Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã cho thụ thể neurokinin-1 ở người Việt Nam

Trên cơ sở những nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của thụ thể neurokinin-1, các hãng dược phẩm đã cố gắng tìm ra các chất đối vận với thụ thể neurokinin-1 nhằm sản xuất thuốc giảm đau

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11

1.1 THỤ THỂ LIấN KẾT VỚI G PROTEIN 11

1.1.1 G protein 11

1.1.2 Thụ thể liờn kết với G protein 11

1.2 HỌ TACHYKININ Ở ĐỘNG VẬT Cể VÚ 14

1.3 THỤ THỂ HỌ TACHYKININ VÀ THỤ THỂ NEUROKININ-1 18

1.3.1 Giới thiệu chung về thụ thể họ tachykinin 18

1.3.2 Thụ thể neurokinin – 1 20

1.4 ỨNG DỤNG CỦA THỤ THỂ NEUROKININ-1 TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH 23

1.5 VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HểA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 26

Chương 2: NGUYấN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 28

2.1 NGUYấN LIỆU 28

2.1.1 Mẫu vật 28

2.1.2 Cỏc cặp mồi sử dụng 28

2.1.3 Cỏc hệ thống vector 29

2.1.4 Chủng vi khuẩn 29

2.1.5 Húa chất và thiết bị 29

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 30

2.2.1 Sơ đồ nghiờn cứu 30

2.2.2 Cỏc kỹ thuật dựng trong nghiờn cứu 31

2.2.2.1 Tỏch RNA tổng số 31

2.2.2.2 Phản ứng phiờn mó ngược 32

2.2.2.3 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) 32

2.2.2.4 Tinh sạch DNA bằng phương pháp thôi gel 33

2.2.2.5 Nối ghép các đoạn DNA vào vector 33

2.2.2.6 Kỹ thuật biến nạp 33

2.2.2.7 Sàng lọc khuẩn lạc 34

2.2.2.8 Tách plasmid 34

2.2.2.9 Kĩ thuật cắt sử dụng enzyme giới hạn 35

2.2.2.10 Kỹ thuật điện di 36

2.2.2.11 Phân tích trình tự cDNA của cDNA-NK1 36

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 TÁCH DÒNG GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 TỪ PHỔI NGƯỜI 37

3.1.1 Tổng hợp cDNA từ mẫu phổi người 37

3.1.2 Khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 37 3.1.3 Khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 39 3.1.4 Tách dòng đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 41

3.1.5 Tách dòng đoạn cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1 44

3.1.6 Giải trình tự cDNA hòan chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 49

3.2 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 49

3.2.1 Thiết kế mồi 49

3.2.2 Tách dòng vector biểu hiện mang cDNA mã hóa cho th ụ thể neurokinin-1 52

3.2.3 Giải trình tự gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 trong vector biểu hiện 56

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

KẾT LUẬN 57 KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

\

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1: Họ các thụ thể liên kết với G protein (GPCRs) 3 Hình 2: Cấu trúc chung của thụ thể xuyên màng 7 lần liên kết với G protein 4 Hình 3: Sơ đồ cắt-nối gen mã hóa cho tachykinin ở động vật có vú 7 Hình 4: Cấu trúc thụ thể NK1 mang chiều dài hòan chỉnh và NK1 có đầu carboxyl bị xén

cụt 12

Hình 5: Sơ đồ nghiên cứu tách dòng và thiết kế vector biểu hiện cDNA mã hóa cho thụ thể

neurokinin – 1 ở phổi người Việt Nam 22

Hình 6: Sơ đồ khuếch đại đoạn 5’ và 3’-NK1 của gen mã hóa cho neurokinin-1…………9

Hình 7: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể

Hình 10: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc các khuẩn lạc với cặp mồi NK1 F/ NK1 R1 34

Hình 11: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn chèn 3’-NK1 bằng cặp

mồi NK1 F1/ NK1 R .35

Hình 12 Sơ đồ tách dòng đoạn cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1 36

Hình 13: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 bằng cặp mồi pJET R/ NK1

Hình 18: Điê ̣n di sản phẩm cắt ve ctor pCDNA 3, pEGFP-N1 và eNK 1 với hai enzyme

1-DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TM Transmembrane

IL Ỉntacellular

CIN V Chemotherapy induced nausea and vomiting

MỞ ĐẦU

Thụ thể neurokinin – 1 thuộc nhóm các thụ thể xuyên màng liên kết với G protein Khi thụ thể này tương tác với cấu tử gắn đặc hiệu SP sẽ dẫn truyền cảm giác đau đớn từ vùng thần kinh ngoại vi về trung ương thần kinh, gây ra trạng thái

lo âu và các triệu chứng giống trầm cảm, mặt khác chúng cũng có tác dụng gây kích thích co cơ trơn và điều hòa các phản ứng miễn dịch của cơ thể

Trên cơ sở những nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của thụ thể neurokinin-1, các hãng dược phẩm đã cố gắng tìm ra các chất đối vận với thụ thể neurokinin-1 nhằm sản xuất thuốc giảm đau cho các bệnh nhân bị chứng đau nửa đầu, thuốc chống trầm cảm, thuốc chống nôn cho các bệnh nhân ung thư, … Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu về thụ thể này ở người Việt Nam còn rất ít hoặc chưa được công bố Chính vì vậy, với mục đích phân lập được đoạn cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể này ở người Việt Nam và biểu hiện chúng trên hệ thống tế bào động vật để có thể chủ động được nguồn gen và các hệ thống sàng lọc thuốc từ

nguồn dược liệu Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Tách dòng và thiết kế

vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở ngườiViệt Nam” Đề tài

được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học; Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme - Protein và Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống,Trường Đại học Khoa học

Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội

Ch-¬ng 1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 THỤ THỂ LIÊN KẾT VỚI G PROTEIN

1.1.1 G protein

G protein lần đầu tiên được phát hiện và mô tả bởi Alfred và Martin khi hai ông nghiên cứu tác động của adrenaline đối với tế bào Với công trình này, hai ông

