Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện kháng nguyên vi rút PRRS trong tế bào thực vật

So với các hệ thống sản xuất vắcxin truyền thống, vắcxin thực vật có nhiều ưu điểm như: dễ dàng tăng quy mô sản xuất và thu sinh khối; các kháng nguyên biểu hiện trong thực vật ổn định ở

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Lê Thi ̣ Thanh

THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN VI RÚT PRRS TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2013

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Lê Thi ̣ Thanh

THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN VI RÚT PRRS TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Nguyễn Tường Vân PGS TS Võ Thị Thương Lan

Hà Nội – 2013

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 3

MỞ ĐẦU

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do vi rút gây ra, có khả năng lây lan nhanh gây thiệt hại nặng nề cho ngành kinh tế Ở Việt Nam bệnh còn được gọi là bệnh “lợn tai xanh” do lợn mắc bệnh thường bị xung huyết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm sau đó tím xanh Đặc trưng của bệnh là hiện tượng sẩy thai ở lợn nái đang chửa hoặc các triệu chứng bệnh về đường hô hấp, đặc biệt là ở lợn con cai sữa

Bệnh được phát hiện lần đầu tiên ở Hoa Kỳ năm 1987 Sau đó xuất hiện ở nhiều nước chăn nuôi lợn theo phương thức công nghiệp: Canada (1987); Nhật Bản (1989); Đức (1990); Hà Lan, Tây Ban Nha, Anh, Pháp (1991); Đan Mạch (1992)…

Từ năm 1992, bệnh đã gây ra các ổ dịch lớn ở nhiều nước khác thuộc Bắc Mỹ, châu

Âu và châu Á, gây tổn thất lớn cho nghề chăn nuôi lợn trên thế giới Ở Mỹ, thiệt hại kinh tế (trực tiếp và gián tiếp) của bệnh lợn tai xanh trong những năm gần đây là lớn nhất so với thiệt hại do các bệnh khác gây ra ở lợn Ước tính hàng năm nước

Mỹ phải gánh chịu những tổn tất do bệnh gây ra khoảng 560 triệu USD do việc tiêu huỷ lợn chết và lợn ốm, chi phí chống dịch và xử lý môi trường

Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam Tuy nhiên các dịch bệnh nặng chỉ được thông báo vào đầu năm 2007, lây lan khắp 17 tỉnh thành, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi Đến nay bệnh đã trở nên khó có thể kiểm soát được và lây lan ngày càng rộng hơn do tập quán và hệ thống chăn nuôi heo phức tạp ở Việt Nam

Để phòng chống bệnh lợn tai xanh, biện pháp vẫn được sử dụng là tiêm phòng vắcxin kết hợp các biện pháp thú y Gần đây chỉ có một số lượng hạn chế các vắcxin bất hoạt và nhược độc cho bệnh lợn tai xanh sử dụng các chủng của châu Mỹ hoặc châu Âu Tuy nhiên vắcxin dạng này có một số nhược điểm như vắcxin bất hoạt hiệu quả bảo vệ miễn dịch thườ ng khô ng cao, còn vắcxin nhược độc ta ̣o ra mức độ bảo vệ tốt đối với các chủng tương đồng nhưng lại có nguy cơ phát triển độc tính trở lại Hiện nay trên thị trường Việt Nam cũng có hai loại vắcxin chống

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 4

PRRSV dạng này nhưng giá thành khá cao, hiệu quả lại thấp và chỉ có khả năng điều trị các các triệu chứng lâm sàng mà không bảo vệ động vật miễn nhiễm với vi rút

Vắcxin thực vật hay còn go ̣i là vắcxin ăn đư ợc (edible vaccine) là một trong những sản phẩm của công nghệ sinh học hiện đại Thực chất vắcxin thực vật là vắcxin tiểu đơn vị được sản xuất dựa trên hệ thống thực vật để thu protein kháng nguyên mong muốn So với các hệ thống sản xuất vắcxin truyền thống, vắcxin thực vật có nhiều ưu điểm như: dễ dàng tăng quy mô sản xuất và thu sinh khối; các kháng nguyên biểu hiện trong thực vật ổn định ở nhiệt độ phòng nên dễ bảo quản và

sử dụng; có thể dùng qua đường miệng như ăn tươi (quả, lá) hoặc nấu chín (hạt, củ;

an toàn; đặc biệt vắcxin ăn được kích thích sản xuất kháng thể của hệ thống niêm mạc ruột hiệu quả hơn vắcxin tiêm

Từ những cơ sở lý luận về khoa học và thực tiễn nói trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện kháng nguyên vi rút PRRS trong

tế bào thực vật”, được tài trợ từ dự án hợp tác quốc tế về KH&CN theo nghị định

thư giữa hai nước Việt Nam – Vương Quốc Bỉ: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa Glycoprotein vỏ (GP5) của virus gây bệnh lợn tai xanh trong thuốc lá và đậu tương” giai đoạn 2011-2013 Đề tài được tiến hành tại Phòng Công nghệ Tế bào

Thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam với mục tiêu: i) Thiết kế vector chuyển gen mã hóa cho một số kháng nguyên của vi rút PRRS vào tế bào thực vật và ii) Đánh giá hiệu quả sử dụng của các vector thông qua việc phân tích sự biểu hiện của các kháng nguyên trong tế bào thuốc lá BY-2

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 5

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME, PRRS)

1.1.1 Giới thiệu chung

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do vi rút gây ra, có lan khả năng lây nhanh và có thể ghép với các loại mầm bệnh khác do đó làm ốm và chết hàng loạt lợn nhiễm bệnh gây thiệt hại nặng nề cho ngành kinh tế [54, 59] Ở Việt Nam bệnh còn được gọi là bệnh “lợn tai xanh” do lợn mắc bệnh thường bị xung huyết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm sau đó tím xanh Đặc trưng của bệnh là hiện tượng sẩy thai ở lợn nái đang chửa hoặc các triệu chứng bệnh về đường hô hấp, đặc biệt là

ở lợn con cai sữa [61]

Bệnh được mô tả lần đầu tiên ở Bắc Mỹ vào năm 1987 và ở châu Âu vào những năm 1990, đầu tiên là Đức, Pháp và Anh sau đó lan tràn khắp châu Âu Năm

1998, bệnh được phát hiện ở châu Á (Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc …) [7, 59] Thời gian đầu do chưa xác định được nguyên nhân nên bệnh có nhiều tên gọi khác nhau [59, 60]:

 Bệnh bí hiểm ở lợn (Mystery Swine Disease, MDS)

 Bệnh tai xanh (Blue Ear Disease, BED)

 Hội chứng hô hấp và sẩy thai ở lợn (Porcine Endemic Abortion & Respiratory Syndrome, PEARS)

 Hội chứng hô hấp và vô sinh ở lợn (Swine Infertility & Respiratory Syndrome, SIRS)

Năm 1992, trong hội nghị quốc tế về sức khỏe gia súc, Tổ chức Thú y thế giới (OIE) đã nhất trí đă ̣t tên cho căn bê ̣nh này là “H ội chứng rối loạn sinh sản và

hô hấp ở lợn” (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) [7] Kể từ

đó, tên này đã trở thành tên gọi chính thức của bệnh

 Rối loạn hô hấp: lợn thở dốc, thở dồn dập, khi kiểm tra mô phổi cho thấy viêm phổi, hoại tử phổi rất nặng

1.2 VI RÖT GÂY BỆNH LỢN TAI XANH

Năm 1991 Viện Thú y Lelystad, Hà Lan đã phân lập được vi rút gây bệnh lợn tai xanh, sau đó là Mỹ, Đức [59, 61] Đến nay, các thông tin về loại vi rút này

đã được nghiên cứu khá rõ Bệnh lợn tai xanh gây ra bởi vi rút PRRS thuô ̣c chi

Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales, có genom là ARN sợi đơn dương [18]

1.2.1 Đặc điểm hình thái

PRRSV là vi rút hình cầu, có vỏ bọc ngoài với đường kính virion vào khoảng

45 – 55 nm, nucleocapsid có đường kính từ 30 – 35 nm Đồng thời, PRRSV là vi rút ARN, có bộ gen là một phân tử ARN sợi đơn dương, mang những đặc điểm chung

của chi Arterivirus [18, 60, 61]

