Lựa chọn các điều kiện lên men xốp tối ưu và nghiên cứu đặc tính xylanase từ vi khuẩn ưa nhiệt

Ứng dụng của xylanase trong công nghiệp thực phẩm Công nghiệp thực phẩm là một trong những ngành công nghiệp có giá trị kinh tế lớn mà trong đó sự trao đổi chất của vi sinh vật có nhiều

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LỰA CHỌN CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN XỐP TỐI ƯU VÀ NGHIÊN CỨU

ĐẶC TÍNH XYLANASE TỪ VI KHUẨN ƯA NHIỆT

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012

1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ NHIÊN

LỰA CHỌN CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN XỐP TỐI ƯU VÀ NGHIÊN CỨU

ĐẶC TÍNH XYLANASE TỪ VI KHUẨN ƯA NHIỆT

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS ĐÀO THỊ LƯƠNG

Hà Nội - 2012

xylanase 73 3.4 Kết quả tủa enzyme xylanase của chủng 118 và B2H2 bằng các dung môi

hữu cơ 73

4

MỤC LỤC HÌNH

1.1 Cấu trúc hóa học của xylan … ……… 14

1.2 Cấu trúc xylan trong cây gỗ ……… ………… 16

1.3 Cấu trúc không gian xylanase của Bacillus subtilis…… … ………… 19

1.4 Các enzyme cần thiết phân cắt hoàn toàn xylan………… ……… 20

1.5 Sự thủy phân thành tế bào thực vật bằng enzyme ……… …… 24

3.1 Vị trí phân loại của chủng B2H2 với các loài có quan hệ họ hàng gần 57

3.2 Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng B2H2……… ……… 58

3.3 Vị trí phân loại của chủng XK-118 với các loài có quan hệ họ hàng gần 59

3.4 Hình thái khuẩn lạc và cuống sinh bào tử chủng 118………… …… 60

3.5 Môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của 2 chủng B2H2 và 118 ……… 61

3.6 Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của 2 chủng B2H2 và 118……… 62

3.7 pH thích hợp cho sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme chủng B2H2 và 118……… 63

3.8 Thời gian thích hợp cho giống khởi động của chủng B2H2 và 118… … 65

3.9 Cơ chất thích hợp cho quá trình tổng hợp xylanase của 2 chủng B2H2 và 118……… 66

3.10 Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng tổng hợp enzyme xylanase của 2 chủng B2H2 và 118 ……… 67

3.11 Thời gian nuôi cấy thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase của 2 chủng B2H2 và 118 ……… 68

3.12 Tỷ lệ giống cấy thích hợp cho khả năng sinh xylanase của chủng B2 H 2 và 118 ……… 69

3.13 Nguồn nitơ bổ sung thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase của chủng B2H2 và chủng 118 70

3.14 Mức độ ảnh hưởng của cao thịt đến khả năng tổng hợp xylanase của chủng B2H2 ……… 71

5

3.15 Mức độ ảnh hưởng của urea đến khả năng tổng hợp xylanase của chủng

118……… ……… 72

3.16 Nguồn cacbon bổ sung thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase của 2 chủng B2H2 và chủng 18 73

3.17 Lựa chọn hỗn hợp khoáng thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp xylanase của chủng B2H2 và chủng 118 74

3.18 Sắc ký trao đổi ion DEAE sepharose mẫu enzyme tủa aceton của chủng 118 ……… ……… 76

3.19 Sắc ký trao đổi ion sử dụng dịch enzyme của các phân đoạn có hoạt độ xylanase cao ở bước rửa cột 77

3.20 Điện di đồ trên gel hoạt độ mẫu enzyme thô có ME (1) và không có ME (2); mẫu enzyme tủa aceton có ME (3) và không có ME (4) 78

3.21 Điện di trên gel hoạt tính mẫu enzyme tủa aceton 79

3.22 Hoạt độ xylanase chủng 118 thu hồi được khi tủa trong muối ammonisunfat từ 30 đến 90% 80

3.23 Điện di trên gel SDS-PAGE và điện di trên gel hoạt độ mẫu enzyme tủa aceton và mẫu enzyme tủa ammonisunfat từ 30 đến 90% 80

3.24 Sắc ký trao đổi ion dịch enzyme tủa ammonisunfat 50% 81

3.25: Kết quả sắc ký trao đổi ion mẫu enzyme tủa ammonisunfat 80% 82

3.26 Điện di SDS-PAGE mẫu enzyme tủa ammonisunfat 80%, E1 và E2 83

3.27 Dải pH thích hợp cho hoạt động của xylanase từ 118 83

3.28 Nhiệt độ phản ứng tối ưu của enzyme xylanase từ chủng 118 84

3.29 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt động của enzyme xylanase từ 118 85

3.30 Khả năng chịu nhiệt của các enzyme xylanase từ chủng 118 ở 600C 86

3.31 Khả năng bền nhiệt của hai loại xylanase tinh sạch từ chủng 118 … 86

3.32 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ xylanase của chủng B2H2 87

3.33 Nhiệt độ thích hợp cho phản ứng enzyme xylanase từ chủng B2H2 88

3.34 Khả năng chịu nhiệt của enyme xylanase từ chủng B2H2 ……… 88

3.35 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ xylanase 89

6

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 11

1 Lý do lựa chọn đề tài 11

2 Nhiệm vụ và mục đích nghiên cứu 12

3 Những đóng góp mới của đề tài 12

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 13

1.1 XYLAN 13

1.1.1 Xylan 13

1.1.2 Cấu trúc của xylan 14

1.2.3 Tính chất của xylan 15

1.2 ENZYME PHÂN GIẢI XYLAN - XYLANASE 16

1.2.1 Nguồn gốc xylanase 16

1.2.2 Phân loại xylanase 17

1.2.3 Cấu trúc 18

1.2.4 Đặc tính của xylanase 19

1.2.5 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt động của enzyme xylanase 21

1.2.5.1 Ảnh hưởng của một số ion kim loại 21

1.2.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 22

1.2.5.3 Ảnh hưởng của pH 22

1.2.5.4 Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa 23

1.2.6 Ứng dụng của xylanase 23

1.2.6.1 Ứng dụng của xylanase trong công nghiệp thực phẩm 23

1.2.6.2 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy 24

1.2.6.3 Ứng dụng của xylanase trong sản xuất nguyên liệu sinh học 24

1.2.6.4 Ứng dụng trong công nghiệp vải sợi 25

1.2.6.5 Ứng dụng trong nông nghiệp 25

1.2.6.6 Ứng dụng của xylanase trong xử lý môi trường 25

1.2.7 Vi sinh vật sinh xylanase 26

1.3 LÊN MEN XỐP 26

1.3.1 Khái niệm lên men xốp 26

1.3.2 Ưu điểm của kỹ thuật lên men xốp 27

1.4 TINH SẠCH ENZYME XYLANASE 30

1.4.1 Tủa enzyme bằng muối ammonisunfat 31

1.4.2 Tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ 32

7

1.4.3 Sắc ký 33

1.4.3.1 Sắc ký lọc gel 33

1.4.3.2 Sắc ký trao đổi ion 34

1.4.3.3 Sắc ký ái lực 35

1.4.3.4 Sắc ký tương tác kỵ nước 36

1.4.3.5 Các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC 36

1.4.4 Điện di 37

1.4.4.1 Điện di trên gel agarose 38

1.4.4.2 Điện di trên gel polyacrylamide 38

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

2.1 CHỦNG VI SINH VẬT, MÔI TRƯỜNG VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 40

2.1.1 Chủng vi sinh vật 40

2.1.2 Môi trường nghiên cứu 40

2.1.2.1 Môi trường nhân giống (g/l) 40

2.1.2.2 Môi trường nuôi dịch thể 40

2.1.2.3 Môi trường kiểm tra hoạt độ enzyme 41

2.1.2.4 Môi trường nuôi xốp 41

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 41

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41

2.2.1 Phương pháp xác định hoạt tính xylanase 41

2.2.1.1 Phương pháp định tính (khuếch tán trên thạch) 41

2.2.1.2 Phương pháp định lượng 42

2.2.2 Tuyển chọn chủng 44

2.2.3 Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng 44

2.2.4 Phương pháp phân loại 44

2.2.4.1 Phương pháp phân loại vi khuẩn dựa vào đọc trình tự ADN 44

2.2.4.2 Quan sát hình thái 48

2.2.5 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase ở các chủng vi sinh vật nghiên cứu 49

2.2.5.1 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase ở các chủng nghiên cứu 49

2.2.5.2 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase ở các chủng nghiên cứu 49

