nhiễm vào vật chủ mới mà chủng “bố - mẹ” chúng không có khả năng gây nhiễm Chủng virút mới có thể là nguyên nhân gây dịch / đại dịch cúm [3]

Ở Việt Nam, ngoài các phân típ virút cúm A lưu hành ở người theo mùa (A/H3N2, A/H1N1) đã ghi nhận nhiều bệnh nhân nhiễm virút cúm gia cầm độc lực cao H5N1 (HPAI H5N1) [10, 12] Sự xuất hiện virút cúm A/H5N1 thường xuyên trong đàn gia cầm cùng với tập quán chăn nuôi gia cầm tại hộ gia đình của người Việt Nam có thể sẽ làm tăng nguy cơ trao đổi và tích hợp di truyền giữa virút cúm gia cầm và virút cúm người Ngoài ra, tần suất thay đổi đặc tính kháng nguyên của virút cúm A/H3N2 (4 lần) nhiều hơn so với virút cúm A/H1N1 (2 lần) tại miền Bắc Việt nam (giai đoạn 2001-2008) [1,31], cho phép nghĩ đến khả năng dễ trao đổi và tích hợp giữa virút cúm A/H3N2 với virút cúm A khác khi có điều kiện thuận lợi

2

Trên cơ sở tiến bộ khoa học trong lĩnh vực sinh học phân tử, rất nhiều các phương pháp mới đã được áp dụng trong nghiên cứu virút cúm, một trong số đó là di truyền ngược (reverse genetic) Kỹ thuật di truyền ngược cho phép chủ động tổng hợp virút cúm có đặc điểm hệ gen mong muốn nhằm tìm hiểu khả năng xuất hiện trong tự nhiên, khả năng gây bệnh cho người của virut này, từ đó chủ động xây dựng các biện pháp phòng chống hữu hiệu Trên thế giới, di truyền ngược đã được áp dụng nhiều trong việc nghiên cứu độc lực virút cũng như phát triển vaccine cúm [30, 38, 45, 48, 51]

Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu:

“Tổng hợp virút cúm mới từ virút cúm A/H5N1 và A/H3N2 bằng kỹ thuật

di truyền ngƣợc”

với mục đích:

1 Xây dựng hệ thống chuyển nhiễm plasmid có khả năng tạo virút cúm A

2 Tổng hợp virút cúm mới từ virút cúm A/H5N1 (cúm gia cầm) và A/H3N2 (cúm người) bằng hệ thống chuyển nhiễm plasmid

3 Tìm hiểu đặc tính cơ bản của virút cúm mới

3

Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1 Khái quát về virút cúm

Đặc điểm chung

Họ Orthomyxoviridae gồm năm chi: virút cúm A, virút cúm B, virút cúm C,

virút Isa và virút Thogoto [21] Virút cúm A lưu hành phổ biến trên người, gia cầm, chim hoang dại và một số động vật khác như lợn, ngựa, hải cẩu…, là căn nguyên gây các đại dịch cúm trên toàn cầu Virút cúm B và C lưu hành chủ yếu ở người và thường chỉ gây nên các vụ dịch vừa và nhỏ

Virút cúm A được chia thành các phân típ (subtype) dựa trên hai glycoprotein

bề mặt là haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) HA được chia thành 16 phân típ (từ H1 đến H16) và NA được chia thành 9 phân típ (từ N1 đến N9) Các loài chim thủy sinh là ổ chứa tự nhiên của tất cả các phân típ virút cúm A Các phân típ gây bệnh cho người chủ yếu là H1, H2, H3 và N1, N2 [5]

Danh pháp quốc tế được quy định cho virút cúm gồm những thông tin sau: típ virút/viết tắt vật chủ (nếu là động vật)/nơi phân lập/mã số phòng thí nghiệm phân lập/năm phân lập Với virút cúm A, có thể bao gồm thêm thông tin về phân típ HA và

NA của chủng virút [53]

Ví dụ: A/swine/Taiwan/l/70 (H3N2)

B/EnglADN/5/66

C/Paris/l/67

Hình thái và cấu trúc virion virút cúm

Virion virút cúm đa hình, có thể hình cầu, hình trứng hoặc đôi khi có hình sợi kéo dài tới 2000 nm, đường kính trung bình từ 80-120 nm

có 2 gai glycoprotein là haemagglutinnin và neuraminidase

1.2 Hệ gen của virút cúm A

Hệ gen virút cúm A gồm tám phân đoạn ARN có chiều dài không giống nhau, đoạn ngắn nhất là 890 nucleotide (phân đoạn 8) và đoạn dài nhất là 2341 nucleotide (phân đoạn 1 và 2) Trên tám phân đoạn ARN của virút cúm đều có những trình tự nucleotide bảo tồn Đầu tận cùng của tất cả các đoạn ARN đều có chung một trình tự gồm 13 nucleotide ở đầu 5’ và một trình tự gồm 12 nucleotide ở đầu 3’ Hai vùng bảo tồn này có trình tự ngược nhau và bổ sung một phần cho nhau Đặc điểm này có vai trò trong quá trình phiên mã và sao chép ARN: polymerase có thể nhận biết trình tự bảo tồn ở đầu 3’của sợi ARN(-) và ở đầu 3’của sợi ARN(+) để khởi đầu quá trình tổng hợp Một trình tự phổ biến thứ ba có ở cả tám phân đoạn ARN là trình tự uridine cách đầu

