Sàng lọc và phân tích đặc điểm phân tử các đột biến FLT3 xuất hiện trên bệnh nhân mắc bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy ở Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- Đỗ Thị Thanh Trung SÀNG LỌC VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ CÁC ĐỘT BIẾN FLT3 XUẤT HIỆN TRÊN BỆNH NHÂN MẮC BỆNH UNG THƯ BẠ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Đỗ Thị Thanh Trung

SÀNG LỌC VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ CÁC ĐỘT BIẾN

FLT3 XUẤT HIỆN TRÊN BỆNH NHÂN MẮC BỆNH UNG THƯ

BẠCH CẦU CẤP DÒNG TỦY Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Đỗ Thị Thanh Trung

SÀNG LỌC VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ CÁC ĐỘT BIẾN

FLT3 XUẤT HIỆN TRÊN BỆNH NHÂN MẮC BỆNH UNG THƯ

BẠCH CẦU CẤP DÒNG TỦY Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHẠM BẢO YÊN

Hà Nội – Năm 2014

Lời cảm ơn

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến TS Phạm Bảo Yên người đã

tận tình hướng dẫn chỉ bảo em trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Sinh lý thực vật và

Hóa sinh, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo mọi điều kiện

về cơ sở vật chất cho em hoàn thành luận văn

Em cũng cảm ơn sự giúp đỡ tạo điều kiện về vật chất và trang thiết bị từ

Phòng Enzym học và Phân tích hoạt tính Sinh học, Phòng thí nghiệm Trọng điểm

Công nghệ protein và enzyme

Đề tài thực hiện có sự hỗ trợ kinh phí của đề tài: “Thiết lập quy trình phát

hiện một số đột biến trên gen FLT3, NPM1 và CEBPA gây bệnh ung thư bạch cầu

cấp dòng tủy ở bệnh nhân Việt Nam” mã số KLEPT.12.02 của Phòng thí nghiệm

Trọng điểm Công nghệEnzyme và Protein, Đại học Quốc gia Hà Nội

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, người

thân đã luôn ở bên cạnh động viên, chia sẻ giúp đỡ em

Em xin chân thành cảm ơn!

Học viên

Đỗ Thị Thanh Trung

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy (Acute Myeloid Leukemia-AML) 3

1.1.1 Thực trạng bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy và tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam 5

1.1.2 Phân loại các thể bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy 12

1.1.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh AML 13

1.1.4 Hướng điều trị đối với người bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy 14

1.2 Gen FLT3 và sự liên quan tới bệnh bạch cầu cấp dòng tủy 19

1.2.1 Cấu trúc và chức năng của gen FLT3 19

1.2.2 Các loại đột biến FLT3 20

1.2.3 Mối liên hệ giữa đột biến trên gen FLT3 và bệnh bạch cầu cấp dòng tủy21 1.2.4 Ý nghĩa của việc nghiên cứu gen FLT3 trong chẩn đoán và điều trị AML 22

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24

2.1 Nguyên liệu 24

2.1.1 Mẫu máu 24

2.1.2 Các hóa chất và bộ kit 24

2.1.3 Máy móc và thiết bị 25

2.2 Phương pháp 26

2.2.1 Tách DNA tổng số từ mẫu máu 26

2.2.2 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân bản đoạn gen có đột biến 27

2.2.3 Nhân đoạn gen FLT3chứa đột biến với cặp mồi đặc hiệu bằng phản ứng

chuỗi polymerase (PCR) 27

2.2.4 Điện di agarose hoặc acrylamide để phân tích phổ băng đột biến 28

2.2.6 Nhân dòng đoạn gen FLT3 và đọc trình tự gen bằng phương pháp Sanger 28

2.2.7 Một số phần mềm sử dụng trong luận văn 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Thu thập và tách chiết ADN hệ gen từ mẫu máu tổng số 31

3.2 Thiết kế và tối ưu quy trình phát hiện đột biến gen FLT3-ITD 32

3.2.1 Thiết kế trình tự mồi 32

3.2.2 Thiết kế và tối ưu quy trình phát hiện đột biến FLT3-ITD 33

3.3 Bước đầu sàng lọc trong quy mô phòng thí nghiệm 36

3.4 Kết quả đưa sản phẩm PCR vào vectơ tái tổ hợp 37

3.5 Phân tích các đặc điểm phân tử của đột biến gen FLT3-ITD 40

3.5.1 Số lượng đột biến gen FLT3-ITD trong một mẫu (số đột biến/mẫu) 40

3.5.2 Kích thước đột biến 40

3.5.3 Trình tự đột biến 44

3.5.4 Mức độ đột biến 45

KẾT LUẬN 47

KIẾN NGHỊ 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ

Bảng 1.1 Giá trị của phương pháp hình thái học và phương pháp

hoá tế bào trong chẩn đoán phân dòng bệnh ung thư bạch cầu cấp

10

Bảng 1.2 Các chất ức chế kinase Tyrosine (TKIs) được Cục Quản

lý thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (FDA) phê chuẩn

19

Bảng 2.1 Thành phẩn của phản ứng PCR đoạn gen FLT3 28

Bảng 3.1 Nồng độ của một số mẫu ADN tổng số 31

Bảng 3.2 Số băng có kích thước lớn hơn băng thường trên mẫu 38

Bảng 3.3 Độ di động của các băng của marker trong điện di 39

Bảng 3.4 Kích thước các đột biến FLT3-ITD 40

Bảng 3.5 Trình tự đột biến các đột biến FLT3-ITD 41

Bảng 3.6 Mức độ đột biến trên mẫu (%) 44

Hình 1.1 Sự phát sinh các loại tế bào máu 9

Hình 1.2 Phân loại bệnh ung thư máu theo tế bào học

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử protein FLT3 26

Hình 2.1 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 27

Hình 3.1 Ảnh điện di ADN tổng số sau khi tách 36

Hình 3.2 Quy trình phát hiện đột biến gen FLT3-ITD 37

Hình 3.3 Điện di sản phẩm PCR một số mẫu máu 38

Hình 3.4 Điện di một số mẫu chứa đột biến FLT3-ITD 39

Hình 3.5 Điện di sản phẩm ADN tinh sạch từ gel 40

Hình 3.6 Kiểm tra ADN trong khuẩn lạc bằng PCR 44

Hình 3.7 Đường chuẩn xác định kích thước băng điện di 45

Hình 3.8 Trình tự protein của một số mẫu đột biến 46

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu,

chữ viết

tắt

Chữ viết đầy đủ Nội dung đầy đủ

ALL Acute Lymphoid Leukemia Bạch cầu cấp dòng lympho

AML Acute Myeloid Leukemia Bạch cầu cấp dòng tủy

AML-NK Acute Myeloid Leukemia -

normal karyotype

Bạch cầu cấp dòng tủy – kiểu hình NST bình thường ATP Adenosine triphosphate Phân tử ATP

ATRA All-trans retinoic acid Axit all-trans retinoic

BAALC Brain and Acute

Leukemia,Cytoplasmic Tên gen CBF Core binding factor Yếu tố bám

CEBPA CCAAT-enhancer binding

protein α Protein bám vào trình tự tăng cường CCAAT αCLL Chronic Lymphoid Leukemia Bạch cầu mãn dòng lympho

CML-BC Chronic Myelogenous

Leukemia in Blastic Crisis

Bệnh mãn tính dòng tủy trong

thời kì phát bệnh

ERG V-Ets Avian Erythroblastosis

FAB French-American-British Hệ thống phân loại bệnh bạch

cầu Pháp-Mỹ-Anh FDA Food & Drug Administration Cục Quản lý thực phẩm và Dược

phẩm Mỹ FLK2 Fetal liver kinase 2 Tên enzyme

FLT3 Fms-like tyrosine kinase 3 Tên enzyme

IDH Enzyme isocitrate

dehydrogenase Tên enzyme ITD Internal tandem duplication Lặp đoạn ngẫu nhiên nội phân tử

