Xác định sự phân bố các Genotype của HCV ở bệnh nhân đến khám và điều trị tại bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương năm 2010 - 2011

Nhưng hiện nay, việc phân loại theo hình thức này không chính xác do vi rút thuộc kiểu gen 6 của HCV có trình tự đoạn này giống với các chủng thuộc kiểu gen 1 nên có sự phân loại nhầm lẫ

1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ NHƯ HÀ

XÁC ĐỊNH SỰ PHÂN BỐ CÁC GENOTYPE CỦA HCV

Ở BỆNH NHÂN ĐẾN KHÁM VÀ ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT ĐỚI TRUNG ƯƠNG

NĂM 2010-2011

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS NGUYỄN VŨ TRUNG

HÀ NỘI - 2012

2

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

(Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải)

BVBNĐTƢ Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương

(Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa bệnh tật)

men)

(Vi rút gây suy giảm miễn dịch ở người)

QHTDKAT Quan hệ tình dục không an toàn

(Phản ứng chuỗi trùng hợp sao chép ngược)

3

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 10

1.1 Vi rút viêm gan C 10

1.1.1 Hình thái và cấu trúc hạt vi rút 10

1.1.2 Chu trình tái bản của HCV 12

1.2 Viêm gan vi rút C 14

1.2.1 Khái niệm 14

1.2.2 Đường lây nhiễm 14

1.2.3 Diễn biến tự nhiên 14

1.2.4 Chẩn đoán phòng thí nghiệm 16

1.2.5 Điều trị viêm gan vi rút C 17

1.3 Các đặc trưng của kiểu gen HCV 18

1.3.1 Kiểu gen HCV phân bố theo địa dư 18

1.3.2 Kiểu gen HCV với nguy cơ lây nhiễm 21

1.3.3 Kiểu gen HCV với mô bệnh học 21

1.3.4 Kiểu gen HCV với đáp ứng và dự đoán đáp ứng với điều trị 21

1.3.5 Kiểu gen HCV với thời gian điều trị 22

1.3.6 Kiểu gen HCV với liều lượng thuốc điều trị 22

1.3.7 Kiểu gen hỗn hợp của HCV 22

1.3.8 Gan nhiễm mỡ và mối liên quan đến kiểu gen của HCV 23

1.3.9 Kiểu gen và diễn tiến bệnh viêm gan C mạn tính 23

1.3.10 Kiểu gen và ghép gan trong nhiễm HCV 23

1.4 Tình hình bệnh viêm gan vi rút C và các nghiên cứu 23

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

4

2.2 Vật liệu nghiên cứu 25

2.2.1 Sinh phẩm, hóa chất 25

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 26

2.4 Quy trình nghiên cứu 27

2.4.1 Thu thập và bảo quản mẫu huyết thanh 227

2.4.2 Quy trình xác định Anti-HCV 28

2.4.3 Quy trình xác định tải lượng vi rút 29

2.4.4 Tách chiết RNA từ mẫu huyết thanh 32

2.4.5 Xác định kiểu gen HCV bằng kỹ thuật giải trình tự gen 33

2.4.6 Thu thập thông tin từ hồ sơ bệnh án 37

2.5 Thời gian nghiên cứu 37

2.6 Địa điểm nghiên cứu 37

2.7 Xử lý số liệu 38

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 39

3.1 Đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu 39

3.1.1 Đặc điểm về tuổi 39

3.1.2 Đặc điểm về giới 40

3.1.3 Tiền sử nhiễm vi rút viêm gan C 41

3.1.4 Tỷ lệ đồng nhiễm HIV và HCV 42

3.1.5 Tải lượng vi rút HCV 43

3.2 Phân bố kiểu gen của HCV ở bệnh nhân đến khám và điều trị tại BVBNĐTƯ 44

3.2.1 Lý do lựa chọn kỹ thuật sequencing tại khu vực core để xác định kiểu gen và kiểu gen phụ của HCV ……44

3.2.2 Phân bố kiểu gen của HCV 45

3.2.3 Phân bố kiểu gen phụ của HCV 47

5

3.3 Mối liên quan giữa kiểu gen HCV với một số đặc điểm về dịch tễ học

và cận lâm sàng 53 3.3.1 Mối liên quan giữa kiểu gen của HCV và tuổi 53 3.3.2 Mối liên quan giữa kiểu gen của HCV và giới 54 3.3.3 Mối liên quan giữa kiểu gen của HCV và tiền sử phơi nhiễm HCV 55 3.3.4 Đặc điểm kiểu gen HCV giữa 2 nhóm đối tượng có đồng nhiễm

HIV và không đồng nhiễm HIV 56 3.3.5 Mối liên quan giữa kiểu gen của HCV và mức độ biến đổi chức

năng gan 56 3.3.6 Mối liên quan giữa kiểu gen của HCV và tải lượng vi rút 59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

6

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự mồi 25

Bảng 3.1: Phân bố bệnh nhân theo tuổi 39

Bảng 3.2 Đặc điểm tiền sử phơi nhiễm viêm gan C 42

Bảng 3.3 Đặc điểm về tải lượng vi rút của mẫu nghiên cứu 43

Bảng 3.4 Mối liên quan giữa kiểu gen HCV và tuổi 53

Bảng 3.5 Mối liên quan giữa kiểu gen HCV và giới 54

Bảng 3.6 Mối liên quan giữa kiểu gen HCV và tiền sử phơi nhiễm HCV 55

Bảng 3.7 Đặc điểm phân bố kiểu gen HCV giữa 2 nhóm đối tượng có đồng nhiễm HIV và không đồng nhiễm HIV 56