6

Phân đoạn 1, 2 và 3: protein PB2, PB1, PB1-F2 và PA

Phân đoạn ARN 1, 2 và 3 mã hóa cho các protein PB2, PB1, PB1-F2 và PA Phân đoạn ARN 1 và 2 có chiều dài 2341 nucleotide Phân đoạn 1 mã hóa cho protein tương ứng gồm 759 axit amin; phân đoạn 2 mã hóa cho hai protein là PB1 gồm 757 axit amin và PB1-F2 (87 hoặc 90 axit amin) [8, 26] Phân đoạn 3 có chiều dài 2233

nucleotide và mã hóa cho protein gồm 716 axit amin Kết quả từ một số nghiên cứu in

vitro về quá trình phiên mã và sao chép ARN đã gợi ý rằng PB2 tham gia vào quá

trình tổng hợp ARN thông tin, gắn vào cấu trúc mũ của ARN thông tin của tế bào chủ; PA liên quan đến quá trình tổng hợp sợi ARN virút (vRNA); PB1 có vai trò khởi đầu quá trình sao chép; PB1-F2 làm chết các tế bào miễn dịch đáp ứng quá trình nhiễm virút [8]

Phân đoạn 4: Hemagglutinin (HA)

HA là một glycoprotein gắn trên màng virút, có vai trò trong quá trình hấp phụ

và xâm nhập vào tế bào của virút Tên gọi của protein này bắt nguồn từ khả năng ngưng kết hồng cầu bằng cách gắn vào glycoprotein đặc hiệu chứa acid neuraminic trên bề mặt tế bào hồng cầu HA là kháng nguyên virút quan trọng nhất chống lại các kháng thể trung hòa, sự thay đổi về tính kháng nguyên của HA là nhân tố tạo thành vụ dịch cúm Chuỗi polypeptide HA tiền thân (HA0) có thể tạo thành hai chuỗi polypeptide HA1 và HA2 nếu liên kết disµlfide bị cắt Sự phân cắt này không ảnh hưởng đến hoạt tính gắn vào thụ cảm thể mà ảnh hưởng đến quá trình dung hợp với màng tế bào để virút xâm nhập vào tế bào vật chủ HA1 chứa phần tận cùng N của HA, HA2 chứa phần tận cùng C, là vùng kị nước, gắn vào màng virút và có tính bảo tồn cao giữa các chủng virút HA2 được cho rằng có vai trò giúp virút xâm nhập vào tế bào

Phân đoạn ARN 4 dài 1765 nucleotide, HA1 gồm 328 axit amin, HA2 gồm 221 axit amin

7

Phân đoạn 5: protein nucleocapsid (NP)

Protein NP tương tác không chỉ với chính nó và ARN trong phức hệ nucleocapsid mà còn tương tác với các protein PB2, PB1 và PA để hình thành đơn vị sao chép Phân đoạn 5 có chiều dài 1565 nucleotidetide, chuỗi polypeptide gồm 498 axit amin Nucleoprotein có vai trò bảo vệ vRNA khỏi sự phân huỷ của các enzyme phân huỷ ribonucleotide (ribonuclease)

Phân đoạn 6: Neuraminidase (NA)

Phân đoạn 6 mã hóa cho neuraminidase - protein gắn màng Neuraminidase sẽ phân cắt liên kết glycosidic gắn với nhóm keto của acid N-acetylneuraminic (acid sialic) thành D-galactose hoặc D-galactosamine NA có dạng hình nấm, gồm 4 chuỗi polypeptide giống nhau, gắn với nhau bằng liên kết disµlfide

Trong quá trình nhân lên của virút, NA giúp giải phóng các hạt virút đang nảy chồi ra khỏi màng tế bào vật chủ NA có thể cũng giúp bộc lộ vị trí phân cắt của phân

tử HA Hoạt tính neuraminidase cũng cho phép virút tránh các sialoglycoprotein ức chế

có mặt trong đường hô hấp, cho phép virút tìm đường đến các tế bào biểu mô đích Kháng thể kháng NA không trung hòa hoạt tính lây nhiễm của virút mà hạn chế chu trình nhân lên của virút và làm suy giảm triệu chứng bệnh

Trình tự nucleotide của đoạn ARN 6, với phân típ N1 và N2, có chiều dài 1413 nucleotide, protein gồm 453 axit amin

Phân đoạn 7: protein M1 và M2

Phân đoạn 7 mã hóa cho hai protein là M1, M2 và có thể protein thứ ba là M3 Trong đó một phân tử được phiên mã trực tiếp từ đoạn ARN, hai phân tử còn lại là kết quả của quá trình chế biến nhờ bộ máy cắt ghép (splicing) ARN thông tin của tế bào chủ

Chiều dài của đoạn 7 là 1027 nucleotide Protein M1 gồm 252 axit amin, M2 gồm 97 axit amin

Phân đoạn 8: protein không cấu trúc NS1 và NS2

Phân đoạn ARN nhỏ nhất mã hóa cho 2 protein là NS1 và NS2 Trong tế bào chủ, NS1 được tạo thành với lượng lớn hơn, liên kết với polysome và hạch nhân Chức năng của NS1vẫn chưa rõ ràng, song người ta cho rằng có liên quan đến quá trình tổng hợp vRNA và đến việc ngừng tổng hợp protein của tế bào chủ NS2 được tổng hợp trong giai đoạn nhiễm muộn, tham gia vào quá trình vận chuyển các vRNP từ nhân ra

tế bào chất [43]

Đoạn ARN 8 dài 890 nucleotide, protein NS1 gồm 230 – 237 axit amin (phụ thuộc vào chủng virút), NS2 gồm 132 axit amin

9

1.3 Quá trình nhân lên của virút cúm A

Quá trình nhân lên của virút cúm A có thể chia thành các giai đoạn sau: (1) gắn màng và xâm nhập vào tế bào chủ, (2) phiên mã và sao chép ARN, (3) giải phóng vRNP ra khỏi nhân và (4) đóng gói, nảy chồi và giải phóng virút thế hệ mới [20, 24, 44]