Hình 1.1 Đặc điểm hình thái, cấu tạo của vi rút PRRS gây bê ̣nh lợn tai xanh [61]

1.2.2 Cấu trúc di truyền

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 7

Hệ gen của vi rút PRRS là ARN sợi đơn dương, có kích thước khoảng 15 kb

và chứa 9 khung đọc mở (ORF - open reading frame): 1a, 1b, 2a, 2b và 3-7 Trong

đó ORF1a và 1b mã hóa cho các protein phi cấu trúc như replicase, polymerase tham gia vào quá trình nhân bản của vi rút Các ORF 2-7 mã hóa cho 6 protein cấu trúc bao gồm 4 phân tử glycoprotein (GP2, GP3, GP4, E), 1 phân tử protein mạng lưới (M) và 1 protein vỏ nhân vi rút (N) [18] (Hình 1.2)

Hình 1.2 Mô hình cấu trúc hệ gen của vi rút PRRS [61]

Dựa vào phân tích cấu trúc gen người ta xác tính được 2 nhóm vi rút PRRS: nhóm I gồm các vi rút thuộc chủng châu Âu (tên gọi phổ thông là vi rút Lelystad) gồm 4 phân nhóm (subtype) đã được xác định Nhóm II gồm các vi rút thuộc chủng Bắc Mỹ (với tên gọi là VR-2332) [18, 62] Gần đây, một biến thể của nhóm II có độc lực cao hơn đã xuất hiện gây nhiều tổn thất ở châu Á [28, 61] Mặc dù đôi khi triệu chứng gây bệnh trên hai nhóm PRRSV có nhiều nét chung, nhưng các nghiên cứu cho thấy giữa hai nhóm có sự khác biệt lớn về bộ gen (mức độ tương đồng chỉ 55-80%), đặc tính gây đáp ứng miễn dịch cũng như độc lực vi rút [7, 42] Điều này

có nghĩa là vắcxin được làm từ một chủng PRRSV sẽ không thể bảo vệ hoàn toàn cho đàn lợn

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 8

Người ta đã chứng minh rằng có sự biến dị di truyền mạnh trong cả 2 nhóm phân lập, được khẳng định qua phân tích trình tự nucleotide và axít amin của các khung đọc mở (ORFs).Tương đồng về trình tự axít amin của VR-2332 so với LV là 76% (ORF2), 72% (ORF3), 80% (ORF4 và 5), 91% (ORF6) và 74% (ORF7) [7, 54]

Phân tích trình tự cho thấy các vi rút đang tiến hoá Giải trình tự một phần hoặc từng gen riêng biệt, hoặc toàn bộ hệ gen, đặc biệt là vùng gen chức năng và cấu trúc (mã hóa cho GP2, 3, 4, E, M, N) cho thấy tiến hoá của các chủng vi rút là

do đột biến ngẫu nhiên và tái tổ hợp trong các gen Ví dụ gen m có độ dài 522 bp ở

nhóm LV và 525 bp ở nhóm VR-2332 [9, 54]

Ngoài ra, trong một nhóm PRRSV cũng có sự khác nhau giữa các phân nhóm Ví dụ: Tổng độ dài hệ gen của chủng vi rút nhóm VR-2332 phân lập tại Mỹ (số đăng ký: AY150564) là 15451 bp, trong đó phần mã hoá cho 7 khung đọc mở là

15071 bp Trong khi hệ gen của vi rút PRRS chủng GD (Quảng Đông) (số đăng ký: EU109503) đại diện cho một nhóm PRRS mới phân lập gần đây có độc lực rất cao

ở Trung Quốc, cũng thuộc nhóm VR-232 lại có độ dài là 15353 bp, trong đó phần

mã hoá cho 7 khung đọc mở là 14981 bp [26, 28, 54]

Về mặt độc lực, vi rút gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn PRRSV tồn tại dưới 2 dạng: dạng cổ điển có độc lực thấp, ở dạng này khi lợn mắc bệnh thì có tỷ lệ chết thấp, chỉ từ 1 - 5% trong tổng đàn và dạng biến thể độc lực cao gây nhiễm và chết nhiều lợn [54]

và đại thực bào amiđan Kháng nguyên PRRSV có thể được phát hiện ở các đại

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 9

thực bào của các mô, tế bào khác bao gồm cả mô cơ [54, 60] Hình 1.3 cho thấy sự thay đổi hình thái của đại thực bào trước và sau khi nhiễm PRRSV

Hình 1.3: Hình thái của đại thực bào khi bị nhiễm PRRSV A: đại thực bào bình

thường; B: đại thực bào bị phá hủy [54]

Một khi hơn 40% đại thực bào bị phá hủy, PRRSV hầu như đã loại bỏ hệ thống bảo vệ của cơ thể [54] Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho những vi khuẩn

và vi rút khác gây bệnh Điển hình của trường hợp này là sự gia tăng nghiêm trọng viêm phổi Ngoài ra, lợn mắc bệnh PRRS thường bị bội nhiễm với các bệnh như

dịch tả lợn, tụ huyết trùng, phó thương hàn, bệnh do xoắn khuẩn Leptospira spp, bệnh do Steptococcus spp, Mycoplasma spp, E.coli Các bệnh kế phát này mới là

nguyên nhân chính gây chết nhiều ở lợn mắc bệnh PRRS [7, 18, 54]

1.2.4 Đặc tính sinh miễn dịch

Trong những nghiên cứu phát triển vắcxin chống lại PRRSV đã được ghi nhận trong hai thập kỷ qua, việc thiết kế vắcxin tiểu đơn vị, việc tạo ra đáp ứng miễn dịch tế bào và dịch thể là đặc biệt quan trọng vì c ả hai cơ chế này đều liên quan đến việc bảo vệ chống lại vi rút Trong quá trình lây nhiễm, lợn thường sản xuất kháng thể đặc hiệu đối với protein N Mặc dù protein N là protein cấu trúc phổ biến nhất và có tính kháng nguyên cao , nhưng mối liên quan giữa kháng th ể kháng protein này với đáp ứng miễn dịch bảo vệ lại không chă ̣t chẽ Vì thế protein N chỉ dùng để chuẩn đoán sự có mă ̣t của PRRSV mà không dùng làm vắcxin tiểu đơn vị [15]

Trong thành phần cấu tạo của vi rút PRRS, cả 6 phân tử protein cấu trúc đều

có khả năng trung hoà kháng thể (bao gồm 4 phân tử glycoprotein, 1 phân tử protein

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 10

màng (M) và 1 protein vỏ nhân virut (N)) nhưng hoạt động trung hoà chỉ xảy ra mạnh với các protein GP5, M và GP3 [18, 19, 23, 26, 54] Do vậy, các protein này thường đươ ̣c dùng như mục tiêu hàng đầu để thiết kế vắcxin tiểu đơn vi ̣ chống lại sự xâm nhiễm của PRRSV GP5 được biết như yếu tố kích thích vi ệc sản sinh kháng thể trung hòa ở lợn và đây là một vấn đề then chốt của miễn dịch dịch thể [19, 23, 39] Tuy nhiên, các nghiên cứu cho thấy GP5 luôn luôn liêt kết với protein mạng lưới M [32, 34, 55] Bên cạnh đó , người ta cũng tìm thấy glycoprotein vỏ GP 3 trong các mảnh vỡ cũng như các tế bào bị nhiễm vi rút , loại protein này cũng kích thích sinh

ra kháng thể trung hòa ở mức cao [54]

1.3 TÌNH HÌNH BỆNH LỢN TAI XANH TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

1.3.1 Tình hình bệnh lợn tai xanh trên thế giới

Mặc dù giữa những năm 1980 đã có những báo cáo về bệnh song vẫn chưa xác định được nguyên nhân gây bệnh Năm 1987 bệnh được ghi nhận ở Mỹ với những triệu chứng lâm sàng về sinh sản kết hợp với hô hấp Năm 1990 hội chứng tương tự đã xuất hiện tại châu Âu, đầu tiên là Đức, Pháp và Anh sau đó lan tràn khắp châu Âu [61, 62]