Bảng 3.8 Mối liên quan giữa kiểu gen của HCV và men gan ALT 57

Bảng 3.9 Mối liên quan giữa kiểu gen của HCV và men gan AST 57

Bảng 3.10 Mối liên quan giữa kiểu gen của HCV và Bilirubin toàn phần 58

Bảng 3.11 Mối liên quan giữa kiểu gen của HCV và tải lượng vi rút 59

7

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ đồng nhiễm HCV và HIV 42

Biểu đồ 3.3 Đặc điểm phân bố kiểu gen HCV 46 9 Biểu đồ 3.4 Phân bố các kiểu gen phụ của HCV 48 1 DANH MỤC HÌNH Hình 1: Mô hình cấu trúc của HCV 10

Hình 2: RNA của HCV 11

Hình 3: Chu trình sống của HCV 12

Hình 4: Sơ đồ tiến triển bệnh nhân nhiễm HCV 15

Hình 5: Tỷ lệ kiểu gen HCV ở các khu vực trên thế giới 19

Hình 6: Tỷ lệ kiểu gen HCV tạicác nước Châu Á 20

Hình 7: Tỷ lệ kiểu gen HCV tại Việt Nam 21

Hình 8: Tỷ lệ nhiễm HCV ở các khu vực trên thế giới 24

Hình 9: Cây phát sinh loài của kiểu gen phụ 1a 50

8

MỞ ĐẦU

Bệnh viêm gan vi rút C hiện nay đang là một vấn đề y tế toàn cầu Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới, tỉ lệ nhiễm HCV trên thế giới khoảng 3,1%, tương đương 170 triệu người, với số nhiễm mới 3-4 triệu người mỗi năm [10] [24] [57]

Tổng chi phí y tế dành cho chẩn đoán và điều trị cũng như phòng viêm gan vi rút C dự đoán tăng từ 30 tỷ USD vào năm 2009 lên đến hơn 85 tỷ USD vào năm 2024 Nếu không điều trị, viêm gan vi rút C diễn biến thành biến chứng xơ gan, ung thư gan và

có thể dẫn đến tử vong [31] [57] Tỉ lệ nhiễm HCV dẫn đến xơ gan là 15-20% sau 20 năm Tỷ lệ ung thư gan trên bệnh nhân nhiễm HCV chiếm khoảng 1,4-3,3% mỗi năm, trong đó, tử vong là 2,6-4% [57] Ở Việt Nam 510% dân số nhiễm HCV [12]

Viêm gan vi rút C là một bệnh nguy hiểm vì triệu chứng lâm sàng thường không rõ ràng, 90% trường hợp không có triệu chứng, trong khi đó hậu quả của bệnh để lại thường rất nặng nề Có 50%-80% viêm gan vi rút C chuyển thành mạn tính, 20%-25% bệnh nhân mạn tính diễn tiến qua xơ gan và ung thư gan [4] [30] Do

đó, xác định chính xác tác nhân HCV là một mục tiêu quan tâm hàng đầu của các bác sĩ Vi rút viêm gan C được phân thành 6 kiểu gen ký hiệu bằng số từ 1 đến 6 và phân ra các kiểu gen phụ ký hiệu bằng chữ a,b,c,…[52] Ngoài xét nghiệm tìm kháng thể kháng HCV, xác định số lượng vi rút trong máu để chẩn đoán tình trạng nhiễm HCV, xác định kiểu gen trước khi điều trị có thể tiên đoán khả năng đáp ứng, xác định thời gian điều trị và dự đoán hiệu quả điều trị kháng vi rút [21] [28] Tại Việt nam, nghiên cứu về kiểu gen HCV được tiến hành từ năm 1994 [40], tuy nhiên, từ đó đến nay, có một số nghiên cứu thực hiện trong khuôn khổ hợp tác nghiên cứu với nước ngoài và được thực hiện ở nước ngoài Ngoài ra, số lượng nghiên cứu còn rất hạn chế Thêm vào đó, nhiều nghiên cứu phân loại kiểu gen dựa vào trình tự đoạn 5’ không mã hóa của bộ gen HCV Nhưng hiện nay, việc phân loại theo hình thức này không chính xác do vi rút thuộc kiểu gen 6 của HCV có trình tự đoạn này giống với các chủng thuộc kiểu gen 1 nên có sự phân loại nhầm lẫn giữa hai kiểu gen này

chúng tôi tiến hành đề tài “Xác định sự phân bố các genotype của HCV bằng kỹ

thuật giải trình tự gen ở bệnh nhân đến khám và điều trị tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương năm 2010-2011” với các mục tiêu sau:

1 Xác định các kiểu gen của HCV ở bệnh nhân đến khám và điều trị tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương bằng kỹ thuật giải trình tự gen

2 Đánh giá mối liên quan giữa kiểu gen HCV với một số đặc điểm về dịch tễ

học và cận lâm sàng

CHƯƠNG 1

Vi rút viêm gan C là thành viên của họ Flaviviridae, là một thể hình cầu có

đường kính 55-65 nm, và có các vỏ ngoài với các gai nhú nhỏ khoảng 6 nm, bao quanh một cấu trúc nucleocapsid 30-35 nm có cấu trúc đối xứng 20 mặt [5] [6] [51]

