Nghiên cứu thu nhận và ứng dụng chế phẩm Glucoamilaza của Aspergillus niger trong lên men Etanol từ bột sắn sống202634

CẤC CHỮ VIET TAT đuọc dùng trong luận ấn... Glucoamllaza và quá trìn h thùy phần bột Bồng... Chất úc chế GA thuỳ phấn bột sống... Lên men sân xuất GA... 2.3.1.Phiiông pháp lên men xốpso

Phần I Mỏ BAU 1

Phân II.TổNG QUAN TAI l i ệ u 4

I GA v à quá t r ì n h th ủ y phân b ộ t s ố n g 4

1 1 D ạ i c u ơ n g q u á t r ì n h t h ủ y p hâ n t i n h b ộ t v à GA 4

1 2 Mối l i ê n quan g iũ a khả nảng bám v à th ủ y phân b ộ t sốn g cùa GA 9

1 3 Phàn úng thuần nghich và chất úc chế GA thủy phân b ộ t s ố n g 11

1 3 1 GA x ú c t ắ c c h o p h ả n ú n g n g ư ộ c 11

1 3 2 C hấ t ú c c h ế GA t h ù y ph ân b ộ t s ố n g 11

I I s à n x u ấ t GA t ù v i s in h v ậ t 14

2 1 Chùng g i ố n g v i s i n h v ậ t ■ 14

2 2 D i ề u k i ệ n v à t h à n h p hầ n mô i t r ư ò n g s à n x u ấ t GA 15

2 3 Lên men s ả n x u ấ t GA ' 1 7 2 - 3 1 P h ư ô n g p h á p l ê n men x ố p 18

2.3.2.Phưông phấp lên men dịch t h ể 18

I I I s ử dụng ch ế phẩm GA t r o n g l ê n men e t a n o l t ù t ỉ n h b ô t 1 9 3.1.Ph\lông pháp Amylo 20

3 2 P h \iô n g pháp M ycom alt 20

3 3 Lên men e t a n o l t r ự c t i ế p t ù b ộ t s ố n g 20

Phần 1 1 1 NGUYÊN LlỆU VÀ PHƯONG PHAP 27

I.V i sinh v ậ t 27

I I H ó a c h ấ t v à t h i ế t b i 27

2 1 Hóa c h ấ t 27

2 2 T h iế t b ị 28

I I I Cấc phUòng pháp phân t í c h 28

3 1 Đ i n g l ư ợ n g đ ư ò n g khủ t h e o p hươ ng p h á p m i c r o - B e r t r a n d 2 8 3 2 Xác đ i n h hàm l ư ợ n g t i n h b ộ t t r o n g m ẫ u 29

3 3 Xác định hiệu suất lên men e ta n o l 29

3 4 Xác đ i n h p r o t e i n t h e o phương p h á p L o w r y 29

IV C á c môi tr u ồ n g dùng t r o n g n g h iê n c ú u 30

4 1 Mô ỉ trưòng Hansen 30

4 2 Môi trư ò n g M a r t i n : 30

4 3 Môi tr u ò n g C zapek 31

4 4 Môi t r ư ò n g cám t r ấ u s ả n x u ấ t e n z i m 31

4 5 Môi t r ư ò n g l ê n men e t a n o l 31

V C á c phưdng pháp x á c đ in h h o ạ t độ e n z im 3 1 5 1 Xác đ ịn h h o ạ t <JỘ GA 31

5 2 Xác đ ị n h h o ạ t đ ộ GA t h ủ y p h â n b ộ t s ố n g 31

V I.C á c t h í nghiệm c v t h ể 32

6 1 P hân l ậ p , t u y ể n c h ọ n v à t ố i ưu h ó a m ô i t r ư ò n g c h o sâ n x u ấ t GA 32

6 1 1 Phân lập chủng nẩm sỢi có hoạt tin h GA thùy phân bột sống 32

6 1 2 T u y ể n c h o n c á c c h ủ n g c ó h o ạ t t i n h c a o 3 3

6 1 3 T ố i ưu hoá m ô i trưòng cho sà n xuất c h ế phẩm GA 3 3

6 2 Bảo qu ả n c h e phẩm GA 38

6 3 Phương p h á p n g h i ê n c ứ u GA 38

6 3 1 T i n h s ạ c h GA 38

6 3 2 N g h i ê n c ú u mọ t s ố ctặc t í n h c ủ a GA 40

6.4.PhucJng pháp n g h iê n cúu c h ấ t úc chế GA th ủ y phân b ộ t s ố n g 42

6 4 1 Xác đ ị n h h o ạ t đ ộ k ìm hãm c ủ a c h ấ t ú c c h ế 4 2 6 4 2 Tinh sa c h tù n g phân c h ấ t úc c h ế 42

6 4 3 Một số đặc t í n h cùa c h ấ t úc chế l i ê n quan (Jen phàn úng th ủ y phân b ộ t sốn g của GA 43

6 5 Tuyển chon c á c chừng nấm men lê n men e t a n o l ỏ n h i ệ t ctộ c a o 45

6 5 1 Sổ tu y ể n c ấ c chủng nấm men lê n men ỏ 42 c 4 5 6 5 2 So s á n h k h ả n ă n g l ê n men c ủ a c á c c h ù n g t r o n g b ì n h S m i t h 4 6 6 5 3 So sánh h iệ u s u ấ t lê n men cùa c á c ch ủ n g 46

6 6 Lên men e t a n o l t r ự c t i ế p t ừ b ộ t s ấ n s ố n g 47

6 6 1 T h í n g h i ệ m l ê n men t r ự c t i ế p t ù b ộ t s ấ n s ố n g 47

6 6 2 Lựa chọn c á c th ô n g số t h í c h hộp cho lê n men tr ự c t i ế p t ù b ộ t sẩ n s ố n g 48

6 6 3 Dộng h ọ c q u á t r ì n h l ê n men ả q u i mô t h ử n g h i ệ m 4 8 V I I - T ín h k ế t q u à 49

Phần IV :KET QũẢ v à thao LUẠN 50

I.Ph ần lậ p v à tuyển chpn cá c chủng nấm S0 Ỉ sỉn h trư ổ n g t r ê n m ô i trư ồ n g ch ú a b ộ t s ố n g 50

1 1 Phần l ậ p 50

1 2 Tuyển ch ọ n 50

I I Tố ỉ Tiu hóa d iê u k iệ n v à th àn h phần môỉ triiò n g sả n x u ấ t ch ế phẩm GA 59

2 1 T ố i ưu đ iể u k iệ n môi tr ư ò n g 59

2 1 1 Ảnh hường củ a n h iệt đ ộ 60

2 1 2 Ảnh hưỏng củ a t ỷ l ệ cám t r ấ u 6 1 2 1 3 Anh hường cù a độ ấm môi tr ư ò n g 62

2 1 4 Ảnh hưởng cù a pH ban d ầ u 63

2 1 5 Anh hưởng củ a t h ò i g ia n lê n men 64

2 2 T ố i ưu hóa th àn h phấn môi trư ờ ng 65

2 2 1 Lựa chọn c á c y ế u t ố th àn h phần môi t r ư ò n g 65

2 2 2 Lập clưòng cong t ố i ưu cho tù n g yếu t ố th àn h phần môi tr ư ò n g 66

2 2 3 Qui hoạch hóa thự c nghiệm th e o 2 nhân t ố 68

2.2.4.BưỐc leo đốc t ố i điểm t ố i ÜU theo Box-Wilson 70

I I I L ụ a chọn ctỉểu k iậ n bâo quản ch ế phẩm G A 72

IV N g h iê n cúu t i n h s ạ c h v à đ ặ c t í n h c ủ a GA 74

4 1 T á c h t ù n g p h ầ n p h ầ n GA 7 4 4 1 1 Lựa chọn dung d ịc h c h i ế t r ú t 74

4 1 2 Thấm dò đ iể u k iệ n k ế t tủ a e n z im 75

4 1 3 s ấ c ký qua c ô t lo c g e l Sep h ad ex G -2 0 0 76

4 1 4 s ẳ c ký q u a c ộ t CM S e p h a d e x C - 5 0 77

4 2 N g h i ế n c ú u m ột s ố đ ặ c t í n h c ủ a GA-I v à G A - I I 81

4 2 1 Anh hưỏng của n h iệt độ ctến hoạt ctộ GA-I và G A -II 8 2

4 2 2 Anh hường cũ a pH đến h o ạ t độ GA-I v à G A - I I 84

4 2 3 Anh hương c ù a c á c io n kim lo ạ i v à cá c c h ấ t khác

7 1 Anh hưởng củ a lượng enzim ctến h iệ u s u ấ t lê n men 10 5

7 2 Anh hường củ a lượng nấm men đến h iệ u s u ấ t lê n m e n 10 8

7 3 Ánh hứỏng cù a số lư ộng b ộ t s ẩ n sốn g cỉến

h iệ u s u ấ t lê n men 109

7 4 N ghiến cửu ctọng học quá t r ì n h lê n men e t a n o l 1 1 3

Phần V : kỂt luận 1 1 7

Phần VI: TAI LlỆU tham khao .120

CẤC CHỮ VIET TAT đuọc dùng trong luận ấn

chiếm v a i t r ò quan t r o n g đ ác b i ệ t ctối v ố i đ ò i sỐ ng.Neu x a xưa con n gư ò i c h ỉ b i ế t v a i t r ò củ a nó t r o n g sàn phẩm lê n men

tr u y ề n th ố n g c á c l ó ạ i đổ uống chúa rượu t h ì clển n ay thự c t ế <áã khẳng đ in h v a i t r ò t o lố n cù a e t a n o l tr o n g n h iề u l i n h vức như

th ứ c phẩm,điiửc phẩm ,y t ế ,c ô n g n g h ỉê p ẽtỉểu chể c á c v â t l i ê u hữu cố mối Hơn th ế nữa nó còn ctưoc c o ỉ l à nguồn nâng lilộ n g

có t r i ể n vọn g cho tương l a i C h ỉ r i ê n g t r o n g công n g h iệ p thực phẩm ,nhu cầu e t a n o l t r ê n th ế g i ó i ctã đ ạ t 9 t ỳ l í t [ 1 3 9 ]