(1) Gắn màng và xâm nhập vào tế bào chủ

Gai HA của virút sẽ phát hiện và liên kết với thụ cảm thể của nó trên bề mặt tế bào chủ Phân tử HA tiền thân, HA0, được tạo thành từ hai dưới đơn vị: HA1, có vùng gắn thụ cảm thể và HA2 có peptide dung hợp; HA1 và HA2 liên kết với nhau bằng liên kết disµlfide Thụ cảm thể của virút cúm là axit sialic liên kết với đường galactose của glycoprotein / glycolipid bằng liên kết alpha 2,6 (virút cúm người) hoặc alpha 2,3 (virút cúm gia cầm) Hai dạng liên kết này rất quan trọng đối với tính đặc hiệu của liên kết HA – thụ cảm thể ở những loài khác nhau Sau quá trình gắn màng, virút sẽ xâm nhập vào tế bào bằng cách tạo bọng (endosome) Trong endosome, ở điều kiện pH thấp (khoảng 5,5), phân tử HA0 sẽ bị thay đổi cấu trúc giúp bộc lộ peptide dung hợp HA2 Peptide dung hợp gắn vào màng endosome khiến cho màng virút và màng endosome hoà vào nhau Môi trường acid trong endosome không những tạo điều kiện để quá trình dung hợp diễn ra mà còn tác động đến kênh ion M2 Ion H+ sẽ đi vào virút qua kênh M2, làm axit hoá lõi virút, giải phóng vRNP khỏi M1, các phân tử vRNP tự do này đi vào tế bào chất của tế bào chủ [11]

Các protein cấu thành vRNP là NP, PA, PB1 và PB2 đồng thời là các tín hiệu định vị nhân (NLS) [37] Các tín hiệu định vị nhân này liên kết với các thành phần của

hệ thống xâm nhập vào nhân tế bào và do đó vRNP đi vào nhân tế bào chủ

10

(2)Phiên mã vào sao chép

Hình 1.2 Chu trình nhân lên của virút cúm

Nguồn: http://varuncnmicro.blogspot.com/2012/05/influenza-hush-bush.html [34]

Virút cúm có hệ gen là RNA(-), quá trình sao chép để tạo các sợi vRNA(-) mới

sẽ được tổng hợp thông qua cRNA(+) cRNA(+) là sợi ARN có trình tự bổ sung với vRNA(-), có chiều dài bằng sợi vRNA(-) Quá trình sao chép hệ gen virút cúm không cần đến mồi mà thay vào đó, các ARN polymerase phụ thuộc ARN (RdRp) sẽ khởi đầu quá trình tổng hợp ARN ngay trên sợi vRNA Đầu 5’ và 3’ của mỗi sợi vRNA có trình

tự đảo ngược và bổ sung một phần với nhau do đó hình thành cấu trúc mở nút chai, cho phép khởi đầu quá trình sao chép mà không cần sử dụng mồi

Khác với nhiều virút khác có hệ gen là ARN(-), quá trình phiên mã của virút cúm diễn ra trong nhân Người ta nhận thấy rằng trong quá trình phiên mã của virút

sẽ được vận chuyển ra tế bào chất để tổng hợp các protein của virút Các protein màng

HA, NA M1 và M2 sẽ được vận chuyển đến màng sinh chất của tế bào trong khi các protein NP, PA, PB1 và PB2 được chuyển vào trong nhân để cùng với vRNA(-) tạo thành vRNP(-) mới [44]

Hệ gen của virút cúm gồm 8 phân đoạn ARN mã hoá cho 11 protein đã biết Mỗi phân đoạn 2, 7 và 8 mã hoá cho 2 protein; các phân đoạn còn lại mỗi phân đoạn

mã hoá cho 1 protein

(3)Giải phóng vRNP(-) ra khỏi nhân tế bào

Trong nhân tế bào, chỉ các vRNP (-) được vận chuyển qua lỗ màng nhân ra tế bào chất thông qua con đường vận chuyển phụ thuộc CRM1 Protein CRM1 là một thụ cảm thể cho các tín hiệu vận chuyển từ nhân ra tế bào chất Đầu tận cùng C của protein M1 liên kết với vRNP, đầu tận cùng N của M1 liên kết với NS2; NS2 liên kết với protein CRM1 Phức hệ gồm M1, vRNP (-) và NS2 sẽ được vận chuyển từ nhân ra tế bào chất nhờ khả năng liên kết của NS2 với CRM1 [13]

(4)Đóng gói, nảy chồi và giải phóng virút thế hệ mới

Virút cúm sử dụng màng sinh chất của tế bào chủ để tạo thành các hạt virút hoàn chỉnh rồi rời khỏi tế bào và tiếp tục gây nhiễm các tế bào lân cận Quá trình đóng

gói virút diễn ra tại vị trí màng sinh chất có các protein HA, NA và M2 của virút

12

Người ta đưa ra hai mô hình giả thuyết cho quá trình đóng gói các đoạn ARN virút: mô hình đóng gói ngẫu nhiên và mô hình đóng gói đặc hiệu Theo mô hình đóng gói ngẫu nhiên, các đoạn vRNA sẽ được đóng gói một cách ngẫu nhiên bên trong virion Mô hình đóng gói đặc hiệu dựa trên cơ sở các tín hiệu đóng gói virút được xác định là các vùng mã hoá và không mã hoá ở đầu 5’ và 3’ trên đoạn vRNA Protein M1

đóng vai trò quan trọng trong quá trình đóng gói và nảy chồi hạt virút

Hạt virút chỉ đươc giải phóng ra ngoài màng sinh chất tế bào chủ khi liên kết giữa acid sialic và glycoprotein / glycolipid được cắt đứt Quá trình này được thực hiện

nhờ neuraminidasa (NA) trên bề mặt virút

1.4 Vai trò của hiện tƣợng trao đổi và tích hợp vật liệu di truyền trong các

vụ đại dịch cúm trên thế giới

Thế kỉ XX và đầu thế kỉ XXI đã ghi nhận có 5 đại dịch cúm xảy ra vào các năm

1918, 1957, 1968, 1977 và 2009 Tìm hiểu căn nguyên gây đại dịch cho thấy đại dịch xảy ra khi xuất hiện chủng virút có tính kháng nguyên mới và cơ thể chưa có kháng thể trung hòa virút đó Trong 5 đại dịch đã xảy ra, 3 đại dịch cúm có căn nguyên là những chủng virút được hình thành do hiện tượng trao đổi và tích hợp di truyền, đó là các đại dịch năm 1957, 1968 và 2009 [2, 15]