Glycoprotein vỏ

Vỏ

Lõi

RNA 60nm

11

Hệ gen của HCV có kích thước khoảng 9,6 kb có chức năng như mRNA làm khuôn tổng hợp protein HCV phân lập được từ các bệnh nhân thuộc các khu vực khác nhau trên thế giới có thể khác nhau về kích thước hệ gen Cấu trúc RNA của HCV bao gồm hai đầu tận cùng 5’ và 3’ không mã hóa, ở giữa là vùng mã hóa cho protein cấu trúc (C, E1, E2) và protein không thuộc nhóm cấu trúc (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A và NS5B) Vùng 5’ không mã hóa (5’-noncoding viết tắt là 5’-NC) có tính ổn định rất cao, gồm khoảng 341-344 nucleotide [4][37] [44] Giữa các sợi HCV riêng biệt, giữa các kiểu phụ và kiểu gen khác nhau thì độ tương đồng về trình

tự 5’-NC tối thiểu hơn 90% Vì vậy, khu vực này thường được áp dụng để xác định nhiễm HCV bằng kỹ thuật PCR Ngược lại, trình tự của NS5B, khu vực core hoặc E1 thay đổi nhiều hơn, nhưng được coi là tiêu chuẩn vàng sử dụng để xác định và phân biệt các kiểu gen HCV [47][50]

Tương tự như tất cả vi rút khác, HCV không thể tự tái bản vì nó không có đầy đủ các nguyên liệu cần thiết Vì vậy, để tái bản, vi rút phải nhiễm vào tế bào vật chủ và sử dụng bộ máy sao chép của tế bào, bao gồm các enzyme và protein Sau khi nhiễm vào tế bào vật chủ, các bước tái bản của HCV sẽ xảy ra trong tế bào chất

Hệ gen của HCV mã hoá cho tối thiểu 10 protein vi rút khác nhau, bao gồm các

Protein cấu trúc Protein không cấu trúc

Gen mã hoá polyprotein

Protein kháng interferon Nucleocapsid

RNA polymerase Glycoprotein vỏ

Protein xuyên màng

Proteases RNA helicase

Co-factors

12

protein cấu trúc (protein vỏ và protein lõi) giúp hình thành vỏ capsid và các protein không thuộc nhóm cấu trúc (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A và NS5B) liên quan đến quá trình tái bản của vi rút Các nghiên cứu gần đây đã làm sáng tỏ chức năng của nhiều protein trong số này Tuy nhiên, vai trò của một vài protein cũng như một

số khía cạnh của quá trình tái bản vi rút và mối tương quan giữa protein vi rút và tế bào chủ vẫn chưa được hiểu một cách đầy đủ Nguyên nhân của việc này là do HCV không thể gây nhiễm nhân tạo trên các dòng tế bào hiện có tại các phòng thí nghiệm trên thế giới Đây chính là một trong những trở ngại lớn trong việc tìm hiểu cặn kẽ

về vi rút này Một điểm quan trọng nữa là vi rút này có khả năng biến thể nhanh và tạo thành rất nhiều kiểu gen và kiểu gen phụ kháng thuốc Do vậy, hiện nay vẫn chưa có một loại vắc xin nào có hiệu quả đối với HCV [7] [57]

Tế bào chất

Vi rút HCV mới

Vi rút HCV

13

- Gắn vào tế bào vật chủ: HCV gắn vào tế bào chủ nhờ các tương tác giữa lớp

vỏ protein của vi rút (protein E1 và E2) với các phân tử là thụ thể bề mặt khảm trên màng ngoài tế bào đích

- Xâm nhập vào tế bào chủ và cởi lớp vỏ bọc, giải phóng RNA vi rút, HCV đi vào tế bào đích chủ yếu do cơ chế ẩm bào nhờ thụ thể Khi HCV gắn lên bề mặt thụ thể, các tế bào đồng hóa thụ thể sẽ hình thành một túi màng mỏng chứa HCV Sau khi vào trong tế bào, HCV sẽ giải phóng hệ gen vào tế bào chất của tế bào chủ và bắt đầu quá trình tái bản

- Dịch mã hệ gen HCV thành protein vi rút: Khi được giải phóng, RNA của HCV được dùng làm khuôn để tổng hợp các protein của nó HCV sử dụng các thành phần của tế bào chủ, đặc biệt là ribosome để tiến hành dịch mã Quá trình này chỉ đòi hỏi một vài thành phần trong bộ máy dịch mã của tế bào chủ Điều đó cho phép HCV khởi động dịch mã hiệu quả ngay cả khi các điều kiện tế bào không thuận lợi Sản phẩm đầu tiên của quá trình dịch mã là một sợi polyprotein dài khoảng 3000 axit amin có chứa tất cả 10 protein vi rút cần cho quá trình tái bản của HCV Đây là quá trình then chốt đối với HCV vì nếu không có các protein quan trọng này sẽ không tạo được các vi rút mới

- Tái bản hệ gen HCV: Quá trình tái bản xảy ra nhờ enzyme polymerase NS5B, là một protein không thuộc nhóm cấu trúc, tổng hợp RNA trên sợi khuôn RNA gồm hai bước chính: 1) hệ gen vi rút được dùng làm khuôn để tổng hợp sợi RNA âm và 2) sợi RNA âm sau đó được dùng làm khuôn để tổng hợp sợi RNA dương của HCV mới Hai sợi RNA mới tổng hợp có thể gắn với nhau hình thành RNA sợi đôi, trong khi đó, tế bào cho rằng RNA sợi đôi là báo hiệu nhiễm vi rút và

sẽ kích hoạt hàng rào phòng thủ của tế bào để ngăn chặn quá trình tái bản và phá hủy RNA vi rút Hơn nữa, polymerase HCV không thể đọc được từ RNA đang ở dạng sợi đôi Vì vậy, để tránh hàng rào phòng thủ của tế bào và duy trì quá trình tái bản, HCV phải giữ cho các sợi RNA âm và dương tách rời nhau Lúc này enzyme helicase, nằm trong vùng trình tự mã hóa cho protein không thuộc nhóm cấu trúc

vi rút viêm gan C, kim chích xăm mình hoặc xỏ lỗ tai không đảm bảo vô trùng; Người nhận máu, chế phẩm máu hoặc các bộ phận cơ thể từ một người cho nhiễm HCV; Phơi nhiễm ở nhân viên y tế (1 - 3%); Nguy cơ lây nhiễm vi rút viêm gan C qua quan hệ tình dục hiếm hơn so với viêm gan B (5 - 10%); Mẹ truyền sang con xảy ra tại thời điểm sinh với những bà mẹ có HCV RNA (+), khoảng 6%; Không rõ đường lây nhiễm chiếm 30 - 40% trường hợp