Thực t ế n ày đã th ú c cfẩy c á c nhà n g h iên cúu tìm kiếm nguồn

cơ c h ấ t mói cho sả n x u ấ t e t a n o l V iệ c sà n x u ấ t e t a n o l tù

x e n lu lo z a đã cíạt cíuộc những k ể t quả n h ấ t cỉịnh nhung r ỉ đưòng

v à nguyên l i ệ u chúa b ộ t v ẫ n l à nguồn cơ c h ấ t chủ yếu .R Ỉ đưòng

th u ận l ộ i cho quá t r ì n h lê n men đơn g iả n tr ự c t i ế p th àn h

e t a n o l.N g o à i c á c l o ạ i ctưòng lê n m e n ,r ỉ đưòng còn chúa n h iề u

c h ấ t có g ỉ á t r i d in h dưỡng cao khác do đó đang t r ổ th àn h nguon

cơ c h ấ t hấp dẫn hơn cho sà n x u ấ t c á c sàn phấm lê n men khác quý

cha v i ệ c hổ hóa , d ịc h hóà v ầ ctuòng hóa t in h b ộ t cùng v ó i nhũng cố gan g tr o n g tổ chúc quản l ý sản x u ấ t v à t i ê u th ụ sàn phẩm ,khà năng sả n x u ấ t ỏ clây c h ỉ có th ể được mỏ rộ n g nếu như

c á c nưóc n ày có cfủ khả năng t i ế p nhận c á c t i ế n bô kỹ th u ậ t , cfổi mói công 'nghê nhắm hạ g i á th àn h sản phẩm.Theo huống này phần lố n c ấ c n g h iê n cúu đểu t ậ p tru n g v à o khá nãng h& g i ả thành sản x u ấ t enzim d ịc h hoá , ctưòng h o á , tă n g h iê u quà t á c dụng cù a nó v à h iê u s u ẩ t lê n men e t a n o l cù a c á c chủng v i s in h

v ậ t sừ dụng.CÓ những n g h iê n cúu áp dụng kỹ th u ậ t d i tr u y ề n để

tạ o r a c ấ c chủng v i s in h v â t nhân t ạ o v ù a có khả nãng s in h enzim clưòng hóa v ù a lê n men e t a n o lc 1 5 , 1 6 ] Đ iểu đó v ù a t i ế t kiêm đtlộc nguồn enzim v ù a đơn g ià n hóa quá t r ì n h sàn x u a t.T u y

v ậ y , khâu hổ hóa t in h b ộ t chiếm 40% c h i p h í nhân cống v à n ãeg lương cho c à quả t r ì n h sả n x u ấ t v ẫ n đang tổ n t ạ ỉ ỏ hầu h ế t c á c

cổ sở sà n x u ấ t

ứng dụng khả năng th ủ y phân tr ự c t i ế p t i n h b ọ t không qua hổ hóa c ù a g lu c o a m ila z a l à một t i ế n bộ tr o n g sàn x u ấ t

e t a n o l n ó i r i ê n g v ầ c á c công nghệ lê n men tù t in h b ộ t n ó i

c h u n g V iệ c l o a i bô hoàn to à n khâu hồ hóa t ỉn h b ô t dẫn ctến ha

! như Thái Lan,Indonesia, N ig e rỉa [2 2 ,3 4 ,1 3 1 ].

c? nưốc t a ,k ể từ k h i mất t h i trư ò n g L iê n xô cũ v à c á c nưốc Dông Ẩ u ,s à n x u ấ t e t a n o l gần như ngùng t r ê do nhũng c h i

p h i quá lố n cho nhộp khẩu enzỉm v à h&n chế củ a c á c q u ỉ t r ì n h

cũ cần p h ả ỉ hổ hóa t in h b ô t.H ầ u như chưa có môt t i ế n bộ nào đưoc úng dụng t a i c á c cơ sỏ sàn x u ấ t G i á th àn h sàn x u a t

e t a n o l t r o n g nưốc lố n hon g i á x u ấ t khẩu dẫn ctến hàng nễưn p h ả i

x u ấ t khẩu hàng trăm ngàn tấ n ngũ cố c không qua chế b iế n tr o n g

k h i đó tiề m năng sàn x u ấ t khoáng 30 t r i ệ u l í t e t a n o ic 1 3 9 ] c ù a

c á c cơ sỏ sá n x u ấ t kéo th e o môt số lượng đáng kể nhân công

tr o n g nưóc không đưộc sủ dụng.

X uất p h á t t ù th ự c t ế t r ê n v à c á c k ế t quả n g h iên cứu gần

đ ầy chúng t ô i t i ế n hành <ẩể t à i "N g h iên cúu sả n x u ấ t v à úng dung khả n ăn g th ủ y phân b ộ t số n g củ a g lu c o a m y la za -tù

À sp e rg ỉllu s n lg e r tro n g lên men e ta n o l trự c t i ế p tìl bột Ban

s ố n g " K ê t quả đã đưa r a một q u ỉ t r ì n h lê n men e t a n o l tr ự c

t ỉ ế p tù b ô t sấ n số n g đ ạ t h iệ u s u ấ t 87-90% 80 v ó i l ý t h u y ế t Đóng góp nhò bé n ầy cũng l à mong muốn củ a chúng t ô i nhắm tù n g bưóc đ ố i móỉ côn g nghê sà n x u ấ t th e o hưống t ỉ ể t kiậm năng

lư ộ n g,đ ơ n g iả n hóa q u i t r ì n h công nghệ dẫn đến hạ g i á th àn h sàn phẩm t a o r a cô h ô i x u ấ t khẩu k h ô i phvc v à mỏ rộ n g sàn

x u ấ t e t a n o l tr o n g nưốc.

Phần I I : T ố N G Q U A N T A I L ĩ Ệ U

I Glucoamllaza và quá trìn h thùy phần bột Bồng.

1 1 D ạ i cilông v ề quấ t r ì n h th ủ y phân t in h b ộ t v à GA

T in h b ô t ctưộc tổ n g hộp nhò quá t r ì n h quang hop củ a thực

v ấ t .Đó l à nguồn cung cấ p cacb on v à năng lũ ộ n g chù yếu cho con

n gư òi v à động v ậ t

T ỉn h b ộ t bao gổm c á c mạch a m ilo z a v à a m ilo p e c t ỉn cấu

t r ú c tù c á c phân tứ g l u c o z a Trong mạch a m ilo z a c á c phần tủ

g lu c o z a được gấn v ố i nhau bầng l i ê n k ế t ÍX ( 1 - 4 ) g l u c o z ỉ t , còn

tr o n g mạch a m ilo p e c t in c á c phân tủ g lu c o z a l a i chlOc l i ê n k ế t

v ó i nhau ờ v i t r í « ( 1 - 4 ) v à <x ( 1 - 6 ) g l u c o z i t tạ.o thành c á c mạch phân nhánh (h ìn h 1 )

Tin h b ô t l ầ nguõn nguyên l i ê u ban đầu quan tr ọ n g cho

n h iề u quá t r ì n h công nghệ sàn x u ấ t v à chế b iế n th\ic phẩm, diiộc phẩm v à c á c dung môi hữu cO Phẳn lố n c á c quá t r ì n h chế b iế n

t in h b ọ t éềxx b ẩ t đầu bắng v ỉ ê c th u ỷ phân c á c l i ê n k ế t g iữ a c á c phần từ g lu c o z a s â n phẩm th u ỳ phân có th ể ctiiộc dùng t r ự c t i ế p

chlối dạng d ỉc h chlòng đậm đ ặc h ay ctũộc t in h chế để th u g lu c o z a

tin h k h iế t.M ăt khác sản phẩm sau thuỷ phân có thể dùng làm

nguyên l i ê u ban đầu cho c á c quá t r ì n h công nghệ t i ế p th e o ctể

sà n x u ấ t r a hàng l o ạ t c á c sà n phẩm n h u :mì c h ín h ( n a t r i g lu t a m a t ) ,

b ia ,r ư O u ,c á c dung môi hữu cứ < a x e to n , b u ta n o l) hoăc c á c a x í t hũu

cơ như a x e t i c , l a c t ỉ c

Nguòi p h á t h iê n r a khả năng sàn x u ấ t g lu c o z a tù t in h

bột l à K irchoff ô n g đã tạ o r a chlộc một dung d ịc h có v ị n g ọ t như đưòng k h ỉ xủ l ý t i n h b ọ t v ố i a x í t [ 4 8 ] Sau dó Payen v à

P e r s o r [ 1 1 , 4 8 ] lầ n ctắu t i ê n tá c h ctưộc ố dạng k ế t t ù a chế phẩm

a m i l a z a bấng c a ch thêm e t a n o l vầo d ic h c h i ế t của mầm cíại

mạch.ThUc r a v i ê c dùng enzim để th u ỳ phần t in h b ô t c h i thứ c sư

b ẩ t áầu kế t ù k h ỉ enzim n ày ctư^c sà n x u ấ t ỏ q u i mô công n g h iệ p nhò quá t r ì n h lê n men v i s in h v ậ t v ố i sán g chế cù a Takam ine

v à o nãm 1 9 1 4 ứ Nhât BẲn.đ^ cfây chế phẩm amilaza chlộc sản X ỉiất

tù nấm S 0 i A sp e rg ỉllu s nigerC A.oryzae) t r ê n môi trư ồ n g cám

m ì Tên thướng phẩm củ a chế phẩm này l à T a k a - d i a s t a z a [1 1 0 ]

V ố i ưu th ế hơn hẳn a x í t v ề t ín h ctăc h iê u c a o ,h iê u s u ấ t

th u ỷ phân c a o ,t ố c cfộ phản úng nhanh cũng như khà năng de dàng

điều khiển quá trìn h phản úng , enzim áã thay thể hầu như toàn

bộ quá t r ì n h th u ỳ phấn t in h b ộ t

Cùng v ố i sự p h á t t r i ể n củ a s in h học,nh ữ n g t i ế n bộ khấc

tr o n g l ĩ n h vự c hoá học v à v ậ t l ý học đã g iú p cho ngành enzim

học nói chung và lin h vuc nghiên cửu a m i l a z a nói r iê n g

đ ạ t ctưộc n h iề u k ế t quả to lố n Khoa học ctã làm sá n g tò cấu

t r ú c phân tủ và cơ chế t ấ c dung củ a a m i l a z a t r o n g quá t r ì n h

th u ỳ phân t i n h b ộ t.C h o ctến n ay n g ũ ò ỉ t a đã p h á t h iệ n ctươc 6

l o ạ i enzim l i ê n quan tr ự c t i ế p ctến quá t r ì n h th u ỷ phân t in h

b ộ t

Quá t r ì n h th u ỳ phần t in h b ộ t b ẩ t đẵu v ó i v i ệ c xừ l ý

t i n h b ộ t ổ n h iệ t c t ộ 8 0 - 10 0 c k h iế n cho t in h b ộ t đ ạ t t ố i múc hồ hoá hoàn t o à n [ 4 8 , 8 9 ] Sau đó l à v ỉ ê c duy t r ì đ iể u k iệ n phàn úng ctể cho c á c enzim được bổ sung v ào r iê n g r ẽ h a y k ế t hop tu ỳ

th e o mục đ íc h th u nhận sản phẩm úng v ố i v a i t r ò cù a c á c l o ạ i enzim kh ấc nhau.