13

Hình 1.3 Nguồn gốc các chủng virút cúm gây đại dịch

to-swine-how-h1n1-kicked-off-a-91-year-pADNemic-era/ [55]

Nguồn:http://blogs.discovermagazine.com/notrocketscience/2009/06/29/from-spanish-14

- Đại dịch cúm năm 1957: xuất hiện vào tháng 2/1957 ở miền Nam Trung Quốc

rồi lan sang Singapore, Hongkong, Mỹ và Anh Trong vụ dịch này đã có hơn 1 triệu người tử vong Căn nguyên được xác định là virút cúm A/H2N2, một chủng mới xuất hiện do hiện tượng trao đổi và tích hợp (reassortment) các đoạn gen của chủng A/H1N1 năm 1918 và chủng virút cúm gia cầm Chủng A/H2N2 mới lấy các đoạn gen PB2, PA,

NP, M, NS của A/H1N1 (1918) còn các đoạn PB1, HA, NA từ virút cúm gia cầm

- Đại dịch cúm năm 1968: có căn nguyên là virút cúm A/H3N2; dịch xuất hiện

đầu tiên tại Hongkong vào tháng 6/1968 sau đó lan ra toàn thế giới vào mùa đông

1968, 1969 và 1970 với tỉ lệ tấn công khoảng 40% dân số, tập trung chủ yếu ở độ tuổi 10-14 Chủng A/H3N2 gây đại dịch là kết quả trao đổi và tích hợp genome giữa chủng A/H2N2 gây đại dịch ở người năm 1957 và chủng virút gia cầm Sự thay thế các đoạn PB1, H2HA trong chủng A/H2N2 (1957) thành các đoạn PB1 và H3HA của gia cầm

đã tạo nên chủng A/H3N2 mới gây đại dịch

- Đại dịch cúm năm 2009: bệnh nhân nhiễm virút cúm mới đầu tiên được phát

hiện ở Mexico, sau đó phát triển thành dịch lan sang các nước châu Mỹ, rồi bùng phát trên toàn cầu Căn nguyên của dịch là do một chủng virút A/H1N1 do trao đổi gen giữa chủng virút cúm A/H1N1 và chủng A/H1N2 (chủng trao đổi và tích hợp bậc 3) gây bệnh trên lợn

1.5 Ứng dụng kĩ thuật di truyền ngƣợc tổng hợp virút cúm A

Di truyền ngược là cách thức phục hồi chức năng của gen khi đã biết trình tự nucleotide đầy đủ của gen (full length) Kĩ thuật di truyền ngược được áp dụng để nghiên cứu sự thay đổi chức năng gen khi thay đổi trình tự nucleotide trên gen Trong nghiên cứu về virút cúm, kĩ thuật di truyền ngược được áp dụng để tổng hợp virút nhằm nghiên cứu sự thay đổi về kháng nguyên, thay đổi độc tính của virút khi thay đổi kiểu gen Trong tế bào chủ, để tạo hạt virút cúm, cần sự có mặt của vRNA(-) và protein virút, quá trình này cần hai loại sợi cRNA(+) và vRNA(-) [41]

15

Từ những năm 90 của thế kỉ trước, virút cúm A đã được tổng hợp bằng cách sử dụng virút trợ giúp Trong công trình nghiên cứu công bố năm 1996 của Palese, P và

cs [40], virút cúm A được tạo ra nhờ một hệ thống phụ thuộc virút trợ giúp: phức hệ

vRNP được tạo ra bằng cách tổng hợp sợi ARN vi vitro cùng với sự có mặt của các

protein polymerase và NP tinh sạch Phức hệ vRNP này được gây nhiễm cùng virút cúm A trợ giúp để tạo virút mới [40] Đến năm 1994, Neumann và cộng sự đã phát

triển một phương pháp khác, trong đó, vRNA được tổng hợp in vivo trong tế bào chủ

nhờ ARN polymerase I Thực hiện chuyển nhiễm plasmid mang cDNA nhân dòng cùng với virút trợ giúp sẽ tạo virút mới có đoạn gen tương ứng với cDNA nhân dòng Với cả hai phương pháp này, virút mang đoạn gen mong muốn được tạo ra đồng thời với virút trợ giúp nên gây khó khăn trong việc sàng lọc virút đích

Năm 1999, Neumann, G và cs đã có những thay đổi về hệ thống tạo virút cúm

A [16] Hệ thống mới không sử dụng virút trợ giúp mà gồm các plamid mang các đoạn cDNA nhân dòng Hai loại plasmid được sử dụng là plasmid biểu hiện vRNA(-) và plasmid biểu hiện protein virút Khi chuyển nhiễm đồng thời 8 plasmid biểu hiện 8 đoạn vRNA(-) và 4 plasmid biểu hiện 4 protein PB2, PB1, PA và NP vào tế bào 293T,

sẽ tạo ra 8 phức hệ vRNP, từ đó tổng hợp nên virút cúm A Ngoài hệ thống gồm 12 plasmid như trên, tác giả cũng đã thử nghiệm với hệ thống 17 plasmid gồm 8 plasmid biểu hiện vRNA(-) và 9 plasmid biểu hiện protein (PB1, PB2, PA, HA, NP, NA, M1, M2 và NS2) để tạo virút cúm A Kết quả cho thấy cả hệ thống 12 plasmid và hệ thống

