Nghiên cứu thành phần loài và đặc điểm sinh học của một số đại diện thuộc họ Nấm tán Pluteaceae ở một số vùng sinh thái chính của Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- Trần Đông Anh NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LOÀI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ ĐẠI DIỆN THUỘC HỌ NẤM TÁN PLUTEACEAE Ở MỘT SỐ VÙ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Trần Đông Anh

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LOÀI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ ĐẠI DIỆN THUỘC HỌ NẤM TÁN PLUTEACEAE

Ở MỘT SỐ VÙNG SINH THÁI CHÍNH CỦA VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2013

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS TSKH TRỊNH TAM KIỆT

Hà Nội - 2013

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đặc điểm chung của nấm lớn 3

1.2 Lược sử nghiên cứu Nấm lớn trên thế giới 6

1.3 Tình hình nghiên cứu Nấm lớn ở Việt Nam 7

1.4 Tình hình nghiên cứu và đặc điểm sinh học họ nấm Pluteaceae 11

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng, địa điểm và nội dung nghiên cứu 16

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 16

2.1.3 Nội dung nghiên cứu 16

2.1.4 Thiết bị nghiên cứu 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Phương pháp thu mẫu 17

2.2.2 Phương pháp xử lý và bảo quản mẫu vật 18

2.2.3 Phương pháp phân tích mẫu vật 20

2.2.4 Phương pháp định loại nấm lớn 21

2.2.5 Nghiên cứu sự mọc của nấm trên môi trường thạch và giá thể 21

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Thu thập mẫu nấm thuộc họ Nấm tán Pluteaceae ở một số vùng sinh thái chính của Việt Nam 24

3.2 Thành phần loài nấm thuộc họ Nấm tán Pluteaceae của Việt Nam và một số đặc điểm sinh học của chúng 24

3.2.1 Danh lục các loài nấm đã ghi nhận 24

3.2.2 Một số đặc điểm hình thái và hiển vi của các loài nấm đã ghi nhận 27

3.2.3 Đặc điểm sinh thái của các loài đã được ghi nhận 31

3.2.4 Ý nghĩa thực tiễn của các loài nấm họ Pluteaceae của Việt Nam 31

3.3 Mô tả đặc điểm hình thái và hiển vi của các loài đã ghi nhận 32

3.4 Nghiên cứu sự mọc và sự hình thành bào tử của một số chủng Volvariella volvacea 47

3.4.1 Trong nuôi cấy thuần khiết 47

3.4.2 Nuôi trồng trên giá thể 53

3.4.3 Nghiên cứu sợi nấm các chủng Volvariella volvacea 55

3.4.4 Nghiên cứu sự hình thành bào tử nấm của các chủng Volvariella volvacea 56

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59

HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

DANH MỤC CÁC HÌNH, ẢNH

Trang

Hình 1.1 Chu kỳ sống của nấm rơm 15

Hình 3.1 Mũ và phiến nấm Pluteus ephebeus 27

Hình 3.2 Mũ và phiến nấm Pluteus plautus 27

Hình 3.3 Mũ và phiến nấm Pluteus leoninus 27

Hình 3.4 Liệt bào Pluteus ephebeus 28

Hình 3.5 Liệt bào Pluteus plautus 28

Hình 3.6 Bào tử đảm Pluteus plautus trên kính hiển vi thường và kính hiển vi điện tử quét 28

Hình 3.7 Bào tử đảm Pluteus ephebeus 28

Hình 3.8 Bào tử đảm Pluteus leoninus 29

Hình 3.9 Mũ và phiến nấm Volvariella volvacea 29

Hình 3.10 Mũ và phiến nấm Volvariella murinella 29

Hình 3.11 Bao gốc ở Volvariella volvacea 30

Hình 3.12 Bao gốc ở Volvariella murinella 30

Hình 3.13 Liệt bào Volvariella murinella 30

Hình 3.14 Liệt bào Volvariella volvacea 30

Hình 3.15 Hậu bào tử Volvariella volvacea 30

Hình 3.16 Bào tử đảm Volvariella volvacea 30

Hình 3.17 Quả thể Volvariella bombycina 32

Hình 3.18 Quả thể Volvariella volvacea 33

Hình 3.19 Quả thể Volvariella murinella 35

Hình 3.20 Quả thể Volvariella subtaylori 37

Hình 3.21 Quả thể và bào tử đảm Pluteus leoninus 38

Hình 3.22 Quả thể Pluteus cervinus 39

Hình 3.23 Quả thể và bào tử đảm Pluteus plautus 40

Hình 3.24 Quả thể Pluteus petasatus 41

Hình 3.25 Quả thể Pluteus longistriatus 42

Hình 3.26 Quả thể Pluteus podospileus 44

Hình 3.27 Quả thể và bào tử đảm Pluteus ephebeus 45

Hình 3.28 Quả thể Pluteus tomentosulus 46

Hình 3.29 Quả thể Pluteus sp 47

Hình 3.30 Hệ sợi các chủng nấm trên môi trường nuôi cấy thuần khiết ở 25o C 47 Hình 3.31 Đồ thị so sánh tốc độ mọc của các chủng nấm ở 25 o C 48

Hình 3.32 Hệ sợi các chủng nấm trên môi trường nuôi cấy thuần khiết ở 30o C 50 Hình 3.33 Đồ thị so sánh tốc độ mọc của các chủng nấm ở 30oC 51 Hình 3.34 Hệ sợi các chủng nấm trên môi trường nuôi cấy thuần khiết ở 35o C 51 Hình 3.35 Đồ thị so sánh tốc độ mọc của các chủng nấm ở 35o C 52 Hình 3.36 Đồ thị so sánh tốc độ mọc của các chủng nấm ở các mức nhiệt độ khác nhau 53

Hình 3.37 Hệ sợi các chủng nấm khi nuôi cấy trên giá thể thóc 54

Hình 3.38 Đồ thị so sánh tốc độ mọc của các chủng nấm trên môi trường agar và trên giá thể thóc ở 35 o C 55

Hình 3.39 Sợi nấm Volvariella volvacea trên kính hiển vi thường 56

Hình 3.40 Bào tử vô tính của Volvariella volvacea dưới kính hiển vi thường 57

Hình 3.41 Bào tử vô tính của Volvariella volvacea dưới kính hiển vi điện tử quét (Độ phóng đại 1000 lần) 57

Hình 3.42 Bào tử đảm và tiểu bính của Volvariella volvacea dưới kính hiển vi thường 58

Hình 3.43 Bào tử hữu tính của Volvariella volvacea dưới kính hiển vi điện tử quét (Độ phóng đại 5000 lần) 58

MỞ ĐẦU

Tính cấp thiết của luận văn

Nấm đã và đang có vai trò quan trọng trong hành tinh chúng ta Chúng làm biến đổi môi trường sống của chúng ta và không thể thiếu được trong nhiều chức năng của hệ sinh thái Nấm hình thành đất, khép kín vòng tuần hoàn vật chất (phân hủy gỗ, thân và là cây, xác côn trùng, …), tăng cường sự mọc cho cây và lựa chọn cây từ môi trường của chúng Chúng gây ngộ độc chúng ta, ký sinh trên cơ thể ta nhưng cũng cung cấp thực phẩm, chữa lành các vết thương và nhiều bệnh hiểm nghèo cho chúng ta Chúng phá hoại mùa màng, nhà cửa, các thiết bị quý và cả sách vở trong thư viện, tranh trong bảo tàng … nhưng cũng sản sinh ra các sản phẩm sinh hóa quý giá như rượu, bia, đồ uống, các chất kháng sinh và các chất có hoạt tính sinh học Chính vì thế, về cả hai phương diện khoa học và thực tiễn, việc đẩy mạnh nghiên cứu nấm đều có ý nghĩa to lớn và ngày càng được đẩy mạnh ở nhiều quốc gia trên thế giới, đặc biệt là ở các nước công nghiệp phát triển

Giới Nấm (Fungi) có số lượng loài lớn, bao gồm 97861 loài, 8283 chi (và gần 5101 synonym), 560 họ, 140 bộ, 36 lớp đã được mô tả [45] và ước tính số lượng loài có thể lên tới 1,5 triệu [37] bên cạnh giới Thực vật (Plantae), Động vật (Animalia), Vi khuẩn (Bacteria) Số lượng loài nấm lớn (Marcrofungi) có quả thể nhìn thấy bằng mắt thường khoảng 14 nghìn loài và có thể lên tới 22 nghìn loài [37]