Đến năm 1992, bệnh đã gây ra các ổ dịch lớn ở nhiều nước khác thuộc Bắc

Mỹ, châu Âu và châu Á, gây tổn thất lớn về kinh tế cho nghề chăn nuôi lợn trên thế giới [61, 62] Từ năm 2005 trở lại đây, 27 nước và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châu lục trên thế giới đã báo cáo cho Tổ chức Thú y thế giới khẳng định phát hiện

có bệnh lợn tai xanh lưu hành [59, 62] Hiện nay, hội chứng này đã trở thành dịch địa phương ở nhiều nước trên thế giới, kể cả các nước có ngành chăn nuôi lợn phát triển như Mỹ, Hà Lan, Đan Mạch, Anh, Pháp, Đức và đã gây ra những tổn thất rất lớn về kinh tế cho người chăn nuôi lên đến hàng trăm triệu đô la [59] Ở Mỹ, người

ta đã đánh giá thiệt hại kinh tế (trực tiếp và gián tiếp) của bệnh lợn tai xanh trong những năm gần đây là lớn nhất so với thiệt hại do các bệnh khác gây ra ở lợn Ước tính hàng năm nước Mỹ phải gánh chịu những tổn tất do bệnh gây ra khoảng 560 triệu USD do việc tiêu huỷ lợn chết và lợn ốm, chi phí chống dịch và xử lý môi

do nhiều nguyên nhân, trong đó chủ yếu là vi rút PRRS và các loại mầm bệnh này

đã làm hàng triệu lợn bị ốm, chết và phải tiêu hủy [28] Kết quả nghiên cứu toàn diện của Trung Quốc đã khẳng định chủng vi rút PRRS gây bệnh tại nước này là chủng độc lực cao, đặc biệt có sự biến đổi của vi rút (thiếu hụt 30 axít amin trong gen vùng NSP2) [28] Năm 2007, các tỉnh Anhui, Hunan, Guangdong, Shandong, Liaoning, Jilin và một số tỉnh khác bị ảnh hưởng nặng buộc Trung Quốc phải tiêu hủy tới 20 triệu lợn để ngăn chặn dịch lây lan [28] Trước diễn biến phức tạp của dịch lợn tai xanh, Bộ Nông nghiệp Trung Quốc đang thực hiện chương trình phòng chống bệnh rất quy mô, riêng chương trình nghiên cứu, sản xuất vắc xin đã được cam kết chi khoảng 280 triệu Nhân dân tệ tương đương với 36,5 triệu USD [28, 34]

Tại Hồng Kông và Đài Loan cũng đã xác định có cả hai chủng Châu Âu và Bắc Mỹ cùng lưu hành, đặc biệt trong cùng một con lợn ở Hồng Kông đã phát hiện nhiễm cả hai chủng nêu trên [28] Dịch lợn tai xanh cũng được thông báo ở Thái Lan từ các năm 2000 – 2007 [59] Các báo cáo cho thấy vi rút gây bệnh lợn tai xanh được phân lập từ nhiều địa phương thuộc nước này gồm cả chủng dòng châu Âu và chủng dòng Bắc Mỹ Trong đó số vi rút thuộc chủng dòng châu Âu chiếm 66,42%, các vi rút thuộc chủng dòng Bắc Mỹ chiếm 33,58% [59]

Phần lớn ở những quốc gia này hiện còn đang lưu hành vi rút gây bệnh lợn tai xanh chủng châu Âu hoặc Bắc Mỹ là những chủng vi rút cổ điển độc lực thấp [26, 28] Tháng 9/2007, Nga đã báo cáo chính thức có dịch lợn tai xanh do chủng vi

rút PRRS thể độc lực cao gây ra [59]

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 12

Như vậy, có thể khẳng định rằng Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

là một trong những nguyên nhân chính gây ra nhiều tổn thất nặng nề cho ngành chăn nuôi lợn của nhiều quốc gia trên thế giới

1.3.2 Tình hình bệnh lợn tai xanh ở Việt Nam

Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam, 10 trong số 51 con có huyết thanh dương tính với PRRS và cả đàn được tiêu hủy ngay sau đó [28] Tuy nhiên từ năm 1997 đến trước tháng 3 năm 2007 chưa phát hiện các ổ dịch lâm sàng trên đàn lợn Việc xảy

ra các ổ dịch lần đầu ở các tỉnh phía Bắc có liên quan đến tình hình dịch ở các nước láng giềng Theo thông báo của các tổ chức quốc tế, trong năm 2006, dịch xảy ra nghiêm trọng ở một số nước trong khu vực [59, 62] Từ tháng 3/2007, bệnh xuất hiện và gây thành dịch tại nhiều địa phương, gây tổn thất lớn về kinh tế cho người chăn nuôi, cụ thể như sau:

 Năm 2007: dịch đã xuất hiện tại 324 xã, thuộc 65 huyện của 18 tỉnh, thành phố Tổng số lợn mắc bệnh là 70.577 con, số lợn chết và phải tiêu huỷ là 20.366 con [1]

 Năm 2008: dịch xuất hiện tại 956 xã, phường, thuộc 103 huyện của 26 tỉnh, thành phố Tổng số lợn mắc bệnh là 309.586 con, số lợn chết và buộc phải tiêu huỷ

là 300.906 con [2]

 Năm 2009: dịch xảy ra ở 69 xã thuộc 26 huyện của 13 tỉnh, thành phố: Bến Tre, Bình Dương, Đồng Nai, Tiền Giang, Vĩnh Long, Hưng Yên, Quảng Ninh, Bắc Giang, Quảng Nam, Gia Lai, Bạc Liêu, Bà Rịa - Vũng Tầu và Đắk Lắk với 7.030 lợn mắc bệnh và 5.847 lợn buộc phải tiêu huỷ [3]

 Năm 2010: dịch đã xuất hiện tại 1.978 xã, phường, thị trấn thuộc 286 quận, huyện của 49 tỉnh, thành phố Tổng số lợn mắc bệnh là 812.947 con, số lợn chết và buộc phải tiêu huỷ là 442.699 con [4]

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 13

 Năm 2011: dịch lợn tai xanh xảy ra hai đợt, tuy nhiên số ổ dịch cũng như số lợn mắc bệnh, số lợn bị tiêu hủy giảm rất nhiều (gần 20 lần cả về phạm vi, quy mô dịch và số lượng gia súc phải tiêu hủy) so với năm 2010 [5] Cụ thể:

+ Đợt 1: Tổng số lợn mắc bệnh là 14.759 con trong đó có 1.468 con lợn nái, 5.346 con lợn thịt và 7.665 con lợn con; tổng số lợn phải tiêu hủy là 14.158 con trong đó 1.373 con lợn nái, 4.850 con lợn thịt và 7.581 con lợn con [5]

+ Đợt 2: Tổng số lợn mắc bệnh là 27.558 con trên tổng đàn 46.328 con của các tỉnh có dịch; tổng số lợn phải tiêu hủy là 12.361con [5]

 Năm 2012: dịch xảy ra tại 453 xã/phường, thị trấn của 95 quận/huyện thuộc

28 tỉnh Tổng số lợn mắc bệnh là 90.688, tổng số chết là 14.065 con, tổng số lợn phải tiêu hủy là 51.761 con [6]

Bảng 1.1 Thống kế tình hình dịch lợn tai xanh tại Việt Nam năm 2007–2012 [1, 2,

3, 4, 5, 6]

Năm có dịch Số tỉnh Số huyện có dịch Số xã, phường có dịch Số lợn

mắc bệnh

Số lợn chết, tiêu hủy

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 14

Từ những thông tin nêu trên có thể thấy rằng những thiệt hại mà Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn gây ra là vô cùng to lớn Bệnh không chỉ gây thiệt hại nặng nề về kinh tế mà qua thực tiễn ở Việt Nam cho thấy nó còn để lại nhiều hậu quả nghiêm trọng khác về môi trường và an sinh xã hội, nhất là đối với các vùng nông thôn, nơi người dân phải sống chủ yếu dựa vào chăn nuôi lợn

1.4 PHÕNG CHỐNG VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH LỢN TAI XANH

Trước những diễn biến phức tạp và thiệt hại to lớn mà Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp đã gây ra trên đàn lợn của nhiều quốc gia trên thế giới, cho đến nay nhiều vấn đề liên quan đến dịch bệnh này đã được nghiên cứu và dần sáng tỏ Đặc biệt là các vấn đề về nguyên nhân, cơ chế gây bệnh, triệu chứng, bệnh tích và các phương pháp chẩn đoán, phòng ngừa dịch bệnh Các biện pháp khống chế bệnh