a-amilaza h ay a(1 -4 )glucohidrolaza(EC 3 2 1 1 ) l a enzim hưống n ộ i,p h â n c ấ t c á c l i ê n k ế t « ( 1 - 4 ) g l u c o z i t có t r o n g mach

a m ilo z a v à a m ilo p e c t in C 1 1 , 3 0 , 8 8 ] V iệ c xù l ý t in h b ô t hồ hoá

v ố i a - a m ila z a lầm giảm nhanh khà năng b a t mầu cù a t in h b ô t v ố i

ì ố t v à <JÔ n h ố t c ù a d ic h hổ hoấ t i n h b ôt.M ạch a m ilo z a chlöc

th u ỷ phân th àn h c á c sản phẩm có phần t ủ lương nhỏ chù yếu l à

m a lto z a v à m a l t o t r i o z a v ố i a m ilo p e c t in k h ỉ b ỉ th u ỷ phân b ờ i

a-amilaza , n g o a i m a lto z a v a m a lt o t r io z a sả n phẩm cồn chíla c à

c á c d e x t r ỉ n g i ố i h ạ n [ 4 1 , 1 1 8 , 12 9 ]c ù n g v ó i 5-10 % g lu c o z a [ 4 8 ]

ß-amilaza h ay ß ( 1 -4 ) glucomaltohydrolaza (EC.3 2 1 2 )

l à enzim .hưống n g o ạ ỉ xú c t á c th u ỷ phân c á c l i ê n k ế t

« ( 1 - 4 ) g l u c o z i t p h la tr o n g b ẩ t đầu t ù đấu không khử t r ê n mạch

a m ilo z a v à a m ilo p e c tin E n z im khống có khà năng th u ỷ phân c á c

l i ê n k ế t <x ( l - 6 ) g l ù c o z i t v à k ế t quả sa u th u ỳ p h ân , sà n phẩm chúa c à m a lto z a v ó i mạch a m ilo z a còn v ó i mạch a m ilo p e c t in sàn phẩm chúa c à m a lto z a v à B - d e x t r ỉ n g i ó i h a n [ 2 1 , 8 8 ]

glucoamilaza(GA) h ay amyloglucozidaza, Ịf amilaza

t r ê n mạch a m ilo z a v ầ a m ilo p e c t in v ầ t ạ o th àn h sản phấm chù yếu c u ố i cùng l à g lu c o z a [ 4 8 , 7 0 , 8 5 , 9 6 ]

N goài ba l o a i a m l l a z a chù yếu n o i t r ê n , l i ê n quan cten

h iệ u s u ấ t v à t ố c độ quá t r ì n h th u ỳ phân t ỉn h b ộ t còn có cá c

T r a n g l u c o z i l a z a hay g l u c o z i l t r a n s f e r a z a xuc t a c cho

quá t r i n h t ạ o nên c á c l i ê n k ế t « ( 1 - 6 ) g l u c o z i t g iữ a h a i phân

từ g lu c o z a , k ế t quà làm giảm h iệ u s u ấ t th u ỳ phân cù a c á c

amilaza [ 4 8 ,8 8 ]

Khả năng c ẩ t c á c l i ê n k ế t « ( 1 - 4 ) , « ( 1 - 6 ) và « ( 1 - 3 ) g iữ a

c á c phân tủ g lu c o z a tr o n g c à mach a m ilo z a v à a m ilo p e c t in đế

th u dhlộc sản phẩm th u ỳ phân t r i ê t cfể l à ưu th ể t u y ệ t đ ố i cù a

GA so v ó i c ấ c amilaza khác [ 2 6 ,7 0 , 8 5 , 1 0 8 ] Chinh v i vậ.y ma enzim

n ày cíã v à đang th u h ú t sự quan tẳm cù a c á c nhầ n g h iê n cúu sàn

x u ấ t v à úng dung.GA nắm tr o n g số những enzim có sàn lượng cao

t r ê n th ế g i ó i ( p r o t e a z a , a - a m ll a s a) sả n phẩm GA nầm 1990 đ a t

t ố i 320 t ấ n [ 2 ] G A chiức sà n x u ấ t chủ y ếu nhò nấm s ợ i như :

Rhizopus delemar, A n iger [4 8 , 7 1 , 9 6 ] v à nấm men Endomycopsỉs

f i b u J i ^ e r a C 2 1 , 8 8 , 1 2 5 ] N goài r a nó còn đưoc p h á t h iê n t r ê n

n h iề u v i s in h v ậ t khấc nhu: Mucorl 1 3 5 ] , Cephalosporium,

N e u r o s p o r a [8 5 ,9 6 ].

GA t in h k h i ế t to n t ạ i chủ yếu ả h a i dạng GA I v à

GA I I [ 1 1 , 2 1 , 8 5 , 8 9 , 9 6 ] C ác GA bền ở môi trư ò n g a x í t hơn so v ố i

ờ môi trư ò n g k iề m t1 1 , 7 0 , 9 6 ] Phàn úng th u ỷ phân cù a GA t h íc h hộp ồ pH 4 , 5 đến 5 , 0 v à ỏ n h iệ t ctộ 4 0 -5 0 C Enzim bển ỏ n h iệ t

độ 40 C[ 1 1 , 2 1 , 9 6 ] Điểm dtẳng đ iê n dao động tù 3 , 5 v ố i GA cùa

A awamori đến 8 ,4 v à i GA cù a Mucor ra u A 'ia r? u s[9 6 ] Trọng

lư ong phần t ủ c ù a c á c GA th a y ctối tù 5 0 0 0 0 đến 10 0 - 0 0 0 [ 8 8 ] Các enzim tương đ ố i g iố n g nhau v ề th àn h phân a x í t am in ctiểu này không c h ỉ đúng v ố i cùng một l o à i mà còn ctúng v ố i c ả c á c

l o à i khấc n h au [ 8 5 ]

Thành phần h y d ra tc a c b o n chiếm tù 3% v ố i GA cù a Mucor rauxianus và Penỉcilium oxalum đến 20% v ò i GA tU A oryzaeiBB ] -Như v ậ y , t ắ t c à GA l à g ly c o p r o t e i n chíia c á c th an h

phần hydratcác bon chủ yểu l à m an o za, glucoza, g a l a c t o z a [ 8 4 ,8 5 ,

8 8 ] Các th àn h phẵn p r o t e in v à h y d ra tc a c b o n gẩn v ố l nhau bang

l i ề n k ể t g l u c o z i t g iữ a c á c phân từ h y d ra tc a c b o n v à c á c a x i t amin như t r ê o n in v à s ê r i n [ 8 5 ] H y d ra tcác b o n không những làm bên h o ạ t t ín h GA mà còn l i ê n quan đến h o ạ t đô enzim một c á ch khấ rõ r ê t K h i l o ạ i bò th àn h phần h y d ra tc a c b o n b à i c á c c h ấ t

ô x y h ó a ,S h ir e nhận th ấ y rắ n g h o ạ t áo cù a enzim giảm th e o t ỳ l ê

th u ận v ố i lư ộng h y d r a tc a c b o n b ị ô x y h ó a [7 0 , 8 3 ] T heo H iro m i,

tr o n g tr u n g tấm h o ạ t cĩộng củ a enzim có i t n h ấ t h a i nhóm

c a c b o x y l , t r o n g k h i đó v a i t r ò cửa c ấ c io n kim l o ạ i v à c á c nhổm

s u l f i h y d r y l l a i không quan tr o n g v ố i h o ạ t độ cù a GA K hi xủ l ý

v ố ỉ C N -,F - , EDTA t h ì hoạ.t ctộ enzim không b i ú c c h ế [ 8 5 ,8 8 ,9 6 ]

1 - 2 - M ố ỉ X iê n quan g iữ a kh à năng bám v ầ o b ộ t số n g v à khả

năng th u ỳ phân b p t số n g c ủ a GA.

Mặc dù GA l à môt t r o n g những enzim ẽhiộc n g h iê n cúu sầu

rộng nhất vế mẶt lý thuyết cũng như úng dụng thực t ế , nhưng

v ỉ ê c úng dung khà năng th u ỷ phần b ộ t sốn g củ a nó mói c h ì đuộc quan tâm n h ỉể u t r o n g những năm gần đây.N hũng th àn h tựu

tr o n g n g h iê n cúu úng dụng khả năng này l à môt t i ế n bô cíáng kế

tr o n g những n g h iê n c ử ư v ề a m ila za tllb 'i.