Một người nhiễm HCV, có thể nhiễm đồng thời vi rút viêm gan A, B

Sau khi bị nhiễm HCV, thời gian ủ bệnh thường kéo dài từ 2 đến 26 tuần, trung bình từ 6 đến 10 tuần

Giai đoạn cấp tính: Bệnh nhân nhiễm HCV ở giai đoạn cấp tính thường không có biểu hiện bệnh lý hoặc chỉ có những biểu hiện bệnh nhẹ (rất khó quan sát

15

bằng mắt thường) Khoảng 60 - 70% các bệnh nhân nhiễm không thể hiện triệu chứng, 20 - 30% có thể có biểu hiện vàng da, 10% các bệnh nhân thể hiện một số triệu chứng không đặc hiệu như: biếng ăn, mệt mỏi, đau bụng Triệu chứng biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân ở giai đoạn cấp tính viêm gan C tương tự như các bệnh nhân nhiễm các vi rút viêm gan gây bệnh khác Do vậy, việc xét nghiệm các bệnh nhân này bằng các thử nghiệm miễn dịch là điều cần thiết để xác định bệnh nhân nhiễm loại vi rút viêm gan nào Tuy nhiên, các thử nghiệm miễn dịch này cho kết quả Dương tính 80% sau 15 tuần kể từ khi có những biểu hiện bệnh lý Tỉ lệ trên tăng dần theo thời gian và tối đa là sau 9 tháng hầu như 100% các bệnh nhân nhiễm HCV đều có thể phát hiện vi rút bằng kĩ thuật miễn dịch

Do nhược điểm về thời gian mà các kĩ thuật miễn dịch tỏ ra không có hiệu quả trong việc phát hiện sớm vi rút Tuy nhiên, do các kỹ thuật phát hiện HCV bằng sinh học phân tử còn quá đắt tiền, vì vậy, kĩ thuật miễn dịch vẫn được sử dụng phổ biến hiện nay

Giai đoạn mạn tính: Sau giai đoạn nhiễm cấp tính, khoảng 15 - 25% bệnh nhân sẽ tự hồi phục thông qua cơ chế loại thải vi rút HCV và cơ thể trở lại trạng thái bình thường Tuy nhiên, khoảng hơn 75% các bệnh nhân nhiễm HCV sẽ chuyển sang giai đoạn mạn tính

16

Trong giai đoạn nhiễm mãn tính, bệnh nhân thường không có bất kỳ một biểu hiện bệnh lý nào Giai đoạn này có thể kéo dài từ 20 - 30 năm hoặc có thể kéo dài hơn trước khi bệnh nhân chuyển thành ung thư gan Tỉ lệ nhiễm HCV chuyển thành xơ gan 15 - 20% sau 20 năm, tỉ lệ càng tăng nếu thời gian nhiễm càng lâu, 71% bệnh nhân xơ gan nếu nhiễm hơn 60 năm Trong nhóm bệnh nhân xơ gan do HCV, mỗi năm 1,4 - 3,3% chuyển sang ung thư gan và 2,6 - 4% tử vong [57]

1.2.4 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

Chẩn đoán viêm gan C, ngoài các xét nghiệm đánh giá chức năng gan, siêu âm gan, sinh thiết gan các xét nghiệm tìm HCV giữ một vai trò rất quan trọng [38] [48]

1.2.4.1 Phương pháp gián tiếp - tìm kháng thể anti-HCV

Có thể tìm thấy kháng thể anti-HCV ở 70% trường hợp khi bắt đầu có triệu chứng và khoảng 90% trong vòng 3 tháng sau Tuy nhiên, nhiều người bị viêm gan

C nhưng không có triệu chứng Anti-HCV không xác định được là đang nhiễm cấp tính, đã lành bệnh (đào thải hết vi rút) hay chuyển sang giai đoạn mạn tính

Tìm kháng thể anti-HCV có thể sử dụng các kỹ thuật như miễn dịch điện hoá phát quang hoặc kỹ thuật miễn dịch ELISA

1.2.4.2 Phương pháp trực tiếp - tìm HCV RNA

Phát hiện trực tiếp vi rút trong máu, một bằng chứng của nhiễm HCV và vi rút đang tăng sinh Có thể phát hiện HCV-RNA trong vòng 1 đến 2 tuần sau khi nhiễm vi rút

1.2.4.3 Các phương pháp xác định kiểu gen

a RT-PCR: Kỹ thuật PCR phiên mã ngược được phát triển và ứng dụng đối với các vi rút có vật liệu di truyền là RNA từ những năm 1990 Đây là kỹ thuật chẩn đoán nhanh, nhạy, đặc hiệu cho từng type huyết thanh, tuy nhiên do độ nhạy cao nên rất dễ xảy ra dương tính giả nếu không kiểm soát được tạp nhiễm của các tác nhân ngoại lai