17 plasmid đều tạo virút cúm A có khả năng gây nhiễm Hệ thống chuyển nhiễm ADN

có ưu điểm hơn so với hệ thống cần virút trợ giúp, đó là tạo ra chính xác virút mong muốn, không phải thực hiện sàng lọc virút đích

Để hạn chế tối đa số lượng plasmid, có nghĩa đơn giản hóa quá trình xây dựng

hệ thống chuyển nhiễm plasmid, năm 2000 Hoffmann, E và cs đã phát triển hệ thống chuyển nhiễm gồm 8 plasmid [19] Hệ thống này chỉ sử dụng một loại plasmid là

16

pHW2000 Plasmid pHW2000 được thiết kế để biểu hiện đồng thời vRNA(-) và protein virút Khi một đoạn gen của virút cúm được nhân dòng vào pHW2000, vRNA(-) và protein của virút sẽ được tổng hợp từ cùng một plamid nhờ ARN polymerase I và ARN polymerase II của tế bào chủ Chính vì vậy, hệ thống mới chỉ gồm 8 plasmid pHW2000 mang 8 đoạn cDNA của virút cúm Hệ thống này có số lượng plasmid ít hơn, đồng nghĩa với việc quá trình xây dựng đơn giản hơn so với hệ thống chuyển nhiễm plasmid của Neumann, G và cộng sự Với ưu điểm này, hiện nay

hệ thống chuyển nhiễm 8 plasmid được sử dụng trong nhiều nghiên cứu về đặc tính phân tử khả năng gây bệnh của virút cúm

1.6 Cơ sở khoa học để thiết kế và thực hiện nghiên cứu

Theo kết quả giám sát cúm của PTN Cúm Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, từ năm 2000 đến nay (tháng 8 năm 2012), ở Việt Nam, virút cúm gây bệnh cho người lưu hành quanh năm, gồm các típ và phân típ cúm A/H1N1, A/H3N2, cúm B, A/H1N1-09 đại dịch (từ năm 2009)

Bên cạnh sự lưu hành các chủng virút cúm người, từ năm 1997 đến nay, dịch cúm gia cầm độc lực cao A/H5N1 (HPAI H5N1) lây từ gia cầm sang người đã và đang gây mối lo ngại cho các nước về nguy cơ bùng phát đại dịch Theo ghi nhận của TCYTTG, tử năm 2003 đến tháng 7/2012 đã có 608 người nhiễm virút cúm gia cầm độc lực cao ở 15 quốc gia khác nhau, trong đó 359 trường hợp tử vong (59,0%) [12] Tại Việt Nam, dịch cúm gia cầm A/H5N1 trên người là những đợt dịch lẻ tẻ, với sự lưu hành của các clade/ hoặc subclade kháng nguyên khác nhau của virút cúm A/H5N1 Virút cúm gia cầm A/H5N1 gây bệnh cho người ở Việt Nam được xác định thuộc 2 clade kháng nguyên 1 và 2.3.4 [28]

Khả năng lây nhiễm virút cúm gia cầm từ người sang người chưa rõ ràng, song nếu xuất hiện một virút cúm có độc lực cao như A/H5N1 đồng thời có khả năng lây nhiễm nhanh chóng như virút cúm mùa hiện tại sẽ là mối nguy hiểm cho sức khỏe cộng

17

đồng Chủng virút này có thể được hình thành do những thay đổi nhỏ trên các đoạn gen của virút hoặc do hiện tượng trao đổi gen giữa chủng virút cúm gia cầm độc lực cao với chủng virút cúm mùa đang lưu hành

Theo kết quả giám sát cúm tại Hà Nội giai đoạn 2001-2005 và giám sát cúm tại miền Bắc Việt Nam giai đoạn 2006-2008, hai phân típ virút cúm mùa là A/H3N2 và A/ H1N1 thường xuyên lưu hành và là căn nguyên của các dịch cúm vào mùa hè [1] Kết quả thu thập được từ hai chương trình giám sát cúm trên cho thấy virút cúm A/H3N2 được ghi nhận là căn nguyên chính của các vụ dịch năm 2002, 2004, 2005,

2007, tương tự virút cúm A/H1N1 là căn nguyên chính của các vụ dịch năm 2003,

2005 và 2008 Virút cúm A/H3N2 gây dịch vào các năm khác nhau có đặc tính kháng

nguyên khác nhau đã được ghi nhận đó là A/Panama/2007/99 (2001-2002); A/Fujian/411/2002 (2004-2005); A/Wisconsin/67/2005 (2006-2007) đến

A/Brisbane/10/2007 (2007-2008) Trong khi đó, các virút cúm A/H1N1 gây dịch trong giai đoạn trên có đặc tính kháng nguyên được xác định là A/New Caledonia/20/1999 (2003; 2005) và A/ Solomon Islands/3/2006 (2008) [1, 31] Kết quả này đã khẳng định

sự tiến hóa về mặt di truyền của virút cúm A/H3N2 nhanh hơn virút cúm A/H1N1, vì vậy virút cúm A/H3N2 dự tuyển cho vắc-xin cúm mùa hàng năm được cập nhật và thay đổi nhiều lần hơn so với virút cúm A/H1N1 trong cùng giai đoạn

Năm 2009, đại dịch cúm A/H1N1 xuất hiện và lan rộng trên toàn thế giới Phân tích cấu trúc hệ gen của virút cúm A/H1N-09 đại dịch cho thấy các gen M và NA có nguồn gốc từ virut cúm lợn H1N1 dòng Á – Âu; còn các gen PB2, PB1, PA, HA, NP,

NS có nguồn gốc từ virút cúm lợn H1N2 dòng Bắc Mỹ Virút cúm lợn H1N2 là virút trao đổi và tích hợp bậc 3 (triple-reassortant virus) giữa virút gia cầm (gen PB2, PA), virút cúm lợn (HA, NP, M, NS) và virut cúm người H3N2 (gen PB1, NA) [46]