đã giành giải Nobel lý sinh – y học năm 1994 [4]

G protein một nhóm protein lớn có bản chất là enzyme GTPases [46] Dựa vào kích thước người ta chia chúng thành hai họ: GTPases dạng monomer kích thước nhỏ và G protein dạng trimer kích thước lớn G protein kích thước lớn được tạo thành từ các tiểu đơn vị alpha (Gα), beta (Gβ) và gamma (Gγ) Hai tiểu đơn vị beta (Gβ) và gamma (Gγ) hình thành phức dimer bền vững (Gβγ); phức này liên kết với tiểu đơn vị alpha (Gα) [29]

G protein định vị ở mặt trong màng tế bào và được hoạt hóa nhờ thụ thể liên kết với G protein (GPCRs) phân bố trên bề mặt màng tế bào

1.1.2 Thụ thể liên kết với G protein

Họ thụ thể liên kết với G protein là những phân tử protein kích thước nhỏ (350-500 acid amine) [45], được phân thành các phân họ khác nhau dựa theo độ tương đồng về trình tự acid amine, chức năng và khả năng liên kết với các cấu tử Đến nay đã người ta đã phát hiện ra 367 thụ thể liên kết với G protein ở người, trong đó có khoảng 150 GPCRs được tìm thấy vẫn chưa biết chức năng [52]

Hình 1: Sự đa dạng của các họ thụ thể liên kết với G protein (GPCRs) [56]

Họ GPCR được phân chia thành ba lớp chính: lớp A, B và C Lớp A hay còn gọi là lớp Rhodopsin đông đảo nhất về số lượng thụ thể trong họ GPCR với 19 phân lớp (Hình 1) Lớp A cho phép nhận tín hiệu từ các monoamine, purine, opioid, chemokine, một số hormone có bản chất peptide hoặc glycoprotein, trong đó đặc biệt là truyền dẫn các tín hiệu có liên quan tới mùi hương Lớp B còn được gọi là lớp Secretin với 34 phân lớp chủ yếu dẫn truyền tín hiệu liên quan tới các hormone

có bản chất peptide như parathyroid, calcitonin, … Lớp C còn được gọi là lớp Glutamate với 8 phân lớp có vai trò thu nhận tín hiệu trong quá trình trao đổi dinh dưỡng của tế bào [3, 60]

Về cấu trúc, tất cả các thụ thể liên kết với G protein đều có đầu amino ở ngoài màng, 7 chuỗi xoắn xuyên màng, 3 vòng ở phía ngoài (exoloop), 3 vòng ở phía trong màng (cytoloop) và đầu carboxyl phân bố trong màng (Hình 2) Hầu hết

các thụ thể này đều được gắn thêm carbonhydrate vào đầu amino và palmityl hóa ở

vị trí Cys ở đầu carboxyl Mỗi chuỗi xuyên màng chứa 20-27 acid amine, đầu amino chứa 7-595 acid amine, các vòng xoắn chứa 5-230 acid amine, đầu carboxyl chứa 12-359 acid amine Điều này cho thấy cấu trúc của GPCR rất đa dạng Người

ta đã tìm ra mối liên hệ yếu giữa chiều dài của đầu amino với kích thước của cấu tử gắn tương ứng [51]

Hình 2: Cấu trúc chung của thụ thể xuyên màng 7 lần liên kết với G protein [60]

Vùng xuyên màng với 7 chuỗi xoắn alpha tạo nên hình dạng đặc trưng cho thụ thể GPCR Trong đó vùng xuyên màng 1, 4, 7 chỉ chứa duy nhất một acid amine

kỵ nước là asparagine hoặc serine Điều này khiến cho chúng có tính kỵ nước cao hơn các vùng xuyên màng còn lại Trên cấu trúc của các vùng xuyên màng thường chứa cysteine tham gia vào tạo cầu disulfit [51]

GPCR đều có chung một cơ chế hoạt động Khi một cấu tử mang tín hiệu (hormone, photon, ) liên kết với vùng đặc hiệu trong thụ thể trên bề mặt tế bào sẽ làm thay đổi cấu hình của GPCR Sự thay đổi đó kích hoạt G protein chuyển từ trạng thái “tắt” – đang liên kết với GDP sang trạng thái “bật” – liên kết với GTP ở tiểu đơn vị Gα Ở trạng thái “bật”, phức Gα-GTP tách khỏi phức dimer Gβγ, khi đó chúng sẽ kích hoạt các enzyme hình thành lên chất truyền tin thứ hai là cAMP hoặc

Trong tế bào

tế bào

Ngoài tế bào

tế bào

inositol triphosphate/diacetyl glycerol (IP3/DAG) Điều này phụ thuộc vào loại tiểu đơn vị alpha trong G protein, từ đó tạo ra một dòng thác những tín hiệu được truyền dẫn, kết quả cuối cùng là làm thay đổi hoạt động sinh lý, sinh hóa của tế bào [29, 38]

Về chức năng, GPCR và G protein cùng phối hợp với nhau để thực hiện vai trò truyền dẫn các tín hiệu hormone, chất dẫn truyền thần kinh, hạt photon ánh sáng, các phân tử mùi hương, các loại peptide, một số ion, từ môi trường bên ngoài vào bên trong tế bào [51, 60] Do có nhiều chức năng rất quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu của tế bào nên hiện nay G protein và các thụ thể liên kết với chúng đang là đích tách động cho nhiều liệu pháp chữa bệnh Theo ước tính có khoảng hơn một nửa số thuốc hiện nay có đích tác động là GPCRs [3, 4]

Tachykinin là một trong những họ neuropeptide lớn nhất được tìm thấy trong

cơ thể của tất cả các loài động vật Có hơn 40 loại tachykinin đã được phân lập từ các nhóm động vật không xương và có xương sống [15, 45]