17

b Realtime RT-PCR: Đây là kỹ thuật sử dụng cặp mồi và đầu dò đặc hiệu cho từng kiểu gen, sử dụng tín hiệu huỳnh quang để phát hiện các sản phẩm phản ứng theo thời gian thực mà không cần điện di Nhiều thử nghiệm realtime RT-PCR đã được phát triển sử dụng kỹ thuật TaqMan và SYBR Green [37]

c Kỹ thuật LiPA: Là kỹ thuật lai trên vạch dò đặc hiệu, sản phẩm PCR được khuếch đại với cặp mồi trong đó có một mồi gắn biotin Lai sản phẩm PCR gắn biotin trên các vạch đoạn dò kiểu gen đặc hiệu, sau đó tiến hành lai sản phẩm PCR

đã có với các que (strip) của bộ thuốc thử LiPA Trên mỗi strip có gắn sẵn các vạch

dò (probe) chuyên biệt cho từng kiểu gen của HCV Tuy nhiên, vì LiPA phải thực hiện trên sản phẩm PCR là kết quả của phản ứng nested PCR nên khả năng bị ngoại nhiễm là khá cao và đây chính là lí do giải thích được tại sao có khá nhiều trường hợp LiPA có kết quả không thể xác định được kiểu gen [4]

d Kỹ thuật giải trình tự gen: Đây là kỹ thuật chuẩn xác nhất, kiểm soát được các sai sót, đảm bảo độ chính xác cao, khắc phục được các nhược điểm của các kỹ thuật trên trong xác định kiểu gen Dựa vào trình tự đã giãi mã, tiến hành so sánh độ tương đồng với các trình tự kiểu gen chuẩn có trong Gene Bank để xác định kiểu gen của HCV Thêm vào đó từ trình tự gen thu được ta có thể có nhiều ứng dụng tiếp theo như phát hiện, theo dõi các đột biến; tạo cây để tìm hiểu mối liên quan, con đường lây nhiễm của các kiểu gen HCV khác nhau trên thế giới…

Không phải trường hợp nhiễm HCV nào cũng cần phải điều trị đặc hiệu Mục đích điều trị đặc hiệu viêm gan vi rút C là đào thải hoặc giảm bớt lượng HCV trong cơ thể, đặc biệt là ở gan và giảm thiểu hoặc loại trừ hoàn toàn tình trạng viêm gan, do đó ngăn ngừa diễn tiến sang xơ gan, ung thư gan Có 6 kiểu gen HCV của viêm gan C và mỗi kiểu gen có thể có đáp ứng điều trị khác nhau Thời gian điều trị

có thể thay đổi tùy theo kiểu gen và nồng độ HCV RNA vào từng thời điểm: tuần 4,

12, 24, 48 và 6 tháng sau khi ngưng thuốc, giảm tác dụng phụ và giá thành điều trị

Hiện nay, các nhà khoa học đã tìm ra các loại thuốc kháng vi rút viêm gan C mới, có thể có hiệu quả hơn và dung nạp tốt hơn các phương pháp điều trị hiện có Hai thuốc mới như telaprevir và boceprevir gần đây đã được cho phép sử dụng ở một số nước

1.3 Các đặc trƣng của kiểu gen HCV

Các nghiên cứu trình tự và xác định kiểu gen chứng minh các kiểu phụ liên quan khá chặt chẽ và phân bố theo địa dư như sau: Kiểu 1a thường gặp ở Bắc, Nam

Mỹ và Australia; Kiểu 1b thường gặp ở Châu Âu và Châu Á; Kiểu 2a thường gặp ở Nhật và Trung quốc; Kiểu 2b thường gặp ở Mỹ và Bắc Âu; Kiểu 2c thường gặp ở Tây và Nam Âu; Kiểu 3a thường gặp ở Australia và Nam Á; Kiểu 4a thường gặp ở

Ai cập; Kiểu 4c thường gặp ở miền trung Châu Phi; Kiểu 5a thường gặp ở Nam Phi; Kiểu 6 thường gặp ở Châu Á (hình 5, hình 6, hình 7)

19

Khác Tổng Thế giới

20

Khác Tổng

21

Kiểu gen 1b thường gặp ở bệnh nhân được truyền máu, kiểu gen 3a thường gặp ở đối tượng tiêm chích ma túy Hiện nay nhiễm vi rút C kiểu gen 3a gia tăng do

số người tiêm chích ma túy tăng lên, còn những người nhiễm HCV kiểu gen 1b thì giảm do tiến bộ trong kỹ thuật truyền máu

Người mắc kiểu gen 1b có nguy cơ bị HCC hơn những bệnh nhân mang các kiểu gen khác do những người nhiễm kiểu gen 1b thường sớm hơn những người nhiễm kiểu gen 2 và 3 vài thập kỷ Điều này cũng có thể áp dụng cho kiểu gen 4 ở vùng Trung Đông

Thông tin về kiểu gen rất quan trọng nó được sử dụng để dự đoán kết quả điều trị Tỉ lệ đáp ứng kéo dài khi sử dụng Peginterferon kết hợp với Ribavirin thường cao hơn ở kiểu gen 2, 3 so với kiểu gen 1

Khác Tổng

22

Kiểu gen 1 được xem như là kiểu gen khó khăn nhất với các liệu pháp điều trị hiện nay Tuy nhiên tỉ lệ đáp ứng với điều trị khi sử dụng interferon mới là peginterferon kết hợp với ribavirin thì dường như tăng lên rõ rệt, > 50% đáp ứng kéo dài Kiểu gen 2 và 3 đáp ứng với điều trị hiện nay tốt hơn có thể lên đến 70% -90% Có một vài bằng chứng đáp ứng với điều trị hiện nay ở bệnh nhân có kiểu gen