Ứng dụng kỹ thuật di truyền ngược chủ động tổng hợp virút cúm mới trao đổi

và tích hợp di truyền giữa virút cúm gia cầm và virút cúm người để tìm hiểu độc lực

ra virút có độc lực cao và phân đoạn gen PB2 của virút cúm người có trong virút cúm gia cầm A/H5N1 có thể làm tăng độc lực của virút cúm này [29] Tương tự, nghiên cứu của Jackson, S và cs năm 2009 cũng xác định khả năng trao đổi và tích hợp vật liệu di truyền của virút cúm A/H3N2 và H5N1 trên mô hình động vật là có thể Thêm vào đó, kết quả phát hiện tỷ lệ cao virút trao đổi và tích hợp trên biểu mô đường hô hấp trên của chồn sương cho phép kết luận rằng: nếu hiện tượng phơi nhiễm của người hoặc động vật với virút A/H5N1 cùng với virút cúm mùa trong cùng thời gian sẽ làm tăng nguy cơ tạo virút cúm trao đổi và tích hợp, có thể đào thải qua đường hô hấp trên như virút cúm mùa [23]

Từ các kết quả nghiên cứu trên, phối hợp với tình hình dịch tễ học bệnh cúm tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành xây dựng hệ thống chuyển nhiễm plasmid có khả năng tổng hợp virút cúm A Sau đó, từ hệ thống chuyển nhiễm này chúng tôi tiến hành tổng hợp virút cúm A mới từ virút cúm A/H5N1 và A/H3N2 Hệ thống chuyển nhiễm plasmid nếu thành công, sẽ tạo điều kiện phát triển các nghiên cứu sâu hơn về virút cúm Đó không chỉ là các nghiên cứu về độc lực virút, khả năng lây truyền của virút

mà còn về hiện tượng trao đổi và tích hợp diễn ra trong quần thể virút cúm A lưu hành tại Việt Nam cũng như các nghiên cứu về phát triển vaccine cúm phòng bệnh trong tương lai

19

1.7 Vấn đề đạo đức và An toàn sinh học trong nghiên cứu

Plasmid pHW2000 được cung cấp bởi PTN của TS Robert Webster, Bệnh viện nghiên cứu nhi đồng St Jude - Mĩ Việc trao đổi và sử dụng plasmid này chỉ với mục đích nghiên cứu, tuân theo các quy định đã cam kết giữa người gửi và người nhận được nêu trong MTA (Material Transfer Agreemet) (Phụ lục 1)

Trước khi tiến hành thực hiện nghiên cứu, nhóm thực hiện được đào tạo, cấp chứng chỉ về An toàn sinh học cơ bản và sử dụng PTN an toàn sinh học cấp II, III

Quá trình chuyển nhiễm plasmid vào tế bào cảm nhiễm để tổng hợp virút cúm được thực hiện trong PTN An toàn sinh học cấp độ III Nghiên cứu viên thực hiện thí nghiệm trong PTN An toàn Sinh học cấp III được cung cấp trang bị bảo hộ cá nhân và phải được sự đồng ý của lãnh đạo Khoa Virút, Khoa An toàn sinh học – Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

Các chủng virút được tạo ra trong nghiên cứu được bảo quản ở điều kiện -800C, trong PTN An toàn sinh học cấp độ III, dưới sự quản lí của lãnh đạo Khoa Virút – Viện

Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

20

Chương 2 - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Virút cúm gia cầm độc lực cao A/H5N1:

Phân đoạn gen HA và NA của chủng A/Vietnam/1203/2004

- Virút cúm người A/H3N2:

Phân đoạn gen PB2, PB1, PA, NP, M và NS của chủng A/Hanoi/N062/2007

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Plasmid pHW2000 và hệ thống plasmid chứng dương

2.2.2 Sinh phẩm và hóa chất

Các bộ sinh phẩm, hoá chất sử dụng trong nghiên cứu có quy trình hướng dẫn thực hiện kèm theo, các bước thực hiện liên quan được tiến hành theo hướng dẫn của

bộ sinh phẩm

22

* Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

Hệ thống mồi dùng khuếch đại các phân đoạn gen đích bằng PCR

Các cặp mồi sử dụng cho PCR được thiết kế với mục đích tổng hợp các phân đoạn gen chiều dài đủ của các chủng virút cúm A, đồng thời phù hợp cho quá trình nhân dòng vào vector pHW2000 Hệ thống mồi này được sử dụng chung cho các chủng virút trong nghiên cứu

Bảng 2.1 Hệ thống mồi dùng khuếch đại các phân đoạn gen đích

Gen Mồi xuôi Mồi ngƣợc

Sản phẩm [bp]

NS Bm-NS-1 TATTCGTCTCAGGG AGCAAAAGCAGGGTG Bm-NS-890R ATATCGTCTCGTATT AGTAGAAACAAGGGTGTTTT 890+29

Trình tự mồi gồm: trình tự nhận biết của enzyme BsmBI hoặc BsaI ở đầu 5’

(màu xanh); và trình tự đặc hiệu virút cúm (màu đen), trình tự đặc hiệu mỗi phân đoạn gen (gạch chân)

23

Hệ thống mồi sử dụng cho quá trình giải trình tự

Hệ thống mồi được sử dụng cho quá trình giải trình tự gồm:

- Cặp mồi đặc hiệu với vector pHW2000: pHW180F và pHW100R

- Các mồi đặc hiệu với mỗi đoạn gen đích

- Các cặp mồi dùng để khuếch đại gen đích (Bảng 2.1)