đã được áp dụng ở nhiều nước nhưng vẫn chưa đem lại hiệu quả như mong muốn Một số nước phát triển có ngành chăn nuôi lợn công nghiệp với quy mô lớn, áp dụng kỹ thuật tiên tiến kiểm soát chặt chẽ con giống và có chương trình khống chế

để thanh toán bệnh lợn tai xanh, kết quả là đã hạn chế được thiệt hại sau hàng thập

kỷ, nhưng bệnh vẫn tồn tại và lưu hành trong các đàn lợn, gây nhiều thiệt hại về kinh tế [54]

Hiện nay vẫn chưa có thuốc đặc trị bệnh lợn tai xanh, mà để hạn chế thiệt hại

do bệnh thường sử dụng một số thuốc kháng sinh như: Tylosin, Enrofloxacine nhằm điều trị các bệnh kế phát và tăng cường sức đề kháng cho lợn bằng các loại thuốc trợ lực (B.comlex, vitamin ) kết hợp các thuốc điều trị triệu chứng như: hạ sốt, chống ỉa chảy, ho, viêm phổi [61] Tuy nhiên hiệu quả đạt được không cao

Do đó, phương pháp phòng bệnh được đặt lên hàng đầu Để phòng chống bệnh lợn tai xanh độc lực cao, biện pháp vẫn được sử dụng là tiêm phòng vắcxin kết hợp các biện pháp thú y Gần đây chỉ có một số lượng hạn chế các vắcxin bất hoạt và nhược độc cho bệnh lợn tai xanh sử dụng các chủng của châu Mỹ hoặc châu Âu Vắcxin dạng này có một số nhược điểm như vắcxin bất hoạt hiệu quả bảo vệ miễn dịch thường khô ng cao, còn vắcxin nhược độc ta ̣o ra m ức độ bảo vệ tốt đối với các chủng tương đồng nhưng lại có nguy cơ phát triển độc tính trở lại [18, 21, 24, 38]

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 15

Hiện nay trên thị trường Việt Nam cũng có hai loại vắcxin chống PRRSV dạng này nhưng với giá thành khá cao (40.000 đồng/liều) mà hiệu quả chỉ đạt 40% và chỉ có khả năng điều trị các các triệu chứng lâm sàng mà không bảo vệ động vật miễn nhiễm với vi rút [18] Cho đến nay, thế giới duy nhất có Trung Quốc sản xuất được vắcxin chống vi rút PRRS độc lực cao [18], tuy nhiên họ vẫn chưa có giấy phép để xuất khẩu loại vắcxin trên

1.5 VẮCXIN THỰC VẬT –THẾ HỆ VẮCXIN MỚI

1.5.1 Ưu điểm của vắcxin thực vật

Việc sản xuất protein tái tổ hợp trên quy mô lớn dựa trên những ứng dụng của công nghệ sinh học đã tạo nên cuộc cách mạng trong việc phòng và chống bệnh trên người và động vật Một hệ thống biểu hiện protein hiệu quả và rẻ tiền vẫn đang

là mối quan tâm của các nhà nghiên cứu và sản xuất Hệ thống biểu hiện trong thực vật đang được phát triển nhằm thay thế hệ thống biểu hiện trong tế bào động vật hay

vi sinh vật do có nhiều ưu thế về giá thành, chất lượng protein cũng như quy mô sản xuất Cụ thể như sau [18, 25, 38]:

 Tế bào thực vật có khả năng tiến hành quá trình biến đổi sau dịch mã như các sinh vật nhân chuẩn bậc cao, đảm bảo vắcxin có hoạt tính đối với người và động vật

 Vắcxin được tạo ra trong điều kiện môi trường thân thiện, độ an toàn sinh học cao và ổn định

 Tế bào thực vật không mang các mầm bệnh của động vật và người nên không có khả năng tái tổ hợp với vi rút độc của động vật

Thực chất vắcxin thực vật là vắcxin tiểu đơn vị, được sản xuất dựa trên hệ thống thực vật để thu protein kháng nguyên mong muốn Đây là một xu thế phát triển mới của công nghệ sinh học Nhiều gen mã hóa cho các kháng nguyên vi khuẩn, vi rút đã được chuyển vào thực vật và biểu hiện với hiệu quả cao Các thực vật chuyển gen biểu hiện kháng nguyên quan tâm được sử dụng trực tiếp làm vắcxin

 Có thể dùng qua đường miệng như ăn tươi (quả, lá), nấu chín (hạt, củ)

 An toàn: vì vắcxin được sản xuất trong thực vật là vắcxin tiểu đơn vị, có khả năng gây đáp ứng miễn dịch mà không cần đến toàn bộ hệ gen của vi rút như vắcxin giảm độc lực hay bất hoạt Do đó, vắcxin dạng này không thể gây b ệnh cho người và động vật, đồng thời cũng tránh được nguy cơ nhiễm mầm bệnh khác như vắcxin sản xuất trong tế bào động vật

 “Vắcxin ăn được” kích thích sản xuất kháng thể của hệ thống niêm mạc ruột hiệu quả hơn vắcxin tiêm Trong thực tế, hầu hết các vi sinh vật gây bệnh đều xâm nhập vào cơ thể qua lớp màng nhầy của đường tiêu hóa, hô hấp và đường tiết niệu Đây là những nơi t ập trung các mô có kh ả năng đáp ứng miễn dịch tốt nhất của cơ thể, như là hàng rào bảo vệ đầu tiên chống lại những vi sinh vật đó

Phát triển vắcxin trong thực vật đánh dấu một bước ngoặt quan trọng trên con đường tìm ra phương thức sản xuất vắcxin dựa vào nguồn nguyên liệu có sẵn,

rẻ tiền và điều này rất có ý nghĩa đối với các nước đang phát triển Rất nhiều quy trình sản xuất vắcxin trong thực vật đã được hình thành như dùng thực vật chuyển gen, thực vật mang lục lạp chuyển gen, thực vật chuyển gen tạm thời, thực vật nhiễm vi rút và nuôi cấy tế bào thực vật… [18] Trong quá trình sản xuất vắcxin thực vật, các cây trồng cho củ, hạt và quả làm thức ăn cho người và động vật thường được chọn để biểu hiện vắcxin vì dễ sử dụng và bảo quản Bênh cạnh việc tạo cây trồng biến đổi gen thì việc sản xuất vắcxin trong tế bào thực vật được nuôi

cấy in vitro cũng có nhiều hứa hẹn và có ưu điểm hơn so với việc sử dụng cây trồng

ngoài tự nhiên như khả năng tạo ra các chất với độ an toàn sinh học cao, ổn định, không phụ thuộc mùa vụ, điều kiện môi trường và không có nguy cơ nhiễm bệnh từ bên ngoài [18]

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 17

Nuôi cấy tế bào có nhiều dạng khác nhau như nuôi cấy rễ phụ, khối mô chồi,

tế bào cố định và tế bào huyền phù Tuy nhiên, nghiên cứu của chúng tôi sẽ chỉ tập trung vào cải tạo và phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào dạng huyền phù vì dạng nuôi cấy này có tính khả thi cao nhất trong việc tạo ra quy trình sản xuất có thể điều khiển được và việc chuyển lên quy mô lớn có thể tiến hành tương đối dễ dàng

Trong nhiều trường hợp, việc sản xuất vắcxin thực vật gặp phải trở ngại lớn khi phải đối mặt với hiện tượng dung nạp đường miệng Tức là hệ miễn dịch màng nhầy của đường tiêu hóa được thiết kế không gây đáp ứng miễn dịch với thức ăn nó tiếp xúc hàng ngày Như vậy, một số loại kháng sinh thực vật sau khi vào đường tiêu hóa sẽ không được hệ miễn dịch màng nhầy nhận ra nên "lờ đi" Ngược lại, một

số "thức ăn" lạ có thể gây phản ứng tức thời hoặc lâu dài do dung nạp đường miệng không tồn tại với chúng LTB (Labile Toxin B subunit - độc tố không chịu nhiệt của

vi khuẩn E coli) thường gây đáp ứng miễn dịch với cơ thể ở mức cao Chính vì vậy,

chúng thường được sử dụng làm tá chất cho việc chuyển tải kháng nguyên qua

đường miệng [20, 31, 37]