MM Multiple Myeloma Bệnh ung thư đa dòng tủy xương

NPM1 Nucleophosmin 1 Tên gen

PCR Polymerase Chain Reaction Chuỗi phản ứng polymerase

RFLP Restriction fragment length

TKD Tyrosine kinase domain Cấu trúc tyrosine kinase

TKIs Tyrosine Kinase Inhibitor Các chất ức chế kinase Tyrosine

TM Transmembrane Vùng xuyên màng

WHO World health organization Tổ chức y tế thế giới

MỞ ĐẦU

Hiện nay, di truyền học nghiên cứu về các đặc điểm sinh học ở cấp độ phân

tử (gen và hệ gen) ngày càng được xem một tiêu chuẩn quan trọng trong chẩn đoán

và tiên lượng các loại bệnh, trong đó có bệnh ung thư bạch cầu Ung thư bạch cầu được chia làm 4 loại tùy theo tính chất cấp tính hay mạn tính và phân loại tế bào dòng tủy hay dòng lympho Và theo thống kê trên thế giới, ung thư bạch cầu cấp dòng tủy (AML) là loại có mức độ phổ biến cao và bộc phát nhanh nên được quan tâm nhất Các bác sĩ thường tiến hành các xét nghiệm di truyền đối với bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy, nhằm quyết định phác đồ điều trị đặc hiệu cho người bệnh để đạt được kết quả tốt nhất Hầu hết bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy đạt tỉ lệ lui bệnh 100% sau một đợt điều trị tấn công, 75- 80% lui bệnh hoàn toàn trên 5 năm và phần nhiều trong số đó có thể coi là đã được chữa khỏi

Ung thư bạch cầu cấp dòng tủy có đặc điểm là các tế bào tăng sinh không kiểm soát, chưa biệt hoá, gọi là tế bào non, cùng với các đặc điểm tế bào dòng tuỷ

Tỷ lệ mắc là 1/150.000 trong suốt thời kỳ niên thiếu và dậy thì Thống kê cho thấy , mỗi năm số bê ̣nh nhân vào Viê ̣n Huyết h ọc Truyền máu trung ương đều gia tăng , và trong tổng số bê ̣nh nhân bi ̣ ung thư máu có tới 2/3 bê ̣nh nhân ung thư ba ̣ch cầu cấp dòng tủy Hầu hết các trường hợp này đều không có nguyên nhân rõ ràng Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã chỉ ra mối liên quan giữa tỷ lệ mắc bệnh và các yếu tố liên quan như nhiễm phóng xạ, tiếp xúc với hóa chất, hoặc kèm theo mắc các bệnh khác như thiếu máu Fanconi hay hội chứng Down Ngoài ra, ung thư bạch cầu cấp dòng tủy phát sinh do các thay đổi bất thường (đột biến) trong tế bào gốc tạo bạch cầu gây ra trong đời sống của một cá thể, làm rối loạn quá trình sản sinh bạch cầu, tạo ra nhiều tế bào bạch cầu bất thường, dẫn đến mất chức năng bảo vệ cơ thể Nếu không được chẩn đoán, điều trị kịp thời và hiệu quả, bệnh nhân AML có thể tử vong

do bị nhiễm trùng, chảy máu, thiếu máu

Những bệnh nhân đã phát hiện ra bệnh ung thư bạch cầu cấp thường sẽ được điều trị ngay, nhằm tiêu diệt các tế bào bạch cầu ác tính và để tuỷ xương phục hồi

trở lại bình thường Điều trị hoá chất là phương thức điều trị chính đối với bệnh ung thư bạch cầu cấp Thông thường, sự kết hợp giữa các thuốc hoá chất (các thuốc steroid) được sử dụng theo một kế hoạch điều trị (thường được gọi là một phác đồ) Điều trị hóa chất được chia làm nhiều giai đoạn: điều trị tấn công, điều trị dự phòng thâm nhiễm hệ thần kinh trung ương, điều trị duy trì Ngoài điều trị bằng hóa chất, bệnh nhân AML có thể được điều trị theo một số phương pháp khác: ghép tuỷ xương, tia xạ khối u

Yếu tố tiên lượng là yếu tố quan trọng nhất để xây dựng các phác đồ điều trị trên các bệnh nhân có kết quả di truyền tế bào bình thường Một số yếu tố tiên lượng tốt là các biến đổi ở mức độ phân tử (gen và ADN) thường xuyên xuất hiện ở các bệnh nhân leukemia cấp dòng tủy, như: đột biến gen NPM1 và gen CEBPA Tuy nhiên, sự có mặt của đột biến nhân đoạn của gen FLT3 là một yếu tố tiên lượng xấu

Chẩn đoán chính xác đột biến gây bệnh là công đoạn mang tính chất quyết định trong việc đưa ra tiên lượng và phác đồ điều trị cho bệnh nhân Đối với bệnh nhân AML, điều này góp phần quan trọng để tăng hiệu quả chữa bệnh cũng như khả năng sống sót Các đột biến gen thường gặp ở bệnh nhân AML đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới, nhưng ở Việt Nam hiện vẫn chưa có một nghiên cứu nàothống

kê đầy đủ về loại đột biến cũng như tỉ lệ đột biến, và nghiên cứu các đặc điểm phân

tử của các đột biến này Đây là một thiếu sót lớn trong việc đưa ra phương pháp điều trị chính xác và kịp thời nhất Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên

cứu tập trung vào đột biến trên gen FLT3 có tên:“Sàng lọc và phân tích đặc điểm

phân tử các đột biến FLT3 xuất hiện trên bệnh nhân mắc bệnh ung thƣ bạch cầu cấp dòng tủy ở Việt Nam”với các mục tiêu:

1 Thiết lập quy trình sàng lọc các đột biến FLT3-ITD trên bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy

2 Bước đầu ứng dụng quy trình đã xây dựng để sàng lọc các đột biến FLT3-ITD trên bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy trong quy mô phòng thí nghiệm

3 Phân tích các đặc điểm phân tử của các đột biến FLT3-ITD tìm được

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy (Acute Myeloid Leukemia-AML)

Tất cả các tế bào máu do tuỷ xương tạo ra, bao gồm:hồng cầu: mang oxy đi khắp cơ thể; bạch cầu: chống lại các vi sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể, bảo vệ cơ thể khỏi các bệnh nhiễm trùng; tiểu cầu: giúp hình thành cục máu đông trong quá trình đông máu Có nhiều loại bạch cầu xuất phát từ hai dòng tế bào khác nhau: dòng tế bào lympho (T và B) và dòng tuỷ (bạch cầu đơn nhân, ưa axit, ưa kiềm và trung tính) (Hình 1.1)

Hình 1.1: Sự phát sinh các loại tế bào máu [55]

Bạch cầu có nhiệm vụ chống vi khuẩn, protein lạ xâm nhập vào cơ thể, tạo khả năng miễn dịch của cơ thể đối với nhiều bệnh do virus và vi khuẩn gây nên Bình thường, các tế bào bạch cầu tự sửa chữa và tái sinh theo con đường được kiểm soát [55] Tuy nhiên, trong một số trường hợp quá trình này thoát khỏi sự kiểm soát

và các tế bào tiếp tục phân chia, nhưng không trưởng thành, chiếm đầy trong tuỷ xương và ngăn cản sự tạo ra các tế bào máu khoẻ mạnh Nguy hiểm hơn là, các tế bào bạch cầu ác tính không trưởng thành, không thực hiện được chức năng bình

thường của chúng, dẫn tới nguy cơ nhiễm khuẩn tăng Hơn nữa, tuỷ xương không sản xuất đủ hồng cầu và tiểu cầu khoẻ mạnh, hậu quả là xuất hiện các triệu chứng như thiếu máu và ban đỏ Bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy là một trong bốn loại ung thư bạch cầu Đây là một bệnh lý của tủy xương, do sự chuyển dạng bất thường của tế bào nguồn tạo máu, từ đó đưa đến các dòng tế bào không biệt hóa hay biệt hóa bất thường Mỗi loại bệnh ung thư bạch cầu có đặc trưng và cách điều trị riêng[49]

Vậy thì nguyên nhân của bệnh ung thư bạch cầu là gì? Cho đến nay, nguyên nhân chính xác của các bệnh ung thư bạch cầu vẫn chưa được khẳng định rõ ràng, đầy đủ Các nhà nghiên cứu đang cố gắng tìm ra nguyên nhân có khả năng gây ra bệnh này Một số nghiên cứu về AML tập trung vào việc tìm hiểu về trẻ em mắc các rối loạn di truyền, như hội chứng Down, được cho rằng có nguy cơ phát triển thành bệnh ung thư bạch cầu cao Nguy cơ này cũng tăng nhẹ đối với anh chị em của những bệnh nhân AML, mặc dù nguy cơ này vẫn còn ít Trong những năm gần đây, một số công bố cho thấy các trẻ em sống ở gần các nhà máy hạt nhân hơn hoặc ở gần các đường điện cao thế có nguy cơ mắc bệnh AML cao hơn, tuy nhiên, chưa có bằng chứng xác thực nào[34], [44]