Bảng 2.2 Hệ thống mồi dùng cho quá trình giải trình tự nucleotide

24

Cặp mồi chẩn đoán phân típ H5: H5-1 và H5-3 được cung cấp bởi TCYTTG,

sản phẩm khuếch đại có chiều dài 219bp

* Sinh phẩm và hoá chất cho quá trình nhân dòng các đoạn ADN đích

Tổng hợp ADN bổ trợ

PCR HotStar HiFidelity Polymerase Kit 202602 QIAGEN Tinh sạch sản phẩm

PCR

Wizard SV Gel & PCR Clean-Up

Xử lí vector,

25

* Phản ứng xác định trình tự chuỗi nucleotide

- Bộ sinh phẩm BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing P/N, Cat.No

4336917, hãng ABI (Applied Biosystems)

- Bộ sinh phẩm DyeEx 2.0 Spin kit Qiagen (Cat.No: 63206)

* Chuyển nhiễm plasmid vào tế bào động vật có vú:

- Sinh phẩm: Lipofectamine2000, INVITROGEN, Cat No 11668-027

- Tế bào: 293T

- Môi trường: Opti-MEM I Reduced Serum Medium Cat No 51985-091; DMEM High Glucose (Cat No 11995), INVITROGEN

* Phân lập virút:

- Môi trường phát triển tế bào: DMEM chứa 10% FCS (Fetal Cafl serum)

- Môi trường phân lập tế bào: DMEM 2% BSA, Trypsin TPCK (0,001 mg/ml)

* Phản ứng ngƣng kết hồng cầu

Hồng cầu gà 0,5%; Dung dịch đệm PBS

2.2.3 Hệ thống cảm nhiễm virút cúm

- Trứng gà có phôi 10 ngày được cung cấp bởi Viện chăn nuôi Việt Nam

- Tế bào MDCK có nguồn gốc từ ATCC – Trung tâm nguồn sinh học toàn cầu

Máy ly tâm tuýp Eppendoff

Máy ly tâm tuýp 15ml / 50 ml

Hãng sản xuất

Bioquell Sanyo Sanyo Beckman-Coµlter Beckman-Coµlter

Phòng thí nghiệm An toàn sinh học cấp II:

Tên thiết bị

Tủ An toàn sinh học II

Tủ -200C, -800C

Máy ly tâm tuýp Eppendoff

Máy siêu ly tâm

Hitachi GFL Sanyo

- Dụng cụ thí nghiệm:

Pi-pét các loại: từ 0,5µl đến 1000 µl,

Đầu côn vô trùng các loại, có phin lọc: từ 1µl đến 1000µl

Phiến nhựa 6 giếng, phiến nhựa 96 giếng đáy chữ V, chai nuôi tế bào 75cm2… Tuýp vô trùng các loại: 0,2 ml; 1,7ml, 2,0ml

- Trang phục bảo hộ cá nhân trong PTN An toàn sinh học cấp 3:

Khẩu trang N95 (3M 1860), bộ quần áo (Tyvek)

27

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Quy trình xây dựng hệ thống chuyển nhiễm ADN có khả năng tổng hợp virút cúm A và tổng hợp virút cúm mới từ virút cúm A/H5N1 và A/H3N2 được tóm tắt trong hình 2.2

Hình 2.2 Quy trình xây dựng hệ thống chuyển nhiễm plasmid có khả năng tạo virút cúm A và quy trình tổng hợp virút cúm mới từ virút cúm A/H5N1 và A/H3N2

28

2.3.1 Lựa chọn chủng virút gốc

Chủng virút cúm A/H5N1 và A/H3N2 được lựa chọn từ các chủng hiện đang lưu giữ tại PTN Cúm, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Chủng virút cúm được lựa chọn phải có hiệu giá ngưng kết hồng cầu (HA) tối thiểu 8

2.3.2 Chuẩn bị vector nhân dòng

Khuếch đại plasmid:

- Biến nạp plasmid pHW2000 vào tế bào cảm biến E.coli chủng DH5-T1 bằng

phương pháp sốc nhiệt

- Sử dụng môi trường LB thạch để lựa chọn tế bào mang plasmid

- Khuếch đại tế bào mang plasmid trong môi trường LB lỏng (100 – 200 ml)

Tách plasmid từ tế bào vi khuẩn: Sử dụng Nucleobond Xtra Midi Kit

Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn:

Hàm lượng plasmid được cắt: 5 µg

- Cắt plasmid bằng enzyme BsmBI

- Tinh sạch plasmid bằng Wizard SV Gel & PCR Clean-Up System

- Xác định nồng độ plasmid sau xử lí bằng máy nanodrop

Bảo quản plasmid ở nhiệt độ -700C

2.3.3 Chuẩn bị ADN nhân dòng

Với mỗi đoạn gen đích, thực hiện 2 phản ứng, tổng thể tích sản phẩm PCR là 100 µl

(chi tiết xem phụ lục 2)

Điện di sản phẩm PCR

Điện di để kiểm tra kết quả PCR và quá trình tinh sạch sản phẩm PCR Sử dụng gel agarose 0.8% có ethidium bromide (10µl / 100 ml dung dịch agarose), hiệu điện thế 100 vol trong 30 phút, thang AND chuẩn 1kb (Promega), quan sát và chụp ảnh dưới tia UV

Nhận định kết quả

Dựa vào kích thước đầy đủ của sản phẩm PCR khi thiết kế mồi và thang ADN chuẩn để lựa chọn ADN đích (sản phẩm mong muốn)

Tinh sạch ADN đích:

Sử dụng bộ sinh phẩm Wizard SV Gel & PCR Clean-Up System

Xử lí ADN đích với enzyme giới hạn:

- Cắt ADN đích bằng enzyme BsmBI hoặc BsaI tương ứng với mỗi loại cặp mồi

- Tinh sạch bằng bộ sinh phẩm Wizard SV Gel & PCR Clean-Up System

30

2.3.4 Nhân dòng ADN đích vào plasmid pHW2000

Đưa ADN đích vào plasmid:

Sử dụng T4 DNA ligase để gắn ADN đích vào plasmid pHW2000 đã xử lí tạo plasmid tái tổ hợp, thực hiện theo quy trình của bộ sinh phẩm

Biến nạp vào tế bào khả biển

Sử dụng phương pháp sốc nhiệt để biến nạp 5 µl plasmid tái tổ hợp vào tế bào vi

khuẩn E.coli (DH5α – T1)

Cấy trải tế bào đã biến nạp trên môi trường LB thạch

- Chuẩn bị môi trường LB thạch có kháng sinh Ampicilline (0,05mg/ml)

- Cấy trải 150 µl vi khuẩn trên đĩa LB thạch

- Ủ đĩa thạch chứa vi khuẩn ở 370C, từ 18 – 20 giờ

Xác định khuẩn lạc chứa plasmid mang ADN đích

- Chuẩn bị môi trường LB lỏng có Ampicillin (0,05mg/ml)

- Chia 3 – 5 ml môi trường LB lỏng vào tuýp li tâm 15 ml

- Nhặt khuẩn lạc từ đĩa thạch LB vào tuýp môi trường LB lỏng

- Nuôi vi khuẩn trong điều kiện 370C, 170 vòng/phút, từ 18 – 20 giờ

- Tách ADN plasmid, sử dụng QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN)

- Điện di plasmid trên gel agarose 0,8%

- Lựa chọn plasmid mang ADN đích, bảo quản ở -200C

Vi khuẩn chứa plasmid mang ADN đích: thêm 200 – 500 µl Glycerol tiệt trùng vào 500 µl vi khuẩn, trộn đều, bảo quản ở -700C

31

2.3.5 Phản ứng xác định trình tự chuỗi nucleotide (sequence)

Mục đích:

- Xác định trình tự nucleotide các đoạn ADN đích tổng hợp từ gen đích (trước nhân dòng)

- Xác định trình tự nucleotide các đoạn ADN đích trong plasmid (sau nhân dòng)

- Xác định trình tự nucleotide các phân đoạn gen của virút cúm tổng hợp bằng hệ thống chuyển nhiễm ADN plasmid

Chu kì nhiệt tạo các đoạn ADN gắn dideoxynucleotide (Cycle sequencing)

Sử dụng sinh phẩm BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit P/N

Ly tâm nhẹ hỗn hợp phản ứng trước khi cho vào máy PCR

Chu trình nhiệt của phản ứng:

Nhiệt độ Thời gian (phút:giây) Số chu kì

25

Bảo quản sản phẩm ở 40C cho tới bước tinh sạch tiếp theo

32

Tinh sạch sản phẩm sau khi chạy chu trình nhiệt gắn dideoxynucleotide

- Mục đích: loại bỏ các dideoxynucleotide và sinh phẩm dư thừa, tránh nhiễu trong quá trình giải trình tự

- Sử dụng bộ sinh phẩm DyeEx 2.0 Spin kit Qiagen (Cat.No: 63206) theo hướng dẫn kèm theo bộ sinh phẩm

Điện di qua mao quản và đọc trình tự nucleotide bằng đầu đọc laser

- Cho 10 µl HiDi Formamide (HiDi Formamide ABI 25 ml P/N: 4311320) vào tuyp 1.5 ml chứa ADN sau khi làm khô (2.3.4.2)

- Chuyển toàn bộ sản phẩm sang phiến 96 giếng (phiến chuyên dùng cho ABI PRISM 3100 – Avant)

- Ủ phiến ở 960C trong 5 phút

- Chuyển phiến vào giá giữ lạnh

- Đặt phiến 96 giếng vào máy ABI PRISM 3100 – Avant

- Cài đặt chương trình chạy, thu kết quả từ tệp dữ liệu khi phản ứng kết thúc

Phân tích các trình tự chuỗi thu đƣợc

Sử dụng phần mềm phân tích DNAstar và SeqMan để phân tích các trình tự chuỗi thu được: nối các đoạn nucleotide thành một đoạn gen hoàn có chiều dài đầy đủ; kiểm tra cấu trúc gen (chiều dài gen, chiều dài ORF, vùng không mã hóa)

2.3.6 Chuẩn bị plasmid cho quá trình chuyển nhiễm

- Lấy 100 µl vi khuẩn được bảo quản trong glycerol cho vào 100 – 200 ml môi trường LB lỏng

- Nuôi vi khuẩn trong điều kiện 370C, 170 vòng/phút, từ 18 – 20 giờ

- Tách ADN plasmid, sử dụng Nucleobond Xtra Midi Kit (ACHEREY-NAGEL)

33

- Xác định nồng độ ADN plasmid bằng máy nanodrop ở bước sóng 260nm

- Bảo quản plasmid ở -700C

2.3.7 Chuyển nhiễm plasmid vào tế bào

Sử dụng sản phẩm plasmid tách bằng Nucleobond Extra Midi Kit cho quá trình chuyển nhiễm

Các bước tiến hành:

- Chuẩn bị tế bào: 1 ngày trước khi tiến hành chuyển nhiễm, tách tế bào 293T với số lượng là 1 x 106tế bào / giếng trong 3 ml môi trường DMEM High glucose (sử dụng phiến nhựa 6 giếng)

- Với mỗi mẫu chuyển nhiễm, chuẩn bị hỗn hợp sau:

Hỗn hợp (1): cho 1ug mỗi plasmid x 8 ADN plasmid vào 250 µl môi trường Opti-MEM, trộn nhẹ bằng pi-pét

Hỗn hợp (2): Pha loãng Lipofectamine2000 trong 250 µl môi trường MEM, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng

Sử dụng trứng gà có phôi 10 ngày tuổi, kiểm tra tình trạng phôi trước khi phân lập

- Tạo một lõ nhỏ trên vỏ ở phía đầu tù của trứng