1.5.2 Sử dụng tế bào thuốc lá siêu sinh trưởng BY – 2 làm hệ thống biểu hiện

Tế bào huyền phù đã được tạo ra từ nhiều loài thực vật khác nhau như

Arabidopsis thaliana, Taxus cuspidate, Catharanthus roseus và các cây trồng quan

trọng khác như thuốc lá, cỏ ba lá, lúa, cà chua và đậu tương …[18] Tuy nhiên, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng dòng tế bào thuốc lá BY-2 làm hệ thống biểu hiện Tế bào thuốc lá BY-2 là dòng tế bào siêu sinh trưởng, được các nhà khoa

học Nhật Bản chọn lọc từ nuôi cấy mô lõi của thân cây thuốc lá Nicotiana tabacum

L cv Bright Yellow No 2 vào năm 1968 BY-2 có khả năng phát triển đồng nhất

và ổn định trên môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền với tốc độ nhân dòng khoảng

100 lần trong vòng một tuần Một đặc điểm ưu việt khác nữa là BY-2 đáp ứng tốt

với quy trình chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium [18] Do vậy, tế bào BY-2

là dòng tế bào thực vật đang được dùng rộng rãi nhất cho việc sản xuất nhiều loại protein tái tổ hợp

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 18

1.6 CHUYỂN GEN VÀO THỰC VẬT THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens [12, 17]

Các vi khuẩn đất A tumefaciens và một số loài họ hàng của chúng có khả

năng chuyển một phần nhỏ ADN vào tế bào thực vật, qua đó kích thích tạo khối u Khối u tạo thành là không gian sống, đồng thời là nơi tổng hợp một số chất dinh

dưỡng có lợi cho vi khuẩn (opine) Như vậy, A tumefaciens đã thực hiện “kỹ thuật

gen” với mục đích tạo ra “cây biến đổi” gen có lợi cho nó Khả năng chuyển ADN

của A tumefaciens được ứng dụng trong công nghệ gen hiện đại [12, 17]

Việc sử dụng A tumefaciens bắt đầu từ năm 1970, khi người ta phát hiện vi

khuẩn này có khả năng tạo nên khối u ở cây hai lá mầm bị thương, được gọi là khối

u cổ rễ (Hình 1.4) Trong các chủng A tumefaciens tạo khối u có một plasmid rất lớn với kích thước khoảng 200-800 kb Từ những thí nghiệm trên những chủng A tumefaciens không độc (không có plasmid này), người ta đã khẳng định plasmid nói

trên là cần thiết cho việc tạo khối u Do vậy, chúng được gọi là Ti-plasmid (tumor inducing-plasmid) [12, 17]

Hình 1.4 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và khối u a: Vi khuẩn A

tumefaciens dưới kính hiển vi điện tử; b: Khối u ở cây và từ khối u này xuất hiện chồi một

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 19

phân chia tế bào liên tục không phụ thuộc vào sự sinh trưởng của cây; hệ gen thứ hai

mã hóa cho một số enzyme điều khiển tổng hợp các dẫn xuất của amino acid hay đường gọi là opine Vùng B là vùng tái bản mang điểm khởi đầu sao chép (oriT) Vùng C liên quan đến sự tiếp hợp Vùng D có tên gọi là vùng độc (virulence region)

có chứa các gen vir, giữ vai trò quan trọng trong việc chuyển T-DNA vào hệ gen

nhân của tế bào thực vật Ngoài ra, mỗi Ti-plasmid còn chứa các gen nằm ngoài vùng T-DNA mã hóa cho các enzyme phân giải opine cung cấp nguồn carbon và nitơ cho

vi khuẩn [12, 17]

Hình 1.5 Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid [12]

Vùng T-DNA có kích thước khoảng 10 kb – 20 kb, nằm giữa 2 trình tự lặp lại gồm 25 bp gọi là bờ trái (left border – LB) và bờ phải (right border – RB) LB và

RB là những yếu tố cần thiết để định hướng cho sự chuyển ADN Sự mất đi 6 bp đầu tiên hoặc 10 bp cuối cùng trong số 25 bp đều ngăn cản sự chuyển của T-DNA Quá trình chuyển T-DNA bắt đầu từ vị trí RB và kết thúc ở vị trí LB Sự định hướng này rất quan trọng, nếu thiếu yếu tố này việc chuyển gen sẽ không xảy ra hoặc không hiệu quả

Hoạt động của vùng vir đóng vai trò quan trọng cho việc chuyển T-DNA sang tế bào thực vật Vùng này có kích thước khoảng 40 kb và bao gồm 6 operon: các virA, B, D và G cần thiết cho việc tạo độc tính; còn vir C và E liên quan đến

việc tạo thành khối u Nhìn chung, gen virA biểu hiện ở mọi điều kiện; gen virC

biểu hiện ở khắp các tế bào sinh dưỡng nhưng biểu hiện mạnh ở dịch chiết từ các

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 20

mô bị thương tổn Hoạt động của các operon này có liên quan chặt chẽ đến sự có mặt của các hợp chất phenol được tiết ra từ các vết thương tổn của cây Từ vết thương cây thuốc lá người ta đã tinh chế và xác định các hợp chất này là acetosyringone và α-hydroxyacetosyringone Chất này vừa có tác dụng làm lành vết thương vừa có tác dụng dẫn dụ vi khuẩn xâm nhập, lại có vai trò như một chất kích

hoạt vùng gen vir thuộc Ti-plasmid kích thích cho sự cắt đoạn T-ADN (tại vùng bờ

trái và bờ phải) để gắn vào hệ gen thực vật

Ý nghĩa của gen vir trong quá trình chuyển gen được giải thích như sau: Gen virA mã hóa cho một protein màng, là chất nhận hợp chất phenol ở tế bào cây bị thương Sự nhận biết chất này dẫn đến sự hoạt hóa sản phẩm gen virG, đến lượt nó lại kích thích sự sao chép và sự biểu hiện của tất cả gen vir Sự hoạt hóa của protein thuộc gen virG có thể do sự vận chuyển những nhóm phosphate Hai protein được

mã hóa từ gen virD2 và virE2 quan trọng đối với việc chuyển T-DNA Protein

virD2 là một endonuclease, cắt sợi đơn đặc hiệu ở bờ phải và trái của T-DNA, Protein virE2 gắn lập tức vào sợi đơn và ngăn cản sự gắn lại với Ti-plasmid (Hình 1.6) Sau đó, bằng cơ chế tổng hợp sửa chữa DNA, từ sợi đơn còn lại trong Ti-plasmid xuất hiện lại một T-DNA hoàn chỉnh Ngoài ra, một protein virD2 gắn vào đầu 5’ của T-DNA sợi đơn đã được cắt ra bằng liên kết đồng hóa trị Bằng cách này tạo ra một phức hệ DNA-protein và được chuyển vào tế bào thực vật Cơ chế của quá trình này vẫn chưa được làm rõ, nhưng có thể là 11 protein được mã hóa từ gen

virB tạo nên một lỗ hổng, qua lỗ này phức hệ DNA-protein được vận chuyển vào

thực vật Khi đến tế bào thực vật phức hệ này đi vào nhân tế bào Protein virD2 và virE2 chứa trình tự định vị nhân đặc hiệu cho phép phức hệ đi qua màng nhân và gắn vào DNA thực vật một cách ngẫu nhiên ở những chỗ gãy trên sợi của DNA của

tế bào thực vật Tuy nhiên, vị trí tái tổ hợp được quan sát là đặc hiệu, bao gồm những trình tự rất ngắn 5-10 bp Quá trình kết hợp được thực hiện nhờ các enzyme thực vật, có thể có sự tham gia của protein virD2 [7, 12, 17]