Trong họ tachykinin, chất P (SP) được mô tả lần đầu tiên năm 1931 bởi Euler và Gaddum khi hai ông nghiên cứu dịch chiết não và ruột ngựa trong cồn Dịch chiết này có tác dụng kích thích hiệu quả hoạt động của ruột và gây giảm huyết áp ở thỏ [21] Tuy nhiên, rất nhiều thí nghiệm nhằm phân lập và tinh sạch SP

có hoạt tính từ các mẫu ruột ngựa đã không thành công Bốn mươi năm sau đó (năm 1970), Chang và Leeman mới tinh sạch được SP từ vùng dưới đồi của bò [14] và đến năm 1973, Studer và cộng sự đã phân lập, tinh sạch SP, đồng thời giải trình tự gene mã hóa cho SP từ ruột ngựa [50] Năm 1983, Kangawa và Kimura đã phân lập được thêm hai tachykinin có hoạt tính dược học khác với SP là neurokinin A (NKA) và neurokinin B (NKB) từ vùng thần kinh trung ương và ngoại vi [31, 33] Hiện nay, tachykinin trong mô động vật có vú đã được xác định gồm có chất P (hay SP), neurokinin A (hay neuromedin L hoặc chất K) và neurokinin B (hay neuromedin K) Riêng NKA được mở rộng thêm 2 dạng là neuropeptide K và neuropeptide γ (Bảng 1)

Bảng 1: Trình tự amino acid đầu carboxyl của các tachykinin ở động vật có vú [61]

Peptide/Nguồn Trình tự amino acid đầu C Tài liệu trích dẫn

Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH 2

Tatemoto và cộng sự,

1985

Não lợn

Các tachykinin ở động vật có vú đều được đặc trưng bởi trình tự đầu

carboxyl với cấu trúc bảo thủ: Phe-X-Gly-Leu-Met-NH 2, trong đó X là một amino acid béo (Val hoặc Ile) hoặc thơm (Phe hoặc Tyr) [20]

Hình 3: Sơ đồ cắt-nối gen mã hóa cho tachykinin ở động vật có vú [37]

Các gen mã cho tachykinin ở người gồm TAC1 (hay PPT-A) định vị trên NST số 7 và TAC3 (hay PPT-B) định vị trên NST số 12 Các gen này tương ứng với gen Tac1 và Tac2 ở chuột Gen TAC1 mã hóa cho SP, NKA, neuropeptide K,

neuropeptide- γ [3, 7] Sở dĩ gene này mã hóa được cho một loạt sản phẩm là do

mRNA tổng hợp từ gen TAC1 đã trải qua quá trình cắt nối luân phiên để tổng hợp

các dạng preprotachykinin khác nhau: alpha (α-PPT), beta (β-PPT) và gamma PPT) [34] Sau quá trình dịch mã, từ các tiền chất protein này sẽ tiếp tục được cắt nối để tạo thành tachykinin SP, NKA, NKB Chi tiết sơ đồ quá trình cắt nối được trình bày trong Hình 3 Trong đó, dạng α-PPT-A mARN thiếu exon 6 được tìm thấy chủ yếu ở trong não Dạng γ-PPT-A mARN thiếu exon 4 và dạng β-PPT-A mARN

(γ-đủ cả 7 exon được tìm thấy chủ yếu ở các hạch thần kinh ngoại biên [36, 37] Các

Dịch mã và tổng hợp protein

Quá trình biến đổi sau dịch mã

Quá trình biến đổi sau dịch mã

Quá trình biến đổi sau dịch mã

đoạn peptide tiền thân được nhận biết nhờ 6 nhóm enzyme thủy phân gọi là convertase và cắt đặc hiệu tại các vị trí Lys-Arg, Arg-Arg hoặc Arg-Lys để tạo thành các dạng tachykinin tương ứng [34, 47] Trong đó cả ba dạng preprotachykinin đều được sử dụng để tạo thành chất P còn dạng preprotachykinin beta và gamma mới được sử dụng để hình thành lên các dạng peptide khác (NKA, neuropeptide γ, neuropeptide K) Ở một số mô trong cơ thể, neuropeptide K và γ

thường có đầu amino dài hơn so với NKA [12] Trong khi đó gen TAC3 (PPT-B)

mã hóa cho neurokinin B biểu hiện chủ yếu trong vùng dưới đồi và ruột [7]

Từ năm 2000, nhóm của Yu Zhang và cộng sự tiến hành nghiên cứu ở tế bào lympho B ở chuột đã phát hiện dạng tachykinin thứ tư là hemokinin Ở người,

hemokinin được mã hóa bởi gen TAC4 (PPT-C) định vị trên NST số 17 [39, 54]

Gen này có được cắt nối theo nhiều cách khác nhau để từ đó hình thành nên nhiều dạng hemokinin và endokinin khác nhau trong cơ thể

Tachykinin được tổng hợp trong các tế bào thần kinh (trung ương và ngoại vi) và cả các tế bào không phải tế bào thần kinh Sự phân bố này phụ thuộc vào từng loài và rất khó tìm ra quy luật phân bố của chất này Có nhiều vị trí biểu hiện tachykinin đến nay vẫn chưa biết chức năng Khi phân bố ở tế bào thần kinh, tachykinin hoạt động như một chất truyền dẫn tín hiệu thần kinh, trong khi ở các tế bào không phải tế bào thần kinh, chúng có vai trò như những chất nội tiết, cận nội tiết hoặc điều chỉnh hoạt động hệ nội tiết [27] Ở động vật có vú, tachykinin chú yếu được biểu hiện ở tế bào không phải tế bào thần kinh dưới dạng SP Sau khi được giải phóng vào máu, SP cùng với serotonin hoạt động như một chất cận nội tiết hoặc một chất nội tiết tố thực sự Khi đó chúng đóng vai trò như một tác nhân gián tiếp gây giải phóng chất gây giãn mạch máu hoặc trực tiếp gây co cơ trơn [8, 21]