2.2.6 Thu hồi enzyme 51

8

2.2.6.1.Chiết enzyme 51

2.2.6.2 Thu hồi enzyme bằng các dung môi hữu cơ 51

2.2.7 Tinh sạch xylanase của chủng 118 52

2.2.7.1 Tủa enzyme trong dung môi hữu cơ 52

2.2.7.2 Tủa enzyme trong muối ammonisunfat 52

2.2.7.3 Sắc ký trao đổi ion 52

2.2.8 Điện di 53

2.2.8.1 Điện di trên gel SDS-PAGE 53

2.2.8.2 Điện di trên gel hoạt tính 53

2.2.9 Nghiên cứu đặc tính enzyme 54

2.2.9.1 pH thích hợp cho hoạt động của enzyme 54

2.2.9.2.Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme 54

2.2.9.3 Khả năng bền nhiệt của enzyme 54

2.2.9.4 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ enzyme 54

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 55

3.1 KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN 55

3.1.1 Lựa chọn các chủng có hoạt độ xylanase cao 55

3.1.2 Lựa chọn các chủng vi sinh vật bền nhiệt có hoạt tính xylanase cao 55

3.2 PHÂN LOẠI 56

3.2.1 Chủng B 2 H 2 56

3.2.1.1 Phân tích trình tự ADNr 16S 56

3.2.1.2 Đặc điểm hình thái 57

3.2.2 Chủng 118 58

3.2.1.2 Phân tích trình tự ADNr 16S 58

3.2.1.3 Đặc điểm hình thái 59

3.3 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY 60

3.3.1 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống 60

3.3.1.1 Môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng 60

3.3.1.2 Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng 62

3.3.1.3 pH thích hợp cho sự sinh trưởng 63

3.3.1.4 Thời gian thích hợp cho giống khởi động 64

3.3.2 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp 65

3.3.2.1 Lựa chọn cơ chất 65

3.3.2.2 Lựa chọn độ ẩm thích hợp 65

9

3.3.2.4 Lựa chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp 68

3.3.2.5 Lựa chọn nguồn nitơ bổ sung 68

3.3.2.6 Lựa chọn nguồn cacbon bổ sung 71

3.3.2.7 Lựa chọn loại khoáng thích hợp 72

3.4 THU HỒI ENZYME 72

3.4.1 Điều kiện thích hợp cho chiết enzyme 72

3.4.2 Thu hồi enzyme bằng các dung môi hữu cơ 73

3.5 TINH SẠCH ENZYME 74

3.5.1 Tinh sạch enzyme xylanase chủng 118 theo phương pháp sắc ký trao đổi ion 74

3.5.2 Tinh sạch xylanase của chủng 118 bằng phương pháp tủa trong muối ammonisunfat bão hòa kết hợp với sắc ký trao đổi ion sepharose DEAE 77

3.6.1 Đặc tính enzyme xylanase từ chủng 118 81

3.6.1.1 pH thích hợp 81

3.6.1.2 Nhiệt độ thích hợp 82

3.6.1.3 Ảnh hưởng của các ion kim loại 83

3.6.1.4 Khả năng chịu nhiệt của enzyme 84

3.6.2 Đặc tính xylanase từ B 2 H 2 86

3.6.2.1 pH thích hợp 86

3.5.2.2 Nhiệt độ 87

3.5.2.3 Bền nhiệt 88

3.5.2.4 Ảnh hưởng của ion kim loại 88

KẾT LUẬN 90

KIẾN NGHỊ 91

TÀI LIỆU THAM KHẢO 92

TIẾNG VIỆT 92

TIẾNG ANH 92

PHỤ LỤC 96

10

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

HPLC : High Performance Liquid Chromatography (sắc ký lỏng hiệu năng

cao) ADN : Acid Deoxyribose Nucleic (acid deoxyribonucleic)

ADNr : Acid Deoxyribose Nucleic ribosome (acid deoxyribonucleic

ribosome) ARN : Acid Ribose Nucleic (acid ribonucleic)

bp : base pair (cặp base)

PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

SDS : Sodium Dodecyl Sulfate

SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate- Polyacrylamide Gel Electrophoresis TAE : Tris - Acetate - Ethylendiamin tetracetic acid

hệ vi sinh vật đường ruột của động vật [11, 6] Ngoài ra, xylanase còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như: phân hủy rác thải; tẩy trắng trong công nghiệp sản xuất giấy, sản xuất nhiên liệu sinh học,… [33, 30]

Xét ở quy mô công nghiệp, sản xuất enzyme là một lĩnh vực đang ngày càng phát triển của công nghệ sinh học nói chung và công nghệ thực phẩm nói riêng Nhu cầu sử dụng enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật ngày càng tăng cao, đặc biệt là enzyme xylanase được sử dụng trong nhiều ngành sản xuất trên toàn thế giới [14] Trong sinh giới, động vật và thực vật không có khả năng tự sinh xylanase, do

đó vai trò thủy phân xylan phụ thuộc chủ yếu vào nguồn vi sinh vật, đặc biệt quan trọng là các nhóm vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm Trước đây, việc nghiên cứu xylanase chủ yếu được tiến hành trên đối tượng nấm sợi Tuy nhiên, gần đây cùng với sự phát mẽ của khoa học công nghệ, ngày càng nhiều chủng vi sinh vật có khả năng sinh xylanase được phát hiện và nghiên cứu sâu Đồng thời, các lĩnh vực liên quan đến enzyme xylanase và ứng dụng của loại enzyme này ở vi khuẩn và xạ khuẩn được các nhà khoa học ngày càng quan tâm hơn

Lên men xốp được đánh giá là con đường tốt nhất để sản xuất enzyme và các sản phẩm bền nhiệt khác Lên men xốp ngày càng được sử dụng rộng rãi trong sản xuất cũng như trong nghiên cứu vì những ứng dụng mang tính thực tiễn và kinh tế của nó Lên men xốp được dùng trong công nghiệp chế biến và sản xuất thực phẩm chủ yếu là lĩnh vực sản xuất các loại hương liệu, sản xuất enzyme (a-amylase, fructosyl transferase, lipase, pectinase, xylanase), các acid hữu cơ (acid lactic, acid citric) và các loại kẹo cao su [8]

Trước đây, trong sản xuất enzyme người ta thường sử dụng kỹ thuật lên men dịch thể Tuy nhiên, khi tiến hành so sánh hiệu quả của các loại hình lên men, người

ta thấy hàm lượng enzyme vi sinh vật có thể sinh ra trong lên men xốp cao hơn

12

nhiều lần so với trong lên men dịch thể khi sử dụng cùng một chủng vi sinh vật trong cùng điều kiện lên men [14]

Để góp phần bổ sung các số liệu cần thiết về việc ứng dụng kỹ thuật lên men

xốp trong công nghiệp sản xuất enzyme chúng tôi thực hiện đề tài: “Lựa chọn các điều kiện lên men xốp tối ưu và nghiên cứu đặc tính xylanase từ các chủng vi khuẩn ưa nhiệt”

2 Nhiệm vụ và mục đích nghiên cứu

- Khảo sát và tuyển chọn những chủng vi khuẩn và xạ khuẩn bền nhiệt có hoạt

độ enzyme xylanase cao

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn nghiên cứu

- Lựa chọn các điều kiện lên men xốp tối ưu cho các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn nghiên cứu

- Nghiên cứu đặc tính và tinh sạch enzyme của các chủng nghiên cứu

3 Những đóng góp mới của đề tài

Đề tài chúng tôi th ực hiện có kế thừa các công trình nghiên c ứu đã công bố gần đây về mặt phương pháp nghiên cứu, tuy nhiên kết quả của nó hoàn toàn mới và độc lập Do đó đề tài s ẽ góp phần đóng góp thêm số liệu vào cơ sở dữ liê ̣u v ề quá trình sản xuất enzyme xylanase bằng kỹ thuật lên men xốp

14

1.1.2 Cấu trúc của xylan

Xylan là một polysaccharide không đồng nhất, bao gồm các gốc D-xylose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4-xylanosidic (β-1,4- D-xylopyranosyl) giữa đường xylopyranose với acetyl, arabinosyl và glucuronysyl [22]

(a)

(b) Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của xylan [35]

(a) Cấu trúc một monomere; (b) Cấu trúc trong tự nhiên

Do tính không đồng nhất của xylan, sự thủy phân của nó phải cần đến một hệ thống enzyme phức tạp Enzyme này thường bao gồm hai loại: enzyme không phân nhánh (β-1,4-endoxylanse, ferulic acid esterases) và enzyme phân nhánh (α-arabinofuranosidase, α-glucuronidase, esterase xylan acetyl và esterase axit phenolic) (Hình 1) Tất cả các enzyme này tác động tương hỗ để chuyển hóa xylan thành cấu tử đường của nó Hệ thống đa enzyme thủy phân xylan khá phổ biến ở vi khuẩn và nấm Các xylan khác loại chứa các nhóm thể khác nhau trong mạch chuỗi chính và chuỗi bên Sự phân giải polysaccharide phức tạp cần có hoạt động hỗ trợ giữa các thành phần khác nhau của hệ thống enzyme thủy phân xylan Trong đó, endo-β-1,4-xylanase là enzyme quan trọng nhất vì nó khởi đầu cho quá trình phân giải xylan thành các xylooligosaccharide ngắn

15

Khác với cellulose, xylan có mạch polymere ngắn hơn, chỉ bao gồm khoảng 150- 200 gốc xylose [20] Các sợi xylan liên kết với nhau nhờ các phân tử acid diferulic và bao quanh các vi sợi cellulose Cùng với lignin, xylan còn có tác dụng bảo vệ các vi sợi cellulose [31]