2 tốt hơn bệnh nhân có kiểu gen 3, nhưng điều này cần thêm các nghiên cứu ngẫu nhiên lớn hơn để xác định lại Lý do có sự liên quan giữa các kiểu gen và đáp ứng với điều trị cần có nhiều nghiên cứu thêm Nhưng người ta cho rằng vi rút thuộc các kiểu gen khác nhau có thời gian sống khác nhau như kiểu gen 2, 3 tồn tại ngắn hơn kiểu gen 1, vì thế sự thải loại kiểu gen 2, 3 dễ hơn kiểu gen 1

Kiểu gen cũng là một yếu tố cần để xác định thời gian cần điều trị Nói chung nếu kiểu gen 1 thời gian điều trị khoảng 48 tuần, kiểu gen 2, 3 cần 24 tuần, tuy nhiên có những nghiên cứu đang thực hiện xác định khoảng thời gian điều trị tốt nhất dựa vào các yếu tố nhất định Một số nghiên cứu cho rằng những bệnh nhân có kiểu gen 1, nồng độ vi rút cao nên điều trị 72 tuần thay vì 48 tuần để đạt được tỉ lệ đáp ứng cao nhất Có một vài nghiên cứu đánh giá thời gian điều trị cho kiểu gen 2

là 12 tuần và kiểu gen 3 là 48 tuần

Genotype cũng là một thông tin quan trọng để xác định liều lượng ribavirin Với những người có kiểu gen 2, 3 liều cho ribavirin là 800mg/ngày, ngược lại liều cho kiểu gen 1 dựa vào trọng lượng cơ thể thường 1000mg - 1200mg/ngày

Một người có thể nhiễm hơn 1 loại kiểu gen Số liệu về kiểu gen hỗn hợp thì hầu như chưa được nghiên cứu nhiều, nhưng một vài số liệu cho thấy,nó có thể ảnh hưởng tới đáp ứng điều trị và diễn tiến bệnh viêm gan vi rút C

23

Tình trạng gan nhiễm mỡ thường thấy ở bệnh nhân viêm gan vi rút C Gan nhiễm mỡ góp phần vào diễn tiến của bệnh và đáp ứng kém với điều trị, mặc dù cơ chế chưa được hiểu một cách rõ ràng Những người nhiễm HCV kiểu gen 3 có khả năng bị gan nhiễm mỡ nhiều hơn và kiểu gen 3 là một yếu tố nguy cơ độc lập và đóng vai trò trực tiếp trong sự phát triển gan nhiễm mỡ

Về liên quan giữa kiểu gen và diễn tiến bệnh gợi ý rằng kiểu gen 1b liên quan với mức độ diễn tiến bệnh nặng hơn so với kiểu gen 2, 3 Nhưng cần có nhiều nghiên cứu hơn để xác nhận điều này

Kiểu gen 1 (đặc biệt là kiểu gen 1b) liên quan đến quá trình xơ hóa nhanh hơn ở những bệnh nhân đã ghép gan

1.4 Tình hình bệnh viêm gan vi rút C và các nghiên cứu

Hiện nay, các số liệu về sự lây truyền HCV trong cộng đồng cho thấy vi rút này là một mối lo ngại nghiêm trọng Trên thế giới có gần 200 triệu người (khoảng 3% dân số thế giới) đang bị nhiễm HCV và 3 - 4 triệu người mới nhiễm mỗi năm [6] [10] [7] Tỷ lệ nhiễm HCV ở các khu vực trên thế giới là khác nhau (hình 8), trong đó các nước châu Phi và châu Á có tỷ lệ nhiễm cao nhất, có khu vực lên tới >10% dân

số Nhiễm HCV là nguyên nhân của khoảng 20% các trường hợp viêm gan cấp tính tại Hoa Kỳ [34]

Ở Việt Nam hiện nay, theo số liệu của WHO có khoảng 5 - 10% dân số nhiễm HCV Tỷ lệ nhiễm HCV tại thành phố Hồ Chí Minh là 2,53%, tại tỉnh An Giang là 4,1% và tại Cà Mau là 2,15% [8] Trong số các bệnh nhân mắc bệnh liên quan đến gan, khoảng 13% có xét nghiệm dương tính với HCV [7]

Đối với các bệnh nhân bị viêm gan, tỷ lệ có HCV trong máu là khoảng 11%, còn ở các bệnh nhân xơ gan là 12,5% và ung thư gan là 8% [7]

24

Năm 1996, nhóm tác giả P Simmonds thuộc đại học Edinburgh, Anh đã giải trình tự gen để phân tích biến thể của vi rút viêm gan C ở các nước Đông Nam Á [38]

Năm 2004, nhóm tác giả Tatsunori Nakano Nhật cũng giải trình tự gen phân tích biến thể vi rút viêm gan C tìm hiểu lịch sử con đường lây nhiễm [35]

Năm 2005, nhóm tác giả Hồ Tấn Đạt tại trung tâm Y khoa MEDIC, thành phố Hồ Chí Minh nghiên cứu và xác định kiểu gen HCV của 327 bệnh nhân viêm gan C cho thấy kiểu gen 1 chiếm 58,4%, kiểu gen 6 chiếm 23,9% và kiểu gen 2 chiếm 13,1% [4]

Năm 2010, Tomoaki Tanimoto cùng cộng sự đã nghiên cứu 486 trường hợp nhiễm HCV trên nhóm tiêm chích ma tuý tại Hải Phòng Kết quả cho thấy tại vị trí 5’UTR-core kiểu gen 6e chiếm ưu thế 32,5%, tại vị trí NS5B kiểu gen 1a chiếm ưu thế 42,6% [54]

25

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu máu của bệnh nhân đến khám và điều trị viêm gan C tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương từ ngày 1 tháng 12 năm 2010 đến ngày 30 tháng 11 năm 2011, được chẩn đoán nhiễm viêm gan vi rút C mạn tính và có chỉ định làm xét nghiệm xác định kiểu gen của HCV