T rong v i ê c p h ấ t h iệ n khả năng th u ỷ phần b ọ t sốn g cù a

GA p h ả ỉ kể đến đóng góp cù a Y am asaki [ 1 3 6 ] Nhung nhũng n g h iê n cứu th e o hưóng n ày c h ỉ được chú ý sa u k h i Y am asaki v à Ueda báo cáo v ể th àn h công t r o n g úng dụng khả nãng th u ỳ phân b ộ t số n g

củ a GA để lê n men e t a n o l tr ự c t i ế p tù b ộ t gạo v à b ộ t n g ồ [ 1 3 7 ]

GA t in h s ạ c h thưòng tồ n t ạ i ờ h a i dạng GA I v à GA I I

H ai dạng iz o z im đã ctược t in h chế tù A nlger v à có tr ọ n g lilộ n g phân t ủ 74900 v à 5430 0 v ố i th àn h phần h y d ra tc a c b o n tương úng

l à 13% v à 18 % GAI th u ỳ phân t i n h b ộ t v ó i tố c đô nhanh htín GA"

I I [ 8 8 ] D iều đổ có n g h ĩa l à hầng số Km v ố i t in h b ộ t hổ hoá củ a

GA I I cao hơn BO v ố i cù a GA I T u y mhỉên c á c t á c g i à chưa quan tầm đến khà nãng th u ỳ phân b ọ t sốn g cù a c á c iz o z im n à y

Khi n g h iê n cúu GA củ a c á c chủng nấm mốc khác nhau ,

Y am asak i nhận th ấ y chúng thưòng tồ n t ạ i ả c á c iz o z im v à khác

b ô t sốn g mạnh gấp ba lầ n so v ố i GA I I [ 1 3 4 , 1 3 5 ] Các n g h iê n cúu

khác cù a U e d a [12 4 ] v à H a y a sh ỉd a [ 4 5 ,4 6 ] t r ê n A awamori cũng cho th ấ y GA I có khả năng th u ỷ phân b ộ t sốn g cao hôn n h iê u 80

v ố ỉ GA II.D ổ n g t h ồ ỉ c á c t á c g i ả [ 4 4 , 1 1 6 , 1 2 1 , 1 2 4 ] cũng nhận

th ấ y cố môt mốỉ tướng quan g iũ a khà nãng th u ỷ phân b ộ t sốn g

củ a GA I v à khả nãng bám củ a nó v à o b ộ t sống.G A I có khà năng bám v à th u ỷ phân m©,nh mẽ b ô t sốn g còn GA I I l ạ i không có khả năng bám cũng như khà năng th u ỷ phấn b ộ t sốn g hoăc bám v à th u ỷ phân b ô t số n g ỏ múc clô th ẩp c 1 1 6 , 1 2 4 ] K et quá tilđ n g tư cũng cíilOc A la m [17 ] báo cáo k h i n g h iê n cúu GA tù v i khuẩn

B s u b t i l i s 3018. TÌẨ th-Uc nghiệm ¿ t a c g i ả nhận đ ịn h ra n g t r ê n phân tủ enzim có h a i v ỉ t r í chúc năng khác nhau,m ột v i t r í

g iú p cho enzim bám v ào b ộ t sốn g còn v ị t r í k i a xú c t á c quá

t r ì n h th u ỳ phân như l à tru n g tầm h o ạ t ctong N ghiên cứu t r ê n

RhizowvcoríGO'i Amylomycesí 10 9 ] , Rhlzopusi 1 2 1 ] , A awamoriíAA,

46] E fibuligera[117Jc\y.B. môt số t á c g i ả khac cũng đồng ý v ò i nhân đ ỉn h n à y Tuy v â y cho ctển lú c đó chưa có n g h iê n cứu nào chúng minh đưoc g i ả t h i ế t t r ê n Đe làm sá n g tò v ấ n để n à y ,

H a y a sh ỉd a v à c t v [ 4 4 , 4 5 , 4 6 , 5 2 , 5 5 ] n g h iê n cứu GA t r o n g môi trư ò n g d ịc h th ể n u ô i A.awamori v à nhận th a y ra n g : enzim t ỉn h

sạ c h tổrí t ạ i ờ ba dang GA I,G A I ' v à GA I I v ố i t r ọ n g lưong phân tủ tương úng l à 9 0 0 0 0 ,8 3 0 0 0 v à 5 7 0 0 0 GA I có khả nảng bám v à th u ỳ phân b ộ t sốn g m©.nh mẽ t r o n g k h i đó GA I l ộ i không

có c ả h a i khả năng n à y T á c g i à đã t i ế n hành th u ỳ phân g i ó i hạn

GA I v ố i proteaza a x ỉ t h o ạc s u b t ỉ l i s ỉ n , lu e clb th a y ra n g GA I

b i c ấ t v à g i ả i phóng r a một g l y c o p e p t ỉ t ( G P I ) có t r o n g lưộng phân tủ l à 7000 v à GA I '.G A I ' không có khả năng bám v à th u ỳ

phằn b ô t eồng nhưng v ẫ n còn h o ạ t t ín h "thuý phân b ộ t sa u hồ hoá.Céic t á c g i ả khấc cũng dta.t chlöc k ể t quả tương tiA k h i n g h iên cứu GA t ù A niger K-271 1 8 ] về mầt d ỉ tr u y ề n học H a y a sh id a cũng chúng minh đuoc ra n g b iế n chủng A.fícum mất khả nầng

tổ n g hop proteaza c h i tồ n t a ỉ một dạng GA I tr o n g môi trư ò n g

n u ô i c ấ y T rong k h ỉ đó v ố i chủng chưa b i đ ô t b iể n GA vẫn tổ n

1 3 2 Chất úc chế GA thuỳ phấn bột sống.

C hất úc ch ế đ ã c h iậ u c á c phản úng enzim ctang th u h ú t

su quan tâm của nhiểu nhà nghiên cứu,nếu enzỉm là chất xúc tác

lý liê n quan đến chúc năng sinh học của một Bố enzim và khi đó

d iề u t r i có h iệ u quá.Như v ầ y v i ậ c n g h iê n cứu c h ấ t ú c chế v ù a

l a i vừa có ý nghĩa trong điều t r i các bênh liê n quan đến chúc

nguồn gốc tù v i sin h v è t ch ỉ th\Ac sư thu hút ctưoc su chú ý kể

tù khi Umerawa tá ch duoc ch ất úc chế pro teaza (Trypsln) tìl v i

b ấ t ctầu châm hơn k h i Murau [ 7 5 ] t á c h đưoc c h ấ t úc chế S P I - 1

t ù s đ la s ta d ic v s 2476 v a U e d a [12 0 ] t á c h chlOc c h ấ t ílc chế t ĩl

S s p 280 T iếp theo Fukuhara đã nhận ctưoc chất íic chế GA thuộc

loộ-ỉ a m ylo stero lt [ 3 9 ] t ìl S d ỉa s ta tỉc u s

N ghiên cúu c h ấ t úc chế đ ạc h iệ u cho phản úng th u ỳ phân

b ộ t số n g v ố i GA b ấ t đầu kể t ù p h á t h iê n cù a Saha v à Ueda [ 1 2 6 ,

1 2 7 ].Khi sử dụng chế phấm GA cfể lên men etan ol trực t iế p tù bột sống , Saha và Ueda nhân thấy hoat độ của enzim b ỉ úc chế

¿Ịáng kể k h i t ă n g nổng ctộ enzim ,như ng h iê n tượng n ày l ạ i không

thấy trong trưòng hộp sủ dụng enzỉm tỉn h sạ o h [1 2 6 ].Cho rấng

thương phẩm GA tù A n lger chíla ch ắt nào đó có hoat tin h ÍẲC

c h ế , t ấ c g i ả đ ã t i ế n hành c ả c bưốc t i n h B&ch chế phẩm qua c ô t

t r a o đ ổ i lo n D EAE-Sephadex-A25 r ổ i lọ c qua g e l G -10 0 v à nhân ctưởc mồt c h ấ t có bản c h ấ t l à g lycoprotein chíla 25%

h y d r a t c a r b o n , t r ọ n g lư ong phân t ủ 1 2 000 C h ấ t úc chế bám hoàn

đã t á c h ctưoc một g lyco p ro tein có tr ọ n g ruộng phân tử 1 0 5 0 0

cố hoạt tín h úc chế.Chất úc chế giàu các a x lt amin như :

s e r i n j 't r e o n i n g l y x i r ^ a x i t a s p a c t ỉ c Thành phần h y d ra tc a c b o n

giàu glucoza,xyloza,m anoza và galactoza.C hat úc chế bám hoàn

to à n v à o b ô t m l;ú c chế t ố ỉ 4 1,5 % múc độ th u ỳ phân b ộ t sốn g cù a

GA nhưng l ạ i không g â y úc chế phán úng th u ỳ phấn t ỉn h b ộ t sau

hổ hoá v ố i G A [9 3 ] Towmprayoon cho rầ n g phần p r o t e ỉn có v a i

t r ò quan t r ọ n g <íốỉ v ố i ho&t t í n h kim hãm cù a c h ấ t úc c h ế V iệ c

xủ l ý v ố ỉ proteaza đa làm mất khả nầng bám v a khả nầng klm hãm phàn úng th u ỷ phấn b ộ t sổ n g v á i GA củ a c h ấ t úc c h ế T ác g i à cũn g nhận t h ấ y c h ấ t ú c chế khác nhau v ề khà năng bấm v à o c á c

J

lo ạ i bột sống và proteaza ch i lam mất hoạt tin h kìm ham khi xử

c h ế sa u k h i c h ấ t úc chế đ ã bám v à o b ộ t s ổ n g [ 9 8 , 1 0 0 , 1 0 5 ]

H iện n ay v i ệ c n g h iê n cúu c h ấ t úc chế n ày v à cơ chế

t á c dụng c ù a nó v ẫ n đang ctưộc t ỉ ế n hành t ạ i Nhật

Ban[ 4 2 , 4 3 , 1 0 1 , 1 0 7 ]

I I SÀn xuất GA tà v i Binh vẬt.