Cấu trúc hóa học của xylan phụ thuộc vào nguồn gốc cũng như vị trí trong tế bào của chúng Ví dụ, trong gỗ của cây lá rộng, xylan bao gồm 89,3% xylose, 1% arabinose, 1% glucose, và 8,3% anhydrouronic acid Thông thường tỷ lệ giữa arabinose: 4-O-methyl-glucuronic acid: xylose trong xylan của cây gỗ mềm là 1,3:2:10 Arabinose, acetylate thường tạo nhánh tại C thứ 3 của đường xylose, glucosyluronic, hoặc 4-O-methyl-glucuronic acid tạo nhánh tại C thứ 2 [16]

Xylan của thực vật trên cạn xuất hiện trên rất nhiều vị trí của vách tế bào của các mô bị lignin hóa, chúng cũng được tìm thấy trên một số loại thực vật khác như rêu, dương xỉ (Aspinal, 1959; Joseleau, 1980) Chúng thường tạo thành vách thứ cấp của những mô có chức năng cấu trúc, nhưng cũng hiện diện trong vách sơ cấp của những vách sơ cấp của một số tế bào đang tăng trưởng, vách sơ cấp của hạt giống và trong một số loài thực vật có chức năng dự trữ (Joseleau và Barnoud, 1974; Mc Neil & cộng sự, 1979; Shaw & cộng sự, 1966) Ở vị trí phía trong của vách tế bào, xylan liên kết với những thành phần cấu trúc khác, đặc biệt là với vi sợi cellulose, với những polymere không phải cellulose khác, trong hầu hết các trường hợp là với lignin Xylan liên kết với lignin bằng liên kết hydrogen và với acid phenon bằng liên kết hóa trị [35]

16

(a)

(b) Hình 1.2 Cấu trúc xylan trong cây gỗ

(a) gỗ mềm; (b) gỗ cứng

1.2 ENZYME PHÂN GIẢI XYLAN - XYLANASE

Xylanase được dùng để chỉ một phức hệ các enzyme cần thiết cho quá trình phân hủy hoàn toàn cơ chất xylan, một polysaccharide không đồng nhất Trong tự nhiên, một số vi sinh vật sử dụng các nguồn năng lượng tự sinh ra các loại xylanase khác nhau Các loại enzyme này ngoài chức năng phân hủy thành tế bào thực vật còn kết hợp với các enzyme thủy phân khác tham gia vào quá trình tách dòng

1.2.1 Nguồn gốc xylanase

Xylanase được sinh tổng hợp bởi nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn và động vật nguyên sinh Trong các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp xylanase, nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn là các nhóm quan trọng nhất, đặc biệt là nấm sợi Các nhóm vi sinh vật có khả năng sinh xylanase phân bố khá rộng rãi và tham gia tích cực vào các chu trình tuần hoàn vật chất, nhất là các quá trình phân giải chất hữu cơ để hình thành chất mùn [31]

17

Các loại xylanase được sinh ra bởi vi khuẩn và nấm sợi ưa kiềm có khả năng chịu nhiệt tốt hơn và do đó chúng được ứng dụng rộng rãi và cho hiệu quả cao hơn trong công nghiệp [22]

1.2.2 Phân loại xylanase

Xylanase được nghiên cứu rộng khắp toàn cầu trong suốt hơn hai thập kỷ vừa qua do chúng có những ưu điểm vượt trội được ứng dụng trong công nghiệp, chẳng hạn như trong công nghiệp thực phẩm, sản xuất thức ăn chăn nuôi, công

nghiệp sản xuất bột giấy và làm giấy

Xylanase thuộc nhóm các enzyme thủy phân liên kết glycoside (glycoside hydrolase, GH), thủy phân xylan Glycoside hydrolase là một nhóm enzyme phân

bố rộng rãi, thủy phân các liên kết glycoside trong chuỗi polysaccharide hoặc oligosaccharide Do cấu trúc phức tạp của các carbonhydrate trong tự nhiên, nên các enzyme đặc hiệu cơ chất khác nhau cũng tồn tại số lượng lớn song song với nó GH

từ các nguồn khác nhau được phân loại thành các họ khác nhau dựa vào trình tự axit amin tương đồng Nguyên tắc cơ bản là từ trình tự axit amin bậc một có thể thấy được mối liên kết trực tiếp giữa cấu trúc bậc này và sự cuộn gấp của các enzyme đối với các thành viên trong một hệ nhất định [7]

Trước đây, các nhà khoa học cho rằng xylanase khác với hệ enzyme glycoside hydrolase (GHs), nhưng gần đây, người ta nghiên cứu được rằng xylanase

có các đặc điểm thuộc hệ enzyme GH5, GH7, GH8, GH10, GH11 và GH43 [19]

Nhưng đa phần xylanase thuộc nhóm GH10 và GH11 [21] Xylanase thuộc hệ

GH10 có khối lượng phân tử nhỏ nhất là 30 kDa và thuộc nhóm acid xylanase Còn xylanase thuộc hệ GH11 có khối lượng phân tử lớn nhất là 30 kDa và thuộc nhóm alkaline xylanase [37]

Dựa vào sự tương đồng trình tự acid amin và các kết quả phân tích về cấu trúc không gian, xylanase chủ yếu được xếp vào họ 10 và 11 của hệ enzyme thủy phân glycoside (Collin & cộng sự, 2005; Jeya & cộng sự, 2009; Sibtain & cộng sự, 2009) Xylanase cả hai họ 10 và 11 đều thủy phân xylan bằng cơ chế thay thế hai lần liên quan đến hai acid glutamic (Sinnot, 1990) Hai phân tử acid này nằm tại trung tâm hoạt động của enzyme và quyết định một phần đến sự hình thành cấu trúc của xylanase Một phân tử acid hoạt động như một chất xúc tác bằng cách thêm proton vào cơ chất, trong khi phân tử acid thứ hai có ái lực mạnh với nhân, có vai trò mở đầu cho phản ứng phân cắt và trong sự hình thành enzyme α-glycosyl (Collin & cộng sự, 2005) [12]

Cơ chế xúc tác

Nhóm acid/base chính

Nucleophilchase chính

11 173 β-Jelly roll Giữ nguyên Glutamate Glutamate

5-Blade propeller Đảo ngược Glutamate Aspartate Các thành viên họ xylanase 10 có cấu trúc α/β gấp cuộn 8 lần và trọng lượng phân tử xấp xỉ 48 kDa, pI thấp, và thủy phân các liên kết glycoside với sự giữ được hình thể nguyên vẹn, trong khi đó, họ xylanase 11 có cấu trúc mạch β gập hình bánh sandwich gần giống với cấu trúc bàn tay phải và có khối lượng phân tử nhỏ hơn, vào khoảng 20 kDa, pI cao và thủy phân các liên kết glycoside với cơ chế xúc tác đổi chỗ hai lần (Hakylinen & cộng sự, 2003; Zhou & cộng sự, 2009)

β-Xylanase thuộc hệ GH10 thuộc nhóm acid xylanase β-Xylanase thuộc hệ

GH11 thuộc nhóm alkaline xylanase [36]

1.2.3 Cấu trúc

Cấu trúc bậc ba của phân tử xylanase được xác định bằng cách sử dụng mô hình Insight II Molecular Theo đó, cấu trúc xylanase bao gồm một miền đơn có chứa 2 vùng cấu trúc β và một miền có chuỗi xoắn α, các cấu trúc này chỉ có ở xylanase hệ GH11 Cấu trúc chung của phân tử xylanase được ví như ―bàn tay phải‖ với các ngón tay ở phía dưới và ngón cái nằm phía trên Trung tâm hoạt động là ngón tay cái, lòng bàn tay và ngón tay

19

Hình 1.3 Cấu trúc không gian xylanase của Bacillus subtilis [18]

Xylanase được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1955 Đó là enzyme thủy phân xylan, phá vỡ liên kết β-1,4-xylanosidic của xylan thành nhiều xylo-oligosaccharide

20

Hình 1.4 Các enzyme cần thiết phân cắt hoàn toàn xylan [36]

Vai trò của các enzyme chính trong hệ thống enzyme xylanolytic cụ thể như sau:

β-1,4-endo-xylanase và ferulic acid esterases

Hai enzyme β-1,4-endo-xylanase và ferulic acid esterases là hai enzyme có vai trò chủ đạo trong quá trình thủy phân mạch chính của xylan Trong đó, β -1,4-endo-xylanase tấn công vào liên kết xylosidic của mạch chính còn ferulic acid

esterases tấn công các liên kết xylosyl còn lại và giải phóng ra các

xylooligosaccharides Hai enzyme này là thành phần chính của hệ enzyme xylanolytic do các vi sinh vật phân hủy sinh học sinh ra, chẳng hạn như các loài

thuộc các chi Trichoderma, Aspergillus, Schizophyllum, Bacillus, Clostridium và Streptomyces [30]

Ferulic acid esterases là enzyme ngoại bào exoglyosidase thủy phân các

oligosaccharide ngắn và xylobiose thành đường xylose Ferulic acid esterases có thể

phân hủy các chất nhân tạo như p-nitrophenyl β-D-xyloside [31] Trong số các

xylooligomer, xylobiose thường là cơ chất tốt nhất Ái lực của enzyme đối với xylooligosaccharide giảm theo mức độ tăng của phản ứng polymer hóa [22] Hầu

hết các ferulic acid esterases được nghiên cứu cho đến nay đều bị ức chế bởi xylose