Trong số các loài nấm lớn, họ nấm tán Pluteaceae được biết đến gồm các loài nấm có kích thước nhỏ đến trung bình, có phiến đính tự do và bào tử màu hồng

Họ Pluteaceae bao gồm 4 chi trong đó 2 chi Volvariella và Pluteus có phân bố rộng rãi, 1 chi hiếm gặp là Chamaeota và chi Volvopluteus mới được mô tả năm

2011 dựa trên các kết quả của các phân tích về sinh học phân tử còn chưa được dẫn ra trong từ điển Nấm của Kirk và các tác giả khác [41] Trong các loài trong

họ này, loài Volvariella volvacea được chú ý hơn cả bởi giá trị dược liệu và giá trị

thực phẩm của nó, loài này có khu phân bố rộng rãi và cho phép nuôi trồng chủ động với số lượng ngày càng lớn nên có ý nghĩa kinh tế cao

Việc nghiên cứu thành phần loài nấm thuộc họ Pluteaceae ở nước ta hầu như mới chỉ ở mức độ nêu lên danh lục một số loài gặp trong tự nhiên [20]; các đặc

điểm sinh học mới chỉ tiến hành chủ yếu ở loài Volvariella volvacea Như vậy, nhìn

chung cho tới nay chưa có chuyên khảo nào nghiên cứu một cách đầy đủ và toàn diện về nhóm nấm này ở Việt Nam

Vì vậy, việc nghiên cứu đầy đủ hơn về các loài nấm này có ý nghĩa khoa học và thực tiễn rõ rệt Nhằm góp phần vào việc giải quyết vấn đề này, chúng tôi tiến hành đề

tài: “Nghiên cứu thành phần loài và đặc điểm sinh học của một số đại diện thuộc

họ Nấm tán Pluteaceae ở một số vùng sinh thái chính của Việt Nam”

Mục đích của luận văn

- Điều tra thành phần loài nấm thuộc họ Pluteaceae ở một số vùng sinh thái của Việt Nam

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số loài quan trọng nhằm bảo tồn nguồn gen quý và ứng dụng trong thực tiễn

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm chung của nấm lớn

Giới nấm gồm những cơ thể dị dưỡng (không quang hợp) có kiểu dinh dưỡng phổ biến là hấp thụ, đôi khi cũng có kiểu dinh dưỡng nuốt thức ăn Cơ thể dinh dưỡng điển hình đơn bào hay đa bào dạng sợi không có hay có vách ngăn; những trường hợp điển hình không có hay có vách ngăn; những trường hợp không điển hình là một amip trần hay là thể nhày giả, thể nhày chính thức Thường là những sinh vật sống bám, sinh trưởng không giới hạn Dạng điển hình không chuyển động, nhưng động bào tử, giao tử cũng như chuyển động bằng giả túc của dạng amip và thể nhày được quan sát thấy Vách tế bào hay vách của bào tử chủ yếu bằng kitin, xenlluloza hay cả hai phần trên Sinh sản vô tính hay hữu tính và phát tán bằng bào

tử có kích thước hiển vi; chỉ có sự phân hóa mô có giới hạn [27]

Giai đoạn nhân: là những cơ thể có nhân chính thức, nhiều nhân; hệ sợi đồng tản hay dị tản; đơn bội, song hạch hay lưỡng bội Bao gồm 97861 loài nấm chính thức, 8283 chi (và gần 5101 synonym), 560 họ, 140 bộ, 36 lớp đã được mô tả Ngoài ra còn 1083 loài nấm nguyên sinh động vật, 103 chi, 26 họ, 9 bộ, 5 lớp; 1033 loài nấm tảo, 124 chi, 29 họ, 16 bộ, 3 lớp [45] Chúng là những cơ thể hoại sinh, cộng sinh hay ký sinh trên các sinh vật khác và ngay cả trên nấm (hyperparasit); phân bố trên toàn thế giới [27]

Nấm lớn (Macro Fungi) bao gồm những nấm có thể sinh bào tử (thường được gọi là quả thể) đạt kích thước lớn hơn 4 mm trở lên, dù chúng thuộc taxon phân loại nào Nấm lớn không phải là những “nấm bậc cao” hay “nấm thượng đẳng” như một

số tác giả quan niệm, vì có nhiều loại nấm ở những bậc taxon thấp lại có quả thể lớn tới vài centimét, và ngược lại rất nhiều loại nấm bậc cao không hình thành quả thể hay có quả thể rất bé Theo quan niệm ấy, nấm lớn bao gồm những nấm nhày có kích thước lớn của Myxomycetes, một số nấm có quả thể phôi thai của họ Endogonaceae trong Zygomycetes, một số đáng kể nấm nang có nang quả dạng

chén, dạng đĩa, dạng củ của Discomycetes cũng như nang quả dạng chai nằm sâu trong mô của Pyrenomycetes và tuyệt đại đa số nấm đảm trừ nấm rỉ, nấm than, nấm chưa hoàn chỉnh Chúng bao gồm những nấm mà ta quen gọi là “nấm” Nấm lớn có

số lượng loài lớn Châu Âu có khoảng 6000 loài đã được mô tả Ở Nhật Bản có khoảng hơn 3000 loài, Trung Quốc có khoảng 8000 loài Trữ lượng của nấm còn chưa có những số liệu đầy đủ Mặc dù vậy, chỉ tính riêng nấm ăn được, sản lượng hàng năm thu được trên toàn thế giới cũng đã lên đến khoảng 7 triệu [27]

(ascogenehyphe) Cuối cùng, đầu tận cùng của sợi sinh nang diễn ra sự hình thành nang bằng cách mọc ra mấu lồi, hai nhân khác tính phân chia có tơ và hình thành vách ngăn tạo ra tế bào mẹ của nang, ở đỉnh có hai nhân, tế bào mấu và tế bào gốc

có một nhân Sau đó tế bào mấu hoà tan màng đổ nội chất vào tế bào gốc, tiếp tục tham gia vào quá trình sinh màng mới, còn hai nhân của tế bào mẹ của nang kết hợp với nhau, tăng kích thước cho một nang thực thụ thường hình chuỳ Nhân 2n vừa kết hợp xong liền phân chia ba lần, trong đó có một lần giảm nhiễm tạo 8 nhân 1n, sau đó được nội chất bao quanh hình thành nên 8 nang bào tử nội sinh Mặt khác, ngay từ khi giao phối cặp cơ quan sinh sản đã được các sợi nấm đơn bội bao quanh Chúng phát triển cao lên cùng với các sợi nang hình thành các sợi ngang (paraphysa) xen giữa các nang trong lớp sinh sản (hymenium), cũng như bện chặt ở phía ngoài tạo nên thể sinh bào tử là nang quả (ascocarpe)

Chu trình sống của nấm đảm (Basidiomycota): đảm bào tử khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ nảy mầm cho ta sợi đơn bội, chúng thường hình thành vách ngăn tạo nên những tế bào một nhân Dạng sợi này tồn tại rất ngắn, rồi mau chóng tiếp xúc với sợi khác tính, giao phối sinh chất và diễn ra quá trình song hạch hóa để tạo nên sợi song hạch Ở phần lớn các loài, tế bào mọc ra một khuỷu – thường gọi là khoá (cầu nối) giữa hai nhân khác tính Sau đó cả hai nhân đều phân chia để cho 4 nhân con, một nhân đi vào nhánh, một nhân ở lại gốc, còn hai nhân khác tính ở phần đầu của sợi Tiếp sau đó khuỷu cong xuống, hoà tan màng, đổ nội chất và nhân vào tế bào gốc, đồng thời xuất hiện vách ngăn với tế bào đỉnh Kết quả là hình thành nên

tế bào song hạch mới, tế bào dưới tế bào đỉnh lại trở nên song hạch và vết tích còn lại như chiếc cầu của ổ khoá nên được gọi là khoá hay cấu nối, móc nối Quá trình song hạch hoá còn diễn ra theo một vài cách khác mà không tạo thành khoá như trên

Sợi song hạch được tạo thành có khả năng sinh trưởng vô hạn và hầu như chiếm toàn bộ đời sống của nấm Trong những điều kiện nhất định, sợi song hạch bện kết lại tạo nên quả thể nấm với hình dạng, kích thước và cấu trúc đa dạng Sau