Khi liên kết với thụ thể tương ứng của mình, tachykinin có vai trò kích thích các tế bào thần kinh, gợi những phản ứng thói quen, hành vi giới tính, dẫn truyền cảm giác đau đớn và gây co trực tiếp hoặc gián tiếp cơ trơn, từ đó gây hiện tượng co thắt ruột, gây giãn mạch máu và phản xạ nôn, gây viêm [6, 8, 40] Dựa vào hiểu biết

về chức năng cuả tachykinin, nhiều nghiên cứu tập trung tìm kiếm các chất đối vận

với tachykinin để điều trị các điều kiện gây viêm như hen suyễn, triệu chứng kích thích co thắt ruột [8, 16, 25] Tuy nhiên, mục đích chính để sử dụng các loại thuốc này là chống buồn nôn cho người và động vật [18, 19]

1.3.1 Giới thiệu chung về thụ thể họ tachykinin

Thụ thể của họ tachykinin (TACR) thuộc lớp A trong họ thụ thể liên kết với

G protein (Hình 1) Tương tự như thụ thể rhodopsin, TACR có cấu trúc gồm 7 vùng xuyên màng đặc trưng được nối với nhau bởi các vòng phía ngoài và phía trong màng sinh chất (exoloop và cytoloop) Những vòng ở phía ngoài màng tế bào của thụ thể liên kết với G protein có chức năng lựa chọn cấu tử gắn đặc hiệu trong khi các vùng xuyên màng có chức năng quyết định hoạt tính của thụ thể Người ta phân loại TACR dựa vào sự sai khác trong các trình tự này [45]

Có ba dạng thụ thể của họ tachykinin ở động vật có vú đã được phát hiện là: neurokinin 1 (NK1), neurokinin 2 (NK2) và neurokinin 3 (NK3) tương ứng với các tachykinin SP, NKA và NKB Trên thực tế, giữa các thụ thể và tachykinin có thể liên kết chéo, nhưng ái lực liên kết thay đổi nhiều giữa thụ thể và cấu tử (Bảng 1) [3, 9, 10, 35] Riêng tachykinin endokinin và hemokinin đều ưu tiên gắn với thụ thể NK1 [21]

Bảng 2: Ái lực liên kết giữa các tachykinin với các thụ thể của chúng [3]

SP NK1 > NK2 > NK3 NKA NK2 > NK3 > NK1 NKB NK3 >> NK2 > NK1 Neuropeptide-γ NK2 > NK1 >> NK3 Neuropeptide K NK2 > NK1 >> NK3

Ngoài ái lực liên kết với các tachykinin khác nhau, ba thụ thể NK1, NK2 và NK3 còn phân biệt với nhau ở một số đặc điểm được thống kê trong Bảng 3

Bảng 3: Một số đặc điểm sai khác giữa các thụ thể NK1, NK2 và NK3 ở người [3, 23, 28]

Đặc điểm Thụ thể NK1 Thụ thể NK2 Thụ thể NK3

Gen mã hóa nằm trên NST 2 10 4

Số lượng acid amine

Độ tương đồng 41% với NK3 47% với NK1 51% với NK1 Khối lượng phân tử 46,364 43,851 51,104

Các nghiên cứu đều chỉ ra rằng gen mã hóa cho 3 dạng thụ thể trên đều chứa

5 exon xen kẽ với 4 intron Việc các gen mã hóa cho TACR chứa intron đã gợi ý rằng các gen này có thể có nhiều cách cắt nối khác nhau, từ đó tạo nên tính đa hình của thụ thể [22]

Khi nghiên cứu các thụ thể TACR người ta thấy có sự biến động về số lượng acid amine giữa các loài động vật Trong đó NK1 ở tất cả các loàiđộng vật có vú chứa 407 acid amine NK2 ở người chứa 398 acid amine, trong khi ở chuột chứa

390 và ở lợn là 402 acid amine Tương tự như thế với NK3 ở người chứa 465 acid amine trong khi ở chuột là 452 và lợn là 440 acid amine [3]

Cả ba thụ thể của họ tachykinin ở người mặc dù có cấu trúc khác nhau nhưng đều có chung cơ chế hoạt động Sau khi tachykinin liên kết vào thụ thể tương ứng của chúng, phức hợp thụ thể-cấu tử sẽ kích hoạt phân tử G protein, từ đó làm tăng hàm lượng Ca2+ nội bào hoặc hoạt hóa phospholipase C làm phân hủy phosphoinositol thành IP3/DAG Một số nghiên cứu khác chỉ ra rằng phức hợp giữa thụ thể tachykinin và tachykinin tương ứng còn có khả năng kích hoạt G protein gây hoạt hóa adenylate cyclase hình thành cAMP [26, 42]

Vai trò của TACR được phát hiện thông qua các thí nghiệm gây đột biến làm mất các gen tổng hợp tachykinin hoặc thụ thể của tachykinin ở động vật [16, 18, 55] Nhìn chung, các TACR khi phối hợp hoạt động với G protein cho phép truyền dẫn tín hiệu từ tachykinin vào trong tế bào, gây co thắt phế quản [23], tăng cường vận chuyển khí ở mạch máu và tăng tiết dịch nhày, gây co thắt cơ trơn, gây phản ứng viêm, Chất đối vận của thụ thể NK1 có cơ chế hoạt động tương tự như chất

P đã được chứng minh là có khả năng chống suy nhược [9, 10] trong khi chất đối

vận với thụ thể NK2 được chứng minh là có tác dụng chống lo âu [11, 12], còn chất đối vận với thụ thể NK3 có chức năng chống lại sự rối loạn thần kinh [46, 14]

1.3.2 Thụ thể neurokinin – 1

Trong họ tachykinin, biểu hiện và đóng vai trò quan trọng nhất phải kể đến

SP SP có khả năng liên kết với cả ba loại thụ thể NK1, NK2 và NK3 nhưng ái lực mạnh nhất với thụ thể NK1 Khi biểu hiện cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1

ở dòng tế bào COS-7, ái lực liên kết giữa thụ thể NK1 với SP có giá trị Kd là 0.35±0.07, cao gấp 100 lần so với NKA và 500 lần so với NKB [24]