Đăc điểm chung giũa lên men sàn xuất GA và các quá trìn h

lê n men v i s in h v â t khác l à h iệ u s u ấ t c ủ a c ả quá t r ì n h phv

thuôc vào ba yếu tố quan trọng : chùng giống v i sinh v â t, ctiều

k iệ n v à th àn h phần môi tr u ồ n g lê n m en,công nghệ lê n m e n [ ll ,2 0 ,

2 1 , 7 1 , 9 4 , 9 7 ]

2 1 Chủng g iố n g v i s in h v â t

v i s in h v ậ t đùng để sản x u ấ t GA cắn được tu y ể n chọn th eo một

sổ c h ỉ t ỉ ê u quan tr ọ n g n h u : t ố c đồ p h á t t r i ể n nhanh ,h iê u s u ấ t

tổ n g hớp enzỉm c a o úng v ó i moi đơn v ị cớ c h ấ t ,k h ả năng s in h trư ờ ng v à tổ n g hộp enzỉm ca o t r ê n môi trư ò n g đơn g ỉà n , r è t i ê n

có s ẵ n T ổ n g hộp i t h a y không có g l u c o z i l t r a n s f e r a z a ,k h ô n g s in h

c á c (ẩôc t ố N g o à i r a c á c c h ỉ t i ê u khác cũng cần đưộc đề cẬp đến

như chịu chlOc các tẩỉểu kiện bất l ộ i :n h iệt đô cao, pH thấp,có mật c á c chất chống n h i ễ m [ 2 1 ,9 4 ,9 6 ]

Những n g h iê n cúu v ê GA cho th ấ y ,h ầ u h ế t c á c nhóm v i

s in h v ậ t ctều có khả năng tổ n g hộp GA như: v i khuẩn [ 2 3 , 5 0 , 5 9 ] , nấm m e n [ 1 1 5 , 1 1 7 , 1 2 5 3 , nấm mốc[ 4 6 , 6 4 , 1 2 1 , 1 2 2 , 1 3 3 ] , x ạ khuẩn [ 4 0 ] , nấm b âc c a o [ 1 0 2 , 1 0 4 ] -Tuy n h iê n , t r o n g thUc t ế ctai d iệ n

th u ộ c c á c c h ỉ A sp e r g lllu s v à Rhizopus như: A niger,

A awamori, Rhizopus delemav,Rhizopus oryzae ctưoc chú ý n h iề u

h ớ n c ả [ 2 1 , 7 1 , 9 6 , 8 8 ]

V iê c tu y ể n chọn c á c chủng có h o ạ t đô GA c a o dùng tr o n g

có sẵn trong các bộ sưu tập v i sinh v ậ t [94] Shoichitaka clã

chùng có h o ạ t độ GA cao v à khả năng th u ỳ phần b ộ t sống hôn hẳn

2 ch ế phẩm GA ẽtưộc sả n x u ấ t t ù A.nlger v a JRhizopus deỉemarí 1 0 3 ] 0 T h á i L a n ,B r u m ir a t a r a [ 2 2 ]c ũ n g tu y ể n chọn ctưoc 2 chủng A n iger MUCK v à A n íger KMB-1 tòi 38 chung co san th 'ich hop cho quá t r i n h lê n men xốp v à d ic h th ể T h e o hưống phân l ậ p ,

T a n i v à c t v [ 1 0 6 ] đ ã phân lậ.p clüOc 18 0 chủng nấm s ô ỉ tù b ô t sấn n h ỉlm mốc v à chọn cíưoc chủng A.sp N-2 cò h o ạ t ctộ tương cfilöng 1 1 4 đôn v ỉ/g a m k h ỉ lê n men xốp v à 14 đơn v ị / ml k h i lê n men d ic h th ể T u y n h iê n thực t ế sàn x u ấ t không th o à mãn v ố i c á c chủng phân lậ p v à tu y ể n chọn t ù tự n h iê n , v i ệ c nâng cao h iê u

s u ấ t v à c ả ỉ b iế n c á c ctăc t í n h sẵ n cố củ a cố c chủng n g h iên cúu nhò k ỹ t h u ậ t d i t r u y ề n l à b iệ n pháp hữu h iê u ctáp úng nhu cầu thtfc t ế n ó ỉ t r ê n K hi sủ dung búc x ạ bấng t ỉ a tử n g o ạ i •,

K u nỉshim a [ 6 3 ] đ ã t ạ o được chùng đ ộ t b iế n có h o ạ t độ cao gấp

5 lẫ n chủng g ố c L i n [ 8 5 ] cũng th àn h công k h i g ây đ ô t b iế n v ầ chọn được chùng đ ộ t b iế n có h o ạ t đô GA cao gấp 1 5 lầ n so v ố i chủng g ố c K hi dùng phuớng pháp l a i B a l l [8 8 ] đ ã ta o đưộc chủng l a i A n lg er có ưu th ế hớn han chùng gốc v ề h iệ u x u ấ t

s in h tổ n g hop GA v à tô c cíô s in h triiớ n g

2 2 D iề u k iệ n v ầ th àn h phần môi trư ò n g lê n men sả n x u ấ t GA Môi trư ò n g có tầm quan tr ọ n g đ ặc b ỉ ê t dfến h iê u s u ấ t v à

l o ạ ỉ enzim ctưoc tố n g h ộ p C á c th àn h phần chù yếu cù a môi trư ò n g

như h y d r a t c a c b o n , n ỉ t d , p h o t pho cố v a i t r ò q u y ế t đ in h đến h iê u

s u ấ t s in h e n z i m C ll ] -T in h b ộ t , d e x t r i n , m a lto z a v à g lu c o z a tỏ

ra th ích hop cho v iê c ainh GA ỏ A awamorlíQQ'], còn saccaroza,

l a c t o z a , f r u c t o z a v à g a l a c t o z a l a i kém h ỉê u quả hớn Các phụ

phấm nông n g h iệp khấc nhu c á m ,trấ u cũng l à nguồn CÖ c h ấ t t h íc h

cho s ỉn h trũ ỏ n g v à s in h enzim cù a chủng n g h ỉên cứu mà còn l à

c h ấ t càm úng t r o n g v ỉ ê c đ iề u hoà s in h tổ n g hộp GA.GA l à sàn

phẩm trao ctổi chất bậc hai cùa tế bầo,chx đưoc tống hợp mạnh

mẽ trong những áỉều kiên nhất đ in h [21,71,85,96].T h eo Alam ,

h o ạ t độ GA tă n g k h i môi trư òn g có mặt c á c nguổn nguyên l i ệ u

enzim ở B lic h e n i forml s [ 20].

Các nguồn n it ơ v à lưong n i t ô khác nhau có ành hưởng đến h iê u s u ấ t s in h tổ n g hop GA Q a a le [8 8 ] nhân th ấ y c á c nguồn

nìtơ hữu CÖ làm tăng h iệu su ất tổng hộp enzim ỏ A awamori so

v ố i các nguổn n itơ vô cơ như n itơ r a tn a tr i Ket quả tương tư

cũng «áưoc Hang nhận t h ấ y k h ỉ sử dụng đâu tuơng làm nguồn n itơ

cho sàn xuất GA tù T thermophỉlalbA'] Ngược l ạ i v ò i A.sp N-2

T a n i l ạ i nhận th ấ y amon su n p h at làm tă n g h iệ u s u ấ t tố n g hộp GA gấp ba lầ n so v ố l nguổn n it ơ hữu cơ l à p e p to n [10 6 3 V iệ c sủ dung p h ố i hộp t h íc h hộp t ỳ l ệ amon su n p h at v à n i t r a t n a t r ỉ cho

k e t qua t o t hon k h ỉ dùng r iê n g r ẽ tù n g l o ạ i muối tr o n g sản

t xuât GA tù Aspergi 1 Just 11 ] Sunphat amon còn ảnh hưỏng đến quá trin h t i ế t enzim từ tế bào vào môi trưòng nhu Ingle đã nhân

th ấ y k h ỉ sả n x u ấ t ampdaza t il A oryzaeí 8 8 ] T y l ẹ g íừ a cacbon

v à n ỉt ơ được c o ỉ l ầ th ôn g số quan tr ọ n g tr o n g môi trư ò n g sản

xuất GA Tỷ lê này thay đổ ỉ tương đối lốn trên các ctối tưộng

khác nhau thậm c h í n gay c à v ố i c á c chùng tr o n g cùng một l o à i

V ố i c á c chùng A.niger, t ỷ l ê t r ê n th a y đ ổ ỉ til 20 v ồ i n g h iên cílu

của Minoda đến 1,2 trong nghỉên cúu của B lack [96].

Phốtpho chiếm v ị t r í quan tr ọ n g tr o n g c á c quá t r ì n h

t r a o đ ố i c h ấ t c ù a t ế bào cũng như tổ n g hộp enzim -Yamada nhận

th ấ y liiộ n g phốtpho t r o n g môi trư ồ n g tù 0,05% đến 0 ,1% l à

trư ò n g k h ác nhu n h ỉậ t ctô,pH cũng cẩn đưộc duy t r ì t h ic h hộp

cho lên men sản xuất GA.Giá t r ị pH t ố i ưu cho sụ phát tr iể n

không thưòng xuyên đổng n h ất v ố i pH t h íc h hộp cho tố n g hộp GA

đ ố i v ố i một chủ n g Chẳng han v ố i chùng A f o e li d e s ,pH t ố i t h ĩc h cho p h á t t r i ể n là 4 ,0 trong k h ỉ ctó pH t h íc h hop cho sản x u ấ t

GA l à 7 ,0 [ 8 8 ] „ G i á t r ị pH củ a môi trư ò n g không c h ỉ ảnh hưỏng đến h iệ u s u ấ t tổ n g hộp GA mà còn ảnh hưỏng đến t ỳ l ệ g iữ a c á c dạng iz o z im kh ác n hau W atanabe nhận th ấ y ,k h ỉ pH mối trư ò n g

tù 2 0 đến 2 , 5 t h ì A.awamori tổ n g hộp chủ y ếu c á c GA c h ịu a x i t

t r ị pH môi tru ò n g l à 6 ,0 đến 6 , 5 [ 1 1 ]

2 3 Lên men sân xuất GA

San xuât enzlm v ỉ sinh v&t nóỉ chung và sản xuất GA nối

r iê n g chu y êu th e o h a i phương pháp lê n men xốp v à lê n men

d ịc h th ê T u ỳ th u ộ c v ào chủng v ỉ s in h v ậ t dùng tr o n g sản x u ấ t ,

cơ c h â t v à đ iề u k iệ n th\Ac t ế mà chọn mợt phương pháp t h íc h

h ộ p

2.3.1.Phiiông pháp lên men xốp(solỉđ State fermentation).