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 21

Hình 1.6 Sơ đồ minh họa quá trình di chuyển T-DNA của Ti-plasmid 1: T-DNA

với bờ phải và bờ trái được chèn vào Ti-plasmid; 2: Sợi đơn được cắt ra nhờ protein được

mã hóa bởi gen virD2; 3: Sợi đơn của T-DNA được giải phóng và kết hợp với protein do

virD2 và virE2 mã hóa, chỗ đứt ở sợi đơn thứ hai được tổng hợp bổ sung; 4: Lấp đầy chỗ

trống trong Ti-plasmid (đường gạch nối đậm) Sợi T-DNA tự do được vận chuyển vào tế bào thực vật ở dạng phức hệ DNA-protein [12]

Từ những phân tích trên có thể thấy Agrobacterium tumefaciens là một hệ

thống chuyển gen tự nhiên Tuy nhiên, quá trình này không thích hợp cho việc ứng dụng trong công nghệ gen vì những nguyên nhân sau [12, 17]:

- Do tạo khối u nên không thể tái sinh được cây hoàn chỉnh và khỏe mạnh từ

tế bào biến nạp gen

- Sự tổng hợp opine là không mong muốn vì cây tiêu tốn năng lượng không cần thiết

- DNA lạ (ngoại lai) không thể đưa vào Ti-plasmid cũng như T-DNA Những plasmid có kích thước > 200 kb là quá lớn, khó thao tác trong phòng thí nghiệm

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 22

Khắc phục những khó khăn trên, các nhà khoa học đã thành công trong việc sửa đổi Ti-plasmid và T-DNA để các phytohormone không được tạo nên Trong những bước tiếp theo gen tổng hợp opine được cắt ra và thay thế bằng những gen chỉ thị, ví dụ: gen kháng kanamycin [12, 17, 18] Ngày nay, người ta sử dụng hệ thống được gọi là vector hai nguồn (binary vector), trong đó chức năng của Ti-

plasmid được thực hiện qua hai plasmid Plasmid lớn mang vùng vir và plasmid nhỏ

mang bờ trái và phải của T-DNA Đây là những vùng của T-DNA duy nhất cần thiết cho việc vận chuyển gen vào thực vật Giữa bờ phải và trái một gen chọn lọc

và những gen lạ được chèn vào [12] Sơ đồ cấu tạo của một vector hai nguồn được minh họa trên hình 1.7 Ưu điểm của vector này là các thao tác chỉ thực hiện với plasmid nhỏ Tất cả những công việc tạo dòng, đưa DNA lạ có thể thực hiện trong

những tế bào E coli, còn plasmid lớn đã hoàn thiện và được chuyển vào A tumefaciens Các mô cần biến nạp được ủ với vi khuẩn A tumefaciens, sau đó vi

khuẩn được loại bỏ và mô tái sinh thành cây hoàn chỉnh [12 17]

Hình 1.7 Sơ đồ minh họa hệ thống vector hai nguồn biến nạp gen vào tế bào thực

vật bằng vi khuẩn A tumefaciens Các gen tạo khối u và tổng hợp nopalin được loại ra, DNA mang một gen đánh dấu để chọn lọc trong thực vật Các gen khác được chèn vào A.t

T-ori: Khởi đầu sao chép để nhân lên trong A tumefaciens; E.c T-ori: Khởi đầu sao chép để

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 23

nhân lên trong E coli; KmR: gen kháng kanamycin để chọn lọc trong E coli và A

tumefaciens; P1, P2: Promoter; T1, T2: Terminator; vir: Vùng vir [12]

1.7 THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN THỰC VẬT BẰNG KỸ THUẬT GATEWAY

Các vector chuyển gen thực vật thường có kích thước rất lớn (từ 8 – 15 kb) bởi ngoài các thành phần cơ bản của một vector tái tổ hợp như tâm tái bản, vị trí đa điểm của enzyme giới hạn, gen chọn lọc/chỉ thị …, vector chuyển gen cần mang một

số trình tự giúp cho sự chuyển, biểu hiện của gen cần chuyển trong hệ gen của tế bào vật chủ Ví dụ: trình tự khởi động (promoter), trình tự tăng cường (enhancer), …

Trước đây, quá trình thiết kế vector chuyển gen thường sử dụng phương pháp kinh điển thông qua phản ứng cắt ADN nhờ enzyme giới hạn sau đó nối ADN nhờ enzyme nối ADN ligase Tuy nhiên phương pháp này tồn tại một số nhược điểm sau:

- Do vector chuyển gen thực vật có kích thước rất lớn nên việc tìm ra vị trí nhâ ̣n biết đơn (single recognition sides – SRS) của một loại enzyme giới hạn để cắt đồng thời vector và đoạn gen quan tâm thường rất khó Như chúng ta đã biết, ADN chứa 4 loại nucleotide A, T, G, C Theo quy luật xác suất thống kê, tỷ lệ 6 nucleotide bất kì thuộc 4 loại nucleotide này sắp xếp một cách ngẫu nhiên là 1/46 (tức 1/4096) Như vậy, cứ 4069 bp sẽ bắt gặp một trình tự lặp lại gồm 6 nucleotide Mặt khác, các enzyme giới hạn sử dụng phổ biến trong chuyển gen thường có trình

tự nhận biết gồm 6 nucleotide [14], hơn nữa một số enzyme được vi sinh vật sử dụng phổ biến thường có xác suất bắt gặp cao hơn bình thường Như vậy, với những vector chuyển gen dài lên đến khoảng 10 kb thì việc tìm ra trình tự nhận biết đơn của một enzyme giới hạn ở vị trí thích hợp trên gen và vector rất khó khăn và mất thời gian Mặt khác, không phải đoạn gen nào cũng đã được nghiên cứu biết rõ trình

tự

- Sử dụng phương pháp cắt - nối ADN bằng enzyme giới hạn và enzyme ADN ligase không định hướng được chiều của đoạn gen đưa vào vector trong trường hợp sử dụng một loại enzyme Sử dụng hai enzyme giới hạn khác nhau có

- Trong phản ứng BP, gen cần chuyển mang hai vị trí attB1 và attB2 ở hai đầu được tái tổ hợp một cách đặc hiệu với hai vị trí tương ứng attP1 và attP2 trong vector “donor” được cung cấp trong bộ kít dưới sự xúc tác của enzyme BP clonase Quá trình tái tổ hợp thành công tạo ra vector “donor” mang gen cần chuyển (kí hiệu

là “entry clone”) đồng thời mang hai vị trí att mới là attL1 và attL2 (Hình 1.8)

Hình 1.8: Sơ đồ minh họa phản ứng BP [30]

- Tiếp theo, gen cần chuyển trong vector “entry clone” được chuyển sang vector chuyển gen (vector nhận – “destination vector”) thông qua phản ứng tái tổ hợp đặc hiệu giữa attL1 và attR1, attL2 và attR2 dưới sự xúc tác của enzyme LR clonase Quá trình tái tổ hợp thành công sẽ tạo ra vector chuyển gen mang gen cần chuyển (Hình 1.9)

Hình 1.9: Sơ đồ minh họa phản ứng LR [30]

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 25

Từ những phân tích trên, để thực hiện đề tài “Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện kháng nguyên vi rút PRRS trong tế bào thực vật”, chúng tôi tiến hành chuyển các gen mã hóa cho các kháng nguyên GP5M, GP5, GP3 của vi rút PRRS

vào tế bào thuốc lá siêu sinh trưởng BY-2 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Đề tài nằm trong khuôn khổ dự án hợp tác quốc tế về KHCN theo nghị định thư giữa Việt Nam – Vương Quốc Bỉ: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa Glycoprotein vỏ (GP5) của vi rút gây bệnh lợn tai xanh trong thuốc lá và đậu tương”, được thực hiện tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ

sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 26

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ

- Vector pDONR 201 nằm trong bộ kít Gateway (Invitrogen)

- Vector chuyển gen thực vật pCB-GW-35S (Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học)

b Chủng vi sinh vật

- Dòng tế bào vi khuẩn E coli DH 5α dùng cho biến nạp vector tái tổ hợp

- Dòng tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58 pGV2260 sử dụng cho việc chuyển các gen quan tâm vào tế bào thuốc lá siêu sinh trưởng BY-2

- Các enzyme: enzyme giớ i ha ̣n NcoI, BamHI (Thermo Scientific, New

England BioLabs) và đệm tương ứng, enzyme nối T4 ADN ligase (Thermo Scientific) và đệm tương ứng, enzyme RNase A …