đó, trên quả thể hình thành nên lớp sinh sản, tạo nên chủ yếu do các tế bào song

hạch hữu thụ là mẹ của đảm và đôi khi có cả các tế bào bất thụ như dạng giá, liệt bào sắp xếp theo dạng bờ rào Tế bào mẹ của đảm tăng kích thước, chứa chất nguyên sinh, thường có dạng chuỳ chuyển thành đảm non và diễn ra sự giao phối hai nhân khác tính Tiếp sau đó diễn ra sự phân chia hai lần, trong đó có một lần giảm nhiễm để cho 4 nhân con Lúc này, ở phần đỉnh của giá mọc ra 4 mấu lồi, nội chất cũng như nhân từng chiếc một đi qua mấu lồi, hình thành nên 4 đảm bào tử ngoại sinh bằng cách nảy chồi phình lên và thắt dần lại Bào tử chín, được phát tán một cách chủ động vào không gian và lặp lại chu trình sống [27]

1.2 Lƣợc sử nghiên cứu Nấm lớn trên thế giới

Nấm được xem là sinh vật có kích thước hệ sợi lớn nhất trên hành tinh chúng

ta (ở Armillaria bulbosa hệ sợi lan rộng tới 15ha, trọng lượng ước tính 10 tấn, thời

gian tới 1.500 tuổi) và có giá trị to lớn trong đời sống con người từ xa xưa [57]

Thế kỷ XVIII - XIX là giai đoạn Nấm học phát triển mạnh mẽ với nhiều công trình nổi tiếng của Patouillard [64,65,66,67,68,69] Vào đầu thế kỷ XX, Nấm học phát triển rực rỡ, trở thành một ngành khoa học thực sự [12] Nhiều công trình nghiên cứu về nấm xuất hiện ở nhiều khu vực khác nhau trên thế giới Trong một thời gian ngắn (30 - 40 năm) nhiều chi nấm mới đã được mô tả dựa vào các đặc điểm hiển vi và nhiều chi nấm cũ được xem xét lại trên cơ sở các tiêu chuẩn phân loại hiện đại Kết quả là đã hình thành được một số hệ thống nấm học khá ổn định ở châu Âu, Bắc Mỹ như hệ thống của Gilbertson and Ryvarden [53] Trong thế kỷ XX nhiều công trình nghiên cứu về nấm học đã được công bố, tiêu biểu như: C Rea với

công trình nghiên cứu “British Basidiomycetes” [52]; Rolf Singer nghiên cứu bộ

Agaricales trên toàn thế giới “The Agaricales in modern taxonomy” [56]; Hanns

Kreisel công bố công trình “Handbuch Fur Pilzfreunde” [70] Pegler D N., Spooner

B nghiên cứu nấm ở Bắc Mỹ và châu Âu trong tác phẩm “The mushroom identifier” đã công bố và mô tả 341 loài [50] ; Ryvarden và Gillbertson trong công trình nghiên cứu nấm lỗ ở châu Âu “European polypores” đã mô tả 322 loài [53] Teng S C nghiên cứu nấm ở Trung Quốc “Fungi of China” đã mô tả 2400 loài với

601 chi [58] Trong những năm cuối thế kỷ XX, đầu thế kỷ XXI các nhà nghiên cứu

đã kết hợp giữa phân loại truyền thống với phân loại dựa trên những tiêu chuẩn hiện đại như: các phản ứng hoá học, sự phân tính, hệ sợi nấm, kiểu gây mục, đặc điểm nuôi cấy, mà đặc biệt là cấu trúc phân tử ADN đã mang lại những kết quả chính xác hơn

Bên cạnh phương pháp phân loại truyền thống dựa vào hình thái (morpho - taxonomy), việc sử dụng các phương pháp phân loại dựa vào hoá học (chemo - taxonomy) và gene (geno - taxonomy) đã loại bỏ được những nhầm lẫn khi phân loại những loài có hình thái tương đồng Một số công trình nghiên cứu dựa vào cấu trúc phân tử ADN như Aime Catherine M et all với công trình “An overview of the higher level classification of Puccinionmycotyna based on combined analyses of nuclear large and small subunit rDNA Sequences” [35]

1.3 Tình hình nghiên cứu Nấm lớn ở Việt Nam

Ở Việt Nam, từ lâu nhân dân đã biết dùng Nấm làm thực phẩm và dược phẩm Nhà bác học Lê Quý Đôn (1726 - 1784) trong tác phẩm “Vân đài loại ngữ ”

và “Kiến văn tiểu lục” đã đánh giá “Linh chi là một sản vật quý hiếm của đất rừng Đại Nam” Ông đã nêu ra những tác dụng lớn của nấm như: kiện não (tráng kiện), bảo can (bảo vệ gan), cường tâm (mạch tim), kiện vị (giúp tiêu hoá ở dạ dày), cường phế (giúp phổi), giải độc, giải cảm và giúp con người sống lâu, tăng tuổi thọ

Trong thời kỳ Pháp thuộc cuối thế kỷ XIX, một số công trình nghiên cứu Nấm ở Việt Nam đã được công bố, trong số đó, phải kể đến những công trình của Patouillard N nghiên cứu khu hệ nấm ở Đông Dương “Contribution à la flore mycologique du Tonkin”; nghiên cứu khu hệ nấm ở Việt Nam và Lào “Nouvelle contribution à la flore mycologique de l’Annam et du Laos”, ông đã công bố 178 loài nấm ở Việt Nam [64,65,66,67,68,69]

Năm 1914, Hariot P & Patouillard N công bố công trình “Champignons recueillies dans l' Annam par M Eberhardt” [62] Ngoài ra còn có một số nhà Nấm học khác cũng nghiên cứu nấm lớn ở Việt Nam như Roger, Petelot, Eberhardt, ; Heim R., Maleneon G đã công bố công trình “Champignons du Tonkin recuellies par M V Demange” [63], Joly P với công trình “Elements de la flore mycologique

du Vietnam” đã định loại 20 loài thuộc chi Xylaria [60]

Ở miền Bắc Việt Nam, việc nghiên cứu nấm được bắt đầu vào năm 1954 tại trường Đại học Tổng hợp Hà Nội lúc bấy giờ với các công trình tiêu biểu của Trịnh Tam Kiệt với đề tài “Sơ bộ điều tra nghiên cứu các loài nấm ăn và nấm độc chính ở một số vùng miền Bắc Việt Nam” [5]; P Joly công bố các yếu tố khu hệ nấm Việt Nam “Elément de la flore mycologique du Vietnam” [60]; Trịnh Tam Kiệt đã công

bố 348 loài thuộc khu hệ nấm lớn vùng Đông Bắc Tam Đảo [6]

Bước sang thập niên 70, việc nghiên cứu nấm lớn đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể, tiêu biểu là các công trình của Trịnh Tam Kiệt: “Đặc điểm khu hệ nấm lớn ở miền Bắc Việt Nam” - “Einige charakteristika der Grosspilzflora Nord - Vietnams” [71]; “Những yếu tố hình thành khu hệ nấm lớn ở miền Bắc Việt Nam

và các nhóm sinh thái của chúng” [7]; cũng trong năm 1977, tác giả công bố tiếp

công trình “Góp phần nghiên cứu hệ nấm Heterobasidiomycetidae ở Việt Nam” [9]

và năm 1978 công trình “Đặc điểm khu hệ nấm phá gỗ, tre ở Việt Nam” [8] trong

đó đã giới thiệu 400 loài nấm sống trên gỗ Từ các kết quả trên, tác giả đã tổng kết

“Đặc điểm khu hệ nấm lớn sống trên gỗ và tre của Việt Nam” [10] Tính đến năm

1978 đã có 618 loài thuộc 150 chi đã được ghi nhận ở miền Bắc Việt Nam Bên cạnh đó còn có các tác giả: Lê Văn Liễu “Một số nấm ăn được và nấm độc ở rừng” với 118 loài [30]; Joly P., Perreau J với công trình “Sur quelques champignons sauvages consomnes au Vietnam Travaux dedies a Georges Viennot-Bourgin” đã giới thiệu một số nấm hoang dại được sử dụng ở Việt Nam [61]; Pfister D H với công trình “Annotated index to fungi described by Patouillard” đã công bố các kết quả nghiên cứu liên quan đến khu hệ nấm Việt Nam [51]

Năm 1978, Trịnh Tam Kiệt công bố “Những dẫn liệu về khu hệ nấm sống trên gỗ vùng Nghệ An” tác giả đã mô tả 90 loài nấm sống trên gỗ [10] Năm 1982, Trịnh Tam Kiệt và Ngô Anh công bố công trình “Góp phần nghiên cứu khu hệ nấm