Phương pháp lê n men xốp ctưộc Takam ine dtể x u ấ t ,mỏ đâu cho

công nghiệp sân xuất enzim nhò v i sinh vật [4 8 ,1 1 0 ] Phương phấp này tỏ ra thuận l o i ỏ một số măt chủ yếu như : de dàng thu

nhận sà n phẩm s ả n phẩm có th ể ctưoc dùng tr ự c t i ế p cho sàn

x u ấ t h a y làm khô ỏ n h iệ t độ t h íc h hợp sa u đó bảo quàn để dùng

dẵn ; hiêu suất sinh enzim trên môt ctón v ỉ cđ chất cao hdn 30

v ố i phương pháp lê n men d ỉc h t h ể ;c ó th ể sàn x u ấ t enzim tù c á c nguổn cơ c h ấ t sẵ n c ó , r ẻ t i ề n chẳng h&n c á c phụ phẩm nông

n g h iệ p như c á m ,t r ấ u Tuy n h iê n phuơng pháp này cũng bộc lộ một

Bố nhưoc điểm như tốn công và diện t i c h nhà xưỏng,d! nhiễm các

v i s in h v ậ t l a tr o n g sàn x u ấ t , khó ctỉều k h iể n v à duy t r ì c á c

th ô n g số môi trư ò n g t ố i ư u,khó khăn k h ỉ t r i ể n k h a i sàn x u ấ t

lố n v ố i cáo chủng đột b iế n hay c á c chủng l a i mẫn cảm v ố i những

men xốp là đô thống khỉ và ctộ ẩm mổi trưòng,chúng có liê n quan

c h ậ t chẽ đển h iệ u s u ấ t v à t h ò i g ia n cù a quá t r ì n h lê n men.

f e r m e n t a t io n )

Lên men d ịc h th ể ctuộc t i ế n hành tr o n g t h i ế t b ị lê n men ( fe r m e n t o r ) <íưộc Wemver đũa r a lẩ n đầu t i ê n năm 1 8 9 1 [9 7 ]

t h i é t b i th u ầ n l ộ i cho đ iê u c h in h c á c 'thong số môi ■brưòng "tối

ưu tr o n g sà n x u ấ t , c á c buốc t i ế n hành đươc th e o d õ ỉ v à kiểm

Bố như độ n h ố t môi trư ò n g , t ố c cfô th ôn g k h í v à t ố c đô khuấy

cần chiOc chú t r ọ n g

I

I I I s ả dung GA trong lên men etanol tò tinh bôt.

Công nghê lê n men e t a n o l tù t in h b ộ t b ấ t đâu vối" bưóc hồ hoá t ỉ n h b ộ t ỏ n h iê t độ cao tủ 80 đến 10 0 C [8 9 ] g iú p cho

t in h b ộ t đ ạ t t ố i múc <ẩộ hổ hoả hoàn to à n Khâu d ic h hoấ v à đưòng hoá t i ế p th e o chủ yếu nhò a-am£laza cù a v i khuẩn

B s u b t l l i s v à GA c ủ a A niger h ay Rhlzopus cteiejn ctr[4 8 ,8 9 ] Biiốc ch u yển hoá t i ế p th e o tù đưòng mói g i ả i phóng

th àn h e t a n o l được th tlc h iậ n nhồ c á c v i s in h v ậ t chủ yếu như nấm men s c e r e v i s i a e , v i khuẩn Zymomonass h ay nám s o i Rhizopus

Công nghệ lê n men tù t in h b ộ t đưoc t i ế n hành th e o h a i phương pháp chù y ếu l à Amylo v à M ycom alt.

3 1 Phướng phấp A m ylo.

T rong phương pháp n ày n g u ò ỉ t a c ấ y đong t h ò i c ả chủng nấm

tr-iiòng lê n men sau k h i hồ hoa t in h bpt , v a i "trò chủ yếu của

chùng nấm S 0 Ỉ l à tổ n g hộp enzim th u ỳ phấn t in h b ộ t th àn h đưòng cho nấm men ch yển hóa th àn h e t a n o l Quá t r ì n h lê n men k ế t th ú c

sa u 7 n gày ỏ n h iê t ctộ v à pH t h ic h hop.

3 2 Phướng phấp M ycom alt.

ơ đ ây v i ệ c d ịc h hoá v à đưòng hoá t in h b ộ t hổ hoá x ả y r a

sộ A sp e r g illu s hoạ.c Ehizopus). Sau đo v i s in h v ạ t le n men

e ta n o lín ấ m men hoặc v i khuẩn) ctược bổ sung vào để chuyến hoá

đưòng thành etanol.Q uá trìn h kết thúc sau 60 ctến 72 giò ỏ

n h ỉê t độ v à pH t h í c h hộp.

3 3 Lên men eta n o l trực t iế p tù bột Bống.

Những c h ỉ p h í v ể t r a n g t h i ế t b ị cho khâu hổ hoá t in h b ộ t

v à v i ệ c chuẩn b i nguồn enzim cho buóc hồ hoá v à d ịc h hoá l à một t r ỏ n g ạ i hạn chế khả năng cạnh tra n h g iũ a công nghệ sàn

x u ấ t e t a n o l từ t in h b ộ t v ầ r i dlưòng.Hạn chế n ày đưộc khẩc phục một c á c h đáng kể nhò t i ế n bộ mối đây tr o n g v i ê c úng dung khà năng th u ý phân b ó t sốn g cù a GA ctể lê n men e t a n o l tù c á c nguổn

ch ú a t i n h b ộ t

Ke tù th ôn g báo tíâu t i ề n củ a Y am asaki v ể khà năng sủ

dung s c e r e v i i a e và GA sàn xuất tíi A nỉger đe len men etan ol

t r ự c t i ế p tù b ộ t số n g th e o q u i t r ì n h t i ế t kiệm năng lư ộ n g [ 13 7 ]

nhiều nghiên cúu ctã quan tâm ctến vấn ctề này.Các nghiên cúu

hoãc sử dụng v i khuẩn v à nấm s ở i ctể lê n men e t a n o l [ 3 7 ,6 8 ] Một

eïizlm và nấm men.Chẳng han Ueda và FuJỉo[36,38,111 ]đã sử dụng

t h i e t b ị cô h ú t ch ân không ctể t á c h v à th u e t a n o l tù d ịc h lê n

m en,Bau đó thẩm t i c h lo & ỉ sàn phẩm k h ỏ i d ic h sa u lê n men để

t á i sủ dụng enzim v à nấm men cho quá t r ì n h lê n men t i ế p t h e o

T iế p ctó P u jío [ 3 6 ,3 7 ] c t ã đưa r a quá t r ì n h lê n men mối tr\Ac t i ế p

tù b ô t số n g ,s ủ đung c h ỉ môt chùng Rhizopus cho to a n bô quá

t r i n h Chủng nấm n ày v ù a có khả nãng s in h enzim có h o ạ t đô th\iỷ phần b ộ t số n g mạnh l & ỉ vù a có khả năng lê n men e t a n o l Quá t r ì n h n ày ctơn g iả n hơn q u i t r ì n h trư ố c ctó b ỏ i v ì không cần khằu chuẩn b ị enzim v à nấm men nhũng t h ò i g ia n lê n men kéo d à i (9 đến 10 n g à y ) v à h iệ u s u ấ t lê n men th ấ p ( 7 3 -8 2 % ) [ 3 8 ] V iệ c cố

cf in h enzim v à nấm men [ 2 9 ,4 7 ] h ay v i khuẩn [6 8 ] t r o n g quá

t r ì n h lê n men t ù b ô t sốn g cfã ctưoc để c ậ p đ ế n L e e đã t i ế n hành

cố đ in h enzim t r ê n k i t i n v à v i khuẩn Zymomonas t r ê n

n a t r i a g ỉ n a t ả h a i c ộ t r i ê n g r ẽ k h i lê n men e t a n o l tù b ộ t số n g

K et quà cho th ấ y mặc dù h iệ u s u ấ t lê n men có th ể đ ạ t t ố i 87%

so VỐI l ý t h u y ế t nhưng t r o n g mè lê n men đầu t i ê n c á c h ạ t

n a t r i a g ỉ n a t b i VÖ v à v i khuẩn g i á i phóng v ào môi trư ò n g tù g i á

th ể do áp lư c C02 tã n g tr o n g quá t r ì n h lê n men [ 6 8 ] N ghiên cứu

men trong màng siê u lọc rvhẵm t á i sử dụng tế bào nấm men và GA

và đ a t đước h iê u s u ấ t 90% 80 v ố i l ý th u y ế t.M ã c dù v â y tro n g

yếu t ậ p tr u n g v à o q u i t r i n h lế n men e t a n o l tù b ộ t sống v ó i

nguốn GA sàn xuất trUc t iế p tù nấm s ộ i A n l g e r l l l l , 112] và A awamorí[3b ,7 2 ,7 3 ] hay Rhizopus[ 3 6 ,3 7 ,3 8 ] Phương phầp nay đa

đưoc t r i ể n k h a i sà n x u ấ t lố n t a i côn g t y S u n to ry Nhật B ân [ 1 1 5 ]

v à c á c nhà máy t ạ i P h i l i p i n [ 1 2 ] ơ đ â y n g o à i c á c th ôn g số như

n h ỉê t ctô, pH môỉ trư ò n g t h íc h hộp cho phán úng enzỉm v à s in h trưởng c ù a nấm men , c á c th àn h phần khấc như lưộng en zim , nấm men v à b ộ t số n g có v a i t r ò q u y ế t ctịnh đến h iệ u s u ấ t v ầ tố c độ của quá t r ì n h lê n men.

Khỉ lên men từ các nguổn nguyên liệ u chúa tin h bôt nói

chung v ầ b ộ t số n g n ó i r i ê n g , nguổn enzim l à th àn h phần quan tro n g hàng đâu q u y ế t đ in h to à n bộ quá t r i n h .T h ò i g ia n v à h iê u

s u ấ t quá t r ì n h phụ th u ọ c trư ó c t i ê n vào h o ạ t dtọ của nguổn enzim sủ dụng h a y v à o khả năng th u ỷ phân t r i ệ t để ruộng b ộ t sống có t r o n g đ ỉc h lê n men chuyển th àn h đưòng chuyển hoá thầnh

e t a n o l nhò nẩm m en.Enzim th u ỳ phân b ộ t sốn g đuoc p h á t h iệ n ỏ

n h iểu nhóm v i s in h vẬ t nhu nấm m en[1 1 1 , 1 1 7 ] , nấm mốc [ 4 8 , 1 2 4 ,

1323 , v i k h u ẩn [ 1 7 , 2 4 ] ,x ạ k h u ẩ n [4 0 ], nấm bâc cao [ 1 0 4 ]

c á c chủng nấm mốc th u ộ c h a i c h ỉ Rhizopus , A sp erg illu s v à nấm

men Saccharcmycopsis fib u lig e r a l 115,117] ở dạng đâm đạc có

h o a t đô enzim t ù 750 <íơn v ỉ/ m l đến 15 0 0 <íứn v ị/ m l [ 7 2 ] hoẽc

hai dong này đểu thuần l ộ i cho vần chuyển , bảo quàn và sù ứvng trong sản xuất dưối các tên thương phẩm như:Glucuzym GRL, GA-AMG,M&t khác nhầm đáp úng t ộ i chỗ nhu cầu GA dùng cho sàn

x u ầ t e t& n o l t ạ i c á c CÖ sơ có Ọ[UỈ mô nhò , nguồn enzim cũng

đưộc chuẩn b i bầng cách lến men xốp v ố i các chùng Rhizopus và

tỉê p cho lên men eta n o l hay toàn bộ sàn phẩm sau lên men cũng

có thể dùng làm nguổn enzím thô cho sản xu ấ t[3 5,111,112,113, 1143.