- Bộ kít tinh sạch sản phẩm PCR “GeneJET PCR Purification Kit” (Thermo

Scientific)

- Bộ kít tinh sạch ADN từ gel “GeneJET Gel Extraction Kit” (Thermo

Scientific)

- Các hóa chất sử dụng cho tách ADN tổng số từ tế bào thực vật: CTAB (Invitrogen), NaCl (Sigma), Tris base (Sigma), EDTA (Sigma)

- Các hóa chất dùng cho điện di axit nucleic: Đệm TAE với các thành phần theo Sambrook và Russell [44] (40 mM Tris acetate, 1 mM EDTA , pH 8.2 - 8.4); đệm loading mẫu 6 X, các loại thang chuẩn ADN (Thermo Scientific, Eurogentec, Geneshun) …

- Acetosyringone (100 mM); các kháng sinh: ampicillin (50 mg/ml), kanamycin (50 mg/ml), cefotaxim (500 mg/ml), rifamicin (25 mg/ml)

- Các hóa chất sử dụng cho phân tích protein [16, 35, 45]: dung dịch PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Sodium Phosphate dibasic, 2 mM Potassium Phosphate monobasic, pH 7.4), đệm điện di protein (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS), Comasie brilient blue 250, dung dịch TBS (20 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5), dung dịch chuyển màng (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20%

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Toàn bộ quy trình nghiên cứu được tóm tắt qua Sơ đồ 2.1

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 30

Sơ đồ 2.1: Tóm tắt quy trình nghiên cứu

PCR với cặp mồi gp5-for/cmyc-rev

PCR với cặp mồi ltb-for/ltb5-rev hoặc ltb-for/ltb3-rev

PCR với cặp mồi gp3-for/cmyc-rev

Overlapping-PCR với cặp mồi ltb-for/cmyc-rev

Vector pBSK-gp5m Vector pSHELP-ltb Vector pBSK-gp3

Overlapping-PCR với cặp mồi ltb-for/cmyc-rev

Đoạn gen ltb-gp5m Đoạn gen ltb-gp3

Nối vào vector tách dòng pBT/T

Vector pBT-ltb-gp5m Vector pBT-ltb-gp3 Vector pBT-ltb-gp5

Cắt với enzyme NcoI

Thiết kế vector chuyển gen vào tế bào thực vật bằng kỹ thuật Gateway qua hai

phản ứng BP và LR Phản ứng LR sử dụng vector nhận là vector pCB-GW-35S

Vector pCB-GW-35S -ltb-gp5m Vector pCB-GW-35S-ltb-gp3 Vector pCB-GW-35S-ltb-gp5

Chuyển các đoạn gen quan tâm vào tế bào thuốc lá siêu sinh trưởng BY-2 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Sàng lọc các dòng BY-2 mang gen cần chuyển bằng kháng sinh chọn lọc và bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen

BY-2-35S-ltb-gp5m BY-2-35S-ltb-gp3 BY-2-35S-ltb-gp5

Kiểm tra sự biểu hiện của gen ở mức độ phiên mã bằng RT-PCR và ở mức độ dịch mã

bằng điện di kiểm tra protein tổng số trên gel polyacrylamide, lai miễn dịch Western Blot .

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 31

Quá trình nghiên cứu gồm 4 bước chính:

Bước 1: Thiết kế các đoạn gen ltb-gp5m, ltb-gp5, ltb-gp3

- Trình tự gen ltb được nối vào đầu 5’ của các gen gp5m, gp3 bằng phản ứng

overlapping-PCR Sản phẩm của phản ứng nối bằng PCR được đưa vào vector tách

dòng pBT/T và biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH 5α Kết quả biến nạp được

kiểm tra bằng phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) và phương

pháp cắt plasmid tái tổ hợp với enzyme giới hạn BamHI

- Tiến hành giải trình tự để chọn ra dòng vi khuẩn chứa vector tái tổ hợp pBT

mang đoạn gen ltb-gp5m hoặc ltb-gp3 có trình tự không làm thay đổi trình tự axit

amin tương ứng khi dịch mã phục vụ các thí nghiệm tiếp theo

- Theo tính toán ban đầu, đoạn gen gp5m được thiết kế có chứa hai vị trí cắt của enzyme giới hạn NcoI nằm ở hai đầu của gen m Do vậy, để tạo ra vector pBT- ltb-gp5 chỉ cần cắt vector pBT-ltb-gp5m với enzyme NcoI nhằm loại bỏ gen m

Mô hình cấu trúc các đoạn gen ltb-gp5m, ltb-gp5, ltb-gp3 được minh họa

trên Hình 2.1

Hình 2.1 Mô hình thiết kế cấu trúc các đoạn gen ltb-gp5m, ltb-gp5, ltb-gp3

Bước 2: Thiết kế vector chuyển gen vào tế bào thực vật sử dụng kỹ thuật

pCB-GW-Bước 3: Chuyển các đoạn gen quan tâm vào dòng tế bào thuốc lá siêu sinh

trưởng BY-2 thông qua chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58

pGV2260

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 32

- Biến nạp các vector chuyển gen đã thiết kế thành công vào tế bào vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens CV58 pGV2260 bằng phương pháp xung điện Kiểm

tra kết quả biến nạp bằng phương pháp PCR

- Chuyển các đoạn gen quan tâm vào dòng tế bào thuốc lá siêu sinh trưởng

BY-2 thông qua chủng vi khuẩn A tumefaciens CV58 pGV2260

- Bước đầu sàng lọc các dòng tế bào BY-2 mang gen cần chuyển trên môi trường đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc thích hợp

- Các dòng phát triển tốt trên môi trường có kháng sinh chọn lọc được kiểm tra sự có mặt của gen cần chuyển bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen

Bước 4: Kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển vào trong tế bào BY-2

- Kiểm tra sự biểu hiện của gen ở mức độ phiên mã: Sử dụng phương pháp RT-PCR

- Kiểm tra sự biểu hiện của gen ở mức độ dịch mã: Sử dụng phương pháp điện di kiểm tra protein tổng số trên gel polyacrylamide và phương pháp lai miễn dịch Western Blot

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1 Phương pháp PCR

a PCR khuếch đại các đoạn gen gp5m, gp3, ltb từ các khuôn tương ứng

Với mục đích tăng cường khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể trong việc

chuyển tải kháng nguyên qua đường miệng, gen mã hóa cho protein LTB (Labile

Toxin B subunit - độc tố không chịu nhiệt lấy từ vi khuẩn E coli) được nối vào mỗi gen gp5m, gp3 bằng overlapping-PCR.

Để phục vụ cho phản ứng nối, trước tiên các gen gp5m, gp3, ltb được

khuếch đại từ các khuôn tương ứng bằng phản ứng PCR sử dụng các cặp mồi đã

Pfu ADN polymerase (5 U/µl)

ADN khuôn

16.3 2.5 2.0 1.0 1.0 1.0 0.2 1.0

- Lặp lại 28 chu kỳ : + Biến tính : 94oC trong 30 giây

+ Gắn mồi : 52oC trong 30 giây

+ Tổng hợp : 72o

C trong 90 giây

- Tổng hợp bước cuối : 72oC trong 10 phút

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 34

b Overlapping-PCR nối gen ltb vào đầu 5’ của các gen gp5m, gp3

Sản phẩm PCR khuếch đại các gen phía trên đƣợc sử dụng trực tiếp làm

khuôn cho phản ứng overlapping-PCR nhằm nối gen ltb vào đầu 5’ của các gen gp5m, gp3 Phản ứng đƣợc tiến hành với các thành phần và điều kiện nhƣ Bảng 2.4

Pfu ADN polymerase (5 U/µl)

ADN khuôn

32.5 5.0 4.0 2.0 2.0 2.0 0.4 2.0

Bảng 2.5: Mồi, ADN khuôn và chu trình nhiệt sử dụng cho phản ứng

overlapping-PCR nối gen ltb vào các gen gp5m, gp3

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 35

- Không bổ sung mồi ở 5 chu kì đầu tiên

2.2.2.2.Phương pháp tinh sạch ADN từ gel agarose

Sản phẩm PCR hoặc sản phẩm cắt ADN với enzyme giới hạn được tinh sạch

từ gel (thôi gel) sử dụng bộ Kit “GeneJET Gel Extraction Kit” (Thermo Scientific)

theo các bước như sau [50] :