ở Bình Trị Thiên” đã xác định 111 loài [13] Năm 1984, Trịnh Tam Kiệt và Phan

Huy Dục với công trình “Góp phần nghiên cứu nấm mực Coprinaceae Rose vùng

Hà Nội” đã công bố 29 loài [14] Năm 1993, Ngô Anh công bố công trình “Nghiên

cứu nấm lớn ở Thừa Thiên Huế” với 104 loài và công bố “Dẫn liệu bước đầu về họ

Coriolaceae Sing ở Thừa Thiên Huế” đã nêu danh mục 60 loài [1], Trịnh Tam Kiệt

công bố “Danh lục nấm lớn của Việt Nam” gồm 826 loài [16]

Năm 1998, Ngô Anh báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu cấp cơ sở “Nghiên cứu khu hệ nấm lớn (Macrofungi) ở Thừa Thiên Huế” với 272 loài nấm lớn, trong

đó 46 loài mới ghi nhận cho khu hệ nấm lớn Việt Nam [1]; Trịnh Tam Kiệt công bố danh lục khu hệ nấm lớn Việt Nam “Preliminary checklist of macrofungi of Vietnam” với 837 loài nấm lớn ở Việt Nam đã được công bố [43] và đặc điểm khu

hệ nấm lớn Việt Nam “Charakteristika der Grosspilzflora Vietnam” [72]

Năm 2000, Nguyễn Thị Đức Huệ đã công bố 134 loài nấm lớn ở Tây Ninh, trong đó có 27 loài mới ghi nhận cho khu hệ nấm lớn Việt Nam [4] Cũng năm

2000, tại Hội nghị Sinh học Quốc Gia, những vấn đề cơ bản trong nghiên cứu sinh học, Trịnh Tam Kiệt, Ngô Anh, U Grafe và J Dorfelt đã công bố “Những dẫn liệu

bổ sung về thành phần loài và hoá các hợp chất tự nhiên của khu hệ nấm lớn Việt Nam”, trong đó các tác giả đã công bố 65 loài mới của khu hệ nấm lớn Việt Nam và thông báo về các hợp chất tự nhiên được nghiên cứu ở 25 loài nấm lớn Việt Nam, trong đó hơn 10 cấu trúc mới về các hợp chất tự nhiên ở nấm lớn Việt Nam đã được xác định cho khoa học [17]

Tại hội thảo quốc tế sinh học năm 2001 tại Hà Nội có nhiều báo cáo như:

Phan Huy Dục báo cáo “Nấm lớn (Macromyces) ở vườn Quốc gia Tam Đảo Vĩnh Phúc” công bố 41 loài, 17 họ trong 2 lớp Ascomycetes và Basidiomycetes [3]; Trịnh

Tam Kiệt và Henrich Dorfelt báo cáo “Các taxon mới ghi nhận cho khu hệ nấm Việt Nam và ý nghĩa của hệ thống sinh thái của chúng” công bố 9 loài mới cho lãnh thổ Việt Nam [18] Cùng năm 2001, Trịnh Tam Kiệt công bố “Nghiên cứu chi

Wolfiporia Ryv & Gilbin ở Việt Nam” [19]; Kleinwachter P., Trịnh Tam Kiệt,

Ngô Anh, Schlegel B., Dahse H M, Hartl A và Grafe U đã công bố 7 hoạt chất

mới nhóm Triterpenoid: Colossolactones A - G (1-7) được chiết từ loài Ganoderma

colossum (Fr.) C F Baker được thu thập ở Thừa Thiên Huế [46]

Năm 2003, Ngô Anh với công trình “Nghiên cứu thành phần loài nấm lớn ở

Thừa Thiên Huế” đã xác định được 346 loài thuộc 134 chi nằm trong 3 ngành

Myxomycota, Ascomycota, Basidiomycota [1]

Năm 2004, Trịnh Tam Kiệt, Trịnh Thị Tam Bảo trong một số công trình:

“Nghiên cứu dưới chi Elfvingia và chi Tomophagus ở Việt Nam” đã xác định được

13 loài thuộc dưới chi Elfvigia và 1 loài thuộc chi Tomophagus; “Nghiên cứu chi

Phellinus ở Việt Nam” đã xác định 22 loài thuộc chi Phellinus và 1 loài thuộc chi Phylloporia; “Nghiên cứu thành phần loài nấm đa niên thuộc họ Coriolaceae” đã

công bố 17 loài trong 8 chi [21]

Tiếp đó, đến năm 2008, Trịnh Tam Kiệt với công trình “Poisonous mushrooms of Vietnam” [44]; Trịnh Tam Kiệt và Trịnh Tam Bảo với công bố

“Thành phần loài nấm dược liệu của Việt Nam” [24]; Trịnh Tam Kiệt và Phan Văn Hợp với công bố “Nghiên cứu thành phần loài và đặc điểm sinh học của chi nấm ly của Việt Nam” [25]; Đoàn Văn Vệ, Trịnh Tam Kiệt với công bố “Nghiên cứu thành

phần loài nấm Mộc nhĩ Auricularia của Việt Nam” [31]; Đoàn Văn Vệ, Trịnh Tam Kiệt “Nghiên cứu thành phần loài nấm Ngân nhĩ Tremella của Việt Nam” [32]

Năm 2010, Trịnh Tam Kiệt công bố “Hệ thống của nấm tới các taxon lớn theo quan điểm hiện đại” đã chỉ ra hệ thống của nấm theo nghĩa rộng tới các bậc phân loại lớn bao gồm các giới phụ, ngành, ngành phụ, lớp, lớp phụ, bộ [26] Đến năm

2012 các tác giả đã công bố một số công trình đáng chú ý như công trình của Trịnh Tam Kiệt, Trần Đông Anh, Trịnh Tam Anh “Một số loài nấm tán mới ghi nhận cho khu hệ nấm Việt Nam” đã mô tả 5 loài nấm mới ghi nhận cho khu hệ nấm Việt Nam [29]; công trình của Cổ Đức Trọng, Trịnh Tam Kiệt đã đưa ra 7 loài nấm mới thu thập ở Nam Bộ và Đà Lạt – Lâm Đồng [33] Đặc biệt Trịnh Tam Kiệt đã xuất bản Sách Nấm lớn ở Việt Nam tập I (2011) và Nấm lớn ở Việt Nam tập II (2012) công

bố gần 900 loài nấm lớn của Việt Nam có kèm theo mô tả và tài liệu dẫn cũng như ảnh màu minh họa đã cung cấp những dữ liệu khá chi tiết về các loài nấm đã ghi nhận được [27,28]

1.4 Tình hình nghiên cứu và đặc điểm sinh học họ nấm Pluteaceae

Họ Pluteaeae là một họ nấm có kích thước nhỏ đến trung bình, có phiến đính

tự do và bào tử màu hồng Các loài của họ Pluteaceae có thể bị nhầm với các loài của họ Entolomataceae nhưng có thể được phân biệt bởi các bào tử góc cạnh và các

phiến đính của chúng Có 4 chi trong họ Pluteaceae bao gồm 2 chi Volvariella và

Pluteus có phân bố rộng rãi, chi hiếm gặp là Chamaeota và chi Volvopluteus mới

được mô tả năm 2011 là kết quả của các phân tích về sinh học phân tử Từ điển nấm học 2008 đã chỉ ra có 364 loài trong họ này [74] Trong Danh lục các loài thực vật Việt Nam phần Nấm, Trịnh Tam Kiệt và các tác giả đã đưa ra danh lục họ

Pluteaceae với 15 loài trong đó chi Pluteus có 8 loài bao gồm Pluteus patricius (Schulzer) Boud nay là Pluteus petasatus (Fr.) Gillet, Pluteus cervinus (Schaeff.) P Kumm., Pluteus plautus (Weinm.) Gillet, Pluteus phlebophorus (Ditmar) P Kumm., Pluteus minutus Pat., Pluteus nanus (Pers.) P Kumm., Pluteus rimosus Murrill, Pluteus salicinus (Pers.) P Kumm và chi Volvariella có 7 loài bao gồm

Volvariella bombycina (Pers ex Fr) Sing., Volvariella volvacea (Bull.) Sing., Volvariella diplasia (Berk & Broome) Singer, Volvariella murinella (Quél.) M.M

Moser, Volvariella pseudovolvacea (Berk & Broome) Singer, Volvariella pusilla (Pers.) Singer, Volvariella taylorii (Berk & Broome) Singer [20]

