Đánh giá đa dạng di truyền một số mẫu giống lúa thu thập tại Lào về đặc điểm nông sinh học

Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa vào các tính trạng hình thái, nông học là phương pháp cổ điển nhưng hiện nay vẫn được sử dụng rộng rãi vì nó không đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền, bố tr

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THANH NHUNG

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU GIỐNG LÚA THU THẬP TẠI LÀO

VỀ ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THANH NHUNG

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU GIỐNG LÚA THU THẬP TẠI LÀO

VỀ ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 604230

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ HÙNG LĨNH

TS ĐỖ THỊ PHÚC

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong luận văn này Mọi kết quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa hoặc sao chép từ các nghiên cứu khác Các số liệu, sơ đồ kết quả của luận văn này chưa từng được công bố

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên!

Học viên

Nguyễn Thanh Nhung

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS Lê Hùng Lĩnh và TS Đỗ Thị Phúc, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và chỉ bảo và hỗ

trợ tôi trong suốt quá trình công tác cũng như trong thời gian học tập, nghiên cứu

và hoàn thành luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và cán bộ công tác tại Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, anh chị em trong Bộ môn Sinh học phân tử- Viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình công tác và thực hiện luận văn

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè và người thân đã động viên, khuyến khích giúp tôi vượt qua những khó khăn trong suốt quá trình nghiên cứu

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Học viên

Nguyễn Thanh Nhung

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 2

2.1 Mục tiêu 2

2.2 Yêu cầu 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

3.1 Ý nghĩa khoa học 3

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 3

4.1 Đối tượng 3

4.2 Phạm vi nghiên cứu 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI4 1.1 Giới thiệu chung về cây lúa 4

1.1.1 Nguồn gốc, sự phân bố của cây lúa 4

1.1.2 Phân loại lúa 5

1.2 Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa 7

1.2.1 Vị trí và tầm quan trọng của đa dạng di truyền 7

1.2.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa ở nước ngoài 8

1.2.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa ở Việt Nam và Lào 11

1.2.4 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 13

CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu nghiên cứu 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Bố trí thí nghiệm 24

2.2.2 Các tính trạng theo dõi và đánh giá 24

2.2.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền bằng chỉ thị ADN 27

2.2.4 Phương pháp phân loại dưới loài 33

2.2.5 Phân tích và xử lý số liệu 33

CHƯƠNG 3: KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Kết quả đánh giá một số đặc tính nông học của các mẫu giống lúa Lào 35

3.1.1 Đa dạng các tính trạng hình thái số lượng 35

3.1.2 Đa dạng các tính trạng hình thái chất lượng 45

3.2 Kết quả đánh giá đa dạng di truyền các mẫu giống lúa Lào bằng chỉ thị SSR 55 3.2.1 Tỷ lệ khuyết số liệu và dị hợp tử của các giống lúa nghiên cứu 55

3.2.2 Hệ số PIC, số alen thể hiện trên từng cặp mồi 57

3.2.3 Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của các mẫu giống lúa Lào 60

3.3 Kết quả phân loại dưới loài các mẫu giống lúa Lào 61

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64

4.1 Kết luận 64

4.2 Đề nghị 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TĂT

ADN Axit Deoxyribonucleic

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa dạng chiều dài đoạn

NSLT Năng suất lý thuyết

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

PIC Polymorphism Information Content - Chỉ số thông tin đa hình của

RGA Resistance Gene Analog – Vùng tương đồng gen kháng

SNPs Single nucleotide polymorphism - Đa hình của các nucleotit đơn SSR Simple Sequence Repeats (Sự lặp lại trình tự đơn giản)

STS Sequence Tagged Site - Điểm trình tự được đánh dấu

TBE Tris-Boric Acid-EDTA

TGST Thời gian sinh trưởng

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại chi Oryza 6

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu giống lúa Lào dùng trong nghiên cứu 22

Bảng 2.2 Danh sách các chỉ thị SSR dùng trong nghiên cứu 73

Bảng 23 Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR 29

Bảng 2.4 Chương trình chạy của phản ứng PCR 29

Bảng 3.1 Sự đa dạng các tính trạng hình thái số lượng của 33 mẫu giống lúa Lào vụ mùa 2012 35

Bảng 3.2 Các yếu tố cấu thành năng suất của 33 mẫu giống lúa thu thập tại Lào vụ mùa 2012 41

Bảng 3.3 Sự đa dạng kích thước hạt thóc của 33 mẫu giống lúa Lào 43

Bảng 3.4 Tần số biểu hiện các tính trạng hình thái chất lượng của thân 46

Bảng 3.5 Tần số biểu hiện các tính trạng hình thái chất lượng của lá 48

Bảng 3.6 Tần số biểu hiện các tính trạng hình thái chất lượng thìa lìa 49

Bảng 3.7 Tần số biểu hiện các tính trạng hình thái chất lượng của bông 50

Bảng 3.8 Tần số biểu hiện các tính trạng hình thái chất lượng hoa và hạt 51

Bảng 3.9 Tỷ lệ khuyết số liệu và dị hợp tử của các giống lúa nghiên cứu 55

Bảng 3.10 Chỉ tiêu số alen và chỉ số đa dạng di truyền PIC của các chỉ thị nghiên cứu 59

Bảng 3.11 Kết quả phân loại bằng dung dịch phenol của 33 mẫu giống lúa Lào và 2 giống đối chứng 62

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ tiến hóa hai loài lúa trồng 5

Hình 2.1 Bản đồ những vùng thu thập mẫu giống lúa tại Lào 22

Hình 3.1 Sự đa dạng chiều cao cây của 33 mẫu giống lúa Lào 37

Hình 3.2 Sự đa dạng khối lượng 1000 hạt của các mẫu giống lúa 40

Hình 3.3 Sự đa dạng các tính trạng hình thái về thân 47

của các mẫu giống lúa nghiên cứu 47

Hình 3.4 Đa dạng hình thái tính trạng chất lượng lá lúacủa 33 mẫu giống lúa Lào47 Hình 3.5 Đa dạng tính trạng hình thái chất lượng thìa lìacủa 33 mẫu giống lúa Lào50 Hình 3.6 Đa dạng hình thái chất lượng bông của 33 mẫu giống lúa Lào 51

Hình 3.7: Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi RM110 58

Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi RM18 58

Hình 3.9 Quan hệ di truyền của 33 giống lúa Lào và BT7 dựa trên 20 chỉ thị SSR 61 Hình 3.10 Phân loại dưới loài các mẫu giống lúa nghiên cứu 63

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Nguồn tài nguyên di truyền thực vật đóng vai trò rất quan trọng đối với sản xuất nông nghiệp theo hướng đa dạng hóa, hiện đại hóa Do sự khác biệt điều kiện

tự nhiên mà mỗi nước có nguồn tài nguyên thực vật khác nhau Trong xu thế hội nhập quốc tế, sự hợp tác chia sẻ thông tin kinh nghiệm và trao đổi nguồn gen đã và

sẽ góp phần khai thác có hiệu quả tiềm năng nguồn gen bản địa cũng như nhập nội hoặc lai tạo được nhiều các giống mới, thúc đẩy phát triển sản xuất nông nghiệp của mỗi nước Hợp tác khu vực và quốc tế trong lĩnh vực sử dụng hiệu quả và bền vững nguồn tài nguyên thực vật là thực sự cần thiết để góp phần thực hiện mục tiêu an ninh lương thực mà Hội thảo kỹ thuật quốc tế về tài nguyên di truyền thực vật lần thứ IV đã đề ra, nhằm phấn đấu giảm lượng dân số đói nghèo xuống còn một nửa vào năm 2015

Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng Hàng năm, các quốc gia

Châu Á tiêu thụ tới 90% sản lượng lúa gạo của thế giới

Cộng hào Dân chủ Nhân dân Lào là nước có nhiều giống lúa cổ truyền với nguồn gen phong phú có thể dùng để tạo ra những giống lúa cải tiến với những đặc tính mong muốn Theo điều tra, đánh giá sơ bộ về tập đoàn lúa địa phương của Lào cho thấy đây là nguồn vật liệu quý phong phú về các tính trạng chất lượng, chống chịu sâu bệnh cũng như các điều kiện bất thuận của môi trường như chịu úng, chịu ngập, chịu mặn…Bên cạnh công tác thu thập và bảo tồn, công tác nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen này có ý nghĩa rất quan trọng trong việc lưu giữ, bảo tồn nguồn gen lúa phục vụ công tác chọn giống Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa vào các tính trạng hình thái, nông học là phương pháp cổ điển nhưng hiện nay vẫn được

sử dụng rộng rãi vì nó không đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền, bố trí thí nghiệm phức tạp mà vẫn đảm bảo hiệu quả nhất định, giúp các nhà nghiên cứu có thể phân biệt các giống một cách nhanh chóng trên đồng ruộng [8]

Ngày nay, với sự phát triển của Sinh học Phân tử, chỉ thị phân tử ADN được

sử dụng rộng rãi trong việc đánh giá, bảo tồn và quản lý nguồn gen nói chung và công tác nghiên cứu đa dạng di truyền nói riêng Các chỉ thị phân tử thường được sử dụng để nghiên cứu, xác định mối quan hệ di truyền của các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài là cơ sở cho việc phân loại dưới loài, phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hóa giữa loài [26] Trong số các chỉ thị phân tử đánh giá đa dạng

di truyền, chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats) hay còn gọi là chỉ thị vi vệ tinh có

độ tin cậy và chính xác cao thường được sử dụng trong các nghiên cứu sâu ở mức

độ phân tử đối với tất cả các đối tượng động thực vật

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá

đa dạng di truyền một số mẫu giống lúa thu thập tại Lào về đặc điểm nông sinh học ”

2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Đề tài kết hợp đánh giá các tính trạng hình thái nông học với chỉ thị phân tử để nghiên cứu đa dạng di truyền Kết quả của đề tài góp phần tạo cơ sở khoa học để xây dựng phương pháp đánh giá đa dạng di truyền và phân loại các mẫu giống lúa

Lào nói riêng và tài nguyên cây lúa nói chung

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài có ý nghĩa trong việc xây dựng cơ sở dữ liệu ở mức độ hình thái và phân tử phục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng nguồn gen lúa của Lào Những chỉ thị có hệ số đa dạng gen cao sẽ rất có ích cho các phân tích đa dạng di truyền, lập bản đồ liên kết và nghiên cứu mối quan hệ về nguồn gốc phát sinh của các giống lúa

Từ các kết quả nghiên cứu giới thiệu một số giống lúa Lào có các tính trạng tốt về năng suất, hình thái có khả năng thích ứng trong điều kiện trồng tại Việt Nam

4 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

1.1 Giới thiệu chung về cây lúa

1.1.1 Nguồn gốc, sự phân bố của cây lúa

Tổ tiên của cây lúa đã tồn tại từ đầu kỷ Phấn trắng Vào giữa thế kỷ này, xuất

hiện một loại nguyên thủy nhất thuộc tộc Oryzae, đó là loại Streptochasta Schard Đến cuối kỷ Phấn trắng xuất hiện loài tre (Bambusta) và loài lúa Oryza Một số loài

khác xuất hiện muộn hơn vào kỷ thứ 3, thời kỳ phát triển mạnh nhất của họ hòa thảo

(Gramineae) Các loài lúa Oryza spp có cùng tổ tiên chung vào thời kỳ địa cầu

Gondwanaland, sau khi trái đất tách rời thành năm lục địa [7]

Tác giả Chang (1985) cho rằng lúa trồng Oryza sativa được tiến hóa từ cây lúa dại Oryza nivara Do thích ứng với khí hậu, đặc biệt là điều kiện nhiệt độ lúa

Oryza sativa lại tiếp tục chia thành ba nhóm: Indica thích hợp với khí hậu nhiệt đới, Japonica thích hợp với khí hậu lạnh, Javanica có đặc tính trung gian [29]

Cheng (2003) khi nghiên cứu di truyền tiến hóa của 101 giống lúa, bao gồm

cả lúa trồng và lúa dại cho thấy loài lúa trồng Oryza sativa chia thành hai nhóm tương ứng với loài phụ là Indica và Japonica Trong khi đó Oryza rufipogon chia thành bốn nhóm là Oryza rufipogon hàng niên và ba nhóm Oryza rufipogon đa niên Kết quả cho thấy các giống lúa Japonica có quan hệ gần gũi với một nhóm

Oryza rufipogon đa niên, còn các giống còn lại có quan hệ với nhóm lúa Oryza rufipogon hàng niên [33]

Nhiều chuyên gia lúa gạo đồng ý rằng lúa Glaberrima và lúa Sativa có cùng

chung nguồn thủy tổ vào thời kỳ lục địa nguyên thủy, nhưng sau khi các lục địa tách

rời nhau, lúa Sativa và Glaberrima tiến hóa từ các loài lúa dại bản địa ở hai châu lục

là châu Á và châu Phi [44]

Hình 1.1 Sơ đồ tiến hóa hai loài lúa trồng

1.1.2 Phân loại lúa

Cây lúa thuộc họ Poaceae, trước đây gọi là họ Hòa thảo (Gramineae), họ phụ Pryzoidea, tộc Oryzae, chi Oryza, loài Oryza sativa và Oryza glaberrima

Morinaga là người đầu tiên đã sử dụng kỹ thuật phân tích genome để định danh các loài lúa dại Công trình nghiên cứu dựa trên cơ sở khoa học này đã giúp phân tích các loài lúa chính xác hơn [6]

Hội nghị di truyền lúa Quốc tế họp tại Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế năm

1963 chia chi Oryza thành 19 loài Căn cứ trên các phát kiến mới về tế bào học và

di truyền cây lúa , năm 1967 Hội nghị Di truyền lúa Quốc tế khẳng định chi Oryza

có 22 loài trong đó có 22 loài lúa dại và hai loài lúa trồng [30] Danh sách loài, số lượng nhiễm sắc thể, bộ gen của từng loài được trình bày ở bảng 1.1

Sau này Vaughan (1994) phát hiện thêm một loài lúa dại mới ở Papua New

Ginea là loài Oryza rhizomatis, đưa số loài của chi Oryza lên thành 23 loài và chia

Ngày nay, các nhà phân loại học đều nhất trí là chi Oryza có 23 loài trong đó

21 loài hoang dại và hai loài lúa trồng là Oryza sativa và Oryza glaberrima thuộc loài nhị bội 2n = 24 có bộ gen AA Loài Oryza glaberrima phân bố chủ yếu ở Tây

và Trung Phi còn loài Oryza sativa được gieo trồng khắp thế giới và phân chia thành hai loài phụ là Japonica và Indica [6]

Bảng 1.1 Phân loại chi Oryza

I Phức hệ O sativa

II Phức hệ O officinalis Ng O latifola

III Phức hệ O.ridleyi

1.2 Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa

1.2.1 Vị trí và tầm quan trọng của đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền là biểu hiện sự đa dạng của các biến dị có thể di truyền trong một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã Xét cho cùng, đa dạng

di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp bazơ cơ bản, thành phần axít nucleic, tạo thành mã di truyền [3]

