Sàng lọc và phân tích đặc điểm phân tử các đột biến FLT3 xuất hiện trên bệnh nhân mắc bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy ở Việt Nam Đỗ Thị Thanh Trung Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.
Trang 1Sàng lọc và phân tích đặc điểm phân tử các đột biến FLT3 xuất hiện trên bệnh nhân mắc bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy ở Việt Nam
Đỗ Thị Thanh Trung
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc gia Hà Nội
Luận văn Thạc sĩ ngành: Sinh học; Mã số : 60 42 01 14
Người hướng dẫn: TS Phạm Bảo Yên
Năm bảo vệ: 2014
Abstract Đã thiết lập được quy trình phát hiện các đột biến trên gen FLT3-ITD gây
ung thư bạch cầu cấp dòng tủy (đã được chuyển giao cho cơ sở y tế) Sàng lọc quy mô phòng thí nghiệm cho thấy: tỷ lệ mẫu chứa đột biến gen FLT3-ITD là 15/200 mẫu, chiếm 7,5% bệnh nhân AML Trong mỗi mẫu chứa đột biến, có từ 1-2 đoạn lặp, mức độ đột biến ở các mẫu là từ 25 - 70% Đoạn lặp và đoạn gốc nằm cạnh nhau Bước đầu
thiết lập được quy trình và thử nghiệm sàng lọc đột biến FLT3-TKD ở một số mẫu Keywords Sàng lọc; Phân tử; Đột biến gen; Ung thư bạch cầu; Sinh học thực nghiệm Content
Trang 2MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1 Bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy (Acute Myeloid Leukemia-AML) 3
1.1.1 Thực trạng bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy và tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam 5
1.1.2 Phân loại các thể bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy 12
1.1.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh AML 13
1.1.4 Hướng điều trị đối với người bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy 14
1.2 Gen FLT3 và sự liên quan tới bệnh bạch cầu cấp dòng tủy 19
1.2.1 Cấu trúc và chức năng của gen FLT3 19
1.2.2 Các loại đột biến FLT3 20
1.2.3 Mối liên hệ giữa đột biến trên gen FLT3 và bệnh bạch cầu cấp dòng tủy21 1.2.4 Ý nghĩa của việc nghiên cứu gen FLT3 trong chẩn đoán và điều trị AML 22
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24
2.1 Nguyên liệu 24
2.1.1 Mẫu máu 24
2.1.2 Các hóa chất và bộ kit 24
2.1.3 Máy móc và thiết bị 25
2.2 Phương pháp 26
2.2.1 Tách DNA tổng số từ mẫu máu 26
2.2.2 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân bản đoạn gen có đột biến 27
Trang 32.2.3 Nhân đoạn gen FLT3chứa đột biến với cặp mồi đặc hiệu bằng phản ứng
chuỗi polymerase (PCR) 27
2.2.4 Điện di agarose hoặc acrylamide để phân tích phổ băng đột biến 28
2.2.6 Nhân dòng đoạn gen FLT3 và đọc trình tự gen bằng phương pháp Sanger 28
2.2.7 Một số phần mềm sử dụng trong luận văn 30
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31
3.1 Thu thập và tách chiết ADN hệ gen từ mẫu máu tổng số 31
3.2 Thiết kế và tối ưu quy trình phát hiện đột biến gen FLT3-ITD 32
3.2.1 Thiết kế trình tự mồi 32
3.2.2 Thiết kế và tối ưu quy trình phát hiện đột biến FLT3-ITD 33
3.3 Bước đầu sàng lọc trong quy mô phòng thí nghiệm 36
3.4 Kết quả đưa sản phẩm PCR vào vectơ tái tổ hợp 37
3.5 Phân tích các đặc điểm phân tử của đột biến gen FLT3-ITD 40
3.5.1 Số lượng đột biến gen FLT3-ITD trong một mẫu (số đột biến/mẫu) 40
3.5.2 Kích thước đột biến 40
3.5.3 Trình tự đột biến 44
3.5.4 Mức độ đột biến 45
KẾT LUẬN 47
KIẾN NGHỊ 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 48
Trang 4TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
(2012), “Bước đầu nghiên cứu gen NPM1 - muta và FLT3-ITD trên bệnh