Trong họ Pluteaceae, Pluteus là một chi lớn của nấm với hơn 100 loài Chúng

sống trên gỗ mục hay chủ yếu trên gỗ mục với bụi bào tử màu hồng và các phiến đính tự do; không có bao gốc hay vòng nấm (ngoại trừ loài hiếm gặp ở Bắc Mỹ mới

được phân loại gần đây là Pluteus mammillatus và trước đó là Chamaeota

sphaerospora) Dưới kính hiển vi, có thể quan sát thấy nhiều dạng liệt bào khác

nhau; các bào tử thường có dạng hình trứng, bề mặt nhẵn hay gồ ghề Chi này được

tách biệt với chi Volvariella bởi chúng không có bao gốc và khác với chi Entoloma bởi chúng sống trên gỗ và đặc trưng của bào tử (chi Entoloma có bào tử hình đa

giác) [75]

Volvariella là chi nấm với phiến và bụi bào tử màu hồng Chúng không có

vòng và có bao gốc ở cuống giống như chi Amanita Một vài loài của chi Amanita nhìn rất giống Volvariella nhưng khác biệt ở chỗ Amanita có bào tử màu trắng và

thường có vòng Khi còn non các phiến của Volvariella cũng màu trắng do đó chúng rất dễ bị nhầm với Amanita Chi này ước tính có khoảng 50 loài Nhiều nghiên cứu trước đây đều chỉ ra Volvariella là một chi thuộc họ Pluteaceae, nhưng những nghiên cứu về ADN gần đây đã tiết lộ ra rằng Pluteus và Volvariella tách

biệt nhau về mặt tiến hóa và có sự khác biệt rất lớn về AND Những nghiên cứu này

đã chỉ ra rằng Volvariella có quan hệ rất gần với các loài nấm "schizophylloid" như

Schizophyllum commune Một số loài Volvariella là những loài nấm ăn phổ biến ở

Châu Âu, chiếm 16% tổng sản lượng nấm nuôi trồng trên thế giới [76]

Chamaeota là một chi thuộc họ Pluteaceae với kích thước nhỏ đến trung bình

Chúng có cuống đính giữa; phiến tự do; bào tử nhẵn, màu hồng và có một lớp màng

hình thành nên vòng trên cuống Chamaeota có thể phân biệt được với Volvariella ở chỗ chúng không có bao gốc và khác với Entoloma ở phiến tự do và bào tử nhẵn Các loài của chi Chamaeota rất hiếm gặp, hầu hết đều là loài nhiệt đới nhưng có ít

nhất hai loài được phát hiện ở Hoa Kỳ [77]

Volvopluteus là chi mới được định nghĩa năm 2011 từ những kết quả phân tích

về phân tử [78]

Bên cạnh những nghiên cứu về nấm nói chung, những nghiên cứu về họ Pluteaceae cũng được nhiều tác giả chú ý đến Năm 1918, C H Kauffman trong công trình “The Agaricaceae of Michigan” đã đưa ra khóa định loại và mô tả các loài thuộc Rhodosporeae ở Michigan trong đó có 3 chi với 21 loài hiện nay được

xếp vào họ Pluteaceae, bao gồm chi Volvaria có 7 loài, chi Chamaeota với 2 loài và chi Pluteus với 12 loài [42] Năm 1958, Singer R trong “Contribution toward a monograph of the genus Pluteus, especially those of the east slope of the Andes and Brazil” đã đưa ra khóa định loại và mô tả 17 loài thuộc chi Pluteus ở Nam Mỹ [55] Năm 2002, T Kobayashi đã nghiên cứu đặc điểm phân loại chi Volvariella ở Hàn

Quốc trong đó tác giả đã xây dựng khóa phân loại và mô tả 10 loài nấm thuộc chi

Volvariella [47] Tiếp đến năm 2006, Minnis A M và cộng sự đã công bố công

trình nghiên cứu về chi Chamaeota ở Hoa Kỳ trong đó đã xác định 2 loài thuộc chi

Chamaeota (Chamaeota sphaerospora và C mammillata) là synonym của nhau và

gộp lại thành 1 loài chung là Pluteus mammillatus [48] Năm 2007 cũng có một số công trình được công bố như “An annotated checklist of Pluteus in the Iberian

Peninsula and Balearic Islands” của Justo A và cộng sự đã chỉ ra danh lục 33 taxa

thuộc chi Pluteus ở Iberian Peninsula và các đảo Balearic [38]; Yang Z L đã công

bố công trình nghiên cứu về các loài thuộc chi Chamaeota ở Trung Quốc trong đó tác giả đã chuyển 2 loài Chamaeota dextrinoidespora và Chamaeota sinica sang chi

Leucoagaricus, cả 2 loài này đều được mô tả lại [59]

Năm 2010 cũng xuất hiện một số công trình nghiên cứu về các loài thuộc họ Pluteaceae như công trình của Ahlawat O P và cộng sự nghiên cứu về đa dạng di

truyền của 2 loài bố mẹ và 15 dòng đơn bào tử của loài Volvariella volvacea dựa

trên hoạt tính enzym, ITS và RAPD [34]; Justo A và cộng sự đã công bố công trình nghiên cứu hệ thống phân loại và đặc trưng tiến hóa của họ Pluteaceae dựa trên các

dữ liệu sinh học phân tử của các gen ribosome nhân, trong đó các tác giả đã công bố

1 chi mới thuộc họ này là Volvopluteus nâng tổng số chi của họ này lên thành 4 chi [40]; Minnis A M và cộng sự với công trình “Pluteus section Celluloderma in the U.S.A.” đã xây dựng khóa phân loại và mô tả chi tiết 19 loài thuộc chi Pluteus ở

Hoa Kỳ [49]; cùng năm này Justo A và cộng sự cũng đã đưa ra danh lục 12 taxa

thuộc chi Volvariella ở Iberian Peninsula và các đảo Balearic [39]

Năm 2011 có một số công trình tiêu biểu như “Species recognition in Pluteus and Volvopluteus (Pluteaceae, Agaricales): morphology, geography and phylogeny”

của Justo A và cộng sự đã nghiên cứu cây phát sinh chủng loại của 185 loài thuộc

chi Pluteus và Volvopluteus ở Châu Phi, Châu Á, Châu Âu, Bắc và Nam Mỹ [Justo

A (2011)]; Dutta A K và cộng sự với công trình “Volvariella of West Bengal, India I.” đã đưa ra khóa phân loại và mô tả 3 loài thuộc chi Volvariella ở phía Tây

của vịnh Bengal [36] Năm 2012, Trần Đông Anh, Trịnh Tam Kiệt công bố công trình “Nghiên cứu thành phần loài và đặc điểm sinh học của một số đại diện thuộc

họ nấm tán Pluteaceae” đã chỉ ra 24 loài nấm thuộc họ nấm Pluteaceae ở Việt Nam

trong đó có 16 loài thuộc chi Pluteus và 8 loài thuộc chi Volvariella đồng thời cũng

chỉ ra 8 loài nấm thuộc họ này là mới ghi nhận cho khu hệ nấm Việt Nam [2]

* Đặc tính sinh học của Nấm rơm Volvariella volvacea

Trong các loài thuộc họ Pluteaceae, loài nấm rơm Volvariella volvacea được

xem là loài có ý nghĩa kinh tế và ứng dụng trong thực tiễn hơn cả Nấm rơm là loài đồng tản sơ cấp, chu kỳ sống được bắt đầu từ khi quả thể trưởng thành, phóng thích bào tử đảm vào không khí và được phát tán nhờ các yếu tố khác nhau của môi trường (hình 1.1) Gặp điều kiện thuận lợi (nhiệt độ, độ ẩm), bào tử đảm nảy mầm, cho ống mầm đạt chiều dài nhất định thì phân nhánh tạo thành hệ sợi đơn bội (haploid) Các sợi đơn bội này có thể kết hợp với nhau để tạo nên sợi song hạch tuy không có khoá (móc nối) được hình thành Cả hai loại sợi đơn bội và song hạch đều

có khả năng hình thành bào tử màng dày nhiều nhân màu nâu hồng (hậu bào tử), hậu bào tử gặp điều kiện thuận lợi lại nảy mầm cho ra hệ sợi đơn bội hay hệ sợi song hạch Theo tác giả Trịnh Tam Kiệt phần lớn các bào tử đảm của nấm rơm là các bào tử hữu thụ (75%), tức là từ một đơn bào tử nảy mầm cho ra ống mầm, rồi tự diễn ra quá trình song hạch hoá để hoàn thành vòng đời mà không cần có sự kết hợp

hệ sợi đơn bội của hai bào tử khác tính, nghĩa là hai tế bào khác tính trên cùng một sợi nấm giao phối nhau; số còn lại (khoảng 25%) là các bào tử bất thụ, không có khả năng tự hoàn thành vòng đời mà cần phải có sự kết hợp của hai đơn bào tử khác tính, đây là các bào tử có ý nghĩa trong chọn tạo giống [15]