(1) Điện di hỗn hợp ADN trên gel agarose 1%, sử dụng máy soi gel cắt lấy băng ADN quan tâm từ bản gel bỏ vào các ống eppendorf 2 ml vô trùng Xác định khối lượng của mỗi miếng gel;

(2) Bổ sung dung dịch Binding theo tỷ lệ: Vmẫu : Vdd = 1 : 1 (100 l dung dịch tương ứng với 100 mg mẫu) Ủ ở 600C đến khi miếng gel tan hoàn toàn;

(3) Chuyển hỗn hợp lên cột thôi gel, ly tâm ở điều kiện 13.000 vòng/phút, trong 1 phút;

(4) Loại bỏ dịch chảy qua cột;

(5) Bổ sung 700 l dung dịch rửa;

(6) Ly tâm ở điều kiện 13.000 vòng/phút trong 1 phút;

(7) Loại bỏ dịch chảy qua cột;

(8) Lặp lại bước (6), (7);

(9) Chuyển cột sang ống eppendorf vô trùng 1,5 ml;

(10) Để khô cột ở nhiệt độ phòng trong 5 phút;

(11) Bổ sung 25 – 30 µl nước deion khử trùng vào chính giữa cột, giữ cột ở nhiệt độ phòng 2 phút, sau đó ly tâm ở điều kiện 13.000 vòng/phút trong 1 phút Thu lấy dịch chảy qua cột

2.2.2.3 Phương pha ́ p nối các đoạn ADN bằng enzyme nối T4 ADN ligase

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 36

Sản phẩm của phản ứng overlapping-PCR nối gen ltb vào các gen gp5m, gp3

sau khi tinh sạch được đưa vào vector pBT/T bằng phản ứng nối nhờ enzyme T4 ADN ligase với các thành phần và điều kiện như Bảng 2.6

Bảng 2.6: Thành phần và điều kiện phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách

dòng pBT/T sử dụng enzyme T4 ADN ligase

Thành phần phản ứng Thể tích (µl)

H2O Đệm T4 ADN ligase 10 X Enzyme T4 ADN ligase (5 U/µl) Vector pBT/T (100 ng/µl)

Sản phẩm PCR đã tinh sạch

2.0 1.0 1.0 1.0 5.0

Ủ hỗn hợp ở 220C trong 2 giờ

2.2.2.4 Phương pháp biến na ̣p plasmid vào tế bào vi khuẩn E coli DH 5α

Để biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E coli DH 5α chúng tôi sử dụng

phương pháp sốc nhiê ̣t Đây là phương pháp đơn giản , phổ biến và tiê ̣n lợi để đưa plasmid tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn Quá trình biến nạp được thực hiện theo theo Sambrook và Russell [46] với các bước như sau:

(1) Tế bào E coli khả biến được lấy từ tủ -80oC, để tan trên đá trong 5 phút; (2) Bổ sung 10 µl sản phẩm nối, búng nhẹ, ủ trên đá 30 phút;

(3) Sốc nhiệt hỗn hơ ̣p ở 42oC trong 60 giây;

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 37

Quy trình tách plasmid bằng phương pháp biến tính kiềm được tiến hành theo Sambrook và Russell [46] với các bước như sau:

(1) Ly tâm 1,5 ml dịch vi khuẩn nuôi cấy qua đêm ở 10,000 vòng/phút trong

5 phút; bỏ dịch trong, thu lấy cặn tế bào;

(2) Hòa cặn trong 100 µl dung dịch I (50 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM glucose, 10 mM EDTA pH 8), vortex, ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút;

(3) Thêm 200 µl dung dịch II (0.2 N NaOH, 1% SDS), đảo nhẹ, ủ trên đá 3 phút; (4) Thêm 150 µl dung dịch III (3 M KOAc pH 5.2), ủ trên đá 5 phút;

(5) Ly tâm hỗn hợp ở 4oC, 13000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch trong; (6) Bổ sung 1 thể tích Phenol:Chloroform:Isoamyl (25:24:1), đảo nhẹ;

(7) Ly tâm hỗn hợp ở nhiệt độ phòng , 13000 vòng/phút trong 5 phút, thu dich pha trên;

(8) Bổ sung 0,6 thể tích isopropanol 100%, trộn đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút;

(9) Ly tâm ở 4oC, 13000 vòng/phút trong 20 phút, loại bỏ dịch trong, thu lấy tủa ADN;

(10) Rửa tủa bằng 0,5 ml cồn 70% lạnh rồi ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút Loại bỏ dịch trong;

(11) Để tủa khô, hòa tan tủa trong 20 - 30 µl nước hoặc TE có bổ sung RNase A đến nồng độ cuối cùng là 20 µg/ml

2.2.2.6 Phương pháp kiểm tra kết quả biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn

Các khuẩn lạc m ọc trên đĩa tha ̣ch có b ổ sung kháng sinh chọn lọc bước đầu được kiểm tra sự có mặt của vector tái tổ hợp mang đoạn gen quan tâm bằng phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) Đây là phương pháp nhanh, đơn giản bởi sử dụng trực tiếp các tế bào vi khuẩn làm khuôn cho phản ứng PCR Tuy nhiên, để có kết quả chính xác hơn, các khuẩn lạc dương tính từ phản ứng colony-PCR được nuôi lỏng qua đêm rồi tiến hành tách thu lấy plasmid Sau đó tiến hành cắt các plasmid này với enzyme giới hạn thích hợp hoặc sử dụng chính

thu lấy plasmid và cắt các plasmid này với enzyme giới hạn BamHI Thành phần và

điều kiện phản ứng cắt đƣợc mô tả trong Bảng 2.7

Bảng 2.7: Thành phần phản ứng cắt plasmid với enzyme giới hạn BamHI

Thành phần phản ứng Thể tích (µl)

H2O

Đệm enzyme BamHI 10 X Enzyme BamHI (10 U/µl)

Plasmid tái tổ hợp

10.2 1.5 0.3 3.0

Ủ hỗn hợp ở 370C trong 2 giờ

2.2.2.7 Phương pháp thiết kế đoạn gen ltb-gp5

Theo tính toán ban đầu, đoạn gen gp5m đƣợc thiết kế có chứa hai vị trí cắt của enzyme giới hạn NcoI nằm ở hai đầu của gen m, do vậy để tạo ra đoạn gen nối ltb-gp5 chỉ cần cắt vector pBT-ltb-gp5m với enzyme NcoI Thành phần và điều kiện

phản ứng cắt đƣợc minh họa trong Bảng 2.8

23.5 3.0 0.5 3.0

Ủ hỗn hợp ở 370C trong 2 giờ

2.2.2.8 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen bằng kỹ thuật GateWay

Để tiến hành thiết kế vector chuyển gen bằng kỹ thuật Gateway, trước tiên

các đoạn gen cần chuyển (ltb-gp5m, ltb-gp5, ltb-gp3) được gắn các trình tự attB1,

attB2 tương ứng vào hai đầu 5’, 3’ của gen bằng phương pháp PCR với cặp mồi attB1-ltb/attB2-cmyc (ngoài vùng trình tự đặc hiệu cho gen, các mồi này còn được gắn thêm trình tự attB1 hoặc attB2 ở đầu 5’) Thành phần và điều kiện cho phản ứng PCR được trình bày trong Bảng 2.9

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 40

Bảng 2.9: Thành phần và điều kiện chu trình nhiệt cho phản ứng PCR gắn các vị trí

attB1, attB2 vào hai đầu của các gen ltb-gp5m, ltb-gp5, ltb-gp3

Pfu ADN polymerase (5 U/µl)

ADN khuôn (plasmid pBT

mang đoạn gen tương ứng)

32.6 5.0 4.0 2.0 2.0 2.0 0.4 2.0

- Biến tính lần đầu: 94oC trong 5 phút

- Lặp lại 28 chu kỳ : + Biến tính: 94oC trong 30 giây

+ Gắn mồi: 58o

C trong 30 giây

+ Tổng hợp: 72o

C trong 1 phút 40 giây

- Tổng hợp bước cuối: 72oC trong 5 phút

Hỗn hơ ̣p được ủ ở 25o

C trong 10 giờ