- sản phẩm thủy phân của chúng Nhiều ferulic acid esterases có hoạt độ transferase,

đặc biệt là ở các nồng độ cơ chất cao, tạo ra sản phẩm phân tử lượng cao

α-L-Arabinofuranosidase

21

Mặc dù enzyme arabinosidase đóng vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân xylan nhưng chỉ có một vài enzyme đã được tinh sạch và mô tả Có hai loại enzyme arabinase, các enzyme α-L-arabinofuranosidase ngoại bào (EC 3.2.1.55) hoạt hóa ngược lại với p-nitrophenyl-α-L-arabinofuranosida trên các arabinan phân nhánh và các enzyme 1,5-alpha-L-arabinase nội bào (EC3.2.1.99), chỉ hoạt hóa các arabinan dạng thẳng

α-L-Arabinofuranosidase có khả năng thủy phân cả hai liên kết 1,3- và

1,5-α-L-arabinofuranosyl trong arabinoxylolan đã được báo cáo trong A ninger và B subtilis Enzyme này đặc hiệu cao đối với arabinoxylan và có thể giải phóng mỗi

arabinose từ arabinoxylan Khi giải phóng arabinose, mạch chính xylan không bị thủy phân và không tạo ra xylooligosaccharide Enzyme này không tác động đối với α-L-1,3 hoặc α-1,5 liên kết arabinose từ arabinan, arabinogalactan, hoặc p-nitrophenyl-alpha-L-arabinofuranoside

1.2.5 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt động của enzyme xylanase

1.2.5.1 1.2.5.1 Ảnh hưởng của một số ion kim loại

Các ion kim loại có thể kìm hãm hay hoạt hóa enzyme Các ion kim loại nặng, ở nồng độ gây biến tính protein, có tác dụng kìm hãm không thuận nghịch hoạt độ enzyme Tác dụng của ion kim loại phụ thuộc nhiều vào nồng độ của chúng Mức độ hoạt hóa của enzyme chỉ tăng theo nồng độ ion kim loại ở những nồng độ thấp trong một giới hạn xác định, khi vượt qua ngưỡng nồng độ này những ion kim loại lại có tác dụng kìm hãm enzyme Giới hạn nồng độ có tác dụng hoạt hóa enzyme của mỗi ion kim loại có thể khác nhau, vì vậy ở cùng nồng độ, cùng điều kiện phản ứng, đối với một enzyme, hai ion có thể có tác dụng trái ngược nhau Hiện tượng này thường xảy ra giữa các ion cùng hóa trị Ảnh hưởng của mỗi ion

22

kim loại đến hoạt động của enzyme xylanase của các loài khác nhau là không giống nhau [1]

1.2.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Do bản chất hóa học của enzyme là protein nên khác với các phản ứng hóa học, vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định khi chưa ảnh hưởng đến cấu trúc của enzyme

Đại lượng đặc trưng cho ảnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng là hệ

số Q10 Đó là tỷ lệ của vận tốc phản ứng ở một nhiệt độ nào đó so với vận tốc phản ứng ở nhiệt độ thấp hơn 10oC Hệ số này càng lớn, phản ứng càng khó xảy ra ở nhiệt độ thường

Q10 = kt+10 /kt

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng enzyme cho thấy, nhiệt độ hoạt động thích hợp (topt) của nhiều enzyme vào khoảng 40-50oC; trên 50oC hoạt độ thường bị giảm mạnh do cấu trúc phân tử của enzyme bị phá vỡ [1]

Xylanase, được sinh tổng hợp bởi nấm thường có nhiệt độ thích hợp là

40-60oC Ví dụ, xylanse của Aspegillus niger hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ từ 45-50oC Còn đối với xylanase, được sinh tổng hợp bởi các loài vi khuẩn thường có nhiệt độ thích hợp từ 37-80oC [21] Ví dụ, xylanase của Bacillus sp hoạt động tốt nhất ở

nhiệt độ từ 50-80oC

1.2.5.3 Ảnh hưởng của pH

Hoạt độ của enzyme phụ thuộc vào pH môi trường Đó là do pH ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa gốc R của các gốc acid amin trong phân tử enzyme, ion hóa các nhóm chức trong trung tâm hoạt động, ion hóa cơ chất, ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng Đường biểu diễn vận tốc của nhiều phản ứng enzyme ở các pH khác nhau

có dạng hình chuông hẹp cân đối, có đỉnh chuông ứng với pH trung tính Như vậy

pH thích hợp (pHopt) của phần lớn enzyme vào khoảng 7 Tuy nhiên, một số enzyme

có pHopt rất thấp (pepsin, protease acid của vi sinh vật), hoặc khá cao như subtisin

(protease kiềm của Bacillus), hoặc ít thay đổi trong một khoảng pH xác định [1]

Xylanase được sinh tổng hợp bởi nấm thường hoạt động ở khoảng pH từ

3,5-6,5 Ví dụ, pH tối ưu cho xylanase của Aspegillus niger là 5 Còn đối với xylanase được sinh tổng hợp bởi các loài vi khuẩn như Bacillus thường có khoảng pH rộng

hơn từ 4-10 [21]

23

1.2.5.4 Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa

Các chất tẩy rửa và dung môi hữu cơ có ảnh hưởng rất mạnh tới hoạt độ của enzyme, tùy từng loại enzyme mà sự ảnh hưởng của các dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa là khác nhau Trịnh Đình Khá (2006) khi nghiên cứu trên chủng

Penicillium sp DTQ-HK1 cho thấy các chất tẩy rửa Tween 20, Tween 80, Trixton

X-100, SDS đều làm giảm hoạt tính của xylanase và SDS làm giảm mạnh nhất, chỉ còn 18-34% Các dung môi hữu cơ (methanol, ethanol, isopropanol và aceton) đều ức chế hoạt tính xylanase, riêng n-butanol ức chế chỉ còn 33-63%

Đỗ Thị Tuyên & cộng sự (2008) cho rằng các dung môi hữu cơ methanol,

ethanol, isopropanol không ảnh hưởng mạnh tới hoạt độ xylanase từ chủng A ozyzae DSM1863, riêng n-butanol làm tăng và aceton làm giảm nhẹ hoạt tính

Tween 20 và Triton X-100 không ảnh hưởng mạnh ở nồng độ thấp (0,2-1%) nhưng làm giảm hoạt tính xylanase ở nồng độ cao (2%), trong khi đó SDS làm giảm hoạt độ enzyme mạnh ở tất cả các nồng độ [31]

1.2.6 Ứng dụng của xylanase

1.2.6.1 Ứng dụng của xylanase trong công nghiệp thực phẩm

Công nghiệp thực phẩm là một trong những ngành công nghiệp có giá trị kinh tế lớn mà trong đó sự trao đổi chất của vi sinh vật có nhiều ứng dụng, doanh thu trên toàn thế giới hàng năm của ngành này lên tới 109 đô la cùng với đó các nghiên cứu liên quan đến lĩnh vực này cũng tăng lên dần Xét ở quy mô công nghiệp, sản xuất enzyme là một lĩnh vực đang ngày càng phát triển của công nghệ sinh học nói chung và công nghệ thực phẩm nói riêng Các enzyme đóng vai trò vô cùng quan trọng, nhu cầu sử dụng enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật ngày càng tăng cao, đặc biệt là enzyme xylanase, được sử dụng trong nhiều ngành sản xuất trên toàn thế giới [14]

Xylanase được ứng dụng trong sản xuất nước hoa quả và làm trong rượu Trước kia, người ta chỉ lọc dịch hoa quả rồi bỏ bã, nhưng khi bổ sung xylanase vào phần bã hoa quả sau khi lọc sẽ thu được một lượng dịch hoa quả bổ sung thêm Hơn nữa, xylanase còn có thể hoạt động trong điều kiện nhiệt độ cao (khoảng 60-70oC) nên có thể ngăn chặn được sự nhiễm vi sinh vật khi chế biến nước hoa quả ở nhiệt

độ cao [15]

Xylanase còn được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm như trong công nghệ sản xuất bánh nướng, hỗ trợ quá trình đường hóa lignocellulose (một polysaccharide khó phân hủy trong thành tế bào thực vật)

24

1.2.6.2 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy

Trước đây việc tẩy trắng giấy phải sử dụng một lượng rất lớn chloride và các hóa chất khác Điều này ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường, vì vậy việc thay thế chloride bằng enzyme xylanase trong sản xuất là rất cần thiết để giảm thiểu ô nhiễm môi trường

Cách đây vài thập kỉ, việc sử dụng xylanase vào công nghiệp sản xuất giấy

đã được ứng dụng Gần đây, các nhà khoa học Canada đã thành công trong việc sử dụng enzyme xylanase cho công nghiệp giấy và bột giấy, nhằm giảm giá thành và giảm lượng chloride đến 90%

Hình 1.5 Sự thủy phân thành tế bào thực vật bằng enzyme [36]

Xylanase hoạt động tốt ở nhiệt độ 50–70oC, đây cũng là nhiệt độ của quá trình tẩy trắng giấy Xylanase được bổ sung vào quy trình sản xuất ngay khi cho

nguyên liệu vào trộn

1.2.6.3 Ứng dụng của xylanase trong sản xuất nguyên liệu sinh học

Sự tiêu thụ nhanh chóng nguồn năng lượng hóa thạch đang cần sự thay thế từng bước một với các nguồn năng lượng thay thế, nguồn này phải thân thiện với môi trường và phải góp phần bảo vệ trái đất thoát khỏi khủng hoảng nhiên liệu Để thu được bioethanol cần biến đổi nguyên liệu từ thực vật qua các bước như: tiền xử lý bằng hóa chất, sau đó thủy phân lignocellulose

25

biopolymere thành các đường khử (sử dụng enzym hoặc hóa chất), rồi lên men các đường khử thành rượu, và cuối cùng là chưng cất và tinh chế bioethanol [11] Tuy nhiên, bước tiền xử lý và sử dụng hóa chất để thủy phân làm giá thành sản xuất cồn còn cao và gây ảnh hưởng lớn tới môi trường Do đó mà các nhà nghiên cứu đang

cố gắng sử dụng công nghệ enzym để thực hiện quá trình này, việc nghiên cứu tạo

ra các loại enzym có hoạt độ cao, và phối hợp sử dụng các enzyme như xylanase, cellulase, lactase đang được đẩy mạnh nghiên cứu

1.2.6.4 Ứng dụng trong công nghiệp vải sợi

Xylanase có nhiều ứng dụng trong công nghiệp vải sợi Xylanase tham gia vào quá trình tách xylan và lignin để thu cellulose một cách nhanh chóng và dễ dàng Do xylan liên kết với lignin, nên để tách được sợi màu nâu từ lignin thì phải tách xylan ra khỏi lignin Xylanase giúp tẩy màu và làm mềm sợi lanh và sợi gai [4]

1.2.6.5 Ứng dụng trong nông nghiệp

Thành phần chủ yếu trong thức ăn chăn nuôi là ngũ cốc có bổ sung thêm các nguyên liệu giàu protein như đậu tương, hoặc nguyên liệu giàu lipid Nhiều thức ăn thực vật có chứa khoảng 30% cellulose, hemicelulose, pectin (những chất mà động vật không hấp thu được) Xylan là chất xơ khó phân hủy trong thực vật và là chất khó tiêu trong thức chăn nuôi Vì thế việc bổ sung xylanase phân giải xylan thành các sản phẩm phân tử thấp giúp động vật dễ tiêu hóa, dễ hấp thụ, và làm giảm ô nhiễm môi trường

Những khẩu phần ăn cơ bản (hạt mì) có chứa pentosan (dạng polysaccharide không tinh bột) cao không thể tiêu hoá được bởi những enzyme tiết ra trong dạ dày của lợn Tuy nhiên, pentosan ở trong hạt mì lại dễ bị phân huỷ bởi xylanase

1.2.6.6 Ứng dụng của xylanase trong xử lý môi trường

Cùng với sự phát triển ngày càng nhanh của xã hội, lượng chất thải cũng tăng khá nhanh Biện pháp xử lý rác thải chủ yếu của nước ta là chôn lấp, nhưng cách này tốn diện tích, thời gian phân hủy dài, đồng thời quá trình xử lý nước rỉ từ rác rất tốn kém Đó là vấn đề đang được quan tâm tại Việt nam hiện nay Việc bổ sung xylanase giúp cho quá trình phân hủy rác hữu cơ nhanh hơn, góp phần giảm nguy

cơ ô nhiễm môi trường

Nguồn chất khô hemicellulose (xylan) được tổng hợp hằng năm rất lớn Vì vậy, việc tận dụng nguồn chất hữu cơ này để làm nguyên liệu cũng như nhiên liệu là

1.2.7 Vi sinh vật sinh xylanase

Như đã trình bày ở mục 1.2.2, xylanase được sinh tổng hợp bởi nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn và động vật nguyên sinh Xylanase chủ yếu thuộc hệ 10 và 11 của

hệ enzyme thủy phân glycoside Xylanase thường được tổng hợp bởi một số vi sinh

vật như Streptomyces, Bacillus, Trichoderma, Aspergillus, Thermobacillus …[36]

Trong các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp xylanase, chi Bacillus

và Streptomyces đặc biệt được quan tâm nghiên cứu Vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đa dạng về sinh thái Các loài thuộc chi Bacillus đã,

đang và ngày càng trở thành những vi sinh vật quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng Các ứng dụng của chúng bao trùm hàng loạt lĩnh vực, từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống đến công nghệ lên men hiện đại, đến sinh học phân tử, y-dược học chữa các bệnh hiểm nghèo, mỹ phẩm, xử lý môi trường ô nhiễm, thu hồi bạc kim loại từ các phế liệu Chính vì lẽ đó nên đã có ngày càng nhiều các nghiên

cứu sâu về chi Bacillus này cũng như mở rộng ứng dụng của chúng đối với đời sống

con nguời, trong đó có rất nhiều nghiên cứu công bố liên quan đến khả năng sinh xylanase của các chủng thuộc chi này [3]

Chi Streptomyces được Wakman và Henrici đặt tên năm 1943 [32] Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất Streptomyces có tiềm năng rất lớn trong

viê ̣c sinh tổng hợp nhiều hợp chất có hoạt độ sinh ho ̣c , phân giải nhiều hợp chất phức ta ̣p, kích thích sự phát triển của cây trồng , có vai trò quan tro ̣ng trong các chu

trình vật chất ngoài tự nhiên Đặc biệt , Streptomyces có khả năng sinh t ổng hợp

nhiều loa ̣i enzyme th ủy phân có hoa ̣t tính cao , trong đó phải kể đến xylanase [13,25,29,5]

1.3 LÊN MEN XỐP

1.3.1 Khái niệm lên men xốp

Thuật ngữ lên mên xốp được dùng cho các quá trình mà trong đó vi sinh vật sinh trưởng bằng cách sử dụng các vật liệu không tan trong nước, trong quá trình lên men này độ ẩm không vượt quá hàm lượng bão hòa của cơ chất xốp Nước là yếu tố thiết yếu cho sự sinh trưởng của vi sinh vật trong lên men xốp, mặc dù chỉ

27

cần một lớp nước mỏng và thông thường nước sẽ được hấp thụ vào bên trong cơ chất

1.3.2 Ƣu điểm của kỹ thuật lên men xốp

Trước đây, ở các nước phương Tây, lên men xốp vẫn ít được chú ý so với lên men dịch thể Sự khác nhau cơ bản nhất giữa các quá trình lên men này là ở một số yếu tố như độ ẩm tối ưu, sự hình thành gradient nhiệt độ, gradient dinh dưỡng, các sản phẩm lên men, cơ chế hình thành bào tử cũng như khả năng sinh enzyme và cơ chế hình thành các chất trao đổi thứ cấp trong quá trình lên men như các chất kháng sinh, acit citric và các chất tạo mùi

Các cơ chất được sử dụng trong lên men xốp được thu thập từ các phế phẩm công nông nghiệp (ví dụ, trấu lúa mì hoặc lúa mì, bã mía, bã cà phê, bã nho, cùi dừa,…) hoặc các nguyên liệu trơ (các chất nhựa trong trao đổi ion) cũng được sử dụng Cơ chất sử dụng gần như không phải xử lý trước khi dùng, trường hợp phải tiền xử lý thì chỉ cần rửa qua bằng nước

Các ưu điểm chính của kỹ thuật lên men xốp:

- Môi trường nuôi cấy đơn giản Một số cơ chất có thể được sử dụng trực tiếp làm môi trường xốp hoặc được cho thêm một số dưỡng chất trước khi sử dụng

- Sản phẩm enzym thu được ở dạng đậm đặc

- Độ ẩm tối ưu thấp và phần lớn giống cấy được sử dụng trong lên men xốp giảm được tối đa nguy cơ nhiễm độc vi sinh vật

- Lượng chất thải sinh ra trong lên men xốp ít hơn so với lên men dịch thể

- Enzyme tạo ra ít nhạy cảm với các chất kìm hãm hoặc ức chế trao đổi chất

Mặc dù có nhiều ưu điểm vượt trội nhưng kỹ thuật lên men xốp cũng vẫn tồn tại một số ít nhược điểm như sau:

- Vi sinh vật được dùng trong nghiên cứu bị giới hạn khả năng sinh trưởng vì

độ ẩm của môi trường hạn chế

- Việc xác định các thông số như độ ẩm, pH, hàm lượng oxy và CO2 tự do là một vấn đề khó khăn vì thiếu dụng cụ tiến hành

- Phạm vi ứng dụng kỹ thuật lên men xốp còn chưa được nghiên cứu rộng rãi Tuy vậy xét về tổng thể, kỹ thuật lên men xốp vẫn có nhiều ưu điểm vượt trội hơn so với các loại hình lên men khác: thân thiện với môi trường sống tự nhiên của các vi sinh vật; năng suất cao hơn trong sản xuất một số loại enzyme nhất định (Babu & cộng sự, 1995; Jecu, 2000); tiết kiệm không gian sản xuất; môi trường