Đa dạng di truyền là cơ sở cho việc tuyển chọn lai tạo những giống, loài mới; đa dạng về loài thường là đối tượng khai thác phục vụ mục đích kinh tế; đa dạng về hệ sinh thái có chức năng bảo vệ môi trường sống; đồng thời các hệ sinh thái được duy trì và bảo vệ chính là nhờ sự tồn tại của các quần thể loài sống trong đó Phần đa dạng sinh học do con người khai thác sử dụng gọi là đa dạng sinh học nông nghiệp [20]

Giá trị của đa dạng di truyền thể hiện ở ba mặt chính [35]:

Giá trị ổn định: Đa dạng di truyền tạo ra sự ổn định cho các hệ thống nông

nghiệp ở quy mô toàn cầu, Quốc gia và địa phương Sự thiệt hại của một giống cây trồng cụ thể được bù đắp bằng năng suất của các giống hoặc cây trồng khác

Giá trị lựa chọn: Đa dạng di truyền tạo ra bảo hiểm sinh học cần thiết chống

lại những thay đổi bất lợi của môi trường do việc tạo ra những tính trạng hữu ích như tính kháng sâu bệnh hay tính thích nghi Giá trị của đa dạng di truyền được thể hiện thông qua việc sử dụng và khai thác các tính trạng quý, hiếm của tài nguyên di truyền thực vật như tính chống chịu, năng suất, chất lượng và khả năng thích nghi Năm 1946, giống lúa mỳ lùn Nhật Bản Norin 10 được nhập vào Mỹ và đã góp phần quan trọng trong cải tạo giống và tăng năng suất lúa mỳ Các giống lúa trồng

có nguồn gốc Đông Bắc Ấn Độ được sử dụng là nguồn kháng sâu, bệnh cho các vùng khác nhau trên thế giới Những tính trạng này đã góp phần tăng sản lượng lúa bình quân của châu Á lên 30% giữa những năm 1981 và 1986 [35]

Giá trị khai thác: Đa dạng di truyền được xem là kho dự trữ tiềm năng các tài

nguyên chưa biết đến Đây cũng là lý do cần phải duy trì cả các hệ sinh thái hoang

dã lẫn các hệ thống nông nghiệp truyền thống

1.2.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa ở nước ngoài

Sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học cùng với sự ra đời của nhiều loại chỉ thị chỉ thị cũng như số lượng của mỗi loại chỉ thị đã làm tăng hiệu quả trong quá trình đánh giá, bảo tồn, khai thác và sử dụng trong với mục đích khác nhau Chỉ thị ADN được ứng dụng hiệu quả trong nghiên cứu di truyền thực vật mà phân tích đa dạng di truyền, xác định các locus kiểm soát các tính trạng, hay chọn giống

phân tử là các lĩnh vực được triển khai hiệu quả

Virk và cs.(1995) nghiên cứu 12 giống lúa trồng châu Á đại diện cho các vùng sinh thái, địa lý khác nhau bằng chỉ thị RAPD Kết quả cho thấy 18 trong số

24 mồi cho 83 băng, trong đó có 48 băng đa hình Số lượng băng đa hình xuất hiện

từ 1-5 băng/ mồi, các băng nằm trong khoảng 300-2700bp [67]

Olufowote (1997) nghiên cứu biến động di truyền trong giống của 171 giống lúa bằng cả hai loại chỉ thị SSR và RFLP Kết quả cho thấy các giống lúa địa phương có mức độ đa dạng, hỗn tạp và dị hợp tử cao hơn các giống lúa cải tiến Cả hai phương pháp đều cho thấy số lượng các alen ở các giống lúa địa phương cao hơn hẳn các giống lúa cải tiến Chỉ thị SSR có khả năng phân biệt các cá thể có quan hệ di truyền gần gũi, đồng thời số lượng alen cao hơn chỉ thị RFLP[58]

Tác giả Yu và cs (2003) đã sử dụng 101 chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng

193 giống lúa từ 26 nước trên thế giới Khoảng cách di truyền từ 0,13-0,88, trung bình là 0,68 Số alen/locus từ 2-11, trung bình 6,3/locus Kết quả phân tích nhóm đã phân 193 giống thành 3 nhóm chính và 9 phân nhóm Nhóm I là các giống lúa

Indica, nhóm II và III thuộc loài phụ Japonica Các locus thuộc nhiễm sắc thể 9,

12 phân biệt rõ nhất sự khác nhau giữa Indica và Japonica [61]

Tác giả Xu (2004) sử dụng 113 chỉ thị RFLP và 60 chỉ thị SSR để định lượng

đa dạng alen của 125 giống lúa thu được từ các bang miền Tây và miền Nam nước

Mỹ và 111 giống từ tập đoàn lúa Quốc tế IRRI Các tác giả nhận thấy cơ sở di truyền các giống lúa hiện nay có ở Mỹ hẹp hơn nhiều so với các giống từ tập đoàn lúa Quốc tế (56% SSR alen so với 96%, và 92 RFLP so với 99%) 31 trong số 236 giống lúa có số lượng các alen cao (chiếm 95% số alen của RFLP và 74% số alen của SSR) có thể sử dụng làm tập đoàn hạt nhân Kết quả cho thấy chỉ thị SSR sử dụng hữu hiệu hơn RFLP cả về khả năng phát hiện các alen lẫn chi phí và kỹ thuật[69]

Lu H và cs (2005) đã phân tích cấu trúc của quần thể lúa ở Mỹ với 115 giống lúa trồng ở Mỹ và 30 giống lúa châu Á bằng 169 chỉ thị SSR Kết quả thu được 870 alen, trung bình 5,15 alen/locus Tần số alen hiếm rất cao, lên đến 50%, trong khi đó tần số alen phổ biến chỉ chiếm 24-26% trong số 870 alen Hệ số đa dạng PIC đạt khá cao, 0,80 Kết quả phân nhóm cho thấy, 115 giống lúa đã phân

thành ba nhóm: Japonica ôn đới với đặc điểm hạt ngắn, Japonica nhiệt đới có đặc điểm hạt trung bình và Japonica nhiệt đới hạt dài Các giống lúa Indica đại diện cho

các giống lúa truyền thống thì phân chia thành các nhóm riêng [46]

Victoria và cs.(2007) nghiên cứu đa dạng trên 24 giống lúa ở Philippine

có chất lượng tốt bằng 164 chỉ thị SSR Trong số 164 chỉ thị SSR có 151 chỉ thị cho đa hình với tổng số alen thu được là 890, trung bình 5,89alen/locus Trong

đó có 89 chỉ thị cho 147 alen hiếm Hệ số đa dạng di truyền PIC từ 0,18-0,91, đạt trung bình 0,68/chỉ thị Theo kết quả phân tích UPGMA, 24 giống lúa chia

thành ba nhóm ở độ tương đồng 40% Nhóm 1 gồm 8 giống Japonica, nhóm 2 và

3 là các giống lúa Indica Trong nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng việc sử dụng chỉ

thị SSR rất hiệu quả trong phân nhóm các loài phụ Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng, những giống lúa có chất lượng tốt thì thường có khoảng cách di truyền cao

hơn và vì thế rất chúng là nguồn vật liệu cho công tác chọn giống [66]

Giarrocco và cs (2009 ) đã nghiên cứu đa dạng di truyền 69 giống lúa của Argentina bằng 26 chỉ thị SSR Kết quả thu được là 219 alen 60 giống lúa phân

thành 3 nhóm Indica, Japonica, Japonica nhiệt đới với độ tương đồng di truyền từ

0,12-0,96.[36]

Nghiên cứu của Malik và cs (2008) về đa dạng di truyền của 40 giống lúa bao gồm 10 giống lúa địa phương của Pakistan, 28 giống lúa cải tiến, 2 giống lúa Nhật Bản bằng 25 chỉ thị RAPD Kết quả thu được 208 băng, số băng đa hình là

189, chiếm 89,4% Kích thước các băng từ 200-400bp Độ tương đồng di truyền của các giống lúa là 0,5-0,96 Dựa trên cơ sở phân nhóm UPGMA, 40 giống lúa đã phân

thành 3 nhóm : nhóm lúa thơm, lúa không thơm và Japonica [47]

S.C Wong và cs (2009) đã sử dụng 12 chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng của 8 giống lúa Bario của Malaysia Kết quả đánh giá hệ số đa dạng di truyền PIC là 0,54, trung bình 2,6 alen/locus Hệ số tương đồng di truyền trong 8 giống lúa dao động từ 0,16-0,92 [62]

Michael J.T và cs.(2010) đánh giá đa dạng các giống lúa của Indonesia bao gồm 246 giống lúa truyền thống, 63 giống lúa cải tiến bằng 30 chỉ thị SSR Tổng số alen thu được trong nghiên cứu là 394 alen, trung bình 13 alen/locus Hệ số đa dạng gen đạt được là 0,66, tần số alen phổ biến từ 21-73% Kết quả các giống lúa nghiên

cứu chia thành hai nhóm lớn: nhóm Indica và Japonica nhiệt đới [49]

Nghiên cứu đa dạng di truyền của 53 giống lúa địa phương của vùng Sarawak- Malaysia của Lee và cs (2011) với 12 chỉ thị nằm trên 12 nhiễm sắc thể Tổng số alen thu được 43 alen, trung bình 3.58 alen/locus Hệ số đa dạng di truyền cũng đạt giá trị cao, từ 0,306-0,730 Kết quả 53 giống phân thành 6 nhóm với hệ số tương đồng từ 0,24-1 [50]

Jingguo Wang và cs (2013) đánh giá 288 giống lúa bản địa vùng Đông bắc á bằng 154 chỉ thị SSR Kết quả đánh giá hệ số đa dạng di truyền dao động từ 0,060-0,856, trung bình 5,344 alen/locus Hệ số tương đồng di truyền trong 288 giống lúa dao động từ 0,061-0,869 [42]

1.2.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa ở Việt Nam và Lào

Việt Nam được coi là một trong những trung tâm khởi nguyên của cây lúa, từ xưa, nhân dân ta đã biết mô tả hình thái các giống lúa và thời vụ gieo trồng Lê Quý Đôn đã mô tả tỉ mỉ và có nhận xét về tính cứng cây, chống đổ và chiều cao cây, nhất

là đối với những giống lúa chiêm “Lúa Sài Đường, chiêm Di cây nhỏ mà yếu, dễ đổ; lúa Tám trâu, lúa Bồ lộ, lúa Thạch, lúa Màng hai, lúa Bột cây cứng thẳng; đặc biệt lúa chiêm vàng và lúa Đăng sơn, cây cứng cao, bị mưa gió không đổ” [4]

Nghiên cứu đa dạng di truyền và phân loại một cách hệ thống lúa trồng ở Việt Nam đã và đang đánh giá đa dạng tài nguyên lúa nước ta Theo Trần Văn Minh

(2004) [9] các giống lúa thuộc loài phụ Japonica có hạt ngắn, lá ngắn màu đậm và

cứng, không có râu đầu hạt thóc, bông ít phân nhánh, độ đóng hạt dày Tác giả Lưu Ngọc Trình (2006) [22], trong tổng số 6.083 giống lúa đang bảo quản tại Ngân hàng gen cây trồng Quốc gia, Trung tâm Tài nguyên thực vật đã tiến hành đánh giá đầy

đủ 60 tính trạng hình thái nông học của 1.819 giống, đánh giá 40 - 50 tính trạng của 1.385 giống và từ 20 - 30 tính trạng của 2.066 giống

Lưu Ngọc Trình (1995) [21] sử dụng chỉ thị phân tử để nghiên cứu đa dạng di truyền của 643 giống lúa, trong đó có 464 giống từ miền Bắc Việt Nam Kết quả đánh giá 454 giống lúa có nguồn gốc miền Bắc Việt Nam thì có 412 giống (89%) thuộc nhóm

lúa Indica, 44 giống (9,5%) thuộc nhóm lúa Japonica và 8 giống (1,5%) không phân loại

được Nguyễn Đức Thành và cs, (1999) [16] đã sử dụng 10 mồi RAPD, 50 cặp mồi SSR và 15 cặp mồi AFLP để nghiên cứu 72 giống lúa nương Kết quả cho thấy các giống lúa nương có đa dạng di truyền cao và là nguồn vật liệu tốt cho công tác chọn giống Phạm Trung Nghĩa và ctv (1999) [59] khi so sánh phương pháp phân tích khoảng cách di truyền bằng chỉ thị RAPD và phương pháp phân tích khoảng cách di

truyền bằng các tính trạng hình thái của các giống lúa đã cho thấy kết quả của hai phương pháp gần giống nhau, nhưng chỉ thị RAPD rõ ràng và chính xác hơn Bùi Chí Bửu và cs (1999) [2] sử dụng 20 mồi RAPD để đánh giá đa dạng di truyền 72 giống lúa địa phương Trong 20 mồi thử nghiệm thuộc nhóm OPA kit, có 10 mồi cho kết quả tốt với 59 băng Kết quả có hai nhóm chính và nhiều nhóm phụ được phân lập Trần Danh Sửu và ctv (2001) [13] sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu các giống lúa ở vùng Tây Bắc và Tây Nam nước ta cho thấy hầu hết các giống lúa ở

vùng Tây Bắc thuộc loài phụ Japonica, còn các giống lúa nước ở Tây Nam nước ta thuộc loại phụ Indica

Vũ Thị Thu Hiền (2012) đã đánh giá đặc điểm nông sinh học và đa dạng di truyền của 41 mẫu giống lúa mới thu thập và chọn tạo để sử dụng trong chọn giống lúa thuần năng suất và chất lượng Kết quả nghiên cứu đã cho thấy các mẫu giống trong tập đoàn có thời gian sinh trưởng ngắn, nhiều dạng thấp cây phù hợp cho vùng thâm canh cao Số bông/khóm, chiều dài bông và chiều dài, chiều rộng lá đòng, khối lượng 1000 có mức độ đa dạng Hình dạng hạt thuộc nhóm thon và thon dài chiếm đa số là nguồn gen quý phục vụ công tác chọn giống lúa chất lượng Dựa trên 14 các tính trạng kiểu hình, 41 mẫu giống lúa với sự sai khác 0,08 phân thành

10 nhóm cách biệt di truyền [8]

Ngô Thị Hồng Tươi và cs (2014) sử dụng 35 chỉ thị phân tử SSR đánh giá đa dạng di truyền 46 dòng/giống lúa cẩm gồm cả lúa nếp và tẻ được thu thập từ các địa phương trong đó có 9 chỉ thị đơn hình và 26 chỉ thị đa hình với tổng số 68 alen

đa hình chiếm tỷ lệ trung bình 62 alen trên một locus Hệ số đa dạng di truyền (PIC) dao động từ 0,08 đến 0,74 với giá trị trung bình là 0,46 [19]

Lào là một trong những nước phong phú nguồn gen lúa, Bộ nông lâm nghiệp Lào kết hợp với Viện lúa quốc tế IRRI đã thu thập được 13.192 mẫu giống lúa trồng

và 237 mẫu thuộc sáu loài lúa hoang dại Những mẫu giống thu thập tại miền bắc, miền trung, miền nam thứ tự là 5915 (44.8%), 4625 (35.1%), 2652 (20.1%) Trong

số mẫu giống thu được 55, 9% là những giống lúa nương và hầu hết là giống lúa

nếp (85.5%) [24] Nhưng điều tra về tập đoàn giống lúa của Lào cho thấy đây là nguồn gen quý, phong phú về các tính trạng chất lượng, chống chịu sâu bệnh, cũng như các điều kiện bất thuận như chịu hạn, chịu nóng Một số nghiên cứu, đánh giá

đa dạng di truyền nguồn gen lúa của Lào: Yosuke Kuroda và cs (2007) [71] nghiên

cứu đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ phân tử của một số giống lúa trồng Oryza

sativa và các quần thể dòng lúa hoang O Rufipogon và Oryza nivara kết quả cho

thấy có sự khác xa về di truyền giữa các dòng giống lúa này Ishikaw R và cs (2002)

đã thu thập đánh giá tập đoàn gồm 132 giống lúa nương được thu thập tại 27 điểm Trong đó gồm có 106 giống lúa nếp, và 16 giống lúa tẻ [39]

1.2.4 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền

1.2.4.1 Chỉ thị hình thái

Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị hình thái là phương pháp đánh giá thông qua các đặc điểm hình thái (hình dạng, kích thước, đặc điểm các bộ phận) Với ưu điểm là dễ dàng tiếp cận, không đòi hỏi các thiết bị đắt tiền cũng như quy trình phức tạp Hiện nay phương pháp này vẫn được sử dụng phổ biến trên cây trồng để giúp các nhà nghiên cứu phân biệt các giống khác nhau bằng mắt thường Tuy nhiên, việc sử dụng chỉ thị hình thái trong phân tích đa dạng di truyền có những hạn chế: (1) Số lượng các chỉ tiêu hình thái có hạn, chỉ thị hình thái chịu tác động của môi trường và phụ thuộc vào giai đoạn nhất định của quá trình phát triển; (2) Việc đánh giá mang tính chất thông kê nên cần thực hiện với số lượng lớn để đảm bảo tính chính xác; (3) Có nhiều tính trạng do đa gen quy định mà không phải toàn

bộ gen đều biểu hiện ra kiểu hình mà có thể đánh giá được Vì thế cho đến nay, các nhà chọn giống thường kết hợp sử dụng các chỉ tiêu hình thái với việc xác định bằng chỉ thị sinh hoá và chỉ thị phân tử ADN để đạt được kết quả chính xác nhất [11], [72]

1.2.4.2 Chỉ thị sinh hóa

Chỉ thị sinh hoá là loại chỉ thị có bản chất là đa hình protein, bao gồm chỉ thị isozyme và các loại protein dự trữ

Các protein khác nhau có khối lượng phân tử và điểm đẳng điện khác nhau, vì vậy chúng có thể di chuyển với tốc độ khác nhau trong quá trình điện di tạo thành những đặc điểm đặc trưng trên gel điện di và có thể hiện thị bằng phương pháp nhuộm Cơ chế này được điều khiển bởi vật chất di truyền là ADN, thông qua dòng thông tin di truyền từ ADN->ARN->protein [15]

Chỉ thị protein và chỉ thị enzyme thuộc loại đồng trội có độ tin cậy cao đồng thời

có thể phát hiện ra các biến dạng khác nhau của protein Tuy nhiên, do số lượng không nhiều và sự biểu hiện chúng phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cá thể, nên các chỉ thị protein và isozyme được ứng dụng tương đối hạn

chế [1]

1.2.4.3 Chỉ thị phân tử ADN

Các chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị dựa trên bản chất đa hình ADN

Nó được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài, phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hoá giữa loài, dùng để lựa chọn tổ hợp lai

Chỉ thị phân tử ADN có thể là một gen hoặc những đoạn ADN đặc hiệu Chỉ thị

di truyền phân tử có tính ổn định cao và có thể xác định trong tất cả các loại mô với

độ chính xác cao mà không bị ảnh hưởng bởi điều kiện của môi trường Chỉ thị phân tử được chia làm hai nhóm chính:

• Chỉ thị dựa trên cơ sở nguyên lý lai ADN: chỉ thị RFLP

• Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN bằng kỹ thuật PCR: RAPD, AFLP, SSR, )

 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism- Đa hình chiều dài

đoạn phân cắt giới hạn)

RFLP là một kỹ thuật nhận dạng ADN bằng cách lai axit nucleic Nguyên lý của phương pháp: ADN của bộ gen sau khi cắt bằng enzyme giới hạn sẽ thành

những đoạn có kích thước khác nhau Khi điện di những đoạn này sẽ phân bố ở những vị trí khác nhau trên gel, qua biến tính các đoạn này trở thành sợi đơn và được chuyển lên màng celulose hoặc nylon Trong quá trình lai ADN tiếp theo, nếu chúng bổ sung với mẫu dò (là một đoạn ADN đã được đánh dấu phóng xạ hoặc hoá học) thì sẽ cho phản ứng lai Kết quả của phản ứng lai là chúng ta có thể xác định được sự đa hình giữa các mẫu ADN khác nhau [15]

Kỹ thuật RFLP đã được các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở người [26] Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội được sử dụng phổ biến trong tạo giống cây trồng với nhiều mục đích khác nhau: lập bản đồ di truyền, chọn lọc sớm tính trạng đơn gen, phân tích đa hình di truyền Tuy nhiên hạn chế của phương pháp này là tốn nhiều thời gian, công sức, kỹ thuật phức tạp, độc hại do sử dụng chất phóng xạ và đòi hỏi ADN chất lượng cao [25], [55]

 Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình

chiều dài các đoạn được nhân bản chọn lọc)

Loại chỉ thị AFLP được phát hiện bởi Zabeau Vos (1993) và được mô tả chi tiết bởi Vos và cs (1995) Các chỉ thị này được dùng như một công cụ đặc trưng để xác định mức độ quan hệ giữa các giống, loài và là nguồn chỉ thị di truyền cho lập bản

đồ liên kết di truyền, nhận biết sự liên kết giữa các chỉ thị phân tử với các đặc điểm hình thái, năng suất, chất lượng hoặc các locus gen khác [68]

Kỹ thuật AFLP dựa trên sự nhân bản chọn lọc ADN từ hệ gen đã xử lý bằng enzyme giới hạn Kỹ thuật này gồm bốn bước:

• Cắt ADN hệ gene bằng enzyme giới hạn và gắn các oligonucleotide tiếp hợp (adapter)

• Khuếch đại tiền chọn lọc bằng cặp mồi tiền chọn lọc

• Khuếch đại chọn lọc sử dụng các tổ hợp mồi EcoRI và MseI chọn lọc khác nhau

• Phân tích trên gel các đoạn ADN được nhân lên

Kỹ thuật này cho phép nhân cùng một lúc một cách đặc trưng với một số lượng lớn các đoạn cắt giới hạn (50 - 100 đoạn) Mỗi đoạn bao gồm một phần cố định dài hơn 15bp chứa vị trí nhận biết của enzyme giới hạn và một phần thay đổi ngắn 2 - 4bp Phần cố định dài tạo ra sự ổn định của sản phẩm và phần thay đổi ngắn tạo ra nhiều locus, có thể trên 100 locus với một tổ hợp mồi AFLP Sự đa hình được xác định bằng sự có mặt hoặc không có mặt của một phân đoạn ADN Sản phẩm PCR sau đó được phân tách trên gel có độ phân giải trình tự cao và có thể nhìn thấy bằng phóng xạ tự chụp Nếu không sử dụng nucleotit được đánh dấu phóng xạ, có thể sử dụng kỹ thuật nhuộm huỳnh quang hoặc nhuộm bạc để quan sát sản phẩm

Ưu điểm: là một kỹ thuật có độ nhạy cao dễ phát hiện đa hình trong toàn bộ hệ gen AFLP cho phép phân tích nhanh, ổn định, đáng tin cậy, có khả năng ứng dụng trong lập bản đồ hệ gen và chọn giống [68]

AFLP cho đa hình cao, vì vậy kỹ thuật AFLP hứa hẹn cho phép xem xét kỹ sự đa hình ở một số lượng lớn locus trong một thời gian rất ngắn và đòi hỏi một lượng rất nhỏ ADN Điều này tạo cho AFLP trở thành một hệ thống chỉ thị lý tưởng cho hàng loạt nghiên cứu di truyền

Nhược điểm: AFLP là chỉ thị di truyền trội do đó không có khả năng phân biệt được cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử Phương pháp phức tạp, đòi hỏi phải có các phương pháp xử lý số liệu tự động trong quá trình phân tích, giá thành cho nghiên cứu là tương đối cao [68], [43]

 Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA – ADN đa hình được

nhân bội ngẫu nhiên)

Kỹ thuật RAPD cho phép phát hiện đa hình các đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên bằng việc sử dùng một mồi đơn chứa trật tự nucleotide ngẫu nhiên Vào đầu thập kỷ 90, những người đầu tiên đã thông báo về việc sử dụng các đoạn mồi đơn dài 10 nucleotide và có trình tự tuỳ ý để phân tích đa hình của bộ genome thực vật (khoai tây, lúa mì) Ngày nay kỹ thuật RAPD đã được thống nhất theo phương pháp là sử dụng các đoạn mồi đơn dài từ 9 – 12 nucleotide, tối thiểu là 4 nucleotide,

có trình tự ngẫu nhiên

Điểm khác của RAPD so với các chỉ thị khác là nó chỉ sử dụng một mồi ngẫu nhiên Đoạn mồi này có thể bám vào bất kỳ vị trí nào trong hệ gen khi tìm được vị trí bổ sung Với đặc điểm đoạn được nhân bản là ngắn ( khoảng từ 200 – 2000 nucleotide) nên khả năng đoạn mồi tìm ra được điểm gắn trên ADN khuôn là không quá khó khăn Theo lý thuyết, số lượng các đoạn ADN được nhân bản phụ thuộc vào độ dài và vị trí các đoạn mồi, kích thước và mức độ phức tạp của cấu trúc ADN

hệ gen Kết quả là sau khi điện di sản phẩm RAPD sẽ phát hiện được tính đa hình dựa trên các phân đoạn ADN được nhân bản [15], [70]

Nhiệt độ gắn mồi của RAPD không cao (300C – 360C) cho nên sẽ có nhiều đoạn ADN khác nhau được nhân bản

Các chỉ thị RAPD thường được sử dụng để phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các quần thể, loài sinh vật, giống cây trồng hay các cá thể để phục

vụ cho công tác lai tạo giống hoặc phân loại Đồng thời, chúng cũng được sử dụng như chỉ thị phân tử để xác định kiểu gen kiểm soát hoặc có liên quan đến một tính trạng nào đó ở sinh vật

Khi phân tích đa hình di truyền bằng phương pháp RAPD nếu hai cá thể có hệ gen hoàn toàn giống nhau thì khi làm phản ứng PCR – RAPD với bất kỳ mồi nào cũng cho băng ADN giống nhau Nếu chúng có ít nhiều khác biệt về genome thì với một số mồi sẽ có những băng khác nhau giữa chúng, sự khác nhau này sẽ thể hiện

sự đa hình di truyền của các cá thể nghiên cứu [70]

Ưu điểm: Nhanh, giá thành cho mỗi mẫu phân tích là thấp, không cần biết những thông tin về trình tự, dễ dàng phân tích cho số lượng mẫu lớn

Nhược điểm: Đây là một kỹ thuật nhạy cảm, phụ thuộc và điều kiện thí nghiệm, các thiết bị nghiên cứu, giai đoạn nghiên cứu Mặt khác, RAPD là chỉ thị trội nên không thể nhận biết được cá thể dị hợp tử Khó nhận biết những đoạn cùng kích thước từ 2 mẫu ADN khác nhau thực sự có được tạo ra từ cùng 1 vị trí trên hệ gen [27]

Để khắc phục những hạn chế này người ta nhân những băng RAPD đặc hiệu, xác định trình tự của chúng rồi thiết kế mồi những đoạn dài khoảng 20bp từ cả hai đầu gọi là chỉ thị SCARs (Sequence Characterized Amplified Regions)

 Chỉ thị Microsatellite (SSR – Simple Sequence Repeats - sự lặp lại của một

trật tự đơn giản)

Trong cơ thể thực vật, hiện tượng lặp lại của một trật nucleotide đơn giản là khá phổ biến Tuy nhiên, tuỳ từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể ít hay nhiều và số lần lặp có thể biến động từ 2 đến hàng trăm ngàn lần Phương thức lặp lại rất phong phú, được chia ra làm 3 kiểu lặp lại sau [145], [34]:

• Lặp lại hoàn toàn (các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau)

• Lặp lại không hoàn toàn (xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một số nucleotide khác)

• Lặp lại phức tạp (có sự xen kẽ giữa những đơn vị lặp lại khác nhau)

Chỉ thị SSR có hai ưu điểm so với các chỉ thị ADN khác:

- Tính đặc hiệu cao: các đoạn mồi SSR được thiết kế dựa trên vùng trình tự sườn có tính bảo thủ cao của các đoạn lặp SSR, do đó sản phẩm nhân gen của phản ứng SSR-PCR đặc hiệu và ổn định hơn các chỉ thị ADN ngẫu nhiên

- Di truyền đồng trội và mức độ đa hình cao: Trải qua tiến hóa và các biến đổi di truyền, số lần lặp lại các motip SSR thay đổi rất nhiều và làm cho các đoạn SSR có chiều dài khác nhau Do đó phản ứng SSR-PCR có thể phát hiện các alen khác nhau trong cùng một locus SSR, qua đó phát hiện được các cá thể đồng hợp tử/dị hợp tử của locus đó

Khác với chỉ thị ngẫu nhiên (RAPD) hay chỉ thị dựa trên các vị trí giới hạn (RFLP, AFLP), chỉ thị SSR được phát triển dựa trên trình tự ADN đã biết trước đối tượng nghiên cứu

Kỹ thuật SSR cho phép ta phát hiện được tính đa hình về chiều dài các trình tự nucleotide đơn giản SSR dùng để chọn lọc tính trạng kháng bệnh khảm do virut ở cây đậu tương, chọn lọc năng suất lúa, xác lập mối quan hệ thân thuộc giữa các giống cây trồng (cà chua, lúa, đậu tương ) xây dựng bản đồ liên kết Mặt khác, kỹ thuật còn được sử dụng trong công việc xác định giới tính ở động vật và thực vật [29]

Nhược điểm cơ bản của việc sử dụng chỉ thị này là: tốn công sức, giá thành cao trong việc xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình bao gồm việc tách dòng và đọc trình tự một số lượng lớn các đoạn ADN trong hệ gen chứa SSR , mỗi loại mồi chỉ đặc trưng cho một loài [27]

STS là chỉ thị nhân bản trực tiếp những locut đã biết bằng việc sử dụng cặp mồi PCR được thiết kế, theo trình tự đoạn đầu và đoạn cuối của những locut đặc

trưng này [5] Các đoạn mồi STS chứa khoảng 20 nucleotide nên có tính đặc hiệu cao với PCR Mỗi một STS được xác định tại một điểm trên bản đồ như là một mốc trong genom Ở cây lúa, các STS được coi như là mốc chuẩn và người ta đã xác lập được các STS liên kết với một số gen kháng sâu bệnh, sử dụng để phát hiện tính đa hình xây dựng bản đồ di truyền liên kết như STS liên kết với gen kháng stress, chịu lạnh ở lúa [14] Nhờ đó việc tìm kiếm các gen kiểm soát hoặc liên quan chặt chẽ đến một tính trạng di truyền nào đó có thể được tiến hành dễ dàng Sử dụng trong lĩnh vực chọn giống dựa vào các dấu phân tử STS để tìm kiếm các gen quan tâm trong quần thể và phân tích nguồn gen, nghiên cứu mối quan hệ họ hàng giữa các loài

Khi so sánh trình tự ADN của những gen kháng đã phân lập từ nhiều loài thực vật khác nhau, các nhà khoa học đã thấy rằng những gen này có chung những vùng lặp lại, như vùng lặp lại giàu leucin (Leucine Rich Repeat: LRR), vùng vị trí liên kết nucleotit (Nucleotit Binding Site: NBS) và vùng protein Kinaza (PK) [37] Bản chất của kỹ thuật RGA là những cặp mồi ADN được xây dựng dựa vào những vùng bảo tồn nằm trong gen kháng Bởi vậy, sản phẩm “nhận dạng” ADN có thể là một vùng hoặc toàn bộ gen kháng Kỹ thuật RGA đã được dùng để tách, lập bản đồ gen kháng

và phân tích đa dạng di truyền [31] Những mồi RGA đã sử dụng cũng tách biệt

những giống lúa có hệ gen di truyền Indica từ hệ gen di truyền japonica Ngoài ra,

mối liên kết giữa chỉ thị RGA với gen kháng bệnh rỉ sắt cũng được phát hiện [32]

 Chỉ thị SNPs (Single nucleotide polymorphism - Đa hình của các nucleotit

đơn)

SNP là những biến dạng của chuỗi trình tự ADN được tìm thấy với tần suất cao nhất trong genome người Theo phân tích chi tiết chuỗi trình tự của những phần nào đó trong genome, ADN từ hai cá thể khác nhau phần lớn đều giống nhau với số cặp base khác biệt nhau nằm ở trong khoảng cho phép 500-1000bp Một cặp base ở một vị trí nào đó sẽ biểu thị sự khác nhau của cá thể có tính chất phổ biến, và một

cặp base khác là biến dị, ít phổ biến hơn ở cùng một vị trí Nếu cặp base ít phổ biến hơn xuất hiện nhỏ hơn 1% trong quần thể, người ta gọi vị trí cặp base đó là một SNP Hiện nay, người ta đã công bố 3 triệu SNP trong genome người, nhiều hơn bất

cứ chỉ thị phân tử nào đã được công bố trước đó Chỉ thị SNP được áp dụng vào đầu những năm 2000, từ genome người cho đến genome các sinh vật khác như cây

Arabidopsis, cây lúa (Oryza sativa)

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

- 33 mẫu giống lúa thu thập từ nhiều tỉnh của Cộng hòa Dân chủ Nhân dân Lào (Hình 2.1)

Hình 2.1 Bản đồ những vùng thu thập mẫu giống lúa tại Lào

: Vùng thu thập Các mẫu giống lúa được thu thập từ nhiều vùng sinh thái khác nhau trên ruộng cạn, ruộng vàn, trên đồi núi và ruộng trũng với những kiểu canh tác đa dạng có tưới tiêu, ruộng trũng nước trời, ruộng sâu ngập nước hay ruộng đất cao nước trời (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu giống lúa Lào dùng trong nghiên cứu

2 VL22 Louangphrabang 19 LP29 Khammouan

- Các giống lúa đối chứng: Bắc Thơm 7 được trồng phổ biến ở đồng bằng Bắc Bộ

thuộc phân loài phụ Indica,giống ĐS1 thuộc phân loài phụ Japonica

- 20 chỉ thị SSR nằm rải rác trên 12 nhiễm sắc thể của bộ gen lúa (Phụ lục 1)

- Dụng cụ, máy móc, hóa chất và thiết bị thí nghiệm

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Bố trí thí nghiệm

- Bố trí thí nghiệm đánh giá tập đoàn theo phương pháp tuần tự không nhắc lại, mỗi giống 2,5m2 (1 x 2,5 m)

- Mật độ: 45 khóm/m2

- Các khâu kỹ thuật trồng và chăm sóc theo đại trà sản xuất

2.2.2 Các tính trạng theo dõi và đánh giá

Các tính trạng theo dõi và đánh giá được thực hiện theo Hệ thống đánh giá tiêu chuẩn cây Lúa của IRRI, 1996 [38]

Các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa được chia thành 9 giai đoạn như sau: Giai đoạn 1: Nảy mầm Giai đoạn 2: Mạ Giai đoạn 3: Đẻ nhánh

Giai đoạn 4: Vươn lóng Giai đoạn 5: Làm đòng Giai đoạn 6: Trỗ bông Giai đoạn 7: Chín sữa Giai đoạn 8: Vào chắc Giai đoạn 9: Chín

Các tính trạng theo dõi và đánh giá gồm:

Bảng 2.2: Các tính trạng hình thái nông học và thang điểm

Bảng 2.2: Các tính trạng hình thái nông học và thang điểm

8 Dài thìa lìa (mm): Đo từ cổ đến đỉnh lá Giai đoạn sinh trưởng 4-5

9 Màu thìa lìa (giai đoạn sinh trưởng 4-5): 1 - Trắng, 2 - Sọc tím, 3 - Tím

10 Dạng thìa lìa (giai đoạn sinh trưởng 4-5): 1 - Nhọn đến hơi nhọn, 2 - Hai lưỡi kìm, 3 - Chóp cụt

11 Màu cổ lá (giai đoạn sinh trưởng 4-5): 1 - Xanh nhạt, 2 - Xanh, 3 - Tím

12 Màu tai lá (giai đoạn sinh trưởng 4-5): 1 - Xanh nhạt, 2 - Tím

13 Thời gian sinh trưởng (ngày) tính từ khi gieo đến khi có 85% số hạt chín trên các khóm

Thời gian sinh trưởng (ngày) tính từ khi gieo đến khi có 50% số bông lúa trỗ cộng với thời gian từ khi 50% số bông lúa trỗ đến khi lúa có 80% số hạt chín

14 Chiều cao cây (cm) Đo từ mặt đất đến đến đỉnh bông dài nhất Giai đoạn sinh trưởng 8

15 Số bông/khóm: Đếm tất cả các bông trong 1 khóm Giai đoạn sinh trưởng

8

16 Góc thân: 1 - Đứng ( 30o), 3 - Trung gian (= 45 o), 5 - Mở (= 60 o),

7 - Tòe ( 60 o), 9 - Bò lan

Bảng 2.2: Các tính trạng hình thái nông học và thang điểm

21 Trục bông (giai đoạn sinh trưởng 8): 1 - Thẳng đứng, 2 - Uốn xuống

22 Độ rụng hạt, giữ chặt và vuốt tay dọc bông và ước tính số % hạt rụng (giai đoạn sinh trưởng 9): 1 - Rất thấp (1%), 3 - Thấp (1-5%), 5 - Trung bình (6-25%), 7 - Dễ rụng (26-50%), 9 - Rất dễ rụng (51-100%)

23 Độ rụng hạt (giai đoạn sinh trưởng 9): 1 - Khó rụng, 5 - Trung bình,

9 - Dễ rụng

24 Râu đầu hạt (giai đoạn sinh trưởng 7 - 9): 0 - Không râu, 1 - Râu ngắn từng phần, 5 - Râu ngắn toàn phần, 7 - Râu dài từng phần, 9 - Râu dài toàn phần

25 Màu mỏ hạt (giai đoạn sinh trưởng 7 - 9): 1 - Trắng, 2 - Vàng rơm,

3 - Nâu, 4 - Đỏ, 5 - Đỉnh đỏ, 6-Tím

26 Màu nhuỵ cái được xác định lúa hoa nở (từ 9 giờ sáng đến 2 giờ chiều, giai đoạn sinh trưởng 6): 1 - Trắng, 2 - Xanh nhạt, 3 - Vàng, 4 - Tím nhạt, 5 - Tím

27 Màu vỏ trấu (giai đoạn sinh trưởng 9): 0 - Vàng rơm, 1 - Vàng hoặc khía vàng, 2 - Đốm nâu, 3 - Khía nâu, 4 - Nâu, 5 - Hơi đỏ đến tím nhạt, 6 - Đốm

Bảng 2.2: Các tính trạng hình thái nông học và thang điểm

33 Chiều dài hạt (mm): Đo từ gốc vỏ mày lên tới mỏ hạt

34 Chiều rộng hạt (mm): Đo ngang chỗ rộng nhất giữa hai nửa

2.2.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền bằng chỉ thị ADN

2.2.3.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số

ADN lúa được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp CTAB cải tiến

Phương pháp CTAB cải tiến trên cơ sở phương pháp của Shagai – Maroof (1984) [63] Quy trình thực hiện gồm các bước:

• Lấy khoảng 1-2g lá mạ (2 tuần tuổi) nghiền với nitơ lỏng trong ống eppendorf thành dạng bột mịn

• Thêm 1 ml dịch chiết (0,1M Tris-Cl, pH8; 0,05M EDTA; 0,5M NaCl; 0,07% β-mercaptoethanol) và 50µl 10% SDS trộn đều

• Ủ 30 phút ở 650C, lắc nhẹ Ly tâm với tốc độ 13000vòng/phút trong 20 phút

• Thu lấy dung dịch nổi ở bên trên cho vào ống eppendorf mới và thêm vào đó một thể tích tương ứng isopropanol, lắc nhẹ

• Ủ trong đá 10-30 phút

• Ly tâm với tốc độ 13000vòng/phút trong 10 phút

• Bỏ pha dịch Làm khô kết tủa Thêm vào 400 µl TE để hoà tan

• Thêm 1µl RNase (10mg/ml)

• Ủ mẫu ở 370C trong 2h

• Thêm 400µl đệm CTAB (0,2M Tris-Cl, pH7,5; 0,05M EDTA; 2M NaCl; 2% (w/v) CTAB)

• Ủ ở 650C trong 15 phút Trong khi ủ thỉnh thoảng lắc nhẹ

• Thêm 800µl Chloroform/isoamyl alcohol tỷ lệ 24/1 và lắc đều thành dạng sữa

• Tiếp tục ly tâm với tốc độ 13000vòng/phút trong 15 phút

• Chuyển phần dịch trong phía trên sang ống eppendorf mới, thêm 1,4ml ethanol 96% và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1h

• Ly tâm với tốc độ 13000vòng/phút trong 10 phút, loại phần dịch và thêm vào 400µl ethanol 70%

• Ly tâm với tốc độ 13000vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ ethanol, cho vào máy quay khô

• Hoà tan ADN trong 200µl H2O (hoặc TE)

• Bảo quản ở nhiệt độ -200C để dùng dần

Kiểm tra ADN tổng số: Chất lượng và nồng độ ADN tổng số được kiểm tra trên gel agarose 0,8%

2.2.3.2 Phương pháp PCR với mồi SSR

Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR được chuẩn bị trong tấm PCR plate 96 giếng Thành phần, hàm lượng của các chất trong mỗi phản ứng như trong bảng 2.3

Bảng 2.3 Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR

55* 30 giây

(*): Nhiệt độ gắn mồi - có thể thay đổi tùy theo từng cặp mồi SSR cụ thể

2.2.3.3 Phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%

 Các bước tiến hành

- Cân 0.8g agarose, đong 100ml TBE 0,5X (5,4g Tris base; 2,76g axít boric; 2ml 0,5M EDTA, pH = 8,0) cho vào bình tam giác

- Đun trong lò vi sóng cho đến khi tạo thành một dung dịch đồng nhất

- Để nguội đến khoảng 50 - 600C, thêm 5l ethidium bromide (10 mg/ml)

và lắc đều

- Chuẩn bị khay và lược Đổ dung dịch agarose vào khay sao cho không có bọt khí Chờ khoảng 45 - 60 phút gel đông

- Rút lược, đặt gel vào bể điện di Đổ 0,5X TBE ngập mặt gel khoảng 2mm

- Tra sản phẩm PCR đã được trộn với Xylen cyanol vào giếng tỷ lệ 5l Xylen cyanol /15l mẫu Thời gian và điện thế sử dụng để điện di dài hay ngắn phụ thuộc vào kích thước của cặp mồi SSR cần kiểm tra Các mẫu chạy với ladder

25 bp

- Soi gel trên máy soi cực tím

2.2.3.4 Phương pháp phân tích kết quả trên gel polyacrylamide

 Chuẩn bị kính

- Lau kỹ bề mặt hai tấm kính 3 lần bằng nước cất, sau đó lau lại 3 lần bằng ethanol 95%, để khô sau mỗi lần lau

- Lau tấm kính dài với giấy lụa tẩm Rain-X Để 5 phút cho khô dung dịch

Chú ý Tránh làm dính dung dịch này lên tấm kính ngắn

- Lau tấm kính ngắn với dung dịch dính (Binding solution) được tạo thành bằng cách thêm 2l Bind Silane vào 1ml chứa 95% ethanol và 5% glacial acetic acid

- Để cho tấm kính khô, lau tiếp bằng ethanol 95% 1 lần

- Lắp ghép 2 tấm kính lại với nhau, sử dụng nẹp Sigma 0,4mm

 Chuẩn bị gel polyacrylamide

Chuẩn bị dung dịch 4,5% acrylamide từ dung dịch gốc 40% acrylamide (19:1

= acrylamide 380g; bisacrylamide 20g pha trong 1 lít nước)

- Đổ 60ml dung dịch 4,5% acrylamide (25,2g Urea: 6ml TBE 10X: 6,75ml

acrylamide/bis-acrylamide 40% (19:1) vào 1 cốc đong 100ml Thêm 300l 10%

APS (ammonium persulfate) và 60l TEMED (N,N,N’,N’-Tetraethyl - ethylendiamine), trộn đều

- Bơm dung dịch gel vào giữa hai tấm kính sao cho không có bọt khí

- Cài lược vào giữa hai tấm kính (răng lược hướng ra phía ngoài) Dùng kẹp

cố định lược

- Để gel polyme hóa trong 1 - 2 giờ

 Điện di

- Tháo lược và loại bỏ hết các mảnh gel thừa bám trên mặt tấm kính

- Lắp ráp bộ điện di Cho 1 lít đệm TBE 1X vào buồng đệm trên và dưới