Đặc trưng về mặt dịch tễ của bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy là giống như các loại ung thư khác, không lây nhiễm và không thể truyền sang cho người khác được Khi các tế bào bạch cầu ác tính nhân lên trong tuỷ xương, sự sản xuất các tế bào máu giảm Do đó bệnh nhân có thể có một số triệu chứng sau: mệt mỏi

và khó chịu do thiếu máu, trên cơ thể xuất hiện các vết thâm tím và chảy máu kéo dài do thiếu tiểu cầu trong máu Đôi khi, bệnh nhân bị nhiễm khuẩn vì số lượng bạch cầu bình thường thấp Một số bệnh nhân có các cơn đau ở các chi hoặc có thể sưng hạch lympho Đầu tiên, các triệu chứng của bệnh giống như các triệu chứng của bệnh cúm, nhưng khi bệnh kéo dài hơn 1 hoặc 2 tuần thì có thể chẩn đoán rõ ràng Sau khi các xét nghiệm di truyền được thực hiện, bệnh nhân nên được điều trị hoá chất ngay, nhằm tiêu diệt tế bào non trong tuỷ xương để đẩy lui bệnh ngay sau đợt điều trị tấn công đầu tiên này Tiếp theo, bác sĩ có thể đánh giá lại tiên lượng và

quyết định thay đổi liều lượng hay số liệu trình điều trị, hoặc chuyển sang phương pháp ghép tuỷ xương [2], [4]

1.1.1 Thực trạng bệnh ung thƣ bạch cầu cấp dòng tủy và tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu trên thế giới

Hiện nay, tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp, trong đó có bạch cầu cấp dòng tủy ngày càng tăng cao Hơn nữa, tỷ lệ tử vong do chưa có phương thức chẩn đoán và điều trị kịp thời cũng rất lớn Vì vậy, nhiều nhà khoa học đã tiến hành các nghiên cứu nhằm tìm ra các phương pháp chẩn đoán, phân biệt các loại bệnh ung thư bạch cầu dựa trên đặc điểm di truyền học nhằm có sự chẩn đoán chính xác, giúp điều trị hướng đích hiệu quả hơn

Các nhà nghiên cứu đã xác định sự thay đổi trong vật chất di truyền của người bệnh có hai cấp độ là: đột biến nhiễm sắc thể và đột biến gen Khoảng 55% bệnh nhân AML có đột biến nhiễm sắc thể, được tìm thấy khi quan sát tiêu bản tế bào (karyotyping) Tuy nhiên, 45% bệnh nhân AML còn lại lại có kiểu hình NST bình thường (AML-NK) không thể phát hiện được (Hình 1.2) [2], [3] Từ đó, nhiều nghiên cứu đã chuyển hướng nhằm phát hiện ra các đột biến gen trên các gen khác nhau ở bệnh nhân AML Trong đó, hơn 80% các đột biến gen được tìm thấy ở bệnh nhân mắc AML-NK là đột biến trên 3 gen nucleophosmin 1 (NPM1), Fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3) và CCAAT-enhancer binding protein alpha (CEBPA)[5], [7], [9]

Hình 1.2: Phân loại bệnh ung thƣ máu theo tế bào học (WHO2008) [2]

Đột biến trên gen NPM1 chiếm tỉ lệ lớn nhất, tới 45% các trường hợp

AML-NK (Hình 3)[15] NPM1 mã hóa cho một protein vận chuyển giữa nhân và tế bào chất, tham gia điều hòa quá trình ức chế khối u theo con đườ ng ARF -p53[14] Protein này còn liên quan đến sự hình thành phức hê ̣ ribosome và các quá trình vâ ̣n

chuyển trong tế bào Hai loại đột biến phổ biến nhất đối với NPM1 là đột biến chèn đoạn lặp YWTG (75-80%) và đột biến mất đoạn GGAGG (ở vị trí Nucleotide 965-969) kèm theo chèn đoạn dài 9 nucleotide (10-15% các trường hợp)[14], [29], [41]

Cả hai loại đột biến đều dẫn đến sự thay đổi khung đọ c protein khiến mô ̣t gốc

tryptophan liên quan đến tín hiê ̣u đi ̣nh vi ̣ trong nhân tế bào bi ̣ thay thế Những đột biến này gây ra sự tích lũy khác thường của sản phẩm protein trong tế bào chất thay

vì trong nhân tế bào Cả hai loại đột biến này đều tạo ra đoạn chênh lệch có độ dài 4 nucleotide so với cá thể không mang đột biến[14]

Đột biến gen FLT3 xuất hiện ở khoảng 25% tổng số bệnh nhân mắc AML với kiểu hình nhiễm sắc thể bình thường, gây ra hậu quả là enzyme tyrosine kinase này luôn luôn ở trạng thái hoạt động mà không cần sự kết hợp của các đơn phân thành dimer (dimerization), dẫn đến rối loạn quá trình phát triển và biệt hóa tế bào máu[8] Các nhóm nghiên cứu FLT3 phát hiện ra hai kiểu đột biến thường gặp nhất trên gen này: lặp đoạn nội phân tử ngẫu nhiên, ITD (internal tandem duplication) và đột biến điểm gây thay thế acid amino aspartic ở vị trí 835 thuộc vùng tyrosine kinase, TKD (D835, tyrosine kinase domain)[12], [19], [30] Tỷ lệ đột biến được tìm thấy trong các nghiên cứu rất khác nhau Chẳng hạn trong nghiên cứu của

Kiểu hình NST bình thường 45%

Kiểu hình NST bất thường 55%

Gilliland và cộng sự năm 2002[19], tỷ lệ bệnh nhân AML chứa đột biến gen ITD là 30%, còn trong nghiên cứu khác của Christine Steudel[47], tỷ lệ này là 19,2%, hay trong nghiên cứu của Yamamoto và cộng sự[54], tỷ lệ này là 7% Thêm nữa, các đặc điểm khác của đột biến như vị trí, kích thước, trình tự đột biến, mức độ đột biến chưa có một kết quả thống nhất Các kết quả trên cho thấy các đặc điểm của đột biến phụ thuộc vào mẫu nghiên cứu (lượng mẫu, khu vực thu mẫu)

FLT3-Đột biến trên gen CEBPA được nhóm tác giả Lin và cộng sự[31] nghiên cứu

và xác định tỉ lệ là 15% ở các bệnh nhân AML châu Á, còn theo những nghiên cứu tiến hành đối với đối tượng bệnh nhân ở các nước phương Tây thì tỷ lệ này là 10%[20] Hai loại đột biến thường gặp nhất, xảy ra trong khoảng 40-45% tổng số người bệnh có đột biến, nằm trong vùng liên kết với DNA đầu C (C-terminal DNA binding domain, bZIP) và vùng hoạt hóa đầu N (N-terminal transactivation domain, TAD) Gen CEBPA mã hóa cho một protein tham gia phiên mã từ đó kiểm soát quá trình biệt hóa tế bào, do đó các đột biến trên gen CEBPA gây ra những biến đổi bất thường trong quá trình này[7]

Các nghiên cứu trên thế giới về đột biến gen trên bệnh nhân AML chủ yếu sử dụng phương pháp PCR và điện di kiểm tra chênh lệch kích thước, để phát hiện những đột biến trên gen thay đổi về độ dài đoạn DNA, đột biến lặp đoạn[26], [27], [37], [38] Ngoài ra, có một số phương pháp khác cũng được sử dụng là cắt enzyem giới hạn, giải trình tự để xác định chính xác nucleotide bị thay đổi trong trường hợp đột biến điểm[6]

Hình 1.3: Tỷ lệ đột biến của một số gen gây bệnh ung thƣ bạch cầu cấp

(WHO, 2008)[53]

Ngoài ra, một số nghiên cứu khác còn phát hiện một số đột biến trên các gen khác như MLL (Mixed lineage leukemia, mã hóa cho một enzyme histone methyltransferase tham gia quá trình sản sinh tế bào máu) hay IDH (mã hóa cho enzyme isocitrate dehydrogenase)[32].Nghiên cứu của tác giả Christine Steudel năm 2003, phân tích đột biến MLL và FLT3-ITD trên 956 bệnh nhân AML trưởng thành bằng kỹ thuật realtime-PCR đã xác định được 5,0% bệnh nhân chứa đột biến MLL, và 19,2% bệnh nhân chứa đột biến FLT3-ITD[47] Nhưng điểm đáng chú ý là

tỷ lệ bệnh nhân AML mang đột biến MLL trong số bệnh nhân AML mang đột biến FLT3-ITD là 8,7%, cao hơn gấp đôi tỷ lệ đó trong số bệnh nhân AML không mang đột biến FLT3-ITD (4,1%) Gần đây, Marccuci và cộng sự [35]nghiên cứu trên 129 bệnh nhân AML, cho thấy rằng có 16,0% bệnh nhân AML xuất hiện đột biến IDH, trong đó 7,6% là IDH1 và 8,7% là IDH2 Trong một nghiên cứu khác, đột biến gene tiền ung thư KIT tại exon 8 nằm ở phần bên ngoài tế bào của thụ thể[24], hoặc tại codon 816 của AL trên vùng TKD gặp trong khoảng 25% trường hợp bạch cầu cấp dòng tủy có yếu tố gắn lõi (CBF: core binding factor) Ung thư bạch cầu cấp dòng tủy có yếu tố gắn lõi được định nghĩa bằng sự hiện diện của chuyển đoạn t(8;21)(q22;q22) hoặc inv(16)(p13q22), t(16;16)(p13;q22) về mặt di truyền[53]