nhân Lơ xê mi cấp dòng tủy”, Y học Việt Nam, 392, tr.64-68
tế bào so với phương pháp dấu ấn miễn dịch trong chẩn đoán phân dòng leucemi cấp ở trẻ em Y học TP Hồ Chí Minh 9 (Sup.1): 59-64
bằng dấu ấn miễn dịch tế bào”,Y học TP Hồ Chí Minh, 11(1): 34-39
các tổ hợp gien thường gặp trong bệnh lý bạch cầu cấp, Luận án tiến sĩ y
học, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Tiếng Anh
P., Amadori S., Federici G., and Lo-Coco F (2005), “Rapid detection of nucleophosmin (NPM1) mutations in acute myeloid leukemia by denaturing
HPLC”, Clinical chemistry, 51 (11), pp 2165-2167
J.W., Hiddemann W., and Spiekermann K (2005), “FLT3-ITD-TKD dual mutants associated with AML confer resistance to FLT3 PTK inhibitors and
cytotoxic agents by overexpression of Bcl-x(L)”, Blood, 105 (9), pp
3679-3685
Van Oosterhoud S., Van Putten W.L., Valk P.J., Berna Beverloo H., Tenen
Trang 5D.G., Lowenberg B., and Delwel R (2003), “Biallelic mutations in the CEBPA gene and low CEBPA expression levels as prognostic markers in
intermediate-risk AML”, Hematology Journal 4(1), pp 31-40
“Uniform sensitivity of FLT3 activation loop mutants to the tyrosine kinase
inhibitor midostaurin”, Blood, 110 (13), pp 4476-4479
thai adult acute myeloid leukemia, in Faculty of Graduate Studies 2008,
Mahidol: Mahidol University p 133
leukemia”, Blood, 82 (2), pp 337-342
Colapietro P., Nichelatti M., Pezzetti L., Lunghi M., Cuneo A., Viola A., Ferrara F., Lazzarino M., Rodeghiero F., Pizzolo G., Larizza L., and Morra
E (2006), “Prognostic impact of c-KIT mutations in core binding factor
leukemias: an Italian retrospective study”, Blood, 107 (9), pp 3463-3468
Gilliland D.G (2004), “Variable sensitivity of FLT3 activation loop
mutations to the small molecule tyrosine kinase inhibitor MLN518”, Blood,
104 (9), pp 2867-2872
P., and Gilliland D.G (2004), “Prediction of resistance to small molecule FLT3 inhibitors: implications for molecularly targeted therapy of acute
leukemia”, Cancer research, 64 (18), pp 6385-6389
A., Bullinger L., Frohling S., and Dohner H (2005), “Mutant nucleophosmin (NPM1) predicts favorable prognosis in younger adults with acute myeloid leukemia and normal cytogenetics: interaction with other gene mutations”,
Blood, 106 (12), pp 3740-3746
Trang 615 Falini B., Mecucci C., Tiacci E., Alcalay M., Rosati R., Pasqualucci L., La
Starza R., Diverio D., Colombo E., Santucci A., et al (2005), “Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype”,
New England Journal of Medicine, 352 (3), pp 254-266
Berger R., Döhner H., Döhner K., Ebert B.L., et al (2007), “Identification of driver and passenger mutations of FLT3 by high-throughput DNA sequence
analysis and functional assessment of candidate alleles”, Cancer cell, 12 (6),
pp 501-513
leukaemia: a rationale for risk-adapted therapy with FLT3 inhibitors”, Best
Practice & Research Clinical Haematology, 16 (3), pp 409-417
opinion in hematology, 9 (4), pp 274-281
and leukemia”, Blood, 100 (5), pp 1532-1542
Heerema N.A., Hirsch B., Raimondi S.C., Lange B., Franklin J.L., Radich J.P., and Meshinchi S (2009), “Prevalence and prognostic implications of CEBPA mutations in pediatric acute myeloid leukemia (AML): a report from
the Children's Oncology Group”, Blood, 113 (26), pp 6558-6566
Wolpin B.M., Jonasova A., Herman P., Fox E.A., Boggon T.J., Eck M.J., Weisberg E., Griffin J.D., Gilliland D.G., Meyerson M., and Sellers W.R (2004), “Identifying and characterizing a novel activating mutation of the