Trong lên men xốp, do độ ẩm thấp nên chỉ có một số loài vi sinh vật nhất định có khả năng thích nghi, chủ yếu là nấm men và nấm, tuy nhiên một số ít loài vi khuẩn cũng được sử dụng trong quá trình này (Pandey & cộng sự, 2000) Một vài ví

dụ điển hình về các vi sinh vật được dùng trong lên men xốp và ứng dụng của chúng được ghi trong bảng sau:

Bảng 1.3 Một số nhóm vi sinh vật được dùng trong lên men xốp (Raimbault,

Nấm men

Saccharomyces cerevisiae Thực phẩm, rượu

Phanerochaete chrysosporium Ủ phân bón, phân hủy lignin

Beauveria sp., Metharizium sp Kiểm soát sinh học, thuốc trừ sâu sinh học

29

Aspergillus niger Thức ăn chăn nuôi, proteing, amylase và acid citric

Pleurotus oestreatus, sajor-caju Nấm

Penicilium notatum, roquefortii Sản xuất penicilin, nấm

Quá trình lên men xốp sử dụng Aspergillus oryzae (thường được gọi là Koji)

được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất các loại đồ uống như rượu, bia và các

thức uống có cồn, Penicillium roque-fortii được dùng trong sản xuất pho mát Ở

Trung Quốc, lên men xốp được dùng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm pha chế (như rượu, nước tương, và giấm) từ những năm 1990 (Chen, 1992) Ở Nhật, lên men xốp trở thành một ngành thương mại sản xuất các enzyme công nghiệp (Suryanarayan, 2003) Từ năm 1986 ở Brazil, nhiều dự án nghiên cứu về giá trị của sản phẩm nông nghiệp ở các vùng nhiệt đới và các sản phẩm phụ nhờ lên men xốp được thực hiện quy mô lớn sử dụng các phế thải nông nghiệp của chính quốc gia này (Soccol & Vandenberghe, 2003)

Năm 2000, nhóm tác giả Maheswari & cộng sự thuộc Viện nghiên cứu công nghệ Ấn Độ đã tiến hành công trình nghiên cứu ―Sử dụng kỹ thuật lên men xốp trong sản xuất và nghiên cứu các ứng dụng của xylanase từ chủng xạ khuẩn

Streptomyces cuspidosporus” Chủng xạ khuẩn này được phân lập từ các mẫu đất

mùn ngay trong khuôn viên của Viện Đây là một trong những công trình đầu tiên

được công bố trong lĩnh vực sản xuất enzyme xylanase từ chủng Streptomyces cuspidosporus bằng lên men xốp [27]

Năm 2007, Sanghi & cộng sự đã sử dụng kỹ thuật lên men xốp để sản xuất

xylanase từ Bacillus subtilis ASH sử dụng cơ chất là phế thải trong nông nghiệp

Theo kết quả của nhóm tác giả, hoạt độ xylanase đạt được lên đến 7482 ± 45.21 U/g Công trình nghiên cứu này không chỉ có ứng dụng rộng rãi trong xử lý môi trường, xử lý rác thải mà còn chứng minh được ưu điểm vượt trội của lên men xốp trong công nghệ sản xuất enzyme [26]

Aguilar & cộng sự (2008) đã công bố công trình nghiên cứu về những ưu điểm của lên men xốp trong lĩnh vực sản xuất enzyme thực phẩm Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã so sánh hiệu quả của lên men xốp so với các loại hình lên men khác Kết quả cho thấy, lên men xốp có nhiều ưu điểm hơn cả và có thể tạo ra hiệu suất sản xuất enzyme cao nhất trong các kỹ thuật lên men sản xuất

vi sinh vật khác nhau nhằm phục vụ cho nhu cầu sử dụng enzyme ngày càng tăng cao

1.4 TINH SẠCH ENZYME XYLANASE

Trong các tổ chức của cơ thể sống, protein có thể ở dưới dạng tự do trong các dịch sinh vật hoặc dưới dạng kết hợp, hoặc bị giữ trong các tế bào Hơn nữa, trong tế bào có chứa hàng nghìn loại protein khác nhau, nên khi chúng ta cần nghiên cứu từng loại protein, trước hết phải chiết rút và tinh sạch chúng Chính vì vậy, các

kỹ thuật chiết rút, tinh sạch và nghiên cứu protein luôn ở vị trí trung tâm của các nghiên cứu hóa sinh và luôn được cập nhật và hiện đại hóa [38]

Tinh sạch enzyme là một chuỗi các quá trình liên tiếp nhằm tách riêng một loại enzyme từ hỗn hợp ban đầu Tinh sạch enzyme là quá trình thiết yếu để xác định được các đặc tính về cấu trúc - chức năng, động lực học, cơ chế xúc tác và sự tương tác giữa các loại enzyme quan trọng Nguyên liệu khởi đầu được sử dụng cho quá trình tinh sạch thường là một loại mô sinh học hoặc dịch nuôi cấy vi sinh vật Quá trình tinh sạch enzyme cho phép tách chiết một loại enzyme từ một hỗn hợp ban đầu có chứa loại enzyme đó, tách riêng các phần có bản chất là protein và phần không có bản chất là protein trong hỗn hợp Quá trình tách chiết này là một quá trình khá phức tạp Các bước tách chiết này dựa vào kích thước phân tử, đặc tính lý hóa, khả năng bám dính và hoạt độ sinh học của từng loại enzyme

Mục đích của việc tinh sạch enzyme nhằm tối ưu hóa hoạt độ xúc tác của enzyme, tinh sạch tối đa được enzyme và nghiên cứu các đặc tính của chúng Tinh sạch enzyme còn được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y tế và công nghiệp

Muốn tinh sạch được enzyme mà vẫn giữ nguyên được đặc tính của nó thì chúng ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, dựa vào nhiệt độ, nồng độ proton (pH), hoặc các tác nhân hóa học (các muối trung tính (NH4)2SO4, Na2SO4,

…)

Để tinh sạch được enzyme, người ta thường sử dụng kết hợp đồng thời nhiều

kỹ thuật khác nhau: thu hồi enzyme bằng muối ammonisunfat, sắc ký trao đổi ion, điện di SDS-PAGE và điện di trên gel hoạt tính

31

1.4.1 Tủa enzyme bằng muối ammonisunfat

Ở nồng độ muối cao, phần lớn protein sẽ giảm tính hòa tan, hiện tượng này gọi là tủa bằng muối (salting out) Mỗi loại protein sẽ kết tủa ở một nồng độ muối nhất định Vì vậy, hiện tượng tủa bởi muối có thể được dùng để phân đoạn protein

Có thể dùng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ để thu hồi các protein enzyme Phương pháp này được tiến hành dựa trện cơ sở: độ hòa tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử protein với các phân tử nước Người ta có thể dùng các muối trung tính để tủa protein vì các muối này vừa làm trung hòa điện tích (do các ion tác động tương hỗ với các nhóm tích điện trái dấu), vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat của phân tử protein Các protein khác nhau

có thể bị kết tủa với nồng độ muối khác nhau, vì vậy có thể dùng muối để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng

Hầu hết enzyme tồn tại trong dịch tế bào đều là những protein ở dạng hoà tan Độ hoà tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác có cực của protein với dung môi, sự tương tác ion của protein với các phân tử muối hiện diện trong dung dịch và

sự tương tác tĩnh điện giữa phân tử mang điện tích hay những nhóm phân tử mang điện tích của protein kết dính lại với nhau

Quá trình kết tủa protein bằng dung dịch muối có nồng độ cao phụ thuộc rất lớn vào tính kỵ nước của phân tử protein Trong dung dịch các gốc kỵ nước của phân tử protein tập trung trên bề mặt, tiếp xúc trực tiếp với các phân tử nước Các phân tử nước này ngăn cản quá trình hình thành liên kết tạo kết tủa giữa các phân tử protein như nhau Khi nồng độ dung dịch muối tăng các phân tử muối bị solvate hoá làm giảm số phân tử nước xung quanh bề mặt các phân tử protein tạo điều kiện cho các bề mặt kỵ nước tiến đến gần nhau và kết tủa xuống

Mặc dù quá trình kết tủa bằng dung dịch muối có nồng độ cao phụ thuộc nhiều vào các phần tử kỵ nước của protein nhưng các yếu tố khác như pH, nhiệt độ cũng gây ảnh hưởng đến quá trình này Ở pH gần điểm đẳng điện pI thì quá trình kết tủa xảy ra dễ dàng hơn và khi nồng độ muối cao thì độ hoà tan của protein giảm Ngoài ra, trong quá trình kết tủa protein bằng muối có nồng độ cao cần lưu ý đến bản chất của muối dùng kết tủa những loại muối có gốc anion tích điện tích âm như: SO42-, PO43-, là những loại muối làm tăng hiệu quả của quá trình kết tủa Gốc cation tuy không ảnh hưởng nhiều nhưng lưu ý không sử dụng các ion phức hoặc các ion có khả năng hình thành liên kết với phân tử protein Dó đó những ion NH4+,

Na+, K+ thường được sử dụng

32

Các muối trung tính có thể dùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4 Tuy nhiên, muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại mà làm bền hầu hết các loại protein enzyme Loại muối này lại rẻ tiền và phổ biến Độ hòa tan của nó lại rất lớn (bão hòa 767g/l ở 250C) Nồng độ (NH4)2SO4 cần thiết để kết tủa protein enzyme khác nhau là khác nhau

Có thể dùng (NH4)2SO4 ở cả 2 dạng: dạng bột và dạng dung dịch bảo hòa Khi dùng bột, người ta cho từng ít một vào dịch chiết protein enzyme Cách cho cũng ảnh hưởng lớn đến lượng kết tủa ban đầu của protein enzyme Khi cho muối vào dịch chiết cần phải có máy khuấy từ để đảm bảo sự hòa tan của muối Nếu thêm từng phần các dung môi hữu cơ hoặc từng phần muối (NH4)2SO4 thì ta có thể tách từng phần hỗn hợp protein Tuy nhiên, để phân chia hoàn toàn những hỗn hợp phức tạp, phương pháp này không cho kết quả tốt vì độ hòa tan của một số protein bị tăng lên Mặc dầu vậy, cách kết tủa từng phần này cũng rất có lợi, đặc biệt là đối với giai đoạn đầu của việc tách chiết và làm sạch protein emzyme, vì phương pháp khá đơn giản[34]

1.4.2 Tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ

Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch Nhìn chung, những phân tử dung môi có hằng số điện môi lớn (như nước, dimethylsulphoxid) có thể ổn định tương tác giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch Ngược lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (aceton, ethanol,…) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trường Do đó,

độ hòa tan của những phân tử protein giảm và xảy ra kết tủa do sự làm giảm hằng

số điện môi hiện hữu của môi trường Điều này có được bằng cách thêm một dung môi hòa tan trong nước như aceton vào dung dịch chứa protein

Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi tăng lên, khả năng hòa tan của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa Tuy nhiên, các dung môi hữu

cơ lại có ái lực với các bề mặt kỵ nước của phân tử protein Kết quả là chúng làm biến tính protein trong suốt quá trình tủa Do đó, khi tủa, chỉ nên sử dụng các dung môi hữu cơ ở nồng độ thấp Thường các protein bị biến tính bởi các dung môi hữu

cơ nên cần thiết làm việc ở nhiệt độ dưới 0oC

Tủa protein bằng các dung môi hữu cơ như cồn và aceton là sự kết tủa thuận nghịch, do đó khi không còn tác nhân gây kết tủa nữa thì protein lại trở lại trạng thái hoà tan bình thường Sự tủa bằng aceton hoặc ethanol có nhiều thuận lợi hơn so với

33

các dung môi hữu cơ khác vì chi phí tương đối rẻ, có sẵn ở dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzym, do nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzym bằng phương pháp sấy nhẹ bằng quạt gió Do bản chất dễ cháy của các dung môi hữu cơ nên cần phải sử dụng thiết bị chịu lửa và giá thành cao, vì thế các dung môi hữu cơ thường không được dùng để tinh sạch enzyme ở quy mô lớn

1.4.3 Sắc ký

Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích trên 2 pha: Một pha đứng yên có khả năng hấp thụ chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động; do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau Các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn với pha này Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách phân đoạn các chất nhờ quá trình sắc ký

Thuật ngữ sắc ký để chỉ các kỹ thuật phân tách và điều chế cho phép tách biệt các hợp phần khác nhau của một hỗn hợp Người ta thường chọn các chất có khả năng gắn kết được với các chất định phân tách làm pha tĩnh Tương tác giữa chất hòa tan và pha tĩnh có thể là tương tác hấp phụ, tương tác ion (trao đổi ion), tương tác kỵ nước, tương tác kiểu rây phân tử hoặc tương tác đặc hiệu sinh học Trong hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký

Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký là một kỹ thuật chuẩn được sử dụng trong phòng thí nghiệm trong nhiều năm Để tinh sạch các chất đích có thể tích nhỏ và giá trị cao, các protein trị liệu hoặc chẩn đoán đặc hiệu, thì phương pháp sắc ký là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất Sắc ký là phương pháp để tinh sạch một protein riêng rẽ khỏi hỗn hợp phức tạp của các protein tới một sự tinh sạch cuối cùng lớn hơn 95% Các kỹ thuật phân tách bằng sắc ký được sử dụng phổ biến, bao gồm trao đổi ion, tương tác kỵ nước, ngăn chặn kích thước, ái lực và ái lực giả, lọc gel, lỏng hiệu năng cao, sắc ký giấy và sắc ký khí

1.4.3.1 Sắc ký lọc gel

Trong sắc ký lọc gel, sự phân tách protein dựa trên kích thước phân tử Pha tĩnh chứa các hạt gel (polymere) xốp có những lỗ nhỏ li ti được bao quanh bởi pha dung môi chuyển động Khi cho protein chảy qua cột thì các phân tử lớn của hỗn hợp có đường kính lớn hơn lỗ của hạt gel nên không thể khuếch tán vào bên trong

1.4.3.2 Sắc ký trao đổi ion

Sắc ký trao đổi ion được sử dụng rộng rãi nhất, có thể bao gồm cả trao đổi cation và anion mạnh và yếu Trong sắc ký trao đổi ion, các protein bị tách dựa trên

sự khác nhau về điện tích Các protein và enzyme nói chung được hấp phụ ở lực ion thấp hoặc ở các giá trị pH trong đó điện tích ion tổng số đủ mạnh để tương tác với điện tích đối của nhựa trao đổi ion Sự tách rửa protein được thực hiện dễ dàng bằng cách thay đổi pH hoặc tăng lực ion của dung dịch rửa

Quá trình phân tách trên cột bao gồm hai giai đoạn: - Hấp phụ thuận nghịch protein cần tinh sạch (và các protein có điện tích gần giống) vào nhựa trao đổi ion - Khử hấp phụ các protein bằng cách: (1) thay đổi pH của dịch rửa sẽ dẫn đến thay đổi độ ion hóa và do đó thay đổi điện tích tổng của protein, (2) tăng lực ion và tăng nồng độ ion đối cạnh tranh

Trong sắc ký trao đổi ion, yếu tố quan trọng nhất là pH, khi pH môi trường đạt đến điểm đẳng điện của protein, protein trở thành chất tích điện âm bám vào chất trao đổi anion Nếu pH môi trường chưa đạt đến điểm đẳng điện của protein thì protein trở thành tích điện dương và bám vào chất trao đổi cation Bản chất của cột sắc ký trao đổi ion chính là một acid hoặc bazơ và nguyên tắc hoạt động của nó phụ

tử mang điện tích âm, gọi là sắc ký trao đổi ion âm Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích [33]

Trong sắc ký trao đổi ion, việc gắn một protein vào nhựa trao đổi ion sẽ phụ thuộc vào trạng thái ion hóa của nó, cũng như trạng thái ion hóa của nhựa trao đổi,

pH, lực ion và nhiệt độ Đối với những protein không bị biến tính ở pH cao hơn điểm đẳng điện của chúng thì có thể dùng DEAE-cellulose (nhựa trao đổi anion) còn đối với các protein không bị biến tính ở pH thấp hơn điểm đẳng điện của chúng thì có thể sử dụng ở CM-cellulose (nhựa trao đổi cation)

1.4.3.3 Sắc ký ái lực

Phương pháp này dựa vào khả năng liên kết đặc hiệu và thuận nghịch của một protein với một phân tử khác (phối tử), đã được gắn bằng liên kết đồng hóa trị vào một chất mang không hòa tan chứa trong cột sắc ký Khi cho một hỗn hợp có chứa protein cần làm sạch đi qua thì chỉ có protein quan tâm bị giữ lại, còn tất cả các protein khác không tương tác được với phối tử sẽ bị rửa trôi ra khỏi cột Tiếp

đó, protein sẽ bị rửa giải ra bằng các phương pháp khác nhau Phương pháp sắc ký

ái lực rất hiệu quả trong việc tinh sạch các enzyme, cho phép thu được enzyme có

độ sạch cao, chỉ bằng một giai đoạn và trong một thời gian ngắn Các nhân tố như chất mang, phối tử, phương pháp gắn kết phối tử cũng như các điều kiện rửa giải enzyme đều có vai trò quan trọng trong sắc ký ái lực

Chất mang (pha tĩnh) phải có một số tính chất sau: - Hoàn toàn không hòa tan trong pha di động - Có độ bền về hóa học và sinh học - Có độ cứng cơ học, có tính háo nước và tính thấm - Không có các tương tác phi đặc hiệu - Có chứa nhiều nhóm chức có khả năng biến đổi khi hoạt hóa trong các điều kiện nhẹ nhàng Các

36

chất mang thường là dẫn xuất của cellulose, các dextran gel, thủy tinh xốp Tuy nhiên, người ta hay dùng agarose hoặc các gel hỗn hợp agarose và polyacrylamide

vì chúng có thêm khả năng lọc gel

Phối tử thường là những chất tương tự cơ chất của enzyme muốn tinh sạch, chất kìm hãm hoặc cofactor Phối tử nói chung phải đặc hiệu với protein và phải có một ái lực trung bình với nó Nồng độ phối tử cũng phải được chọn thích hợp và nếu thừa phối tử sẽ gây ra những án ngữ không gian đáng kể Trường hợp khi phối

tử là một phân tử nhỏ hoặc khi phân tử enzyme quá lớn có thể gây ra sự "cồng kềnh không gian" thì phối tử sẽ được nối dài thêm bằng một đoạn "cánh tay đòn" để nó

dễ tiếp cận với tâm hoạt động của enzyme Cánh tay đòn thường là một mạch carbohydrate nhị chức dài từ 6-8 carbon

1.4.3.4 Sắc ký tương tác kỵ nước

Sắc ký tương tác kỵ nước sử dụng tính chất kỵ nước của protein bề mặt như

là một đặc điểm để chọn lọc Loại phân tách này thích hợp khi được tiến hành tiếp theo bước kết tủa ammonium sulphate, và không cần thiết phải loại bỏ muối trước khi thực hiện bước sắc ký này Bằng cách dùng các kỹ thuật hấp phụ và khử hấp phụ bề mặt sẽ làm giảm mạnh thể tích của các dung dịch protein và lượng protein cần tinh sạch sẽ tăng lên từ 90-95% Chất lượng này đủ cho hầu hết các ứng dụng của protein đặc biệt Các protein sẽ lần lượt được phân tách ra tùy theo tương tác của chúng với một chất mang có chứa các nhóm kỵ nước (ưa béo)

Các protein chứa các nhóm kỵ nước trên bề mặt, chất mang kỵ nước và dung môi ưa nước tạo thành một hệ ba thành phần và tương tác được với nhau Hệ này có thể bị rối loạn khi thay đổi nhiệt độ, pH hoặc lực ion Nói chung, các tương tác sẽ mạnh nếu ta tăng lực ion Các protein bị giữ lại, tiếp đó có thể được rửa giải một cách chọn lọc bằng cách giảm lực ion này hoặc bằng cách giảm độ phân cực của dung môi rửa (thêm ethylene glycol hoặc một chất tẩy rửa hoặc tăng pH dịch rửa)

1.4.3.5 Các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao còn được gọi là sắc ký lỏng cao áp hay sắc ký lỏng giá thành cao Đây là phương pháp phân tách các chất bằng cách dùng áp suất

để đẩy nhanh dung dịch qua cột sắc ký với một hiệu suất cao Đầu tiên, kỹ thuật này được thiết kế để phân tách các phân tử hữu cơ nhỏ hòa tan trong các dung môi không phải nước, sau đó kỹ thuật này đã nhanh chóng phát triển thành một phương thức thích hợp để phân tách các protein trong các dung môi nước Tuy nhiên, đa số

so với các phương pháp sắc ký khác nhưng nhược điểm của hệ thống này là đắt tiền nên khó áp dụng ở quy mô lớn [40]

1.4.4 Điện di

Điện di protein (Protein Electrophorus) là dùng dòng điện 1 chiều để dịch chuyển các tiểu phân tử protein trên môi trường gel dựa trên lực Lorenz Những phân tử khác nhau sẽ dịch chuyển với tốc độ khác nhau mà ta có thể quan sát được trên điện di đồ Tốc độ di chuyển này được quyết định bởi 3 yếu tố: điện tích, kích thước và khối lượng phân tử

Điện di hay điện di trên gel (electrophorus hay gel electrophorus) áp dụng trong sinh học phân tử là một kĩ thuật để phân tích các phân tử protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện (isoelectric point) Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn điện và tạo điện trường đều, một bản gel (thường là agarose hay polyacrylamide) đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử, một loại đệm để duy trì pH không đổi tương đối và các chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide, bạc, xanh Coomassie) để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di

Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ di chuyển đến cực âm (-) hoặc cực dương (+) tùy theo điện tích của chúng Protein là loại phân tử có điện tích thực, hoặc âm hoặc dương, còn acid nucleic luôn có điện tích âm không đổi vì khung phosphat của nó, do đó, luôn di chuyển đến cực dương Các phân tử protein được chạy điện di trên một khuôn đỡ (support matrix) như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamide Trong đó, gel agarose

1.4.4.1 Điện di trên gel agarose

Agarose là một polysaccharide có khối lượng phân tử 120.000 Da, là một trong hai thành phần chính của agar chiếm khoảng 70% khối lượng, phần kia là agaropectin chiếm khoảng 30% Agarose là một polymere mạch thẳng màu trong suốt hoặc trong mờ giống agar được tạo thành khi hỗn hợp agarose và nước được đung sôi đến 1000C và sau đó làm lạnh, dạng gel xuất hiện ở 40 đến 450C Gel agarose được dùng làm giá đỡ cho acid nuleic trong kỹ thuật điện di ngang hay trong nuôi cấy bacteriophage Điện di trên gel agarose thường được dùng để phân tách những đoạn ADN/ARN có kích thước nhỏ từ 200 đến 50.000 kb Độ phân giải thay đổi khi nồng độ agarose hoặc loại agarose thay đổi, nồng độ agarose thường dùng trong điện di là từ 0.5 đến 2% Vị trí các phân tử ADN trong gen được xác định bằng phóng xạ tự ghi hay nhuộm ethidium bromide, các chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của acid nucleic và sẽ phát huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại

Ưu điểm của kỹ thuật điện di này là gel được rót dễ dàng, không gây biến tính mẫu, và bền vững vật lý hơn polyacrylamide Mẫu dễ được thu hồi Nhược điểm của phương pháp này là gel có thể bị nóng chảy trong quá trình điện di, đệm

có thể bị tiêu hao và các dạng khác nhau của acid nucleic sẽ chạy không ổn định

1.4.4.2 Điện di trên gel polyacrylamide

Polyacrylamide có đơn phân là acrylamide, độ dài của nó được quyết định bởi nồng độ acrylamide được cho vào, thường được dùng với nồng độ là 3.5 đến 20%

39

Không giống với điện di trên agarose, điện di trên gel polyacrylamide được dùng chủ yếu để phân tách và xác định đặc tính của hỗn hợp các protein cho phương pháp điện di theo phương thẳng đứng So với điện di trên agarose, điện di trên polyacrylamide có mức độ phân dải cao hơn, đối với ADN, điện di trên gel polyacrylamide giúp phân biệt được những đoạn trình tự chỉ khác nhau 1 nucleotide

40

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 CHỦNG VI SINH VẬT, MÔI TRƯỜNG VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.1.1 Chủng vi sinh vật

- Sử dụng 26 chủng vi sinh vật đươ ̣c lưu gi ữ tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội

2.1.2 Môi trường nghiên cứu

2.1.2.1 Môi trường nhân giống (g/l)

- Xạ khuẩn: sử dụng môi trường YG (cao nấm men -10, Glucose-10, Nước -

1, pH-7) Khử trùng 121oC trong 15 phút

- Vi khuẩn: sử dụng môi trường canh thang (Peptone - 5, cao thịt - 3, NaCl 5, Nước - 1, pH 7.0) Khử trùng 121oC trong 15 phút

2.1.2.2 Môi trường nuôi dịch thể

a Môi trường nuôi vi khuẩn: gồm 5 môi trường ký hiệu từ V1- V5 Khử trùng ở

1210C, 15 phút

* Môi trường V1 (g/l): Cao thịt - 3; Peptone - 5; NaCl - 5; Nước - 1; pH7 [8]

+ Môi trường V2 (g/l): Cao thịt - 3; Peptone - 5; NaCl-5; CMC - 2; Nước - 1; pH 7 + Môi trường V3 (g/l): Cao men - 2; Cao thịt - 4; Peptone - 5; CMC - 10; K2HPO4 - 1; MgSO4 - 0.2; CaCl2 – 3; Na2HPO4 - 11; FeCl3 -0.28; Nước - 1; pH 7

+ Môi trường V4 (g/l): Cao men - 5; Peptone - 5; Cao thịt - 10; CMC - 10; MgSO4.7H2O-0.2; K2HPO4-1; Nước - 1; pH7

+ Môi trường V5 (g/l): Cao men - 2; Peptone - 2; Glucose - 10; KH2PO4 - 1.5; MgSO4.7H2O - 0.5; Nước -1; pH 7

b Môi trường nuôi xạ khuẩn: gồm 5 môi trường ký hiê ̣u từ X1 tới X5 Khử trùng ở

1210C, 15 phút

* Môi trường X1 (g/l): Cao men – 10; Glucose-10; Nước - 1; pH 7

* Môi trường X2 (g/l): Tinh bột tan - 10; CMC – 2; NaCl - 1; - 1; KH2PO4 - 1; (NH4)2SO4 - 2; CaCO3 - 2; Nước - 1; pH 7

* Môi trường X3 (g/l): Tinh bột tan - 10; NaCl - 1; MgSO4.7H2O - 1; KH2PO4 - 1; (NH4)2SO4 - 2; CaCO3 - 2; Nước - 1; pH 7

* Môi trường X4 (g/l): Cao men – 3; Peptone-5; Glucose-10; NaCl -10; Nước - 1; pH

7

* Môi trường X5 (g/l): Cao men - 5; Peptone - 0.075; KH2PO4 – 1.5; Tween-80 - 5; (NH4)2SO4 – 4.5; K2HPO4-1; Nước - 1; pH 7