Như đã nói ở trên, NK1 là một thành viên trong họ thụ thể liên kết với G protein, chúng chứa 7 vùng xuyên màng kỵ nước, trong đó có 3 loop xuyên ngoài màng và ba loop xuyên trong màng, đầu carboxyl nằm trong tế bào chất trong khi đầu amino nằm ngoài màng tế bào Thụ thể này chứa 407 acid amine Những cấu trúc liên quan trực tiếp tới chức năng của thụ thể gồm cầu disulfit tạo thành giữa Cys105-Cys180 thuộc TM 3 và TM4; đầu amino của NK1 bị glycosyl hóa tại vị trí Asp14 và Asp18; đầu carboxyl bị palmityl hóa ở vị trí Cys322 [58]; trình tự Asp-Arg-Tyr của TM3 và Lys/Arg-Lys/Arg-XX-Lys/Arg nằm ở đầu carboxyl của thụ thể phía là nơi tương tác với G protein (Hình 4A)

Hình 4: Cấu trúc thụ thể NK1 mang chiều dài hòan chỉnh và NK1 có đầu carboxyl

bị xén cụt

Gen mã hóa cho neurokinin-1 có hai cách cắt nối trong tự nhiên hình thành nên dạng NK1 mang chiều dài hoàn chỉnh và dạng NK1 bị xén cụt đầu carboxyl tận cùng ở người và ở lợn [5, 11, 22] Cả hai dạng NK1 này phát hiện ra thấy ở tất cả các vùng trong não, thậm chí mở rộng ra tới hệ thần kinh vùng ngoại vi trong ngũ tạng Nguyên nhân của sự xuất hiện dạng NK1 có đầu carboxyl bị xén cụt là do bị lỗi trong quá trình cắt bỏ exon số 5 đã tạo ra sớm mã kết thúc [5] Khi dịch mã sang protein, dạng NK1 dài hoàn chỉnh chứa 407 acid amine, trong khi dạng NK1 bị xén cụt chứa 311 acid amine Hai dạng này khác nhau ở chiều dài đầu carboxyl tận cùng – vị trí gây ra sự phosphoryl hóa trong quá trình truyền tín hiệu của thụ thể NK1

Do sự khác biệt về đầu carboxylnên khi biểu hiện ở dòng tế bào thận phôi người HEK 293, hai dạng thụ thể NK1 này có nhiều điểm khác biệt về chức năng (Bảng 4) [30] Theo nghiên cứu của Fong và cộng sự cho thấy ái lực của NK1 bị xén cụt đầu carboxyl giảm 10 lần so với NK1 có trình tự dài hòan chỉnh khi tương tác với chất đồng vận SP [22] Điều này gợi ý rằng cần phải có một lớp thuốc mới phù hợp với dạng thụ thể này

A NK1 dài hoàn chỉnh B NK1 bị xén cụt đầu carboxyl

Glycosyl hóa

Palmityl hóa hóa

Disulfit

Glycosyl hóa

Disulfit

Bảng 4: Sự khác biệt trong chiều dài của đầu carboxyl liên quan tới chức năng của thụ thể

NK1 [30]

Đặc điểm NK1 mang chiều dài hoàn chỉnh NK1 bị cắt cụt

đầu tận cùng carboxyl

Số lượng acid amine 407 311

Biến đổi hàm lượng Ca nội bào có không

Phosphoryl hóa PK-Cδ tăng giảm

Sự hoạt hóa ERK nhanh chậm

Sự biểu hiện mRNA IL-8 tăng giảm

Gần đây, có nghiên cứu còn chỉ ra mối liên hệ giữa chiều dài thụ thể neurokinin-1 với việc bị nhiễm virus HIV Cụ thể là ở những người âm tính với HIV biểu hiện dạng NK1 hoàn chỉnh nhiều hơn đáng kể so với nhưng người dương tính với virus HIV [48]

Cơ chế hoạt động của thụ thể NK1 có thể tóm tắt như sau: SP được giải phóng ra từ các bóng synapse gắn vào thụ thể NK1 ở màng sau synapse tạo ra điện thế hoạt động ở màng sau theo cơ chế phụ thuộc Ca2+ Khi thụ thể NK1 bị kích thích, bản thân chúng tương tác với G protein, từ đó có thể tạo nên chất truyền tin thứ hai theo ba phương thức: một là phụ thuộc hệ thống truyền tin thứ hai thông qua phospholipase C phân hủy phosphatidyl inositol bên trong màng tế bào thành IP3 và DAG IP3 hòa tan vào tế bào chất và liên với thụ thể trên mạng lưới nội chất hạt dẫn đến sự huy động Ca2+ vào trong tế bào chất, từ đó DAG trên còn nằm lại trên màng kích hoạt kinase C phụ thuộc Ca2+ gây hiện tượng phosphoryl hóa nhiều protein đích Đây là phương thức hoạt hóa chính của thụ thể TACR cũng như là TACR1 Hai là sự huy động acid arachidonic thông qua phospholipase A2 và ba là gây ra sự tích lũy cAMP thông qua kích hoạt enzyme adenylate cyclase [35]

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng thụ thể NK1 ở người được mã hóa bởi một gen đơn bản nằm trên NST số 2, kích thước của gen mở rộng lên tới 151 kb [13] Trình tự cDNA mã hóa cho thụ thể NK1 ở người và chuột tương đồng tới 89% [28]

Theo ngân hàng dữ liệu, gen NK1 khi tiến hành phiên mã có thể cho ít nhất 4 dạng

mRNA khác nhau Mỗi cách thức biểu hiện sẽ cho một dạng thụ thể NK1 có ái lực

với các chất đồng vận khác nhau Quá trình này xảy ra ở những mô chuyên biệt

[13] Tuy nhiên, cho đến nay, người ta mới chỉ phát hiện được 2 dạng biểu hiện của

gen này [30, 22]

Thụ thể NK1 được tìm thấy cả trong vùng thần kinh trung ương và ngoại vi

tương tự như SP, cụ thể là ở tế bào thần kinh, màng trong mạch máu, các tế bào cơ,

ruột-dạ dày, phổi, tế bào thuộc hệ miễn dịch, đảo giáp, … Sự liên kết giữa SP với

thụ thể NK1 cho phép truyền đi các tín hiệu stress, đau đớn, phản ứng viêm và co

rút cơ trơn, … [55]

1.4 ỨNG DỤNG CỦA THỤ THỂ NEUROKININ-1 TRONG ĐIỀU

TRỊ BỆNH

Từ những hiểu biết về chức năng của thụ thể neurokinin 1 hứa hẹn đây sẽ là

đích tác động hiệu quả cho các phương pháp điều trị một số căn bệnh có liên quan

Do đó cũng không có gì ngạc nhiên khi nhiều hãng dược phẩm lớn tập trung nghiên

cứu về thụ thể tachykinin nhằm tìm ra các chất đối vận của chúng để ứng dụng

trong điều trị bệnh: làm thuốc giảm đau, chống lo âu, trầm cảm, chữa các bệnh

đường hô hấp,… Sự phát hiện ra các chất đối vận với thụ thể NK1 cũng là một mắt

xích quan trọng trong việc thay đổi hướng điều trị trong việc ngăn ngừa chứng buồn

nôn và sự nôn mửa do tác dụng của hóa trị liệu ung thư Tuy đến nay các nghiên

cứu về chất đối vận với thụ thể tachykinin vẫn chưa đạt được kết quả như mong đợi

và gặp rất nhiều khó khăn, nhưng việc sử dụng thụ thể NK1 làm đích tác động của

thuốc vẫn là một bài tóan hay và khó cho nhiều nhà nghiên cứu Trong đó các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào những phân tử không có bản chất peptide có

khả năng thấm xuyên qua màng tế bào thần kinh Trong tương lai, chất này hứa hẹn

sẽ cho phép điều trị bệnh liên quan tới chứng nghiện rượu [13], …

Kể từ khi tachykinin được phát hiện ra lần đầu tiên, người ta đã biết khá rõ

hoạt tính sinh học của chúng trong các trường hợp bệnh lý và sinh lý học Tuy

nhiên, hiệu quả điều trị của các chất đối vận với tachykinin đến nay vẫn chưa được

hiểu biết một cách đầy đủ

Chất đối vận của thụ thể là những chất có khả năng liên kết thuận nghịch với thụ thể Thông thường cả chất chủ vận và chất đối vận đều có thể liên kết với một vùng nhất định trong thụ thể, nhưng chất đối vận thường không liên kết tại những vị trí chính xác để kích hoạt cơ chế hoạt động của thụ thể Do vậy, chất đối vận không

có hoạt tính sinh học nhưng có khả năng ức chế cạnh tranh làm giảm hoặc khóa hoạt tính của chất đồng vận [41]

Từ những kết quả nghiên cứu về vai trò của các chất đối vận thụ thể NK1, người ta đã đưa một số hợp chất vào sản xuất thành thuốc trên thị trường Các chất này đều có bản chất phi peptide, có vai trò chủ yếu trong việc điều trị chứng trầm cảm, các biểu hiện stress, chứng đau nửa đầu, giảm đau, giảm triệu chứng tâm thần, rối loạn thần kinh, giảm tình trạng nôn mửa đối với những bệnh nhân ung thư…

Theo công bố của viện ung thư quốc gia Hoa kỳ, khi tiến hành hóa trị liệu cho các bệnh nhân ung thư, có tới hơn 75% các ca hóa trị liệu có phản ứng nôn mửa chỉ sau 24h điều trị, 90% bệnh nhân bị nôn sau 2-5 ngày sau hóa trị Điều này gây ảnh hưởng lớn tới sức khỏe và tinh thần của bệnh nhân và làm giảm đáng kể số bệnh nhân kiên trì điều trị theo phương pháp này Theo báo cáo của Hội Điều Dưỡng Xã Hội Về Ung Thư, có đến 50% số bệnh nhân ở giai đoạn CINV bỏ cuộc

vì lí do gặp phải các triệu chứng sau khi hóa trị Năm 2003, Cục Quản Lý Dược Và Thực Phẩm của Mỹ đã phê duyệt việc áp dụng các phương pháp liên quan đến thụ thể NK1, dẫn đến việc sử dụng một lớp thuốc mới có tác dụng đối vận thụ thể NK1 trong phương pháp hóa trị liệu [41, 43] Hiệu quả khả quan được chứng minh rõ khi

sử dụng các loại thuốc này trong phác đồ điều trị, chúng làm giảm và chậm đáng kể

quá trình xảy ra các triệu chứng CINV

Một ứng dụng rộng rãi nữa của thuốc đối kháng thụ thể NK1 là tham gia vào việc điều trị chứng tâm thần phân liệt Theo các nghiên cứu về não bộ thì con đường Mesolimbic liên quan trực tiếp đến các triệu chứng của nghiện, tâm thần phân liệt, trầm cảm do chúng tham gia vào việc tăng lượng dopamine trong não bộ bằng các

cơ chế khác nhau [44] Trong cơ thể, nếu chất chủ vận SP được truyền đi sẽ kích hoạt con đường này dẫn đến tăng hoạt tính của dopamine ở các tế bào thần kinh Vì

vậy, một trong những phương pháp điều trị là ngăn chặn sự tương tác của chất P với thụ thể NK1 bởi các thuốc đối kháng liên kết với thụ thể này Các hợp chất này tác động làm điều chỉnh sự tiết ra dopamine ở các hệ thống Mesolimbic

Theo một nghiên cứu mới vào năm 2012 đã chứng minh được vai trò của NK1 cùng phối tử của chúng là chất P trong sự phát triển khối u ung thư Chất P và các hợp chất khác khi kích hoạt thụ thể NK1 dẫn đến sự thủy phân các phosphoinositide, huy động Ca2+ và hoạt động của protein kinase kích hoạt quá trình phân bào Hoạt động của NK1 được tìm thấy liên quan đến các quá trình phát sinh ung thư như phân chia nguyên bào, sự di chuyển của các tế bào và di căn Do

đó thụ thể NK1 cũng như chất P ảnh hưởng mạnh mẽ đến vi môi trường của khối u trong ung thư [6]

Kể từ đó tới nay, các chất đối vận có bản chất phi peptide được nghiên cứu rộng rãi và nhiều cấu trúc cũng như cơ chế tác dụng của chúng đã được làm sáng tỏ Năm 1998, Kramer và cộng sự đã công bố những nghiên cứu bệnh học về tác dụng

và tính an toàn của MK-869 ở bệnh nhân trong phần lớn các trường hợp rối loạn trầm cảm Năm 2003, lần đầu tiên chất đối vận NK1 là aprepitant (Emend) được hiệp hội quản lý thuốc và thực phẩm (FAD) Hoa Kỳ phê chuẩn cho phép sản xuất

và lưu thông trên thị trường Gần đây người ta phát hiện ra hợp chất T-2328 là một chất đối vận thụ thể NK1 không có bản chất peptide Chất này được đưa trực tiếp vào tĩnh mạch để điều trị nôn cấp tính và nôn kéo dài trong điều trị ung thư Người

ta đề xuất đưa chất này vào sản xuất thuốc chống buồn nôn qua hoạt động thụ thể NK1 [3] T-2328 có hiệu lực quan trọng, hàm lượng ức chế của chất này là dưới nanomol và thấp hơn 16 lần so với aprepitant lưu hành trên thị trường Sự ức chế này có tính chọn lọc cao đối với thụ thể NK1 nên cũng được đưa vào làm thuốc trên thị trường [43]

Tuy có ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y, dược nhưng những nghiên cứu về thụ thể neurokinin – 1 ở Việt Nam vẫn còn rất ít hoặc chưa công bố Theo một tài liệu mới đây người ta đã thành công trong việc tách dòng cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 từ mẫu não của người Việt Nam Tuy nhiên, khi đối chiếu với trình tự

cDNA được công bố trên ngân hàng dữ liệu NCBI (Mã số M81797.1) [59] phát hiện thấy 5 điểm sai khác tại các vị trí 184, 333, 370, 641, 996 trong đó tất cả A trong trình tự gốc đều bị thay thế bằng G tại các vị trí 184, 333, 641 và 996, còn ở

vị trí 370, C bị thay bởi T Kết quả là có acid amine đã bị thay đổi như trong Bảng

5

Bảng 5: Sai khác về trình tự protein giữa cDNA mã hóa cho thụ thể neurkinin-1 ở người

Việt Nam so với trình tự protein cDNA NK1 trên NCBI

Acid amin (cDNA NK1 mã số M81797.1)

Acid amin (cDNA từ não người Việt Nam)

R - Arginine (62) G - Glycine

T – Threonine (124) A - Alanine

Y – Tyrosine (214) C - Cysteine

E - Glutamic acid (332) G - Glycine

Từ đó đặt ra câu hỏi rằng sự sai khác giữa trình tự acid amine trong cDNA tách dòng từ não người Việt Nam với trình tự acid amine trong trình tự cDNA gốc

có phải là do tính đa hình của gen? Để trả lời câu hỏi đó chúng tôi quyết định tách dòng lại cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 từ mẫu phổi ở một cá thể người Việt Nam khác Từ nguồn gen này, chúng tôi thiết kế vector biểu hiện cho cDNA mã cho thụ thể neurokinin-1 để biểu hiện chúng trên hệ thống tế bào động vật, từ đó có thể chủ động được nguồn gen và các hệ thống sàng lọc thuốc có tính đối vận với thụ thển neurokinin-1 từ nguồn dược liệu ở Việt Nam Đây là lí do để

chúng tôi tiến hành đề tài “Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho

thụ thể neurokinin – 1 ở người Việt Nam”

NEUROKININ-1

Gen mã hóa cho thụ thể liên kết với G protein được dung hợp vào nhiều hệ vector và nhiều dòng tế bào khác nhau Người ta đã thử biểu hiện chúng trên cả tế bào nhân sơ và cả trên tế bào nhân thực Tuy nhiên, do thụ thể liên kết với G protein thường được biến đổi sau dịch mã bằng cách gắn thêm carbonhydrate hoặc lipid

hóa… nên việc biểu hiện trên hệ thống tế bào nhân sơ thường không cho kết quả như mong muốn

Trên hệ thống tế bào nhân thực, các nghiên cứu chỉ ra rằng mỗi gen mã hóa cho thụ thể liên kết với G protein phù hợp với một hệ thống biểu hiện khác nhau [Kenneth Lunstrom] và hiệu quả cao nhất ở các vector Semiki forest virus và Baculovirus

Theo các nghiên cứu đã công bố, NK1 được biểu hiện trong vector pCDNA [24], pMAM-neo [24; 28], pVLl393 [32], pAHygCMV1 [49]… ở các chủng tế bào HEK293, COS-7, CHO, … đều cho kết quả khả quan Một nghiên cứu gần đây năm

2006 của Farahdiba và cộng sự khi nghiên cứu truyền tin của thụ thể β-arrestin 1 đã tiến hành dung hợp gen mã hóa cho thụ thể này với gen mã hóa cho NK1 và biểu hiện chúng trong hai hệ vector pCDNA3.1 và pEGFP-N1 cũng cho kết quả tốt Đây

là tiền đề cho chúng tôi lựa chọn và thiết kế vector biểu hiện pCDNA3 và N1 trong đề tài

pEGFP-pCDNA3 và pEGFP-N1 là vector biểu hiện ở tế bào động vật với các đặc điểm được trình bày trong phụ lục

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Mẫu vật

Mẫu phổi tươi của người bị ung thư phổi được cung cấp bởi Viện Quân Y

103 (kí hiệu H211 lấy ngày 25/1/2011)

2.1.2 Các cặp mồi sử dụng

Hai cặp mồi NK1 F/ NK1 R1 và NK1 F1/ NK1 R được thiết kế dựa theo trình

tự cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin – 1 được công bố trên ngân hàng dữ liệu [57]

Cặp mồi NK1 F3/ NK1 R3 được thiết kế dựa vào trình tự cDNA hoàn chỉnh tách dòng từ phổi người Việt Nam Các cặp mồi này được cung cấp bởi hãng IDT (Mỹ) Trình tự các mồi được trình bày trong Bảng 6

Bảng 6: Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu

NK1 F CGAAATGGATAACGTCCTCCC

Phân lập cDNA

mã hóa cho thụ thể neurokinin – 1

NK1 R CAAGTCCCAGTGTGAGGGTG

NK1 F1 GATCTACTTCCTCCCCCTGC

NK1 R1 GCCAGCAGATGGCGAAGG

NK1 F3 ATTTAAGCTTACCATGGATAACGTCCTCC Chuyển gen mã hóa cho

neurokinin-1 từ vector tái

tổ hợp pJET1.2-NK1 sang vector biểu hiện NK1 R3 TAAGGATCCCTAGGAGAGCACATTG

pJET Forward CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC Sàng lọc các

khuẩn lạc thu được pJET Reverse AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG

2.1.3 Các hệ thống vector

- Hệ thống vector biểu hiện ở tế bào động vật: pCDNA3, pEGFP-N1;

- Hệ thống vector tách dòng pJET 1.2 (Gene JETTM PCR Cloning Kit (Fermentas);

Thông tin về hệ thống vector biểu hiện được trình bày ở Phụ lục

2.1.4 Chủng vi khuẩn

- Chủng tế bào khả biến E coli DH5α dùng cho việc duy trì các vector tái tổ hợp

2.1.5 Hóa chất và thiết bị

a Các kit sử dụng: Các kit được sử dụng trong nghiên cứu và mục đích sử

dụng được trình bày trong Bảng 7

Bảng 7: Tên và mục đích sử dụng các kit trong nghiên cứu

AccuPrep® Viral RNA Extraction Kit (Bioneer) Tách RNA tổng số QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) Tinh sạch sản phẩm cắt High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) Tinh sạch sản phẩm PCR

Gene JETTM PCR Cloning Kit (Fermentas) Tách dòng cDNA phân

lập được

b Các hóa chất khác

- dNTPs (Promega);

- GoTaq Flexi(Promega);

- Pfu polymerase (Fermentas);

- Enzyme T4 DNA ligase (Invitrogen);

- Các enzyme giới hạn (Fermentas, New England Biolabs);

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Lubertani Broth (LB) gồm 1 % trypton, 0,5% cao nấm men, 0,5% NaCl;

- Các hóa chất thông dụng khác đều đạt độ tinh khiết dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử

c Thiết bị

Các máy móc, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu thuộc Phòng thí nghiệm Sinh

Y - Khoa Sinh học; Phòng Genomic - Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym - Protein và Phòng Sinh học Phân tử - Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Hình 5: Sơ đồ nghiên cứu tách dòng và thiết kế vector biểu hiện cDNA mã

hóa cho thụ thể neurokinin – 1 ở phổi người Việt Nam

2.2.2 Các kỹ thuật dùng trong nghiên cứu

2.2.2.1 Tách RNA tổng số

Sử dụng mẫu phổi người bị ung thư phổi (mẫu tươi) để tách RNA tổng số

theo quy trình của kit AccuPrep® Viral RNA Extraction Kit (Bioneer) Quy trình

tách chiết gồm các bước chính như sau:

- Cân 20 mg mẫu phổi người cho vào ống eppendorf 1.5 ml

Tách RNA tổng số Mẫu phổi tươi

Tổng hợp cDNA

Cắt-nối tạo NK1 hoàn chỉnh

Tách dòng NK1 hoàn chỉnh

cDNA-Chuyển cDNA-NK1 vào vector biểu hiện pCDNA3, pEGFP-N1

Tách dòng vector biểu hiện pCDNA3, pEGFP- N1 mang cDNA-NK1

Khuếch đại đoạn 3’-NK1 Khuếch đại đoạn 5’-NK1

Giải trình tự cDNA-NK1 hoàn chỉnh trong vector

- Bổ sung 400 µl Binding Buffer (VB), trộn nhẹ 5 giây rồi ủ mẫu ở nhiệt độ phòng 10 phút để ly giải tế bào

- Bổ sung 100 µl isopropanol, trộn đều trong 5 giây, ly tâm nhanh trong 10 giây Chuyển phần dịch lên cột, ly tâm loại bỏ dịch

- Rửa cột với 500 µl W1 Buffer, ly tâm nhanh trong 1 phút để loại bỏ dịch

- Rửa lại cột với 500 µl W2 Buffer, ly tâm nhanh trong 1 phút loại bỏ dịch, ly tâm lại 1 phút để loại bỏ cồn trong W2 Buffer

- Bổ sung 50 µl Elution Buffer, ly tâm thu RNA

2.2.2.2 Phản ứng phiên mã ngƣợc với enzym AMV Transcriptase

RNA tổng số được tách chiết từ mẫu phổi người, sau đó được dùng làm khuôn trong phản ứng phiên mã ngược để tổng hợp cDNA nhờ enzyme phiên mã

AMV Transcriptase (Promega) Phản ứng này được thực hiện theo quy trình hướng

dẫn của Promega với các bước chính sau

- Bước 1: Trộn RNA và mồi, ủ hỗn hợp ở 70oC, 5 phút để biến tính RNA rồi ủ ngay vào trong đá

Trong bước này, chúng tôi sử dụng lần lượt 2 mồi là Hexamer và mồi oligoT

để tổng hợp riêng rẽ cDNA từ một mẫu RNA đã tách chiết

- Bước 2: Bổ sung đệm và dNTP, ủ ở 25oC trong 10 phút

- Bước 3: Bổ sung enzyme AMV Transcriptase 300u/µl, thực hiện phản ứng

tổng hợp theo chu trình nhiệt: 250C 10 phút, 370C 90 phút, 850C 10 phút Sản phẩm cDNA được bảo quản ở 4oC

2.2.2.3 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phản ứng PCR là kỹ thuật khuếch đại đoạn trình tự DNA nhờ sự thay đổi của