Những nghiên cứu trên cho thấy rằng các đột biến gen gây bệnh AML thường xảy ra theo nhóm trên một tổ hợp gen Chính vì vậy, việc nghiên cứu, tìm ra các loại đột biến xuất hiện trong hệ gen của người bệnh có ý nghĩa quan trọng trong việc hỗ trợ công đoạn tiên lượng bệnh chính xác, từ đó đưa ra phương thức điều trị phù hợp, hiệu quả[48], [50]

1.1.1.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh AML cũng ngày càng tăng, thêm vào đó công tác chuẩn đoán trong y học chưa phát triển khiến cho nhiều bệnh nhân phải chịu những hậu quả đáng tiếc Đây là niềm trăn trở của các nhà khoa học trong nước

hiện nay Kế thừa các nghiên cứu khoa học về lĩnh vực này trên thế giới, ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu đi sâu về bệnh ung thư bạch cầu ứng dụng các phương pháp di truyền hiện đại

Năm 2005, nhóm tác giả Trần Thái Bình và Lâm Thi ̣ Mỹ đã nghiên c ứu trên

189 bệnh nhân là trẻ em, mắc bệnh ung thư bạch cầu cấp (bao gồm cả AML và

ALL) trong đó có gần 30% trẻ được chẩn đoán là AML [2] Nghiên cứu đưa ra so sánh giá trị của phương pháp hình thái ho ̣c – hóa tế bào với phương pháp dấu ấn

miễn di ̣ch Các tác giả k ết luận : phương pháp hình thái học – hóa tế bào dễ thực hiện, đơn giản, ít tốn kém và cho kết quả nhanh chóng nên vẫn có giá tri ̣ cao đối với điều kiê ̣n thực tế Viê ̣t Nam [2], [3]

Tuy nhiên, phương pháp dấu ấn miễn di ̣ch là “tiêu chuẩn và ng” trong chẩn đoán Kết quả về khả năng chẩn đoán đạt được khi sử dụng phương pháp hình thái học và phương pháp tế bào trong chẩn đoán bệnh ung thư bạch cầu cấp thể hiện trong bảng 1.1 cho thấy hai phương pháp cũ này chỉ đạt độ chính xác cao khi kết hợp với nhau Ví dụ như, đối với bệnh nhân AML, khả năng chẩn đoán chính xác khi sử dụng phương pháp hình thái học là 91,67%, sử dụng phương pháp hóa tế bào là 80%, còn khi kết hợp cả 2 phương pháp thì khả năng chẩn đoán chính xác là 100% [2]

Bảng 1.1: Giá trị của phương pháp hình thái học và phương pháp hoá tế bào trong chẩn đoán phân dòng bệnh ung thư bạch cầu cấp [2]

Phương pháp hình thái học Khả năng chẩn

Tác giả đã lựa chọn phương pháp dấu ấn miễn di ̣ ch cho công tác chẩn đoán

và chứng minh phương pháp này phát huy tính chính xác cao hơn nhiều so với hai phương pháp cũ Sự khác biệt lớn giữa kết quả hình thái học và dấu ấn miễn dịch cụ thể như sau: 8 trường hợp M0 (6,84%) và 3 trường hợp M7 (2,56%) trong khi hình thái học không phát hiện được nhưng đã được tìm ra nhờ phương pháp dấu ấn miễn dịch Và đặc biệt là có 58 trường hợp hình thái học chẩn đoán AML nhưng không

rõ phân loại type, và 9 trường hợp phức tạp không phân định được AML hay ALL, tất cả những trường hợp này đều được làm rõ bằng dấu ấn miễn dịch [3]

Tuy nhiên, các nghiên c ứu về bệnh ở trong nước dựa trên các phương pháp chẩn đoán ung thư máu truyền thống như kiểm tra lâm sàng, quan sát hình thái, hóa tế bào hay xác đi ̣nh dấu ấn miễn di ̣ch không thể chỉ ra những thay đổi trên DNA [1]

Đây là một hạn chế không chỉ với công tác chẩn đoán mà còn ảnh hưởng tới việc tiên lượng và xây dựng phác đồ điều trị Bệnh nhân AML mang các đột biến khác nhau sẽ phản ứng khác nhau với các phương pháp trị liệu (phóng xạ hay hóa chất, loại thuốc sử dụng) Chính vì vậy, chẩn đoán nhanh và chính xác là yếu tố có tính chất quyết định đối với việc xây dựng phác đồ điều trị kịp thời, hiệu quả, tăng khả năng sống sót của người bệnh Yêu cầu chẩn đoán phân tử là tối cần thiết vì thế giới

đã thống nhất theo tiêu chuẩn WHO 2008, trong đó các tổn thương phân tử được dùng làm 1 tiêu chí xếp loại, tiên lượng bệnh, cũng như dùng làm chỉ thị đánh giá hiệu quả điều trị bệnh khi sử dụng phác đồ điều trị nhắm đích[52], [53]

Gầy đây, trong Hô ̣i nghi ̣ Sinh ho ̣c Phân tử ở Đa ̣i ho ̣c Y Hà Nô ̣i, tác giả Kiều Thị Vân A nh và cô ̣ng sự [1], đã báo cáo về nghiên cứu sử du ̣ng phương pháp PCR

để xác định chính xác đột biến gen gây bệnh AML trên hai gen là NPM 1 và FLT3 Tuy kích thước mẫu nhỏ (36 bê ̣nh nhân ), nhưng nhóm nghiên cứu đã có những

thành công bước đầu Nghiên cứu cho thấy, phản ứng chuỗi polymerase phối hợp với phản ứng cắt enzyme giới hạn có những ưu điểm sau: đơn giản, hiệu quả cao, chi phí thấp [1] Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam chưa có một quy trình nào được ứng dụng rộng rãi ở các cơ sở y tế để phát hiện các đột biến gen thường gặp ở các bệnh nhân AML có kiểu hình nhiễm sắc thể bình thường

Mới đây nhất, tại đại học Y dược Hồ Chí Minh, tác giả Phan Nguyễn Thanh Vân đã bảo vệ thành công luận án tiến sĩ với đề tài “Ứng dụng kĩ thuật khuếch đại gen khảo sát các tổ hợp gen thường gặp trong bệnh bạch cầu cấp” [4] Theo đó, sau khi chẩn đoán xác định bạch cầu cấp dòng tủy hay bạch cầu cấp dòng lympho, chúng ta nên sử dụng RT-PCR trong xác định các tổ hợp gen thường gặp trong bạch cầu cấp dòng tủy (AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9) Xét nghiệm này nên được thực hiện thường qui ở các bệnh viện chuyên khoa huyết học,

là cơ sở để phân nhóm tiên lượng và lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp Phương pháp này có ưu điểm là thời gian ngắn, độ chính xác cao [4]

Dựa trên các kết quả của các nghiên cứu trên, đề tài tập trung nghiên cứu và phân tích đặc điểm sinh học của các đột biến gây bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng

tủy trên gen FLT3 Từ đó, làm tiền đề cho các nghiên cứu về sự liên quan giữa đột biến trên gen này và sự biểu hiện của người bệnh, góp phần có những phương pháp điều trị cho phù hợp đối với các bệnh nhân mắc bệnh ung thư bạch cầu cấp tính

dòng tủy

1.1.2 Phân loại các thể bệnh ung thƣ bạch cầu cấp dòng tủy

Theo WHO năm 2008, bệnh ung thư bạch cầu được chia làm bốn loại chính: bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy (AML), bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng lympho (ALL), bệnh ung thư bạch cầu mãn tính dòng lympho (CLL),bệnh ung thư bạch cầu mãn tính dòng tủy (CML) Bệnh CLL và ALL thường gặp hơn ở người lớn, còn bệnh bạch cầu ở trẻ em thường là bệnh AML và CML [53], [55], [56]