Tiêu chuẩn chẩn đoán viêm gan vi rút C mạn tính: phát hiện đồng thời HCV và HCV RNA trên 6 tháng [57]

Anti-2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Sinh phẩm, hóa chất

- Kít định lượng AST, ALT, Bilirubin của BeckmanCoulter

- Kít xác định Anti-HCV Monolisa Anti-HCV plus version 2, Biorad

- Kít đếm tải lượng vi rút COBAS AmpliPrep/COBAS TapMan HCV, Roche

26

- Hoá chất tách chiết RNA: Bộ kít tách chiết RNA của hãng QIAGEN (Mỹ)

- Hoá chất tổng hợp cDNA: Bộ kít MonsterScrip 1st-Strand cDNA của hãng Epicentre (Mỹ)

- Hoá chất thực hiện phản ứng PCR: Kít Invitrogen (Mỹ)

- Hoá chất điện di

- Hoá chất tinh sạch: Bộ kít tinh sạch của hãng QIAGEN (Mỹ)

- Hoá chất giải trình tự gen: Bộ kit Bigdye 3.1 (ABI)

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị

Dụng cụ: - Các loại pipett (10 µl, 200 µl, 1000 µl)

- Các loại đầu côn tương ứng

- Ống máu không chất chống đông cho xét nghiệm anti-HCV, định type và đếm tải lượng vi rút

- Ống máu có chống đông Heparin cho xét nghiệm AST, ALT và Bilirubin

- Ống eppendorf các loại

- Giá để mẫu

Thiết bị: Tủ lưu mẫu -200

C, -700C, máy li tâm tốc độ cao, máy ly tâm nhỏ, máy votex, dàn ELISA, máy sinh hoá tự động (Olympus AU400), máy PCR, bộ điện di, máy đọc gel (Gel Doc-Biorad), máy giải trình tự gen (3130 Genetic Analyzes-ABI)

2.3 Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang

27

2.4 Quy trình nghiên cứu

SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU

Bệnh nhân

nghiệm SH,

MD, SHPT Anti HCV

Thu thập

thông tin

(phụ lục 2)

Âm tính (Loại khỏi nghiên cứu)

Dương tính (Lưu mẫu

Phân tích

<38 bản sao/mL (Loại khỏi nghiên cứu)

≥ 38 bản sao/mL Tách chiết RNA

cDNA+Nested PCR

Điện di kiểm tra sản phẩm

Tinh sạch sản phẩm PCR PCR sequence

Tinh sạch và đọc trình tự gen Phân tích phả hệ

28

2.4.1 Thu thập và bảo quản mẫu huyết thanh: các mẫu huyết thanh của bệnh

nhân có Anti-HCV dương tính được bảo quản ở -700C tới khi làm xét nghiệm giải trình tự xác định kiểu gen và đếm tải lượng vi rút

2.4.2 Quy trình xác định Anti-HCV: Sử dụng bộ kít Monolisa Anti-HCV plus

version 2, Biorad

A/ Nguyên lý: Monolisa Anti-HCV PLUS Version 2 là thử nghiệm miễn dịch gắn

men dựa trên nguyên lý kỹ thuật sandwich 1 bước nhằm phát hiện kháng thể HCV trong huyết thanh hoặc huyết tương

B/ Chuẩn bị hoá chất:

- Cơ chất: 1R9:10R8 lưu trong tối sử dụng trong vòng 6h nhiệt độ phòng

- Dung dịch rửa: 1R2: 19 nước cất, lưu ở 2-300C sử dụng trong vòng 2 tuần

C/ Quy trình:

- Viết danh sách mẫu và bảng sơ đồ mẫu

- Lấy giá đỡ và các thanh xét nghiệm ra khỏi túi

- Cho 80 l dung dịch hoà loãng bệnh phẩm (R6) vào mỗi giếng

- Cho 20 l huyết thanh chứng âm (R3) vào các giếng A1, B1

- Cho 20 l huyết thanh chứng dương (R4) vào các giếng C1, D1, E1

- Cho 20 l mẫu xét nghiệm lần lượt vào các giếng G1…Trộn đều bằng cách hút nhả lên xuống 3 lần

- Đậy giếng bằng tấm nhựa để tránh sự bay hơi bề mặt

- Ủ 60  5 phút trong máy ủ ở 370C

- Bỏ tấm nhựa, cho phiến vào máy rửa, rửa 3 lần không ngâm

- Cho 100 l dung dịch chất cộng hợp vào các giếng Đậy phiến bằng tấm nhựa và ủ 30  5 phút ở 370C

29

- Bỏ tấm nhựa, cho phiến vào máy rửa, rửa 4 lần

- Cho 100l dung dịch cơ chất (10R8:1R9) vào mỗi giếng Ủ tối 30  5 phút ở nhiệt độ phòng 18-250C

- Dừng phản ứng bằng 100l dung dịch R10

- Đọc ở bước sóng 450/620nm trong vòng 4-30 phút sau khi cho dung dịch dừng phản ứng

D/ Nhận định kết quả: Việc khẳng định sự có mặt kháng thể HCV của mẫu được

so sánh với giá trị chứng ngưỡng

OD (C1) + OD (D1) + OD (E1) Giá trị trung bình chứng ngưỡng =

Kết luận: Âm tính nếu OD mẫu < C.O (giá trị chứng ngưỡng)