Trong quá tr ìn h lên men etan ol tù các nguyên lỉệ u thông thuồng ,v iệ c bổ sung s c e r e v is ia e lên men etan ol là lúc

đã kết thúc quá tr ìn h dich hoá và quá trìn h clưòng hoá gần nhũ xây ra hoàn toàn.Lúc ctó ch ỉ xảy ra môt quá tr ìn h lên men etanol tù đưòng Tốc ctộ cùa quá tr ìn h phụ thuộc chủ yếu vào

số lilộng và cưồng độ lên men cùa tế bào nấm men vố i quá trin h

vẬ y.ơ ctẳy có h a i quá t r ì n h đồng t h ò i x ả y r a : th u ỷ phân b ô t

Bống thành chlòng và lên men eta n o l từ chlòng nhò nấm men.Nhiều

Khi đó t ấ t cả ctưòng lên men vùa ctược g iả i phóng nhò phàn úng thuỷ phân bột sống cùa enzim ctươc sủ dụng hết ngay cỉể lên men etan ol và tố c <áô cùa quá tr ìn h ch ỉ phv thuộc chủ yếu vào tốc

dô thuỳ phân bôt sổng Tuy nhiên vể số lương tế bào nấm men sủ dụng cũng không thống nhất.Ueda cho b i ế t , vẫn cíat t ố i hiệu suất lên men e ta n o l cao t ó i 90-95% khi sừ dụng lUộng tế bào nấm men

là 1 gam/100 ml dlch lên men.Trong thực tế lUộng tế bào nấm

men é p [ 1 1 2 3 v ố ỉ quá t r ì n h lê n men g ỉá n đoạn t r ụ c t i ế p tù b ộ t

sống th ì v iệ c sân xuất nấm men chù yếu theo con đưòng hiếu

k h í[ 3 5 ,3 8 ,7 2 ,lll,1 1 2 ] ,clôi khỉ theo con ctưòng yểm k h í[27,114,*

hiếu khí và yếm khỉ khi t iế n hành lên men gián ctoaníbatch ferm entation), nhưng có thể nhận thấy sự khác b iệ t trong quấ trình lên men bán liê n tụ c ơ đây , ưu thế về khả năng chống

ch iu c á c sả n phẩm t r a o đ ổ i c h ấ t l ạ i th u ộ c v ề nấm men đước

chuẩn b ị theo con đưòng yếm k h i.

nói chung h ay lxlộng b ộ t sấn sống n ói r iê n g sẽ ảnh hiiỏng trự c

t i ế p đến t ố c đọ v à h iệ u s u ấ t cù a quá t r ì n h th ôn g qua áp s u ấ t thẩm th ấu N ồ n g đô cơ c h ấ t cao làm tă n g áp x u ấ t thẩm th ấ u , ngăn

cản quá "trình trao đôi chât của nâm men, úc chê quá trìn h lên men và t i ế t eta n o l vào mối trưòng[51] Điếu này dẫn đến v iệ c

hình th àn h c ấ c sà n phẩm phụ v à giâm h iệ u s u ấ t lê n men.Mặt khác

lưong bột sống còn ânh hưởng đến tố c đô cùa cà quá tr ìn h thông qua nồng đô cớ chất theo phương tr ìn h M ichaelis-M enten[2].M ột

cyan o-glu cozit c6 tá c dụng ức chế phản úng thuỳ phân của GA

£ 1 4 ] Chỉnh v ì v â y <áể đ ạ t h iê u s u ấ t lê n men cao cần p h ả i lư a

chọn lư ộng bột Bẩn sống th lch hộp.

Lên men eta n o l trtfc t iế p tù bột Bống là một t iế n bộ

kỹ th u ậ t t r o n g công nghê lê n men tù t in h b ố t.N ó mang l a i h iệ u quà k ỉn h t ế đáng kể th ôn g qua v i ệ c t i ế t kiệm t ó ỉ 40% c h ỉ p h í

vê năng luợng dùng cho bưốc hổ hoấ t in h b ộ t [ 3 2 , 7 2 , 7 3 , 1 1 5 ] Đôn g iả n bưốc hồ hoá so v ó i c á c q u i t r ì n h trư ó c đ ây vùa t i ế t kiêm đưoc c á c c h i p h i cho khâu nầy v ù a t ạ o r a khả nãng úng dụng th u ận l o i cho c á c cơ sờ sản x u ấ t b ị hạn chế v ề vốn ctầu tư

ban đầu [ 8 4 ] Tuy nhiên trong thuc tế sản xuất,phương pháp này

cùng bộc l ộ một số nhược điểm như t h ò i g ia n lê n men kéo d à i v à

h iệ u s u ấ t lê n men th ấ p do nhiễm c á c v i khuẩn t r o n g thành phần môi t r iiò n g T h ò i g ia n lê n men chậm 5 - 7 n gày [ 3 5 , 3 7 , 3 8 ] chủ yếu

l i ê n quan ctến t ố c đô th u ỳ phân b ộ t sốn g cù a GA chậm so v ó i

t in h b ộ t hổ h o á.U ed a nhận th ấ y tố c độ lê n men b ộ t hổ hoá lốn hôn h a ỉ lầ n so v ố i t ố c độ lê n men b ô t sốn g t r o n g cùng ctỉều

k i ê n C l l l ] M ãt kh ác SU la n g ctọng cù a b ộ t sổn g tro n g môi trư òn g

l ê n men cũng c á n t r ả S\A t ư ơ n g t á c g i ữ a e n z i m v à b ộ t s ố n g dẫn

đến làm chậm t ố c ctô phản úng v à keo d à i t h ò i g ia n lê n men Đe khấc phục nhưộc ếiểm n ày môt mặt p h à i n g h iê n cúu ìvta chọn nồng

<íọ enzim v à ctiều k iệ n t h íc h hộp cho phàn úng th u ỷ phân GA v ó i

một lượng bọt sống nhất đ in h [lll]-M ậ t khác , cần t iế n hành lên

men e t a n o l ỏ n h iệ t cíô c a o (40 C) v ó i nấm men c h iu n h iê t nhẳm

rút ngấn t h ò i gian lên men thông qua v iê c tăng tốc đô phàn úng thuỳ p h ẳ n c ủ a GA nh ò n h i ệ t ¿ 0 [ 2 7 ] U e d a v à Fu j io ctã t h à n h công

k h i t i ế n hành lê n men v ố i t h i ế t b ị cố hệ th ốn g cánh khuấy nhầm

han chế B\J lẩng đọng cùa bột sống [3 6 ].

Khâu hố hoa t i n h b ộ t không những th uận l o i cho phản úng

th uỷ phân cù a GA mà còn có t á c dung th an h trù n g c á c tạ p khuẩn

cố tr o n g nguyên l i ệ u lê n m en.D iều n ày không x ả y r a v ố i quá

t r ìn h lê n men trU c t i ế p t ù b ộ t sốn g Sự có mặt cù a t&p khuẩn

là mối đe doa <Jối v ố i h iệ u s u ấ t củ a quá t r ì n h lê n men Nhấm khấc phuc khó khăn n ày ,m ôt mặt cần t i ế n hành lê n men tro n g môi trư ò n g pH t h ấ p ( 3 , 5 - 4 , 0 ) t h íc h hộp cho phàn úng th u ỳ phân cùa GA v à lê n men c ù a nấm men [ 3 6 ] , mặt khác có th ể sừ dung ưu

th ế v ề số lilộ n g t ế bào nấm men nhầm cạnh tr a n h cơ c h ấ t lê n men tro n g cíỉều k iê n b ấ t l ơ i cho v i khuẩn l à pH th ấ p v à nồng <JÔ

e t a n o l c a o t r o n g môi t r ư ò n g [ 7 3 ] V iệ c dùng c á c c h ấ t chống nhiem khuẩn chẳng hạn K 2 S 2 O 5 v ố i t ỳ l ệ 0,02% g ây úc chế v i khuẩn nhưng không ảnh hưỏng cfến nấm men Xên men e t a n o l [ l l l ] Trong sản x u ấ t lố n c á c b iê n pháp t r ê n đưộc dùng p h ố i hop v ố i nhau[ 1 1 5 ]

Những t i ế n bô gần ctầy tr o n g n g h iê n cúu bàn c h ấ t củ a quá

t r i n h lê n men t r ự c t i ế p tù b ộ t sốn g cho th ấ y khả năng tổ n g hộp

GA th u ỳ phân b ộ t số n g l ầ do gen q u ỉ đ i n h A s h i k a r ỉ [ 1 5 ] ctã chuyển gen tổ n g hởp GA th u ỳ phân b ộ t sốn g tù Rhizopus vào

s c e r e v is ía e nhò p la s m id PYGA-2269 v a nhân chlơc chủng nấm men mối có khả nãng lê n men e t a n o l t r ụ c t i ế p tù b ô t s ố n g [ 1 6 ]

Phần 1 1 1 ; N G U Y Ẽ N L iê u v a I P H Ư Ơ I S I G .

ĩ Vi B i n h v é t

-Nấm Bội t r o n g lu ậ n v à n này sủ dụng 35 chủng đ a n g

*

(áưộc bảo quản t ạ i TTNCVSVUD v à c á c chủng phán lậ p đước

tù bánh men v à b ộ t nhỉem mốc ổ c á c đ ị a philơng khấc nhau -Nêứn men :s ừ dụng 87 chùng đang đưộc bào quản t ạ i TTNCVSVHUD.

ĨĨ.Hoá chất v à t h i ế t b i

2 1 Hoá c h ấ t.