Đối với bệnh AML, có hai hệ thống phân loại các nhóm phụ (subtype) đang được sử dụng rộng rãi hiện nay, đó là hê ̣ thống phân lo ại của Pháp-Mỹ-Anh (FAB)

và hê ̣ thống của Tổ chức Y tế thế giới (WHO)[53]

Theo hệ thống phân loại FAB, bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy được chia thành 8 nhóm phụ: M0 (bệnh bạch cầu dòng tuỷ cấp tính với bằng chứng biệt hoá dòng tuỷ tối thiểu); M1 (immature myeloblastic - bệnh bạch cầu nguyên bào tuỷ cấp tính không trưởng thành; M2 (mature myeloblastic - bệnh bạch cầu nguyên bào tuỷ cấp tínhcó trưởng thành; M3 promyelocytic: bệnh bạch cầu tiền tế bào tuỷ cấp tính); M4 (myelomonocytic - bệnh bạch cầu tế bào đơn nhân dòng tuỷ cấp tính); M5 (monocytic- bệnh bạch cầu nguyên bào đơn nhân/tế bào đơn nhân cấp tính); M6 (erythrokemia - bệnh bạch cầu hồng cầu cấp tính); M7 (megakaryocytic - bệnh bạch cầu nguyên mẫu tiểu cầu) Hệ thống phân loại này được sử dụng phổ biến vì cách phân loại dựa trên hình thái tế bào, đơn giản, dễ xác định Tuy nhiên, còn nhiều hạn chế vì mang tính chất chủ quan, có những trường hợp bệnh nhân không biểu hiện rõ ràng nên không thể phân loại được [2], [52]

Theo WHO,năm 2008, bệnh AML được phân loại dựa trên một số tiêu chí: tỉ

lệ các tế bào blast (tế bào máu chưa trưởng thành); hình thái học tế bào; di truyền học tế bào; di truyền học phân tử; dấu ấn miễn dịch Ví dụ như dựa vào mức độ tế

bào blast, 20% blast trong tủy xương hoặc trong máu được coi là ngưỡng cho chẩn đoán Còn dựa vào di truyền học tế bào có thể xác định bệnh AML theo những đột biến t(8;21)(q22;q22), inv(16)(p13.1q22) hoặc t(16;16)(p13.1;q22) trong các trường hợp khi mức độ blast chưa đạt ngưỡng[53]

1.1.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh AML

Sự chẩn đoán của bệnh máu ác tính được dựa trên hình thái học, mô bệnh học, sự biểu hiện của kháng nguyên khác nhau của tế bào bạch cầu, và phân lọaị Pháp – Mỹ - Anh (FAB) Những yếu tố dùng để tiên lượng bệnh bao gồm: dấu hiệu lâm sàng, tuổi, số lượng bạch cầu lúc chẩn đoán, những dấu ấn miễn dịch, các yếu

tố di truyền, trong đó phân tích nhiễm sắc thể từ tuỷ xương là một yếu tố quan trọng trong lựa chọn phác đồ điều trị và tiên lượng bệnh [2]

Đầu tiên, bệnh nhân sẽ được các bác sỹ sẽ thực hiện thăm khám lâm sàng, các bác sỹ có thể phát hiện được hạch sưng to, gan-lách to Khi đó, các bác sỹ sẽ yêu cầu làm thêm xét nghiệm công thức máu nhằm kiểm tra số lượng các tế bào máu và thành phần các loại bạch cầu Khi mắc bệnh bạch cầu, số lượng bạch cầu tăng cao, giảm số lượng tiểu cầu, lượng Hemoglobin giảm thấp

Sinh thiết chẩn đoán là phương pháp lấy một mảnh mô trong tủy xương để soi dưới kính hiển vi tìm tế bào máu ác tính Sinh thiết là biện pháp duy nhất giúp chẩn đoán xác định tế bào ác tính trong tủy xương Có hai cách lấy tủy xương: chọc hút tủy bằng cách sử dụng kim nhỏ và có lỗ để chọc vào xương, hút lấy một ít tủy xương; sinh thiết tủy bằng cách sử dụng kim lớn hơn để lấy một mảnh tủy xương Ngoài ra, tùy thuộc triệu chứng và thể bệnh mà bác sỹ cho làm một số xét nghiệm như: xét nghiệm gen nhằm xác định nhiễm sắc thể bất thường Philadelphia trong bệnh bạch cầu dòng tủy mãn tính; xét nghiệm dịch tủy nhằm xác định sự xuất hiện

tế bào bạch cầu bất thường trong máu; hay chụp X quang nhằm phát hiện hạch to trong ổ bụng hoặc các vị trí khác [55]

Hiện nay, hệ thống xác định nguy cơ cho bệnh nhân ung thư bạch cầu, dựa vào các dấu hiệu di truyền tế bào, giúp đưa ra tiên lượng tốt, trung bình hay xấu

Những bệnh nhân mang đột biến chuyển đoạn t(15; 17), thường có tiên lượng rất tốt, và không cần chỉ định ghép tủy xương ở đa số trường hợp này Phần lớn các bệnh nhân có công thức nhiễm sắc thể bình thường, thuộc nhóm có tiên lượng trung bình Nhóm bệnh nhân này thường không đáp ứng với phác đồ điều trị hoá chất thông thường cũng như phác đồ điều trị tăng cường, đòi hỏi phải điều trị ghép tuỷ Điều này có thể do tính đa dạng về cấu trúc phân tử của bệnh nhân Trong vòng mười năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra sự xuất hiện của các đột biến đặc hiệu hoặc thay đổi sự biểu hiện của một gene nào đó là yếu tố trực tiếp tác động lên tiên lượng của bệnh nhân Mặc dù phần lớn những nghiên cứu này tiến hành trên đối tượng người lớn, nhưng một vài nghiên cứu trong số đó cũng ghi nhận những đặc điểm đó trên đối tượng là trẻ em Mẫu bệnh phẩm dùng trong xét nghiệm di truyền là máu ngoại vi và tuỷ xương, với các phương pháp di truyền hiện đại như lai miễn dịch huỳnh quang tại chỗ (FISH) hay PCR [2], [3]

Một số yếu tố tiên lượng quan trọng khác cũng được khuyến cáo, đặc biệt những trường hợp có chuyển đoạn giữa NST 8 và 21 t (8; 21), đảo đoạn nhiễm sắc thể 16 ivr (16), chúng thường kết hợp với những đột biến gen kể trên, làm thay đổi tiên lượng[25], [34] Mặt khác những bệnh nhân này thường hay có đột biến ở gene KIT[11], [24] Trong những nghiên cứu gần đây về việc xây dựng tiêu chuẩn về các bất thường di truyền trong tiên lượng bệnh nhân, đã chứng minh rằng sự xuất hiện đột biến trên gene KIT có liên quan đến khả năng bệnh nhân bị tái phát[11] Tuy nhiên, các nghiên cứu này mới chỉ tiến hành trên người lớn, và cần thực hiện những nghiên cứu xa hơn trên trẻ em

1.1.4 Hướng điều trị đối với người bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy

Có nhiều biện pháp điều trị khác nhau đối với bệnh ung thư bạch cầu như: theo dõi-chờ đợi, hóa trị liệu, điều trị đích, điều trị sinh học, xạ trị, ghép tế bào gốc hoặc phẫu thuật cắt bỏ khối u Có thể phối hợp nhiều biện pháp điều trị Sự lựa chọn biện pháp điều trị tùy thuộc chủ yếu vào: thể bệnh, tuổi của người bệnh, sự xuất hiện tế bào bạch cầu trong tủy Riêng đối với các bệnh nhân bị bạch cầu cấp tính

cần được điều trị ngay với mục đích giảm các triệu chứng của bệnh để đạt hiệu quả lui bệnh[39] Sau khi đạt lui bệnh, một số biện pháp được tiến hành nhằm ngăn chặn

sự tái phát của bệnh Với bệnh bạch cầu mạn tính không có triệu chứng, điều trị có thể được trì hoãn với sự theo dõi của bác sỹ và tiến hành điều trị khi các triệu chứng xảy ra Điều trị giúp kiểm soát bệnh và các triệu chứng Bệnh nhân có thể được điều trị duy trì để tránh tái phát nhưng với phác đồ hóa trị liệu thông thường, rất ít bệnh nhân khỏi bệnh, tuy nhiên ghép tủy có thể mang lại hy vọng điều trị khỏi đối với bệnh bạch cầu mãn tính[50]

1.1.4.1 Hóa trị

Một số bệnh nhân được điều trị hóa chất giúp tiêu diệt tế bào ung thư Tùy thuộc từng thể bệnh mà bác sỹ cho người bệnh dùng đơn hóa chất hoặc phối hợp đa hóa chất Có nhiều con đường đưa hóa chất vào cơ thể khác nhau: đường uống; đường tĩnh mạch; đường tủy sống; hoặc đường não (Một số hóa chất không thể vượt qua hàng rào máu não nên sau khi truyền tĩnh mạch thuốc không thể theo máu đến não được Vì vậy, thông qua ống thông tĩnh mạch trung tâm (catheter Ommaya), người ta đưa thuốc trực tiếp vào hộp sọ) [55]

Hóa chất được điều trị theo chu kỳ với khoảng thời gian dùng thuốc và khoảng nghỉ Hóa chất giúp tiêu diệt tế bào ung thư và giảm các triệu chứng nhưng cũng có thể gây nên tổn thương các tổ chức lành, đặc biệt các tổ chức có tế bào phân chia nhanh như tế bào máu, tế bào chân tóc, tế bào đường tiêu hóa, buồng trứng và tinh trùng Khi đó người bệnh được bác sỹ theo dõi và điều trị hỗ trợ Trị liệu bằng hóa chất có thể gây nên một số hậu quả không mong muốn như làm giảm các tế bào máu lành tính, tăng nguy cơ bị nhiễm khuẩn, chảy máu, mệt mỏi do thiếu hồng cầu Các bác sỹ sẽ truyền máu cho người bệnh nếu thấy thiếu máu nặng Về biểu hiện bên ngoài, hóa trị liệu sẽ gây rụng tóc, sau khi ngừng điều trị, tóc mọc trở lại nhưng kiểu tóc và màu tóc có thể thay đổi Hóa trị liệu gây mất cảm giác ngon miệng, buồn nôn, nôn, ỉa chảy, đau họng miệng,khi đó có thể sử dụng số thuốc giúp

giảm các triệu chứng này Một số hóa chất gây vô sinh do làm tổn thương tinh trùng

và trứng Vì vậy, trước khi lựa chọn hóa trị liệu, bệnh nhân cần thiết trao đổi với bác sỹ về nguyện vọng sinh đẻ sau điều trị để bác sỹ cân nhắc lựa chọn thuốc và cách bảo quản tinh trùng, trứng trong ngân hàng mô [55], [56]

1.1.4.2 Điều trị nhắm đích

Khái niệm về điều trị nhắm đích đã được các nhà khoa học đưa ra từ nhiều năm trước Vào năm 1953, Pressman và Korngold đã chứng minh rằng các kháng thể có thể nhắm đích đặc hiệu lên tế bào ung thư[42] Tuy vậy, phải tới năm 1975, khi Kohler và Milstein nhận giải thưởng Nobel cho công trình nghiên cứu của họ về

kỹ thuật hybridoma, việc sản xuất kháng thể đơn dòng nhắm đích kháng nguyên đặc hiệu mới bắt đầu trở thành hiện thực[28] Năm 1980, Nadler và cộng sự đã điều trị bệnh nhân u lymphô ác tính đầu tiên bằng kháng thể đơn dòng[39] Ngày nay, có tới trên 3000 bệnh nhân ung thư được điều trị bằng kháng thể đơn dòng Song song với các nghiên cứu theo hướng điều trị bằng kháng thể đơn dòng, phương pháp điều trị nhắm đích phân tử (molecular targeting theray) cũng được nghiên cứu và phát triển Phương pháp này được ứng dụng thành công đầu tiên trong điều trị ung thư bạch cầu bằng thuốc ức chế đặc hiệu tyrosine kinase, STI571 (signal transduction inhibitor 571)[21], [22] Như vậy, điều trị nhắm đích ngăn chặn sự phát triển của tế bào ác tính thông qua ức chế hoạt động protein bất thường làm kích thích sự phát triển của tế bào ung thư

1.1.4.3 Điều trị sinh học

Điều trị sinh học giúp kích thích sự miễn dịch tự nhiên của cơ thể chống lại

tế bào ung thư Có nhiều biện pháp điều trị sinh học khác nhau: một số gắn kết với

tế bào bạch cầu ác tính, một số vận chuyển các chất gây độc tế bào, một số khác giúp cải thiện hệ thống miễn dịch kích thích cơ thể chống lại tế bào ung thư

Điều trị ghép tế bào gốc giúp tạo điều kiện cho hóa chất liều cao thực hiện được Hóa chất liều cao giúp tiêu diệt tế bào ung thư nhưng cũng làm tổn thương tế bào lành trong tủy Vì vậy, tế bào nguồn tạo máu sẽ được tiêm vào cơ thể (giống

truyền máu) sau khi điều trị bằng hóa chất, nhờ đó các tế bào máu bình thường được phát triển từ các tế bào gốc này Có hai biện pháp ghép tế bào gốc là: ghép tế bào gốc tự thân và ghép tủy dị thân Ghép tế bào gốc tự thân là sử dụng tế bào gốc của chính mình Trước khi được điều trị hóa chất liều cao, tủy xương sẽ được lấy đi Các tế bào này có thể được điều trị để tiêu diệt các tế bào ung thư và sau đó được giữ lạnh rồi truyền lại vào cơ thể sau khi được điều trị hóa chất liều cao Đối với ghép tủy dị thân: Tế bào gốc được lấy từ tủy xương của thành viên trong gia đình hoặc từ người cho khác phù hợp với cơ thể của bệnh nhân [55], [56]

Hiện nay phương pháp điều trị bệnh ung thư máu chủ yếu vẫn là thay tủy xương của người bệnh bằng tủy xương của một người hiến phù hợp (thích hợp nhất

là người cùng huyết thống với người bệnh) để thay thế phần tủy xương đã bị hư hỏng và kích thích sinh ra hồng cầu cũng như kìm hãm sự gia tăng đột biến của bạch cầu Tuy nhiên, khả năng thành công rất thấp, chỉ khoảng 10% và khả năng bệnh tái phát cũng rất lớn (khoảng từ 3 đến 5 năm)

1.1.4.4 Gây chết tự nhiên (apotosis)

Áp dụng cơ chế gây chết tế bào tự nhiên (apoptosis) là một trong những phương pháp hữu hiệu để loại thải tế bào ung thư Nhóm nghiên cứu Bùi Thị Kim

Lý, Hoàng Thành Chí, Yuko Sato, Viện nghiên cứu, Trung tâm sức khỏe toàn cầu

và y tế quốc gia, Tokyo, Nhật Bản, Toshiki Watanabe, Trường ĐH Tokyo, Tokyo, Nhật Bản đã chứng minh rằng hợp chất chiết xuất từ trà xanh, epigalocatechin-3-gallate EGCG, dẫn xuất vitamin A all-trans retinoic acid (ATRA) và PKC412 gây apoptosis lên dòng tế bào ung thư máu AML mang đột biến gen FLT3[33]

Để đánh giá hiệu quả của sự kết hợp giữa 3 loại thuốc này, nhóm tác giả đã

sử dụng phương pháp isobologram Kết quả cho thấy sự kết hợp giữa ATRA và PKC412 có tác động siêu cộng gộp/cộng gộp trong khi đó sự kết hợp giữa ATRA

và EGCG hay giữa EGCG và PKC412 cho tác động cộng gộp/đối kháng Từ các kết quả trên cho thấy, sự kết hợp giữa ATRA và PKC412 hứa hẹn nhiều tiềm năng ứng dụng trong lâm sàng điều trị bệnh AML liên quan đến đột biến gen FLT3[23], [33], [50]

1.1.4.5 Sử dụng các chất ức chế tyrosine kinase

Trong nhiều năm qua, các chất ức chế tyrosine kinase được đưa vào một vai trò ngày càng quan trọng trong điều trị ung thư[13] Tyrosine kinase có chức năng chuyển nhóm phosphate từ một phân tử được gọi là ATP (adenosine triphosphate) cho các gốc tyrosine Có nhiều tyrosine kinase (TK) trên toàn hệ gen, hỗ trợ các chức năng trong tế bào, chẳng hạn như phân chia tế bào, cái chết, sự trưởng thành,

và di cư Trong các tế bào khối u, tất cả các phản ứng này là quan trọng đối với các khối u để tồn tại và lây lan khắp cơ thể Thông qua việc tác động vào thụ thể tyrosine kinase, các con đường truyền tín hiệu điều khiển tế bào ung thư bị gián đoạn, từ đó tiêu diệt khối u[10], [43] Các thuộc tính chống ung thư thu được thông qua việc sử dụng chất ức chế TK đã trở thành một trọng tâm quan trọng cho việc phát triển thuốc chữa bệnh ung thư bạch cầu, đặc biệt là ung thư bạch cầu cấp dòng tủy AML[17]

Trong bảng 1.2, tất cả các chất ức chế phân tử nhỏ được dùng đường uống Hầu hết các chất ức chế phân tử nhỏ trải qua quá trình trao đổi chất và tương tác theo nhiều cách khác nhau Đồng thời, đích nhắm đến của các phân tử đó là những gen đã được nghiên cứu gây ra các bệnh ung thư

Bảng 1.2 Các chất ức chế Tyrosine kinase (TKIs) đƣợc Cục Quản lý thực

phẩm và Dƣợc phẩm Mỹ (FDA) phê chuẩn

Dasatinib

(Sprycel)

BCR-ABL, họ SRC, KIT, PDGFR

c-Bệnh bạch cầu mãn tính dòng tủy, bệnh bạch cầu cấp tính lymphocytic Erlotinib

(Tarceva) EGFR

Ung thư phổi tế bào không nhỏ, ung thư

tuyến tụy Gefitinib

(Iressa) EGFR Ung thư phổi tế bào không nhỏ

Imatinib

(Gleevec)

BCR-ABL, c-KIT,

Bệnh bạch cầu lymphocytic cấp tính, bạch cầu myeloid mãn tính, khối u dạ dày-ruột

PDGFR đệm, hội chứng hypereosinophilic,

mastocytosis hệ thống Lapatinib

(Tykerb)

HER2/neu, EGFR Ung thư vú với HER2/neu quá mức Nilotinib

(Tasigna)

BCR-ABL, c-KIT, PDGFR

Giai đoạn mạn tính hoặc Ph dương tính CML tăng tốc cho các bệnh nhân kháng/

không dung nạp của điều trị bằng imatinib Sorafenib

(Nexavar)

BRAF, VEGFR, EGFR, PDGFR

Tế bào ung thư thận, ung thư biểu mô

tế bào gan Sunitinib

(Sutent)

VEGFR, PDGFR, c-KIT, FLT3

Tế bào ung thư thận, dạ dày-ruột đệm

khối u

1.2 Gen FLT3 và sự liên quan tới bệnh bạch cầu cấp dòng tủy

1.2.1 Cấu trúc và chức năng của gen FLT3

Gen FLT3 (FMS-like Tyrosine Kinase-3) còn có tên gọi là CD135, FLK2 (Fetal liver kinase 2), STK1 (Stem cell kinase 1) Gen FLT3 nằm ở NST 13 (13q12.2), bao gồm 24 exon, và kéo dài 96.982 bp (từ 27.475.753 bp đến 27.572.735 bp), phiên mã tạo ra ARN 3.700 bp, khung đọc mở có kích thước 2979

Đột biến lặp đoạn (3-400bp)

Đột biến điểm D836, I836 chèn giữa S840 và N841

Màng tế bào

Bình thường FLT3 tồn tại ở dạng monomer, là protein không hoạt hóa ở trên

bề mặt tế bào cho đến khi phân tử ligand của FLT3 liên kết với thụ thể, tạo nên sự dime hóa thụ thể Sự dimer hóa FLT3 dẫn đến sự photphoryl hóa vùng tyrosin-kinase, lúc này thụ thể hoạt hóa sẽ kích thích các con đường truyền tín hiệu trong tế bào, từ đó điều khiển nhiều quá trình sinh học khác liên quan đến sự tăng trưởng và phân chia của tế bào đó[18], [19]

Hình 1.4: Cấu trúc phân tử protein FLT3 [18], [19]

1.2.2 Các loại đột biến FLT3

Các nghiên cứu của nhiều nhà khoa học từ những năm đầu tiên của thế kỉ 21 cho thấy đột biến trên gen FLT3 gồm 2 loại chính: đột biến lặp đoạn và đột biến điểm

Đột biến lặp đoạn (FLT3-ITD - internal tandem duplication) là những đột biến xảy ra do có sự chèn thêm một đoạn, lặp lại một đoạn nằm ngay trong gen, chiếm tỷ lệ 15- 30% bệnh nhân AML theo nghiên cứu của Gilliland DG năm

2002[19] Đột biến lặp đoạn ITD thường được phát hiện bằng cách điện di sản phẩm phản ứng PCR được nhân lên nhờ cặp mồi đặc hiệu trên gel agarose Theo nhiều nghiên cứu, kích thước của các đột biến được tìm thấy rất khác nhau, phụ thuộc vào các đặc điểm của mẫu[37] Trong nghiên cứu của tác giả Yamamoto và cộng sự năm 2001, đột biến này được xác định ở exon 11 và exon 12[54] Tuy nhiên, sau đó gen FLT3 được thay đổi cách đánh số thứ tự exon, cho nên exon 11

và 12 được chuyển thành exon 14 và 15 Theo nghiên cứu của tác giả Derek L Stirewalt và cộng sự năm 2003, đột biến này được tìm thấy ở exon 14 và 15 của gen FLT3[48]

Đối với đột biến điểm (FLT3-TKD), nhiều nghiên cứu cũng xác định được nhiều đột biến điểm ở nhiều vị trí khác nhau Chẳng hạn, theo nghiên cứu của tác giả Yamamoto năm 2001[54], đột biến điểm gồm có đột biến D835Y và D835E được tìm thấy ở bệnh nhân AML (M3).Phương pháp nhân dòng cho thấy các đột biến này xảy ra ở các alen khác nhau, những đột biến này bao gồm đột biến thêm 3 Nucleotid (TTG) giữa D835 và I836, và sự thay thế AT thành GA ở Nu thứ nhất và thứ 2 của I836, gây ra sự chèn thêm Leucin và thay đổi Ileucin thành Asparagine (I836 1D) Đột biến điểm thường được tìm ra bằng phương pháp SSCP (single-strand conformational polymorphism) hoặc phương pháp cắt enzyme giới hạn[38], [54]

1.2.3 Mối liên hệ giữa đột biến trên gen FLT3 và bệnh bạch cầu cấp dòng tủy

Nghiên cứu mới đây của Neil Shal và cộng sự từ chương trình Bệnh máu ác tính ở trung tâm ung thư Henlen Diller Family Comprehensive thuộc UCSF[23], thực hiện trên 8 bệnh nhân bạch cầu được chẩn đoán lâm sàng liên quan đến hợp chất AC220, là chất ức chế FLT3 đầu tiên nghiên cứu Tất cả 8 bệnh nhân sau lần đầu tiên sử dụng thuốc với AC220 đã lui bệnh Các nhà nghiên cứu đã phát hiện một hoặc nhiều hơn những đột biến FLT3 phát triển khi xuất hiện sự kháng AC220 trên cả 8 bệnh nhân Ngày nay, người ta đã tìm thấy nhiều hợp chất có thể điều trị nhắm đích cấu trúc kháng AC220 của FLT3 nhằm tiêu diệt những tế bào ung thư

bạch cầu chứa đột biến[50] Những kết quả của nghiên cứu này cũng khẳng định những đột biến kháng thuốc ở FLT3 tiêu biểu cho việc điều trị nhắm đích mang lại giá trị cao cho sự phát triển thuốc điểu trị bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy trong tương lai

Đột biến nội lặp đoạn (ITD) của gen FLT3 được tìm thấy từ 3-400bp ở exon 14-15 mã hóa cho vùng cận màng của FLT3[45] Đột biến điểm của FLT3 xảy ra ở chuỗi nặng ngoài tế bào của vùng tyrosine kinase (TKD), tương đồng với đột biến điểm được tìm thấy ở RTKs khác như c-KIT và FMS[11] Nhiều nghiên cứu cho thấy đột biến FLT3 là tổn thương di truyền thường gặp nhất ở bệnh nhân AML Tần

số của FLT3/ITD là 15-35%, thêm khoảng 5-10% bệnh nhân mang đột biến điểm FLT3/TKD[16] Cả 2 loại đột biến FLT3 này gây nên sự hoạt hóa phân tử ligand độc lập của thụ thể và hoạt hóa con đường tín hiệu xuôi dòng Sự có mặt của đột biến FLT3/ITD liên quan tới hậu quả lâm sàng xấu ở cả bệnh nhân AML trẻ em và người lớn Đột biến ITD được chỉ ra có liên quan đến 5-10% bệnh nhân mắc hội chứng tăng sinh quá mức tế bào bạch cầu (MDS), vài trường hợp bệnh ALL, trình

tự đoạn lặp thuộc exon 14 và đôi khi liên quan đến intron 14 và exon 15[40]

1.2.4 Ý nghĩa của việc nghiên cứu gen FLT3 trong chẩn đoán và điều trị AML

Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy, việc xuất hiện đột biến gen FLT3

có khả năng gây ra những phản ứng kháng thuốc, nhằm tự bảo vệ tế bào ung thư chứa các đột biến này[22] Điều đó làm giảm hiệu quả của việc điều trị cho các bệnh nhân mắc bệnh ung thư bạch cầu, đặc biệt là bệnh AML Hơn nữa, đối với mỗi loại đột biến gen FLT3 lại có những cơ chế phản ứng lại với thuốc khác nhau Vì vậy, việc nghiên cứu và tìm ra đột biến gen FLT3 sẽ giúp bác sĩ có những tiên lượng chính xác, và xây dựng phác đồ điều trị phù hợp, mang lại hiệu quả chữa trị tốt nhất cho bệnh nhân[46] Đồng thời, nhiều loại thuốc tiềm năng ứng dụng trong lâm sàng điều trị bệnh AML liên quan đến đột biến gen FLT3 cũng có thể được phát triển Tuy nhiên, việc nghiên cứu về đột biến trên gen FLT3 ở bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy (AML) chưa có một quy trình chuẩn nào được xây dựng

và thử nghiệm với quy mô lớn nhằm đưa ra một con số thống kê về tỉ lệ bệnh có ý

nghĩa, cũng như chưa có một nghiên cứu nào đi sâu vào nghiên cứu các đặc điểm phân tử của các đột biến đó

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Mẫu máu

* Số lượng, phương thức lấy mẫu:

Chọn lọc mẫu : 208 mẫu máu, trong đó có 8 mẫu máu của người thường không mang bệnh (mẫu 37, 38, 39 và mẫu 204 đến 208) và 200 mẫu máu của bệnh nhân đươ ̣c chẩn đoán AML ta ̣i Viê ̣n Huyết ho ̣ c và Truyền máu Trung ương Tiêu chuẩn chẩn đoán AML: blast trong máu hoă ̣c tủy > 20%, hình thái học và hóa học tế bào thuộc AML (M0-M7 theo tiêu chuẩn FAB ), quần thể blast mang c ác marker dòng tủy Tiêu chuẩn cho ̣n mẫu: 1-2 ml di ̣ch tủy hoă ̣c máu lấy từ bê ̣nh nhân đã được chẩn đoánAML Mẫu máu sau khi lấy về được chia vào các ống eppendorf 1,5ml, mỗi ống 200µl, được bảo quản ở -20oC

2.1.2 Các hóa chất và bộ kit

Các hóa chất và bộ kit được đặt mua từ các hãng hóa chất uy tín dành cho nghiên cứu sinh học phân tử

Hóa chất dùng cho tách chiết plasmid từ vi khuẩn

- Dung dịch I: glucose 50mM, Tris-HCl 25mM pH 8,0, EDTA 10mM pH 8,0

- Dung dịch II (pha trước khi dùng): SDS 10%, NaOH 5N

- Dung dịch III: glacical acetic acid 0,2M, CH3COOK 0,2M pH 4,8

- RNase 10mg/ml

- Phenol bão hòa trong TE, pH 8,0

- Chloroform, Sodium acetat 3M

- Ethanol 99% lạnh (giữ ở -20oC), Ethanol 70% lạnh (giữ ở -20oC)

- Dung dịch TE: Tris-HCl 10mM pH 8,0, EDTA 1mM pH 8,0

Hóa chất dùng cho phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)

- PCR buffer Taq DNA polymerase 10X

- PCR buffer DeepVent DNA polymerase 10X

- Dung dịch MgCl2, MgSO4 25mM

- dNTP 8mM

- Mồi aprE-F-BamHI, aprE-R-SacII, E-anh-R, pAX01-F-seq, pMTL-R

- Nước cất (ddH2O)

Hóa chất dùng cho điện di trên gel agarose

- Agarose (Sigma), Safe View

- Ethidium bromide 10mg/ml,

- Dung dịch điện di TAE (Tris-base, acetic acid, EDTA 500 mM)

- Dung dịch nạp mẫu DNA 6X (orange G 0,2%, xylene cyanol 0,05%, bromophenol blue 0,09%, glycerol 60% và EDTA 60mM)

Hóa chất dùng trong cảm ứng biểu hiện gen

- Xgal, IPTG 100mM

- Dung dịch TE, Tris 1M

- Môi trường TSA, môi trường LB

- Kháng sinh: ampicillin

2.1.3 Máy móc và thiết bị

Máy móc thiết bị phục vụ cho các thí nghiệm thuộc phòng Enzyme học và phân tích hoạt tính sinh học; phòng Protein tái tổ hợp, thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Máy điều khiển nhiệt theo chu kì PCR PTC-100 (Bio-rad)

- Bộ điện di đứng loại nhỏ Mini-Protean Tetra Cell

- Bộ điện di ngang DNA Horizon 58 (Life Technology)

- Hộp soi đèn tử ngoại Hoefer (UVTM – 19 – 230V)

- Bộ điện di protein (Biorad)

- Máy ly tâm lạnh (Hettich Centrifugen)

- Máy lắc ổn nhiệt (Stualrt Scientific)

- Máy chụp hình gel Imagemaster VDS (Amersham Biosciences)

- Nồi hấp khử trùng Autoclave (SS325-TOMY)

- Máy Vortex (IKA, Mỹ)

- Máy đo pH (Orion, Anh)

- Tủ ấm Memmert (Đức), Tủ sấy Memmert (Đức)

- Tủ cấy vô trùng Class II (Mỹ)

- Bể ổn nhiệt (Memmert)

- Cân kỹ thuật Ohaus (Mỹ), Cân phân tích Precica (Thụy Sỹ)

- Máy khuấy từ gia nhiệt Bibby (Anh )

- Tủ mát 4oC (Nhật ), Tủ lạnh -20oC (Nhật )

2.2 Phương pháp

2.2.1 Tách DNA tổng số từ mẫu máu

Để thu được DNA tổng số, các mẫu máu được xử lý bằng bộ kit “DNA Blood mini kit” của hãng Qiagen Mẫu máu khi thu về được chia vào các ống eppendorf 1,5ml, mỗi ống chứa 200µl mẫu

Đầu tiên, mẫu máu tổng số được loại bỏ các thành phần không phải tế bào như protein và phá vỡ tế bào bằng 20µl QIAGEN Protease (or proteinase K), 200µl đệm ALủ mẫu ở 56oC trong 10 phút

Sau đó, ly tâm nhẹ, bỏ dịch nổi và chuyển vào cột QIAamp mini, bổ sung Ethanol 96o Tiếp tục ly tâm ở 6000g (8000 rpm) / phút, bỏ dịch và rửa tủa 2 lần với 500µl đệm AW1, và 500µl đệm AW2 trong vòng 3 - 5 phút

Cuối cùng, bổ sung 100 µl nước đã loại bỏ enzyme phân hủy ADN vào cột, ủ

ở nhiệt độ phòng (15-25oC) 1 phút, sau đó ly tâm ở 6000 g(8000 rpm) trong 1 phút,

thu dịch trong ống eppendorf

Mẫu ADN tổng số sau khi thu được sẽ điện di kiểm tra trên gel agarose 1%,

và đo nồng độ bằng máy đo phổ hấp thụ (nanodrop) Sau đó, được bảo quản ở

-20oC

2.2.2 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân bản đoạn gen có đột biến

Mồi trong phản ứng sao chép DNA là những trình tự RNA ngắn được tổng hợp bởi enzyme Primase; còn mồi trong sinh học phân tử là những đoạn oligonucleotide ngắn được tổng hợp hóa học

2.2.3 Nhân đoạn gen FLT3chứa đột biến với cặp mồi đặc hiệu bằng phản ứng

chuỗi polymerase(PCR)

DNA tổng số được sử dụng làm khuôn trong phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu tương ứng của gen FLT3 Chu trình nhiệt của phản ứng đã tối ưu như sau:

Hình 2.1: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Mỗi phản ứng PCR gồm các thành phần theo bảng 3 bổ sung thêm 3µl DNA tổng số Trong đó, các mẫu ADN tổng số được pha về nồng độ ADN trong khoảng

từ 40-50 ng/µl Quá trình thao tác thực hiện trong điều kiện sạch (có thể vô trùng), sau đó nhanh chóng đạt mẫu vào trong máy gia nhiệt PCR