Hình 1.1 Chu kỳ sống của nấm rơm

Sau khi được hình thành, sợi song hạch có khả năng sinh trưởng vô hạn và hầu như chiếm toàn bộ đời sống của nấm Trong những điều kiện xác định, sợi song hạch bện kết lại tạo nên các giai đoạn khác nhau của quả thể nấm, sau đó, trên quả thể nấm hình thành nên lớp sinh sản, tạo nên chủ yếu do các tế bào song hạch là mẹ của giá (đảm) sắp xếp theo dạng bờ rào [27]

Trên lớp sinh sản, tế bào mẹ của đảm tăng kích thước chứa đầy chất nguyên sinh thường có dạng hình chuỳ chuyển thành giá non và diễn ra sự giao phối hai nhân khác tính Tiếp theo đó có sự phân chia hai lần, trong đó có một lần giảm nhiễm để cho 4 nhân con Lúc này, ở phần đỉnh của giá mọc ra 4 mấu lồi, nội chất cũng như nhân từng chiếc một đi qua mấu lồi, hình thành nên 4 giá bào tử ngoại sinh bằng cách nảy chồi phình lên và thắt dần lại Bào tử chín, được phát tán một cách chủ động vào không khí và lặp lại chu kỳ sống [27]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, địa điểm và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là các loài nấm thuộc họ Pluteaceae thu thập ở một số vùng sinh thái của Việt Nam

Để có nguyên liệu nuôi cấy tốt chúng tôi đã chọn những ống giống có cùng ngày tuổi, cắt lấy hệ sợi ở mép colonie và nuôi cấy trên môi trường nghiên cứu Các chủng giống gốc hiện được lưu trữ tại Bộ mẫu Giống gốc Nấm của Phòng Công nghệ Giống gốc Nấm - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - ĐHQGHN

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Việc thu thập mẫu được tiến hành chủ yếu tại Hà Nội và các tỉnh kế cận trong

đó bao gồm các vườn Quốc gia Ba Vì, Tam Đảo, Cúc Phương; vùng đồi bán sơn địa

và vùng đồng bằng

Mẫu được xử lý, nghiên cứu đặc điểm sinh học, bảo quản và lưu trữ tại Phòng Công nghệ giống gốc nấm - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc Gia Hà Nội

2.1.3 Nội dung nghiên cứu

- Thu thập mẫu ngoài thiên nhiên, xử lý các mẫu thu được, xây dựng bách thảo, phân lập thuần khiết một số chủng có khả năng ứng dụng

- Phân tích đặc điểm hình thái và hiển vi nhằm xác định thành phần loài nấm

đã thu thập được

- Nghiên cứu sự mọc của sợi và sự hình thành bào tử của một số loài quan trọng trên môi trường nuôi cấy thuần khiết và trên giá thể

2.1.4 Thiết bị nghiên cứu

- Dụng cụ để thu mẫu ngoài thực địa: túi thu mẫu, nhãn, rìu nhỏ cầm tay, bút chì, sổ ghi chép, dao nhọn cứng, túi giấy, kính lúp cầm tay, giấy báo và máy ảnh

- Dụng cụ để nghiên cứu trong phòng thí nghiệm: Kính hiển vi Graf – Apsco,

kính hiển vi Olympus CH - 40, Kính hiển vi chụp ảnh Olympus Model CHT, kính lúp cầm tay, kính lúp 2 mắt Bauch Lomb, kính hiển vi điện tử với độ phóng đại

1000 cho đến 160000, máy ảnh điện tử, máy ảnh Pentax

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp thu thập, xử lý, phân tích và định loại theo phương pháp của Trịnh Tam Kiệt [27,28], Rolf Singer [56]

Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học: sử dụng các phương pháp nấm học trong nghiên cứu hình thái quả thể, bào tử và nghiên cứu tốc độ mọc của hệ sợi nấm theo Trịnh Tam Kiệt [15,27], Schwantes [73]

2.2.1 Phương pháp thu mẫu

Để thu mẫu những nấm sống trên gỗ, trên cây chúng tôi dùng dao nhọn đục, hoặc dùng rìu nạy, tách hay bổ chúng ra khỏi giá thể Khi tách cần lấy cả một phần nhỏ mẫu gỗ mà trên đó nấm sống

Ghi chép các kiểu gây mục của nấm (trắng, nâu, hỗn hợp, mục vết thương, mục rễ, mục màng, mục thối, mục tạo nên những khoang trống nhỏ, xốp ), ở phần nào của cây (cưa ngang để quan sát, ghi chép), tên địa phương và tên khoa học cây

mà trên đó nấm mọc Gặp nhiều mẫu nấm cần thu thập ở các giai đoạn phát triển khác nhau thì quan sát và ghi chép sự hình thành quả thể của chúng, kể cả những dạng không điển hình về màu sắc, hình dạng Những mẫu đã quá già hoặc bị côn trùng phá hoại, bị giòi đục không được thu thập lẫn vào để tránh lây lan, phá hỏng các mẫu nấm khác Trường hợp mẫu là loại hiếm, không còn mẫu nào khác, có thể thu để riêng và xử lý đặc biệt trong phòng thí nghiệm

Mẫu ngay sau khi vừa thu phải ghi ký hiệu và nhãn hiệu

Ghi bằng bút chì hay bút mực không bị nhoè trong nước Sau đó phải chú ý quan sát và ghi chép những đặc điểm dễ biến mất của nấm vào phiếu điều tra đã in sẵn như: màu sắc, mặt mũ nấm và các phần phụ (khô, nhầy dính, có vảy, lông, mụn, ), chụp ảnh nấm

Sau đó gói nấm lại Dùng giấy báo gói lại thành dạng phễu, đặt phần cuống nấm xuống đáy phễu còn mũ nấm ở phía trên Mỗi mẫu nấm được gói riêng, không

để lẫn hay gói lẫn những mẫu nấm, nhất là những loài khác nhau, tránh bào tử nấm

sẽ lẫn lộn nhau Những nấm có kích thước nhỏ, dễ gãy vỡ được đựng riêng trong các lọ nhỏ, hộp nhựa, hộp đựng phim Không dùng túi ni lông để đựng mẫu vì nó không thoát khí và hơi nước, tạo điều kiện thuận lợi cho mốc và vi khuẩn phát triển Điều tra trong nhân dân để biết thêm giá trị sử dụng, cũng như tác hại của một số loài nấm

2.2.2 Phương pháp xử lý và bảo quản mẫu vật

Mẫu lấy được bảo quản nơi thoáng mát Nếu giấy bọc bị bẩn hay ướt thì được thay thế, mô tả, ghi chép tiếp những đặc điểm của nấm vào phiếu điều tra: kích thước, hình dạng, màu sắc, các đặc điểm của mặt mũ, mép mũ, bào thể, bụi bào tử, cuống nấm, thịt nấm Những mẫu chưa phân tích được và đủ tiêu chuẩn thì cần tiến hành làm bách thảo nấm (bách thảo khô, bách thảo ngâm, bách thảo nuôi trồng)

Bách thảo khô: nấm được phơi khô tự nhiên dưới ánh nắng mặt trời hoặc sấy

biến dạng và thay đổi màu sắc nhiều Phòng thí nghiệm có phương tiện hiện đại, mẫu có thể được làm khô theo phương pháp khô lạnh ở nhiệt độ và áp suất thấp trong tủ lạnh, phòng có nhiệt độ thấp, có bơm hút không khí ẩm nên rất ít biến dạng

và giữ nguyên màu sắc

Nấm được xếp lên phên đan hay lưới thép mắt cáo có gờ xung quanh treo lên trên nguồn nhiệt Đối với những nấm nạc có kích thước lớn có thể chẻ đôi hoặc bổ

ra làm nhiều lát mỏng hơn để sấy cho chóng khô Nấm có thể xếp giữa các lớp giấy bản, giấy báo, lót và phủ vải mịn rồi ép và sấy khô từ từ và thay giấy để hút bớt độ