Dương tính nếu OD mẫu > C.O Làm lại nếu C.O -10% < OD mẫu ≤ C.O

2.4.3 Quy trình xác định tải lƣợng vi rút: Sử dụng bộ kít COBAS AmpliPrep/COBAS

TaqMan HCV của Roche

A/ Nguyên lý

Xét nghiệm COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV là xét nghiệm khuếch đại axít nucleic dùng để định lượng RNA của virút viêm gan C trong huyết thanh người Thiết bị COBAS AmpliPrep tự động xử lý mẫu và COBAS TaqMan tự động khuếch đại và phát hiện

30

Xét nghiệm COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV gồm 3 quá trình chính: (1) Chuẩn bị mẫu để tinh chiết được RNA của HCV;

(2) Sao mã ngược RNA đích để tạo ra DNA bổ trợ (cDNA), và

(3) Đồng thời khuếch đại cDNA đích và phát hiện quá trình bị cắt của mẫu dò gắn 2 màu huỳnh quang đặc hiệu với tác nhân đích

Xét nghiệm COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV cho phép tự động chuẩn bị mẫu, sao mã ngược, khuếch đại PCR cùng phát hiện HCV RNA đích và HCV RNA chuẩn định lượng (QS) Thuốc thử Master Mix chứa đoạn mồi và các mẫu dò đặc hiệu cho cả HCV RNA và HCV RNA QS Thuốc thử Master Mix được phát triển để đảm bảo định lượng tất cả các kiểu gen HCV từ 1 đến 6 Các DNA khuếch đại được phát hiện nhờ sử dụng các mẫu dò đánh dấu đặc hiệu cho tác nhân đích và QS, cho phép phát hiện độc lập sản phẩm khuếch đại của HCV từ mẫu và từ HCV QS

Xét nghiệm sử dụng HCV QS để định lượng RNA virút HCV HCV QS cho phép bù trừ ảnh hưởng của những ức chế trong phản ứng PCR và kiểm soát quá trình chuẩn bị và khuếch đại, cho phép định lượng chính xác hơn lượng HCV RNA trong mỗi mẫu HCV QS là một cấu trúc RNA không lây nhiễm chứa những chuỗi HCV với những vị trí gắn mồi giống hệt như RNA đích HCV và một vùng gắn mẫu

dò duy nhất cho phép sản phẩm khuếch đại của HCV QS có thể phân biệt được với sản phẩm khuếch đại của tác nhân đích HCV QS được thêm vào mỗi mẫu với số lượng xác định và trải qua toàn bộ quá trình chuẩn bị mẫu, sao mã ngược, khuếch đại PCR và phát hiện mẫu dò đánh dấu Thiết bị phân tích COBAS TaqMan tính nồng độ HCV RNA trong mẫu xét nghiệm bằng cách so sánh tín hiệu HCV với tín hiệu HCV QS cho mỗi mẫu thử và mẫu chứng

B/ Chuẩn bị mẫu

Xét nghiệm COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV sử dụng thiết bị COBAS AmpliPrep để chuẩn bị mẫu tự động bằng kỹ thuật tách chiết mẫu dùng hạt

31

từ tính silica Quy trình sử dụng 850 µL huyết thanh Protease và phân tử HCV QS RNA có nồng độ xác định được cho vào mỗi mẫu cùng lúc với thuốc thử ly giải và hạt từ tính Sau đó, hỗn hợp được ủ để HCV RNA và HCV QS RNA gắn kết lên bề mặt của các hạt từ tính Những phần không gắn kết, như muối, protein, và những tạp chất tế bào khác bị loại bỏ trong quá trình rửa các hạt từ tính Sau khi tách riêng các hạt từ tính và hoàn tất quá trình rửa, axit nucleic bám trên bề mặt các hạt từ tính

sẽ được thôi ra ngoài dung dịch nhờ nhiệt độ cao Mẫu đã qua xử lý chứa hạt từ tính, HCV RNA và HCV QS RNA đã phân tách, được đưa vào với Master mix và chuyển vào thiết bị phân tích COBAS TaqMan Tiếp đó, máy sẽ thực hiện sao mã ngược, khuếch đại và phát hiện HCV RNA đích và HCV QS RNA nhờ sự phân cắt mẫu dò đánh dấu kép đặc hiệu cho tác nhân đích và HCV QS

C/ Phát hiện sản phẩm PCR trong xét nghiệm COBAS TaqMan

Xét nghiệm COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV sử dụng kỹ thuật PCR theo thời gian thực Việc sử dụng các mẫu dò phát huỳnh quang đánh dấu kép cho phép phát hiện tức thời sự tích luỹ sản phẩm PCR bằng cách đo cường độ phát huỳnh quang phóng thích ra từ phần nhuộm huỳnh quang trong quá trình khuếch đại Các mẫu dò bao gồm mẫu dò đặc hiệu HCV và HCV QS có gắn phân tử phát huỳnh quang và phân tử hấp thu huỳnh quang Khi chất phát huỳnh quang và chất hấp thu huỳnh quang phóng thích và tách ra thì sự hấp thu không còn nữa, do đó tín hiệu huỳnh quang của chất phát huỳnh quang tăng lên Sự khuếch đại của HCV RNA và HCV QS RNA được đo một cách độc lập ở các bước sóng khác nhau Quá trình này được lặp lại theo số chu kỳ chỉ định, mỗi chu kỳ làm tăng cường độ phát quang của các chất phát huỳnh quang tương ứng, cho phép phát hiện độc lập HCV RNA và HCV QS RNA Ở chu kỳ PCR mà đường cong biểu diễn nồng độ theo số

mũ bắt đầu vào pha tăng trưởng sẽ tương quan với số lượng nguyên vật liệu ban đầu khi mới tham gia vào PCR Xét nghiệm có độ đặc hiệu cao (99,6%) và khoảng động rộng giúp phát hiện và định lượng HCV RNA Ngưỡng phát hiện 38-172.500.000 bản sao/mL