FLT3 tyrosine kinase in AML”, Blood, 104 (6), pp 1855-1858
Williams I., Amaral S.M., Curley D.P., Duclos N., Neuberg D., Scarborough R.M., Pandey A., Hollenbach S., Abe K., Lokker N.A., Gilliland D.G., and
Trang 7Giese N.A (2002), “CT53518, a novel selective FLT3 antagonist for the
treatment of acute myelogenous leukemia (AML)”, Cancer cell, 1 (5), pp
421-432
resistance of FLT3-ITD by SAR302503”, Blood Cancer Journal, 3, pp
e138
Y.-K., Kim H.-J., Sohn S., Kim S., Lee W., Kim K., Mun Y.-C., Kim H., Park J., Min W.-S., Kim H.-J., and Kim D (2013), “KIT D816 mutation associates with adverse outcomes in core binding factor acute myeloid
rearrangement”, Ann Hematol, 92 (2), pp 163-171
M.G., and Kim H.J (2010), “Prognostic significance of nucleophosmin mutations and FLT3 internal tandem duplication in adult patients with
cytogenetically normal acute myeloid leukemia”, Korean Journal of
Hematology, 45 (1), pp 36-45
Kuriyama K., Jinnai I., Shimazaki C., Akiyama H., Saito K., Oh H., Motoji T., Omoto E., Saito H., Ohno R., and Ueda R (1999), “Prognostic implication of FLT3 and N-RAS gene mutations in acute myeloid leukemia”,
Blood, 93 (9), pp 3074-3080
Naoe T (1998), “Internal tandem duplication of the FLT3 gene is a novel modality of elongation mutation which causes constitutive activation of the
product”, Leukemia, 12 (9), pp 1333-1337
secreting antibody of predefined specificity”, Nature, 256 (5517), pp
495-497
Trang 829 Kronke J., Bullinger L., Teleanu V., Tschurtz F., Gaidzik V.I., Kuhn M.W.,
Rucker F.G., Holzmann K., Paschka P., Kapp-Schworer S., et al (2013),
“Clonal evolution in relapsed NPM1-mutated acute myeloid leukemia”,
Blood, 122 (1), pp 100-108
D.E., Mcdowell E.P., Adelsperger J., Frohling S., Huntly B.J., Beran M., Jacobsen S.E., and Gilliland D.G (2007), “FLT3 mutations confer enhanced proliferation and survival properties to multipotent progenitors in a murine
model of chronic myelomonocytic leukemia”, Cancer cell, 12 (4), pp
367-380
F.H., Yao M., Huang S.Y., and Tien H.F (2005), “Characterization of CEBPA mutations in acute myeloid leukemia: most patients with CEBPA mutations have biallelic mutations and show a distinct immunophenotype of
the leukemic cells”, Clinical Cancer Research, 11 (4), pp 1372-1379
Edwards C.R., Khanin R., Figueroa M.E., Melnick A., Wellen K.E., O'rourke D.M., Berger S.L., Chan T.A., Levine R.L., Mellinghoff I.K., and Thompson C.B (2012), “IDH mutation impairs histone demethylation and
results in a block to cell differentiation”, Nature, 483 (7390), pp 474-478
and Watanabe T (2013), “Inhibition of FLT3 expression by green tea
catechins in FLT3 mutated-AML cells”, PLoS ONE, 8 (6), pp 1-9
clinical implications 2011: American Society of Clinical Oncology p
231-236
D., Holland K.B., Whitman S.P., Becker H., Schwind S., et al (2010),
“IDH1 and IDH2 gene mutations identify novel molecular subsets within de
Trang 9novo cytogenetically normal acute myeloid leukemia: a Cancer and
Leukemia Group B study”, Journal of Clinical Oncology, 28 (14), pp
2348-2355
alterations of FLT3 in acute myeloid leukemia”, Clinical Cancer Research,
15 (13), pp 4263-4269
Rocnik J.L., Lange B.J., Gilliland D.G., and Radich J.P (2008), “Structural
and numerical variation of FLT3/ITD in pediatric AML”, Blood, 111 (10),
pp 4930-4933
Small D., and Berg K.D (2003), “Detection of FLT3 internal tandem duplication and D835 mutations by a multiplex polymerase chain reaction
and capillary electrophoresis assay”, Journal of Molecular Diagnostic, 5 (2),
pp 96-102
D.W., Antman K.H., and Schlossman S.F (1980), “Serotherapy of a patient with a monoclonal antibody directed against a human lymphoma-associated
antigen”, Cancer research, 40 (9), pp 3147-3154
“Tandem duplication of the FLT3 gene in acute lymphoblastic leukemia: a
marker for the monitoring of minimal residual disease”, Leukemia, 14 (3),
pp 522-524
Buccisano F., Amadori S., Mecucci C., Falini B., and Lo-Coco F (2005),
“Simultaneous detection of NPM1 and FLT3-ITD mutations by capillary
electrophoresis in acute myeloid leukemia”, Leukemia, 19 (8), pp
1479-1482
Trang 1042 Pressman D and Korngold L (1953), “The in vivo localization of
anti-Wagner-osteogenic-sarcoma antibodies”, Cancer, 6 (3), pp 619-623
M.A., Pierce S., Daver N., Garcia-Manero G., Faderl S., et al (2013), “Phase
2 study of azacytidine plus sorafenib in patients with acute myeloid leukemia
and FLT-3 internal tandem duplication mutation”, Blood, 121 (23), pp
4655-4662
and Preudhomme C (2008), “Cooperating gene mutations in acute myeloid
leukemia: a review of the literature”, Leukemia, 22 (5), pp 915-931
H., Sauerland C.M., Serve H., Buchner T., Haferlach T., and Hiddemann W (2002), “Analysis of FLT3 length mutations in 1003 patients with acute myeloid leukemia: correlation to cytogenetics, FAB subtype, and prognosis
in the AMLCG study and usefulness as a marker for the detection of minimal
residual disease”, Blood, 100 (1), pp 59-66
Society of Hematology, pp 178-184
Thiede C (2003), “Comparative analysis of MLL partial tandem duplication and FLT3 internal tandem duplication mutations in 956 adult patients with
acute myeloid leukemia”, Genes, Chromosomes and Cancer, 37 (3), pp
237-251
Willman C.L., and Radich J.P (2001), “FLT3, RAS, and TP53 mutations in
elderly patients with acute myeloid leukemia”, Blood, 97 (11), pp
3589-3595
malignancies”, Nature Reviews Cancer, 3 (9), pp 650-665
Trang 1150 Tallman M.S (2005), “New strategies for the treatment of acute myeloid
leukemia including antibodies and other novel agents”, Hematology / the
Education Program of the American Society of Hematology American Society of Hematology Education Program, pp 143-150
Wermke M., Bornhauser M., Ritter M., Neubauer A., Ehninger G., and Illmer T (2002), “Analysis of FLT3-activating mutations in 979 patients with acute myelogenous leukemia: association with FAB subtypes and
identification of subgroups with poor prognosis”, Blood, 99 (12), pp
4326-4335
Organization (WHO) classification of the myeloid neoplasms”, Blood, 100
(7), pp 2292-2302
A., Harris N.L., Le Beau M.M., Hellstrom-Lindberg E., Tefferi A., and Bloomfield C.D (2009), “The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute
leukemia: rationale and important changes”, Blood, 114 (5), pp 937-951
Asou N., Kuriyama K., Yagasaki F., Shimazaki C., et al (2001), “Activating mutation of D835 within the activation loop of FLT3 in human hematologic
malignancies”, Blood, 97 (8), pp 2434-2439
Website:
https://www.healthbase.com/hb/cm/leukemia-leukaemia-types-acute-chronic-
symptoms-treatment-chemotherapy-radiotherapy-immunotherapy-stem-cell-transplant-targeted-therapy-cost-abroad-medical-tourism.html
Trang 1256 http://www.webmd.com/cancer/tc/leukemia-topic-overview