ẩm như ở thực vật bậc cao Ngoài ra có thể xử lý mẫu như sau: dùng dao sắc bổ qua quả thể ở chính giữa nấm thành 3–4 phiến, mỗi phiến dày 1,5 – 2 mm Những lát cắt ở giữa được giữ nguyên để quan sát thịt của mũ, phiến, quan hệ giữa phiến và cuống cũng như cuống nấm Lát phía ngoài gồm non nửa mũ và cuống, dùng dao hay thìa nhỏ nạo hết thịt nấm, phiến nấm và chỉ giữ lại biểu bì của mũ và cuống Đặt các lát cắt ngang, cuống và mũ nấm đã nạo thịt và sửa lại cho có dạng giống với

mũ nấm lên giấy tráng gelatin rồi phủ giấy bản và sấy khô Mẫu nấm sẽ dính vào giấy tráng gelatin Cũng có thể trải các mẫu nấm để nguyên hay vừa bổ mỏng hoặc mới nạo lên phiến xelophan, phủ vải mịn rồi xếp giấy bản, ép và sấy khô Sau đó nhấc mẫu ra và dán lên giấy croki bằng dung dịch xeluloit trong axeton đặc như mật ong hoặc dùng chỉ khâu như ở thực vật bậc cao

Những mẫu nấm sau khi đã được làm khô như trên vẫn rất dễ bị ẩm trở lại, dễ

bị các vi khuẩn, nấm mốc, cũng như côn trùng phá hoại, nhất là trong điều kiện nhiệt đới Cho nên các mẫu nấm sau khi đã sấy khô, cần được bọc trong giấy bóng

mờ hay để trong túi polyetylen có băng phiến hay xông hơi formalin, ete Nhưng tốt nhất là tẩm trong dung dịch HgCl2, trong cồn như ở thực vật bậc cao Những mẫu trên được xếp vào hộp carton, hộp gỗ hay thùng kẽm đựng mẫu, đậy kín và sắp xếp theo thứ tự quy định cho tập bách thảo khô

Bách thảo ngâm: nấm được ngâm trong dung dịch formalin 4% hay cồn pha

loãng 30 – 50%, cũng có thể dùng dung dịch hỗn hợp (1/3 cồn, 1/3 formalin và 1/3 glyxerin) để ngâm mẫu Các dung dịch trên vẫn còn làm nấm cong queo, biến dạng

và thay đổi màu sắc nên gần đây người ta đã ứng dụng phương pháp của Latz để chống lại hai hiện tượng trên, đó là trộn lẫn 25g sunfat kẽm, 10ml formalin trong 1lít nước cất rồi ngâm nấm vào Thông thường sau khi ngâm, dung dịch trở nên vẫn đục, tuy nhiên sau 24 giờ quá trình này sẽ ngừng lại Lúc đó có thể gặn lọc dung dịch hay thay thế để có dung dịch trong suốt

Để có những mẫu đẹp ở vị trí như ý muốn, dùng các miếng kính cắt vừa bình thuỷ tinh, buộc toàn bộ hay từng nửa nấm bổ đôi, ngâm trong dung dịch có nồng độ thích hợp, đậy kín nắp, gắn bằng parafin nung chảy Phương pháp bách thảo ngâm

thường được ứng dụng với nấm quả thể chất thịt

Bách thảo nuôi trồng (herbar cultur): Cần phân lập thuần khiết nấm Nấm có

thể được phân lập thuần khiết từ quả thể, hạch nấm, mô đệm, thể hình rễ và ngay cả sợi nấm nằm trong giá thể hay rễ nấm của thực vật bậc cao Khi phân lập nấm từ quả thể nên chọn các quả thể non hay quả thể sắp sửa hình thành bào tử thành thục Khi phân lập phải tiến hành trong điều kiện vô trùng Dùng tay bẻ đôi quả hay một phần của quả thể rồi dùng dao cấy hay que cấy cứng chuyên dùng cho nấm đã vô trùng cắt từng miếng mô có kích thước 2 x 2 x 2 mm hay tách từng miếng nhỏ, dài chuyển vào môi trường thích hợp trong ống thạch nghiêng hay trong đĩa petri Khoảng 2 – 3 ngày sau nấm đã mọc sợi từ miếng mô cấy ra Nếu bị nhiễm, cần cấy truyền để có giống thuần khiết Không dùng cồn lau trên quả thể hay nhúng cả mẫu cấy vào dung dịch sát trùng vì sẽ ảnh hưởng tới sự mọc bình thường của sợi, trừ những trường hợp mẫu đã bị bẩn, già

Mô nấm sau khi đã phân lập trong thạch nghiêng hay đĩa petri cần chuyển sang để ở nhiệt độ thích hợp để nấm phát triển (250

C - 300C)

Sau khi cấy truyền, nếu nấm đã thuần khiết thì kiểm tra lại dưới kính hiển vi những đặc điểm của sợi (có thể so sánh với sợi của mô nấm) rồi đánh số hiệu và chuyển vào tập bách thảo nuôi trồng

Mẫu nấm của bách thảo nuôi trồng nếu có người chăm sóc thì 4 tuần cấy truyền một lần Nếu thiếu người chăm sóc, có thể tráng parafin và để ở nhiệt độ thấp

40C, 3-6 tháng lại cấy truyền lại Khi để ở nhiệt độ thấp, một số loài nấm có nhiệt độ tối thích cao có thể bị ảnh hưởng phần nào tới sinh trưởng và phát triển bình thường Mỗi mẫu để trong bách thảo nuôi trồng cần ít nhất là 4 ống giống của các giai đoạn tuổi khác nhau: 2 ống mọc tốt của lần cấy thứ nhất, 1 ống của lần trước và

1 ống cấy lần trước nữa

2.2.3 Phương pháp phân tích mẫu vật

Mẫu vật phân tích tốt nhất là các mẫu tươi vừa thành thục mới thu hái Phân tích tất cả các đặc điểm hình thái và các cấu trúc hiển vi Trước hết, cắt một phần quả thể nấm gồm một phần mô mũ và thể sinh sản (phiến nấm) Tách khoảng 2 – 3

phiến với cả phần mô mũ rồi dùng dao cắt vuông góc với phiến Các lát cắt như vậy cho phép quan sát được nhiều yếu tố như quan hệ giữa thể sinh sản và mô mũ, cấu trúc mô bất thụ (trama) của thể sinh sản, lớp sinh sản và các thành phần của nó như sợi nấm, đảm, liệt bào và đảm bào tử Ngoài ra, để quan sát rõ hơn hệ thống sợi nấm

ta dùng kim nhọn tách mô của mũ hay cuống nấm rồi để trên lam, dùng hai kim nhọn tách nhỏ sợi nấm ra mà quan sát theo chiều dài của sợi Để tìm đầy đủ các loại sợi nên lấy sợi từ các phần khác nhau cũng như các giai đoạn phát triển khác nhau của nấm

Những lát cắt mẫu tươi thường được quan sát trong nước cất, còn những lát cắt mẫu khô phải tiến hành quan sát trong những dung dịch đặc biệt như dung dịch KOH 3 - 5% hay dung dịch amoniac 10% có tác dụng làm cho mô phồng lên trở lại trạng thái ban đầu

Khi phân tích mẫu vật phải chụp ảnh, vẽ lại và đo kích thước chính xác các cấu trúc hiển vi quan sát được, các cấu trúc cần nghiên cứu sâu được đo kích thước

và chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử, các đặc điểm được ghi chép thêm vào phiếu điều tra cùng với những đặc điểm đã ghi ngoài thiên nhiên và đặc điểm bên ngoài của nấm

2.2.4 Phương pháp định loại nấm lớn

Quá trình định loại được tiến hành qua các bước:

- Các mẫu sau khi được xử lý thì sắp xếp theo họ và chi

- Định tên khoa học theo từng chi

Dùng các khoá lưỡng phân và các bản mô tả loài của các tác giả trước để định loại Khi định loại phải khách quan, coi trọng những đặc điểm vốn có của loài đã nghiên cứu, tránh chủ quan có ý định từ trước

2.2.5 Nghiên cứu sự mọc của nấm trên môi trường thạch và giá thể

2.2.5.1 Tốc độ mọc của sợi nấm

* Trên môi trường thạch

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu tốc độ mọc trên môi trường thạch khoai tây ở

3 mức nhiệt độ 25o

C, 30oC và 35oC Phương pháp tiến hành như sau:

Giống gốc thuần khiết của các chủng được phân lập từ giá thể có sợi nấm trên môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) trong buồng cấy vô trùng Thành phần môi trường PDA (cho 1 lít) bao gồm: khoai tây (đã gọt vỏ, cắt nhỏ): 200g, glucose : 20g, agar : 20g, nước cất vừa đủ 1 lít

Sau đó, giống gốc nấm trên môi trường thạch nghiêng được cắt thành từng miếng kích thước 0,5 cm rồi cấy truyền sang môi trường thạch trong bình tam giác

ở trung tâm bình để nghiên cứu tốc độ sinh trưởng của hệ sợi Mỗi ngày theo dõi 2 lần, mỗi lần cách nhau 6 giờ

Tốc độ mọc hệ sợi nấm được tính theo Schwantes (1971) [73]: V = X/T

Trong đó:

- V: tốc độ mọc của hệ sợi (m/h)

- X: bán kính của bề mặt thạch (m)

- T: thời gian sợi nấm mọc kín bề mặt thạch (h)

* Trên môi trường nhân giống cấp II

Tốc độ mọc của hệ sợi được theo dõi tại nhiệt độ mà trên môi trường nuôi cấy thuần khiết khả năng phát triển của hệ sợi là tốt nhất Giá thể được dùng làm môi trường cấp II là thóc luộc Phương pháp luộc thóc như sau: thóc Q5 trước khi luộc được đãi sạch trấu và tạp chất, sau đó tiến hành luộc thóc, khi thấy sôi lăn tăn và đều khắp nồi thì tiến hành rút bớt lửa, khi thấy hạt thóc nứt được 1/2 hạt thì cho nồi

ra khỏi bếp hoặc tắt lửa, ủ khoảng 20 phút đến khi hạt thóc nứt được 2/3 hạt thì tiến hành đổ thóc ra và dùng quạt thổi thật mạnh sao cho thóc ráo nước và nguội thật nhanh Thóc sau đó được đưa vào bình tam giác, đậy nút bông và khử trùng ở 1 atm trong 1,5 giờ

2.5.5.2 Độ dày sợi nấm

Độ dày của hệ sợi nấm được đánh giá trên môi trường thạch trong bình tam giác theo thang điểm từ 3 - 1 Chủng có độ dày lớn nhất được cho điểm 3, các chủng còn lại tuỳ theo độ dày mà được cho điểm từ 2,5 - 1, mỗi điểm cách nhau 0,5 đơn vị

2.5.5.3 Sự hình thành hậu bào tử

Nghiên cứu các giai đoạn hình thành hậu bào tử trên kính hiển vi quang học Các chỉ tiêu theo dõi gồm: Lượng hậu bào tử xuất hiện (được đánh giá theo thang điểm giống với phương pháp đánh giá độ dày sợi), màu sắc hậu bào tử

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Thu thập mẫu nấm thuộc họ Nấm tán Pluteaceae ở một số vùng sinh thái của Việt Nam

Việc thu thập mẫu được tiến hành chủ yếu tại Hà Nội và các tỉnh kế cận trong

đó bao gồm các vườn Quốc gia Ba Vì, Tam Đảo, Cúc Phương; vùng đồi bán sơn địa

Tổng số mẫu nấm thu được khoảng 30 mẫu, chủ yếu ở dạng sấy khô và một số được ngâm trong dung dịch bảo quản

3.2 Thành phần loài nấm thuộc họ Nấm tán Pluteaceae của Việt Nam và một

số đặc điểm sinh học của chúng

3.2.1 Danh lục các loài nấm đã ghi nhận

Chi Volvariella Speg., 1899

1 Volvariella bombycina (Pers ex Fr) Sing

Mọc trên gỗ cây lá rộng Ăn được

2 Volvariella volvacea (Bull.) Sing

Mọc trên rơm rạ mục Ăn được

3 Volvariella diplasia (Berk & Broome) Singer

Mọc trên đất Ăn được

4 Volvariella murinella (Quél.) M.M Moser

Mọc trên đất Ăn được

5 Volvariella pseudovolvacea (Berk & Broome) Singer

Mọc trên đất mùn Ăn được

6 Volvariella pusilla (Pers.) Singer

Mọc trên đất mùn Ăn được

7 Volvariella taylorii (Berk & Broome) Singer

Mọc trên đất Ăn được

8 Volvariella subtaylori Hongo

Mọc trên đất rừng cạnh nơi có thảm mục Ăn được

Chi Pluteus Fr., 1836

1 Pluteus petasatus (Fr.) Gillet

Mọc trên cây chết đang trong thời kỳ phân hủy mạnh, hoặc trên các đống mùn bã thực vật đang phân hủy Ăn được

2 Pluteus leoninus (Schaeff.) P Kumm

Mọc trên gỗ mục Chưa rõ tác dụng

3 Pluteus cervinus (Schaeff.) P Kumm

Mọc trên gỗ mục Ăn được

4 Pluteus semibulbosus (Lasch) Quél

Mọc trên gỗ mục Chưa rõ tác dụng

5 Pluteus plautus (Weinm.) Gillet

Mọc trên gỗ mục Chưa rõ tác dụng

6 Pluteus longistriatus (Peck) Peck

Mọc trên gỗ hay thảm mục Chưa rõ tác dụng

7 Pluteus phlebophorus (Ditmar) P Kumm

Nấm hoại sinh trên gỗ mục Chưa rõ tác dụng

8 Pluteus podospileus Sacc & Cub

Mọc trên đất mùn Chưa rõ tác dụng

9 Pluteus minutus Pat

Mọc trên vỏ cây Chưa rõ tác dụng

10 Pluteus ephebeus (Fr.) Gillet

Mọc trên gỗ mục và trên đất Chưa rõ tác dụng

11 Pluteus nanus (Pers.) P Kumm

Mọc trên gỗ mục Chưa rõ tác dụng

12 Pluteus rimosus Murrill

Mọc trên gỗ Chưa rõ tác dụng

13 Pluteus salicinus (Pers.) P Kumm

Mọc trên gỗ mục Ăn được nhưng gây ảo giác

14 Pluteus tomentosulus Peck

Mọc trên đất có tàn tích thực vật Chưa rõ tác dụng

15 Pluteus sp

Mọc trên gỗ mục Chưa rõ tác dụng

Như vậy, có 23 loài nấm thuộc họ Pluteaceae đã được ghi nhận ở Việt Nam,

trong đó ưu thế thuộc về chi Pluteus với 15 loài, có 8 loài thuộc chi Volvariella

Trong số 23 loài, có 1 loài thuộc chi Volvariella là Volvariella subtaylori Hongo và

6 loài thuộc chi Pluteus là Pluteus leoninus (Schaeff.) P Kumm, Pluteus

semibulbosus (Lasch) Quél., Pluteus longistriatus (Peck) Peck, Pluteus podospileus Sacc & Cub., Pluteus ephebeus (Fr.) Gillet và Pluteus tomentosulus

Peck là mới được ghi nhận cho khu hệ nấm lớn Việt Nam so với Danh lục Nấm

Việt Nam được công bố năm 2001 (Trịnh Tam Kiệt và các tác giả khác); 1 loài

Pluteus sp chưa xác định được tên khoa học

3.2.2 Một số đặc điểm hình thái và hiển vi của các loài nấm đã ghi nhận

Họ Pluteaeae là một họ nấm có kích thước nhỏ đến trung bình, có phiến đính

tự do và bào tử màu hồng, quả thể của các đại diện thuộc chi Pluteus và Volvariella

đều có dạng nón, dạng ô điển hình, nhẵn và có phủ lông mịn (Hình 3.1, 3.2, 3.3, 3.9, 3.10)

Ở chi Pluteus dưới kính hiển vi, có thể quan sát thấy nhiều dạng liệt bào khác

nhau; các bào tử thường có dạng hình trứng, bề mặt nhẵn hay gồ ghề (hình 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8)

Hình 3.7 Bào tử đảm Pluteus ephebeus

Hình 3.4 Liệt bào Pluteus ephebeus

Hình 3.6 Bào tử đảm Pluteus plautus trên kính hiển vi thường và kính hiển vi

điện tử quét

Hình 3.5 Liệt bào Pluteus plautus

Chi Volvariella có phiến và bụi bào tử màu hồng, có bao gốc ở cuống giống như chi Amanita (hình 3.11, 3.12) Một vài loài của chi Amanita nhìn rất giống

Volvariella nhưng khác biệt ở chỗ Amanita có bào tử màu trắng và thường có vòng

Khi còn non các phiến của Volvariella cũng màu trắng do đó chúng rất dễ bị nhầm với Amanita Dưới kính hiển vi chúng ta cũng có thể quan sát thấy các dạng liệt bào