Các hoá c h ấ t t i n h k h i e t cíạt cíộ sạ c h phân t í c h tro n g nưóc

và nưốc ngoài chù yếu sau:

2 - l.l.H o ấ chất dùng díể đinh lưộng hydratcacbon

CUSO 4 5 H 2 O, Fe2(S0-4>3, KMnƠ4(Chemical Kanto C o ,N h Ậ t)

2 2 Các t h i ế t b i

Cân ctiện (E B -26 0 0 Sh im ad zu , Nhật ,T Y P -2 2 5 4 , S a r t o r i u s , Đúc ),

tủ ấm (TYP-2009,Memmert,Đúc),máy lấ c ổn nhiệt(TYP- 1083,

G FL,D ứ c), n ổ i c á c h th u ỷ ổn n h iệ t ( T Y P - 10 0 2 , GFL, Đúc) máy

l y tâm (TY - 2 4 , B a la n ) , máy so màu(UV-1 5 0 , Shim adzu,

pH( Đúc), cổn k ế( Tokyo,NhẬt).

I I I C ấ c p h ú ở n g p h á p p h ầ n t í c h :

3 1 Đ ịnh lUOng đuòng khử th e o phüöng pháp m lc r o - B e r t r a n d [ 6 i ]

3 1 1 Chuẩn b i.

-dun g d ic h B : C-ftH-iKNaO© 4 H 2 O 200 gam

t r ê n t ù a rứ a t ủ a v ố i 5 ml rnióc c ấ t , l y tâm th u l ấ y tủa.Thêm

3 ml dung d ịc h c l ẩ c cho ta n đểu C h u ẩn dộ v ó i dung d ịc h D cho ctến k h i x u ấ t h iệ n mầu hổng n h ạ t.G h ì số ml dung d ic h D,

Cân 100 mg bọt cho vào ống nghiêm chịu n h iệt,b ổ sung

tục trong 3 giò , làm lanh , trung hoà v ố i Na2C03.Thêm nưốc cat cho cíù 5ml.xác định tổng số ctưòng khử có trong dịch sau thuỳ phẩn bắng phương pháp micro-Bertranđ.Lưong tin h bột ctilộc tín h tương chiởng v ố i tổng số ctưòng khủ nhân vố i 0 , 9 Tù

đó tin h số phần trăm tin h bột trong mẫu[14].

3 3 Xấc đ ịn h h iê u s u ấ t lê n men e t a n o l

sủ đụng phướng pháp cất hiệu suất theo các nghiên cứu

trư ó c đ â y [ 3 5 , 3 7 , 1 1 2 ] Lấy 10 0 ml d ic h sau lê n men , thêm

vào một lưộng nưốc cấ t tương cíưống.Nổi v ố i ong sinh hàn,

c ấ t(v /v ) bang cổn kế.

Phân trãm h iế u s u ấ t lê n men đươc t ín h th eo h iệ u s u ấ t

-dung d lc h F o l i n - C i o c a l t e u 'IN.

3 4 2 -Cách t i ế n hành:

Chuẩn b i dung d ic h c n g ay trư ố c k h i dùn g:pha d ịc h A v à

B th eo t ỳ l ê l : 5 0 ( v / v )

Lấy 0 , 5 ml mẫu phân t í c h <100-1000 M g/m l p r o t e ỉ n ) , thêm vào

5ml (ịung dịch c , lấ c đêu, ctể 10 phút, thêm vào 0 ,5 ml dich

F o l i n - C ỉ o c a l t e u , l ấ c ctều,để n h iệ t độ phòng tro n g 30 p h ú t, so

màu ỏ bưốc sóng 750 nm.íLâp đổ th i chuẩn v ố i albumin huyết thanh bò có nổng đô thay đổi tù 100 ctếniooo ụg/ml p rotein

IV Các mổi trúòng chủ yểu .

4 3 MÔI truòng Czapek[3]:

mlóc máy vừa ¿tủ,pH(6,0-6,5> ,Khủ trùng(1 atm/30 phút).

4 4 Môi tru ồ n g cám ~trâu :Dùng cho sàn x u ấ t enzim tro n g

4 5 Môi truồng lên men eta n o l[4 ]

Glucoza (18%),pepton(0,5% ), KHsPCU (0,3%),MgSCU(0,1%) miốc máy vùa đù,pH 4 ,5

5 1 X ác đ ịn h h o ạ t đô GA [ 7 2 , 1 1 4 ]

n a tr i a x êta t 0,2N,pH 4 ,5 :1 m l;nư óc c ấ t : l ml; d ịc h enzim :

lm l.T o à n bô hon d ịc h chlởc g iữ 10 phút ổ 40 c , l ẩ y lm l d ic h phản úng x á c đ in h đưòng khủ th e o phưông pháp m icro - B e r t r a n d Một <íơn v ị h o a t đô GA l ầ lượng enzim làm g ỉ â i phóng lưong đưòng khừ tương đương v ó i lmg g lu c o z a tr o n g 1 ml hon d ịc h phàn úng ỏ đ iể u k iệ n t r ê n

phàn úng x á c đ ỉn h đưàng khử th e o phtldng pháp m ic r o - B e r t r a n d

Môt đỏn v ị hoạt độ GA v ố i bọt sông là lượng enzim lầm

g iâ i phồng lương đưồng khử tương đưứng vố i lmg glucoza

tro n g 1 ml hon d ịc h phản úng ỏ đ iề u k iệ n t r ê n

V I C ác t h í n g h i ê m c ụ t h ề i

6 1 ,Phân lâ p , tuyền chon chủng và t ố i ưu hoá môi trưòng sản xuất GA.

6 1 1 Phân lập và thuần k h iế t chùng nấm S0i có hoạt tin h

GA thuỷ phân bôt sống.

nhau v à c á c mẫu b ô t nhiễm mốc.

-M ôi trư ò n g phân l ậ p : môi trư ò n g M a rtin

- c á c h t i ế n h à n h :c â n l ấ y một gam mẫu cần phân lâ p ,p h a

loãng v ố i mlốc vô trùng có đô pha loãng 10 3-10 6 Chuẩn bị sẵn và khủ trùng thành phần môi trưồng Martin (trù tỉn h bôt

v à s t r e p t ô m y x in ) Sau k h i thanh trù n g áể n h iệ t đô ha xuống

t ố i 4 5 - 5 0 ° C ,b ổ sung t i ế p s tr e p tô m y x in v à t ỉn h b ộ t (đã etưoc

khử trùng khô ỏ n h iêt đô 120 c trong 2 giò).L ấc đểu,đổ

15 ml ra <íĩa p e t r i ( d = 15 cm);cfể n g u ô i v à lầm khô măt th a c h ; ctể ỏ t ủ ấm sa u 24 g iò K iể m t r a p h ấ t h ỉậ n v à l o a i c á c đ ĩ a có khuẩn l ạ c nhỉSm nếu có trư ố c k h i phân lâp D ù n g p ip e t vô

trùng l ấ y 2 0 - 3 0 M1 mẫu phần lậ p cho vào c á c đ ĩ a th ạ c h ỏ

trên g a t õfêu trên mặt thach.Giữ trong tủ ấm 30 c , kiểm tra

gự x u ằ t h iậ n cu â c a c khusin l ặ c ĨĨIOC SŨU 2 4 ) 36 J 48 y 00 § iò - Csc

khuẩn lạ c mốc x u ấ t h iê n t a i c á c th ò i điểm t r ê n đuộc cấ y

t r u y ề n v à o ống nghiệm th ach n g h iê n g chúa môi trư ò n g C zapek.

6 1 2 Tuyển chọn c ấ c chùng nấm mốc cỏ h o ạ t đô GA cao

Bưốc tu y ể n chọn dưa v à o v i ệ c x á c đ ỉn h h o ạ t tíộ GA của

d ịch c h i ế t enzim tù môi trilòn g cám t r ấ u lê n men các chùng

nấm mốc kh ác nhau như s a u :b à o tủ nấm mốc cố tro n g ống th ạch

n g h iên g (s a u c ấ y t r u y ề n 7 - 1 0 ngày)cfuoc hoà ta n v ố i 10 ml rniốc vô trù n g .L ấ y lm l d ic h bào t ù ( 1 0 B - 1 0 B bào tủ /m l) chia vào b ìn h nón l o a i 250 ml chúa môi trư òn g cám t r ấ u đã đũôc

khủ trùng sẵn Lấc đều, giũ à 30°c trong 5 ngày.Bổ sung vào

100 ml nưốc c ấ t »nghiền nhỏ hê sơ ỉ nấm ,ctể qua đêm ờ 4° c

Loc bỏ s ử i n ấ m ,ly tâm d ịc h lọ c ỏ tố c độ 8000 v ò n g /p h ú t.

D ich enzim th u cỉưoc dùng để x á c đ in h h o ạ t độ GA,

6 1 3 T ố i tiu hoá đ iể u k iệ n v à môỉ trư ò n g sả n x u ấ t chế phẩm GA

th a y đ ổ ỉ t ỳ l ậ cám t r ẩ u

+ Ảnh hường của n h iệt đô : n h iệt độ lên men thay ctổi

t ù 2 5 - 4 5 c

+ Ảnh huởng củ a pH ban đầu:D ựa vào v i ê c th a y ctổi pH

củ a d ic h khoáng làm âm môi trư òn g v ố i HC1 0 ,1N v à

NaOH 0 , IN

n g ày cú sa u 24 g iò mẫu ctưởc l ấ y r a , x á c đ ịn h h o ạ t dô GA.

-T ố i ưu hoá th àn h phần môi trư ơ ng cho san x u a t GA dua

th eo c á c phương pháp đ ã đưoc mô t ả trư ố c đ â y [ 4 , 1 3 , 9 5 ] lầ n lu o t

qua các bưốc sau:

►

+Chon các thành phần môi trưòng th lch hộp dvla theo phương pháp ồ vuông L a tin h [1 3 ].0 đây thành phần các bon(C) đưộc ltfa chọn tù các nguồn như:Tinh bôt tan (C i);b ột sẩn(Cs);

nhu: (NH-4 )2S04< N i); ( NHa )zCO( N 2 ), NH 4 NƠ 3 ( N 3 ) và thành phần phốt pho ctươc chon tù các nguồn sau: KH2P04(P.2>; K 2 HP 0 < (P i);

Pĩĩ05(P3) Thi nghiệm đưộc bố t r í theo ô vuông Latinh như aau: