Nghiên cứu đánh giá khả năng phân hủy Polylactic Axit (PLA) của một số chủng vi sinh vật phân lập ở Việt Nam

Các sản phẩm từ polymer sinh học có ưu điểm là khả năng tự phân hủy thành các thành phần cơ bản không gây ô nhiễm môi trường.. Từ những lí do trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tà

-

NGUYỄN THỊ THANH LỊCH

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY POLY LACTIC AXIT (PLA) CỦA MỘT SỐ CHỦNG

VI SINH VẬT PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

-

NGUYỄN THỊ THANH LỊCH

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY POLY LACTIC AXIT (PLA) CỦA MỘT SỐ CHỦNG

VI SINH VẬT PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN QUANG HUY

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình hình ô nhiễm môi trường trên thế giới và Việt Nam 3

1.1.1 Tình hình ô nhiễm môi trường trên thế giới 3

1.1.2 Tình trạng ô nhiễm môi trường ở Việt Nam 4

1.2 Tình trạng ô nhiễm rác thải nilon 5

1.3 Một số phương pháp xử lý rác thải 8

1.3.1 Phương pháp chôn lấp 8

1.3.2 Phương pháp đốt 9

1.3.3 Phương pháp xử lý rác bằng con đường sinh học 10

1.4 Polymer sinh học 11

1.4.1 Khái niệm 12

1.4.2 Nhựa sinh học – Khả năng ứng dụng và nhu cầu thị trường 12

1.4.3 Một số loại polymer sinh học phổ biến hiện nay 13

1.4.3.1 Polylactic acid (PLA) 13

1.4.3.2 Polyhydroxyalkanoate(PHA) và Poly–3–hydroxybutyrate (PHB 14

1.4.3.3 Poly – ε – caprolactone (PCL) 15

1.4.3.4 Polyamide (PA) 16

1.4.3.5 Polybutylene succinate (PBS) và polyethylene succinate (PES) 17

1.4.3.6 Polyethylene (PE) 17

1.4.4 Ưu, nhược điểm và hướng phát triển của polymer sinh học 18

1.4.4.1 Ưu điểm 18

1.4.4.2 Nhược điểm 19

1.5 Các vi sinh vật có khả năng phân hủy polymer sinh học 20

1.5.1 Vi khuẩn 21

1.5.2 Xạ khuẩn 22

1.5.3 Nấm 23

1.6 Cơ chế phân hủy polymer sinh học theo con đường sinh học 23

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Nguyên liệu 26

2.2 Hóa chất và thiết bị 26

2.2.1 Hóa chất 26

2.2.2 Thiết bị 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Phương pháp thu thập mẫu 27

2.3.2 Môi trường phân lập nuôi cấy 27

2.3.2.1 Môi trường khoáng cơ bản 27

2.3.2.2 Môi trường LB 27

2.3.3 Phân lập trên môi trường khoáng có bổ sung 0,2% PLA 28

2.3.3.1 Phương pháp cấy trải 28

2.3.4 Phương pháp xác đi ̣nh, nhâ ̣n da ̣ng chủng nghiên cứu 28

2.3.4.1 Phương pháp nhuô ̣m Gram 28

2.3.4.2 Chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét 29

2.3.4.3 Phương pháp giải trình tự gen mã hóa 16S rARN 30

2.3.5 Phương pháp xác đi ̣nh hoa ̣t đô ̣ một số enzyme ngoại bào 30

2.3.5.1 Xác định khả năng sinh amylase 30

2.3.5.2 Xác định khả năng sinh cellulase 31

2.3.5.3 Xác định hoạt độ catalase 31

2.3.5.4 Xác định hoạt độ protease 32

2.3.6 Phương pháp đánh giá khả năng phân hủy PLA 34

2.3.6.1 Phương pháp đo vòng phân hủy PLA 34

2.3.6.2 Phương pháp thu hồi PLA 35

2.3.6.3 Phương pháp tăng khả năng phân hủy PLA 35

2.3.7 Phương pháp tối ưu hóa các điều kiê ̣n nhiê ̣t đô ̣, pH, nồng đô ̣ muối NaCl 36

2.3.8 Phương pháp thống kê sinh học 36

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy PLA 37

3.2 Đặc điểm hình thái của chủng T2 41

3.3 Phân loại chủng T2 dựa trên trình tự 16S rARN 43

3.4 Hoạt độ một số enzym ngoại bào của chủng T2 44

3.4.1 Khả năng sinh amylase 44

3.4.2 Khả năng sinh cellulase 45

3.4.3 Hoạt độ catalase và protease 46

3.5 Khả năng phân hủy polymer sinh học 47

3.5.1 Khả năng phân hủy PLA của chủng Klebsiella variicola T2 47

3.5.2 Khả năng phân hủy một số polymer sinh học khác của chủng Klebsiella variicola T2 49

3.6 Tối ưu hóa các điều kiện phân hủy PLA 51

3.6.1 Tối ưu khả năng phân hủy PLA từ chủng Klebsiella variicola T2 51

3.6.2 Tối ưu điều kiện nhiệt độ 52

3.6.3 Tối ưu điều kiện pH 54

3.6.4 Ảnh hưởng của NaCl 55

KẾT LUẬN 56

KIẾN NGHI ̣ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC 65

MỞ ĐẦU

"Ô nhiễm môi trường là sự làm thay đổi tính chất của môi trường, vi phạm tiêu chuẩn môi trường" (Theo Luật Bảo vệ Môi trường của Việt Nam) Trên thế giới, ô nhiễm môi trường được hiểu là việc chuyển các chất thải hoặc năng lượng vào môi trường đến mức có khả năng gây hại đến sức khoẻ con người, đến sự phát triển sinh vật hoặc làm suy giảm chất lượng môi trường Các tác nhân ô nhiễm bao gồm các chất thải

ở dạng khí (khí thải), lỏng (nước thải), rắn (chất thải rắn) chứa hoá chất hoặc tác nhân vật lý, sinh học và các dạng năng lượng như nhiệt độ, bức xạ

Ô nhiễm môi trường đang trở thành hiểm họa đối với đời sống của sinh giới và

cả đối với con người ở bất kỳ phạm vi nào, từ quốc gia, khu vực đến toàn cầu Ô nhiễm môi trường là sản phẩm của quá trình công nghiệp hóa và đô thị hóa diễn ra trên 200 năm nay Ô nhiễm hiện nay đã lan tràn vào mọi nơi, từ đất, nước đến khí quyển, từ bề mặt đất đến các lớp sâu của đất và của đại dương

Giá nhiên liệu tăng cao và các vấn đề về môi trường hiện là mối bận tâm hàng đầu của nhân loại Việc sử dụng các sản phẩm từ nhựa polymer có nguồn gốc sinh học

để thay thế dần các loại nhựa polymer tổng hợp đang là một hướng rất triển vọng Các sản phẩm từ polymer sinh học có ưu điểm là khả năng tự phân hủy thành các thành phần cơ bản không gây ô nhiễm môi trường Tuy nhiên khả năng tự phân hủy của chúng trong đất diễn ra chậm và phải mất nhiều thời gian để quá trình phân hủy bắt đầu xảy ra

Vi sinh vật phân hủy polymer sinh học nói chung luôn tồn tại trong các môi trường tự nhiên khác nhau như đất, nước, bùn Số lượng, chủng loại các vi sinh vật có khả năng phân hủy polymer sinh học phụ thuộc vào các điều kiện tự nhiên [37, 48, 57]

tế bào/ml vi sinh vật có khả năng sử dụng hay phân hủy các loại polymer sinh học khác nhau [44] Trên thế giới đã có nhiều công bố về các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy polymer sinh học như vi khuẩn, nấm sợi và xạ khuẩn

Ô nhiễm môi trường ở Việt Nam đang là một trong những vấn đề gây nhức nhối với toàn xã hội, trong đó có ô nhiễm do rác thải từ các sản phẩm nhựa Việc phát triển

và ứng dụng các sản phẩm polymer si nh ho ̣c vào đời sống nhằm giảm thi ểu ô nhiễm môi trường đang ngày càng được quan tâm

Việc phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy polymer sinh học là công việc rất có ý nghĩa góp phần xử lý làm sạch môi trường Tuy nhiên ở Việt Nam số lượng các công bố điều tra nghiên cứu về vi sinh vật

có khả năng phân huỷ các polymer sinh học là không nhiều

Từ những lí do trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đánh

giá khả năng phân hủy poly lactic axit (PLA) của một số chủng vi sinh vật phân lập ở Việt Nam” làm cơ sở cho việc ứng dụng trong việc tạo các chế phẩm chủ động

trong việc tăng nhanh quá trình phân huỷ tự nhiên và giảm thiểu ô nhiễm môi trường

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình ô nhiễm môi trường trên thế giới và Việt Nam

1.1.1 Tình hình ô nhiễm môi trường trên thế giới

Trong những năm gần đây, nhân loại đã và đang đối đầu với những hiểm họa

do ô nhiễm môi trường gây ra Vấn đề ô nhiễm môi trường không còn là riêng của bất

kì quốc gia nào, mà nó đã trở thành mối quan tâm của toàn thế giới

Các nhà hoạt động môi trường tại Anh đã gọi xứ sở sương mù là “hố rác của châu Âu” Hiện tại, số lượng rác thải tại Anh mỗi năm tăng trung bình khoảng 3% Nếu không có những biện pháp hữu hiệu, các bãi rác hiện có tại Anh sẽ hết chỗ chứa sau 9 năm nữa, dẫn tới nguy cơ một cuộc khủng hoảng tương tự như ở Napoli vừa qua

Nguy cơ quá tải của các bãi chứa rác không chỉ là vấn đề của riêng Italia và Anh, mà là của nhiều quốc gia Liên minh châu Âu (EU) đã buộc phải ra một quy định, bắt buộc các nước thành viên phải giảm bớt nhanh chóng lượng rác thải, cũng như hạn chế đáng kể việc sử dụng lại các bãi rác Theo Quyết định số 99/31/EU ngày 26-4-

1999, các thành viên EU đến năm 2010 phải giảm được 25% lượng chất thải chở đến các bãi rác so với mốc thời điểm năm 1995 và đến năm 2020 là 65% [69]

Ngoài những nước đã có được những chiến lược xử lý rác đúng đắn như Đức,

Hà Lan và Áo; các quốc gia vùng Bắc Âu cũng đặc biệt coi trọng vấn đề này Tại Thụy Điển hiện đang rất phổ biến sản xuất phân bón từ rác thải sinh hoạt Chính vì nhờ biện pháp trên, Thụy Điển đã tăng tỷ lệ rác thải được tái chế lên 49%, đồng thời giảm số lượng rác nói chung xuống tới 19% [69]

Theo số liệu của Cơ quan Bảo vệ môi trường Mỹ chỉ có 55% tổng số rác tại Mỹ được chở tới các bãi rác trong năm 2006 Theo một nghiên cứu của Tổ chức “Hòa Bình Xanh”, đại dương trên khắp thế giới đã trở thành một bãi rác khổng lồ chứa đựng gần 6,5 triệu tấn rác thải (hình 1) [69]

Hình 1 Rác thải xâm lấn đại dương

1.1.2 Tình trạng ô nhiễm môi trường ở Việt Nam

Trong khi các nước tiên tiến trên thế giới như Nhật, Mỹ, Anh đầu tư hàng triệu USD tái chế rác thải, thì ở Việt Nam lại nằm trong số những quốc gia đang lãng phí nguồn năng lượng này

Tình hình ô nhiễm trong thời gian gần đây đã trở nên bức xúc, đặc biệt ở 3 thành phố lớn là Hà Nội, TP Hồ Chí Minh và Đà Nẵng Theo thống kê tại Hà Nội, khối lượng rác thải sinh hoạt tăng trung bình 15%/năm, vởi tổng lượng ước tính 5.000 tấn/ngày đêm, và dự đoán chỉ năm 2012 có thể không còn chỗ để đổ rác (hình 2) [5]

Thành phố Hồ Chí Minh mỗi ngày có trên 7.000 tấn rác thải sinh hoạt Thời gian gần đây, tình hình xả rác bừa bãi cũng như những bất cập trong khâu xử lý chôn lấp rác thải trở thành vấn nạn ở nước ta [5]

Hình 2 Hà Nội ngập tràn rác thải [5]

Theo kết quả khảo sát của Bộ Tài nguyên và Môi trường phối hợp với Đại sứ quán Đan Mạch tại Việt Nam cho biết: Ô nhiễm môi trường gia tăng ngày càng mạnh như: ô nhiễm hữu cơ ở các lưu vực sông; ô nhiễm tại các đô thị, các khu, cụm công nghiệp, làng nghề; sản xuất nông nghiệp; vùng ven biển Môi trường nước mặt ở hầu hết các đô thị và ở nhiều lưu vực sông bị ô nhiễm chất hữu cơ và các thông số ô nhiễm đặc trưng đều vượt tiêu chuẩn cho phép nhiều lần, nổi cộm nhất là các lưu vực sông Nhuệ-Đáy, sông Đồng Nai [76]

1.2 Tình trạng ô nhiễm rác thải nilon

Ngày nay, túi nilon được sử dụng rộng rãi và có phần không kiểm soát được Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích mà nó mang lại thì những ảnh hưởng của nó đến môi trường và sức khỏe con người cũng không hẳn là nhỏ Các tác hại chính có thể kể đến là:

Thứ nhất: túi nilon gây tác hại ngay từ khâu sản xuất bởi vì việc sản xuất túi nilon phải sử dụng nguyên liệu đầu vào là dầu mỏ và khí đốt, do đó trong quá trình sản xuất nó sẽ tạo ra khí CO2 làm tăng hiệu ứng nhà kính, thúc đẩy biến đổi khí hậu toàn

Thứ hai: việc sử dụng túi nilon sẽ gây tác hại xấu tới sức khoẻ của con người Túi nilon được làm từ nhựa PVC (poly vinyl clorua) không độc nhưng các chất phụ gia thêm vào để làm cho túi nilon mềm, dẻo, dai lại vô cùng độc hại Các chất phụ gia chủ yếu được sử dụng là chất hoá dẻo, kim loại nặng, phẩm màu… là những chất cực kỳ nguy hiểm Chất phụ gia hóa dẻo TOCP (triorthocresylphosphat) có thể làm tổn thương

và làm thoái hoá thần kinh ngoại biên và tuỷ sống; chất BBP (butyl benzyl phthalate)

có thể gây độc cho tinh hoàn và gây ra một số dị tật bẩm sinh nếu thường xuyên tiếp xúc với nó [4]

Những loại túi nilon tái chế hoặc hộp nhựa, bình nhựa, túi nhựa có thể chứa DOP (dioctin phatalat) cực độc, ảnh hưởng đến cơ quan sinh dục nam Trẻ em bị nhiễm chất này lâu dài có thể thay đổi giới tính: các bé trai có thể bị nữ tính hóa, vô sinh nam; còn bé gái có nguy cơ dậy thì sớm [4]

Các loại nilon màu nếu sử dụng để đựng thực phẩm tươi sống, đồ ăn chín có thể khiến thực phẩm nhiễm các kim loại như chì, clohydric gây tác hại cho não và là nguyên nhân gây ung thư phổi, gây ngộ độc và ung thư

Thứ ba: Các túi nilon chủ yếu được sử dụng một lần rồi bị thải ra môi trường Theo ước tính số nilon con người thải ra trong một năm sẽ phủ kín bề mặt trái đất tấm nilon khổng lồ dày tới 0,8 mm Chỉ tính riêng nước ta, với con số ướng lượng như trên thì trong một năm số lượng túi trải ra trên bề mặt cả nước là 9,1 chiếc/1m2 Theo khảo sát sơ bộ, năm 2010 trung bình một ngày, Việt Nam xả khoảng 2.500 tấn rác nhựa ra môi trường Tuy nhiên chỉ một phần nhỏ trong số này được thu gom, tái chế, còn phần lớn bị vứt bỏ khắp nơi Việc này không chỉ gây lãng phí về kinh tế mà còn là hiểm hoạ môi trường cho con người [4]:

Túi nilon kẹt sâu trong cống rãnh, kênh rạch còn làm tắc nghẽn cống, rãnh, kênh, rạch gây ứ đọng nước thải và gây ngập úng Các điểm ứ đọng nước thải sẽ là nơi sản sinh ra nhiều vi khuẩn gây bệnh Ngoài ra, bên cạnh ảnh hưởng tới nguồn nước, đất sức khỏe, túi nilon còn gây mất mỹ quan

Một tác hại nữa đó là việc xử lý túi nilon là một bài toán khó giải Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng, việc chôn lấp túi nilon sẽ ảnh hưởng tới môi trường đất, nước do

nilon khó phân huỷ, còn đốt chúng sẽ tạo ra sẽ tạo ra khí thải có chất độc dioxin và Furan gây ngộ độc, ảnh hưởng đến tuyến nội tiết, gây ung thư, giảm khả năng miễn dịch, rối loạn chức năng tiêu hoá và các dị tật bẩm sinh ở trẻ nhỏ [4]

Đối với thế giới ngày nay, túi nilon đã, đang và sẽ là một vấn nạn môi trường nghiêm trọng do chính con người gây ra, việc hạn chế sử dụng túi nilon hoặc thay thế bằng sản phẩm khác đang trở nên cấp thiết (hình 3)

Tại Ấn Độ và Bangladesh, túi nilon bị cấm ở một số thành phố Tại Hoa Kỳ, các thành phố Long Beach, San Francisco và tại Israel đều cấm hành vi vứt túi nilon ra bãi biển [72] Mỗi phút trên thế giới có hơn 1 triệu túi nilông được sử dụng Mỗi năm, toàn thế giới sử dụng hơn 13 tỉ túi nilông, trung bình mỗi người sử dụng 220 túi nilông trong một năm Bình quân mỗi năm một người Ireland sử dụng 328 túi nilông Con số này ở Úc là 250 túi/người/năm và ở Scotland là 153 túi/người/năm [74, 75]

Số túi nilông có thể tái sản xuất được chiếm 67% trong tổng số túi thải ra, nhưng theo tính toán các nước phát triển thì chỉ thu được 72% số túi có phân huỷ Ước tính trên thế giới 1 năm có 9,3 tỷ tấn túi nilông không được thu gom phải tự phân huỷ trong tự nhiên [2]

Ở Việt Nam, các loại túi nilon được sử dụng tràn lan trong hoạt động sinh hoạt

xã hội Hiện chưa có số liệu thống kê chính thức về số lượng túi nilon được sử dụng ở Việt Nam

Theo một khảo sát của Trung tâm môi trường Công nghiệp (CIE), trung bình một người Việt Nam trong 1 năm sử dụng ít nhất 30 kg các sản phẩm có nguồn gốc từ nhựa Từ 2005 đến nay, con số này là 35 kg/người/năm Năm 2000, trung bình một ngày, Việt Nam xả khoảng 800 tấn rác nhựa ra môi trường Đến 2010, con số đó là 2.500 tấn /ngày và có thể còn hơn [7]

Hiện nay mỗi ngày Hà Nội thải ra khoảng 200 tấn chất thải khó phân hủy Điển hình là túi nilon, nhiều túi đã chôn lấp được 20 năm nhưng khi đào lên vẫn không tiêu hủy được Đây chính là khó khăn trong công tác xử lý chất thải sinh hoạt hiện nay [71]

1.3 Một số phương pháp xử lý rác thải

Với tình trạng ô nhiễm rác thải nói chung và rác nilon nói riêng đang là vấn nạn trên toàn cầu Đi đôi với nó là các biện pháp đưa ra nhằm giảm thiểu ô nhiễm môi trường Trong đó hiện có một số phương pháp đang được sử dụng

Đối với bãi chôn lấp cũ (không hợp vệ sinh): không có lớp lót đáy, không có hệ thống thu gom và xử lý khí thải và nước thải Vì thế, mặc dù chi phí chôn lấp thấp nhưng tốn nhiều diện tích nên chi phí đất cao, chi phí xử lý môi trường sau khi chôn lấp cũng rất cao, những tác động đến môi trường và sức khoẻ cộng đồng là nghiêm trọng và lâu dài

Công nghệ chôn lấp hợp vệ sinh, có thu gom và xử lý nước rác và khí bãi rác, kể

cả có và không thu hồi năng lượng, thì chi phí đầu tư cũng rất lớn (cho giá trị đất sử dụng, hệ thống xử lý gas và động cơ gas phát điện), chi phí vận hành cao nên giá thành sản xuất điện cao, thị trường tiêu thụ khó chấp nhận Theo thống kê của Viê ̣n chiến

lươ ̣c chính sách Tài nguyên và Môi trường , chỉ có 15,5% các bãi chôn lấp ở Việt Nam

là hợp vệ sinh , gần 85% còn lại đều không đủ tiêu chuẩn cho phép Tại Hà Nội , 90% lươ ̣ng rác thải được xử lý bằng phương pháp chôn lấp [14]

Theo một tính toán mới đây của các đơn vị xử lý môi trường thì đến năm 2015,

Hà Nội sẽ không còn chỗ chôn lấp rác Nguyên nhân chính do hiện nay, rác thải sinh hoạt trên địa bàn thành phố mới chủ yếu áp được xử lý bằng biện pháp chôn lấp [14]

Mỗi ngày, Khu liên hợp xử lý chất thải Nam Sơn tiếp nhận và chôn lấp khoảng

4000 tấn rác thải sinh hoạt, trong tổng số gần 200.000 tấn rác thải sinh hoạt phát sinh mỗi ngày của cả khu vực nội, ngoại thành 90% lượng rác thải sinh hoạt của thành phố

Hà Nội không được phân loại từ nguồn được đưa về đây để chôn lấp Với nhiều loại rác thải sinh hoạt, trong đó có nilon được chôn lấp lẫn lộn, đã gây rất nhiều khó khăn cho đơn vị xử lý rác, khiến cho bãi rác này quá tải nhanh chóng [70]

1.3.2 Phương pháp đốt

Thiêu hủy là giảm chất thải có thể đốt cháy đến các chất tồn dư vô hại bằng cách đốt ở nhiệt độ cao (900–1000oC) Nhiệt độ này là đủ để thiêu hủ y tất cả các vật liệu dễ cháy, để lại là tro và rác không đốt được Thiêu hủy đa ̣t hiê ̣u suất cao nhất là phải làm giảm khối lượng rác thải xử lý từ 75% – 95% Tuy nhiên, trong thực tế chất thải thiêu huỷ chỉ đa ̣t chưa đến 50% [15]

Thiêu hủy một cách hiệu quả có thể chuyển đổi một khối lượng lớn chất thải dễ cháy với một khối lượng nhỏ hơn nhiều là tro được xử lý tại một bãi rác Chất thải dễ bắt lửa có thể được dùng để bổ sung nhiên liệu khác trong việc tạo năng lượng điện Nhờ thiêu đốt dung tích chất thải rắn được giảm nhiều chỉ còn 10% so với dung tích ban đầu trọng lượng giảm chỉ còn 25% hoặc thấp hơn so với ban đầu Như vậy sẽ tạo điều kiện cho việc thu gom và giảm nhu cầu về dung tích chứa tại chỗ, ngay tại nguồn, đồng thời cũng dễ dàng chuyên chở ra bãi chôn lấp tập trung [15]

Chi phí xây dựng các lò đốt rác rất cao Tại Mỹ, chi phí cho việc xây dựng một

lò đốt rác tiêu tốn 8 tỷ USD nhưng chỉ xử lý được 25% lượng rác thải [15]

Tại Việt Nam, lò đốt rác được sử dụng ít hơn bãi chôn lấp Lý do chủ yếu khiến

Nếu sử dụng công nghệ này, Thành phố Hồ Chí Minh dự tính mỗi năm sẽ phải tốn trên

12 triệu USD cho xử lý rác thải [14]

Xử lý rác thải bằng phương pháp đốt không phải là mô ̣t biê ̣n pháp an toàn Quá trình đốt cháy sinh ra các khí độc , tro đô ̣c ha ̣i Tro rác thả i chứa các chất đô ̣c ha ̣i la ̣i đươ ̣c xử lý ta ̣i các bãi chôn lấp Ống khói từ lò thiêu có thể thải ra nitơ oxit , carbon và lưu huỳnh , đó là tiền chất của mưa axit , cùng với carbon monoxide và kim loại nặng như chì, cadmium, và thủy ngân Đồng thời, việc đốt các chất thải nhựa cũng làm s ản sinh ra rất nhiều các khí nhà kính, tiêu biểu như khí mêtan [14]

Hê ̣ thống các bãi chôn lấp và đốt rác không đảm bảo việc xử lý các loại rác thải nhựa một cách an toàn Trong khi đó thời gian phân huỷ kéo dài của các chất thải nhựa

sẽ gây ảnh hưởng rất lớn đến môi trường hiê ̣n ta ̣i và sau này Với tốc độ gia tăng dân số

và phát triển đô thị như hiện này thì lượng rác thải nhựa s ẽ ngày càng tăng lên Điều này đưa ra vấn đề cần có một biệ n pháp có hiê ̣u quả hơn trong viê ̣c giải quyết ô nhiễm môi trường hiê ̣n nay

1.3.3 Phương pháp xử lý rác bằng con đường sinh học

Phương pháp xử lý rác thải bằng con đường sinh học sử dụng các yếu tố, sinh vật nhằm biến đổi các thành phần trong rác thải thành những chất ít độc hại hơn có lợi với môi trường ví dụ: Dùng bèo tây, rau muống, tảo, lau, sậy để xử lý đất bị ô nhiễm kim loại nặng, các giống cây trồng để cải tạo đất, tăng độ phì và chống xói mòn đất có

ý nghĩa rất lớn đối với môi trường…

Đặc biệt, người ta ngày càng quan tâm đến vai trò của vi sinh vật trong quá trình

xử lý rác thải dựa vào khả năng sử dụng rác thải làm nguồn cacbon của các vi sinh vật Tất cả các nhóm vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn, đều có những chủng có khả năng xử lý rác

Đối với phương pháp xử lý bằng con đường sinh học thường có chi phí ban đầu cao, mất nhiều năm nghiên cứu và hoàn thiện dần các phương pháp Tuy nhiên, nó lại

có ưu điểm vượt trội so với phương pháp đốt và chôn lấp thông thường như: tốn ít diện tích (khoảng 20% so với các bãi chôn lấp), xử lý triệt để và ngay lập tức lượng rác thải đưa vào, giảm thiểu mùi hôi phán tán vào không khí, không gây ô nhiễm nguồn nước

ngầm, giảm thiểu được mầm bệnh, sử dụng lâu dài, sau xử lý rác thải có thể tạo ra các sản phẩm có lợi cho chăn nuôi, trồng trọt [10]

Ứng dụng công nghệ sinh học xử lý chất thải rắn ở Việt Nam chủ yếu tập trung vào xử lý các phế thải nông nghiệp, chất thải của các ngành công nghiệp chế biến lương thực và thực phẩm và rác thải sinh hoạt Phương pháp thường sử dụng là ủ hiếu khí và ủ kỵ khí dựa trên đặc điểm vi sinh vật Ủ hiếu khí được ứng dụng để xử lý chất thải làm nguồn phân bón hữu cơ và ủ kỵ khí thích hợp cho xử lý rác thải sinh hoạt, rác thải nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm Thực tế cho thấy hiệu quả tái sử dụng chất thải ở Việt Nam còn thấp Đã có nhiều loại chế phẩm vi sinh vật được nghiên cứu sản xuất và ứng dụng để nâng cao hiệu suất phân huỷ và mang lại hiệu quả kinh tế cao Hiện nhiều địa phương trong nước đã ứng dụng công nghệ ủ compost để xử lý rác thải sinh hoạt (Hà Nội, Nam Định, Thái Bình, Tp Hồ Chí Minh, Bình Phước, ) [6]

1.4 Polymer sinh học

Việt Nam đang trong quá trình đẩy mạnh công nghiệp hóa – đô thị hóa và cùng với nó là sự gia tăng chất thải sinh hoạt, trong đó có chất thải túi nilon Các bao bì nilon hiện đang sử dụng ở nước ta và nhiều nước trên thế giới thuộc loại khó và lâu phân hủy Những đặc điểm ưu việt trong sản xuất và tiêu dùng túi nilon đã làm lu mờ các tác hại đối với môi trường khi thải bỏ Đó cũng là lý do chính yếu giải thích tại sao túi nilon lại được dùng rất phổ biến ở nhiều quốc gia trên thế giới bất chấp những cảnh báo về tác hại to lớn và nhiều mặt tới môi trường, sức khỏe và trở thành vấn nạn trong quản lý môi trường ở hầu hết các quốc gia đang phát triển, trong đó có Việt Nam

Trong những năm gần đây, để giải quyết tình trạng ô nhiễm môi trường do rác thải nilon và các sản phẩm nhựa, các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu, phát triển và ứng dụng các sản phẩm polymer sinh học có khả năng tự phân hủy trong tự nhiên thay thế các sản phẩm nhựa có nguồn gốc hóa dầu Một số polymer đã và đang được nghiên cứu, phát triển và ứng dụng vào đời sống, góp phần giảm thiếu ô nhiễm môi trường [32]

1.4.1 Khái niệm

Polymer sinh học là dạng polymer tổng hợp từ các polyester như poly lactic axit (PLA), poly (-hydroxybulyrate) (PHB), poly (-caprolactone) (PCL) PLA hiện được sản xuất ngày một nhiều nhiều trong những năm gần đây Chúng được sử dụng trong công nghiệp gia công nhựa để sản xuất các sản phẩm như chai, các loại bao bì hay trong công nghiệp dược phẩm, y tế như các loại chỉ khâu, vật liệu thay thế…[33, 49]

1.4.2 Nhựa sinh học – Khả năng ứng dụng và nhu cầu thị trường

Vật liệu mới là lĩnh vực đang được phát triển mạnh Một hướng quan trọng là những vật liệu xanh thân thiện môi trường có nguồn gốc thiên nhiên như nhựa sinh học Sự ra đời của công nghệ “nhựa sinh học” là cuộc cách mạng quan trọng trong công nghệ chất dẻo, được xem như một giải pháp nhằm giảm dần sự lệ thuộc vào dầu

mỏ đang có nguy cơ cạn kiệt, đồng thời góp phần nâng cao sức khỏe và bảo vệ môi trường, hai lợi thế khiến nhựa sinh học có nhiều tiềm năng phát triển [76]

Những ứng dụng cho các loại sản phẩm “sử dụng nhiều lần” bao gồm vỏ điện thoại di động (NEC), sợi làm thảm (Dupont Sorona), và vật dụng nội thất xe hơi (Mazda) Công ty Arkema của Pháp hiện đã sản xuất một loại nhựa sinh học gọi là Rilsan, loại này được dùng làm ống dẫn nhiên liệu và ứng dụng làm ống dẫn bằng nhựa Mục tiêu trong những lĩnh vực này là vật liệu phải không bị phân huỷ sinh học nhưng phải được tạo ra từ những nguồn nguyên liệu thân thiện với môi trường [76]

Hiện có khoảng 180 công ty trên thế giới tham gia sản xuất trong lĩnh vực nhựa sinh học Trong đó có 45 công ty sản xuất với sản lượng khoảng 400 000 tấn mỗi năm, tập trung cao nhất ở Mỹ, Đức và Nhật Bản Hãng nhựa của công ty Mitsubishi đã thành công trong việc nâng cao sức chịu nhiệt và sức bền của acid polylactic, kết hợp với các loại nhựa tự phân hủy

Tổ chức nông nghiệp của Liên minh châu Âu (COPA-Committee of Agricultural Organisation in the European Union) và Hiệp hội các Ủy ban nông nghiệp của Liên minh Châu Âu (COGEGA-General Committee for the Agricultural Cooperation in the European Union) đã công bố các đánh giá về tiềm năng nhựa sinh học trong nhiều lĩnh vực khác nhau của nền kinh tế châu Âu [73]

Nhựa sinh học ở Việt Nam vẫn còn là vấn đề khá mới mẻ Năm 1998, một số nhà sản xuất đã đến Việt Nam để nghiên cứu về khả năng làm nhựa sinh học từ bột bắp

và bột khoai tây nhưng khong thành công do giá thành sản xuất cao và không đủ nguồn nguyên liệu [73]

Hiện nay, đã có công bố chính thức về công trình nghiên cứu, chế tạo và ứng dụng thành công vật liệu polymer phân hủy sinh học không gây ô nhiễm môi trường thành công lần đầu tiên ở Việt Nam [68]

1.4.3 Một số loại polymer sinh học phổ biến hiện nay

1.4.3.1 Poly lactic acid (PLA)

PLA được sản xuất từ việc lên men tinh bột thực vật (thường là bắp) Sau thời gian sử dụng, PLA dễ dàng bị phân hủy bởi những vi sinh vật có trong đất hoặc không khí và chuyển hóa thành CO2 và H2O Nhựa PLA được thương mại hóa từ những năm

90 và đã đạt được những thành công ban đầu trong cấy mô, chỉ khâu sinh học và hệ thống truyền thuốc do khả năng tự phân hủy theo thời gian

Sau đó, năm 2002, khi công nghệ sản xuất nhựa sinh học đã phát triển, nhà sản xuất Nature Works (Cargill) đã thương mại hóa nhựa PLA dùng trong các sản phẩm đời sống với giá cả rất cạnh tranh PLA có thể được sử dụng cho các sản phẩm như chậu cây và tã lót trẻ em, làm bao bì, vỏ chai nhựa… Một nghiên cứu mới đây của công ty Pira cho thấy tiêu thụ nguyên liệu bao bì phân hủy sinh học trên toàn cầu trong giai đoạn 2005-2006 đạt 43 ngàn tấn và sẽ đạt con số 116 ngàn tấn vào năm 2011 Trong số các nguyên liệu được sử dụng, nhựa PLA chiếm đến 43% và sẽ có hơn 50 ngàn tấn sẽ được tiêu thụ vào năm 2011 [73]

Nhựa PLA là loại nhựa trong suốt Tính chất của nhựa PLA không chỉ tương tự như nhựa truyền thống làm từ dầu hoả (như PE hay PP), mà còn có thể gia công dễ dàng trên các thiết bị chuẩn hiện có để gia công sản phẩm nhựa truyền thống theo phản ứng trùng hợp mở vòng của axit lactic thành poly lactic :

Phương pháp lên men được sử dụng để sản xuất axit lactic từ tinh bột ngô và đường mía Tuy nhiên axit lactic không thể trùng hợp trực tiếp để tạo thành sản phẩm hữu ích bởi vì mỗi một phản ứng trùng hợp tạo ra một phân tử nước dẫn đến quá trình hình thành chuỗi polymer bị suy giảm Thay vào đó, axit lactic được oligomer hóa sau

đó dimmer hóa tạo thành monomer lactic dạng vòng [26]

PLA có nhu cầu lớn nhất trong số tất cả các polyme sinh học Nhựa PLA nói chung đều ở dưới dạng hạt với nhiều tính chất khác nhau và được sử dụng trong công nghiệp gia công nhựa để sản xuất sản phẩm dạng cuộn, khuôn, ly, tách, chai hay các loại bao bì khác [27]

1.4.3.2 Polyhydroxyalkanoate(PHA) và Poly–3–hydroxybutyrate (PHB)

PHA gồm các polyester được tổng hợp từ mô ̣t số vi khuẩn sử du ̣ng rất ít các chất dinh dưỡng cần thiết như nitơ , phospho, magiê PHA có tính chất như tinh bô ̣t ở

thực vâ ̣t và chất béo ở đô ̣ng vâ ̣t

PHA chia thành thành 3 nhóm: nhóm thứ nhất là nhóm có số lượng cacbon từ 3–5: poly–3–hydrobutyrate (PHB), nhóm thứ hai là nhóm có khối lượng phân tử ở mức trung bình với số cacbon từ 6–14: poly–3–hydroxyoctanoate (PHO), và nhóm thứ 3 là nhóm có các polymer ở dạng đồng trùng hợp với các polymer khác trong họ PHA : poly–3–hydroxybutyrate–co–3–hydroxyvalerate (PHBV)

Năm 2000, lươ ̣ng PHA sử du ̣ng trên thế giới là 1,4–2 triê ̣u tấn PHA được sử dụng chủ yếu trong việc bao gói thực phẩm , dươ ̣c phẩm, làm chai lọ nhựa , đồ chơi, dụng cụ thể thao…[53] Khả năng tự phân hủy của PHA đã được biết đến rất nhiều qua

mô ̣t số vi khuẩn và nấm , mức đô ̣ phân hủy phu ̣ thuô ̣c vào đă ̣c điểm của từng loa ̣i enzym depolymerase ngoa ̣i bào của PHA [32]

Cấu trúc phân tử PHA

PHB là mô ̣t da ̣ng polymer thuô ̣c ho ̣ PHA PHB (poly 3-hydroxybutyrat) là một loại nhựa sinh học chịu nhiệt, dễ phân hủy, đang được quan tâm như là một nguồn thay thế lý tưởng cho nhựa tổng hợp do có các tính chất tương tự nhựa tổng hợp PHB được sản xuất từ tinh bột hoặc có thể thu được từ quá trình nuôi cấy vi khuẩn

PHB hiện diện trong nhiều sản phẩm, từ vỏ chai nước ngọt đến cấy ghép y học, được ứng dụng để tạo ra màng mỏng trong suốt chịu nhiệt (khoảng 13000C); có khả năng phân hủy hoàn toàn thành CO2 và H2O nhờ các chủng vi sinh vật sử dụng PHB như là nguồn carbon và năng lượng cho các hoạt động sống của chúng Từ năm 1982, công ty hóa chất ICI (Imperial Chemical Industries)đã thương mại hóa sản phẩm PHB

từ vi khuẩn Rastonia eutropha [73]

Khi nghiên cứu quá trình sản xuất PHB từ vi sinh vâ ̣t , Lee và cô ̣ng sự thấy rằng PHB là nguồn năng lượng và nguồn cacbon dự trữ trong nô ̣i bà o của mô ̣t số vi khuẩn Như vâ ̣y, các vi sinh vật này đều có chứa enzym có khả năng tổng hợp PHB tạo ra sản phẩm ban đầu ở da ̣ng monomer [34]

1.4.3.3 Poly – ε – caprolactone (PCL)

PCL là mô ̣t da ̣ng nhựa có khả năng phân hủy , có nhiệt độ nóng chảy thấp chỉ ở

60oC, kết tinh ở –60oC PCL có thể bi ̣ phân hủy bởi rất nhiều các vi sinh vâ ̣t ki ̣ kh í và hiếu khí có trong tự nhiên như: Pennicillium sp, Aspergillus sp, Clostridium [62]

Phản ứng trùng hợp ε-caprolactone thành PCL

PCL có thể bi ̣ phân hủy dưới tác du ̣ng của hai enzyme là lipase và esterase Sự phân hủy PCL phu ̣ thu ộc vào trọng lượng phân tử và độ kết tinh của chính phân tử đó Khả năng phân hủy của PCL có thể tăng lên nhờ phản ứng đồng trùng hợp với các polyester khác, các polymer thu được qua phản ứng đồng trùng hợp này có độ kế t tinh

và nhiệt độ nóng chảy thấp hơn các polymer đồng nhất và như vậy nó dễ phân hủy hơn [49]

PCL thường sử dụng làm phụ gia cho các loại nhựa vì nó làm tăng khả năng gia công cũng như tính bền va đập Khi trộn với tinh bột, PCL làm giảm giá thành và tăng khả năng phân hủy sinh học của vật liệu Ngoài ra, người ta còn sử dụng PCL như một chất hóa dẻo cho PVC [66]

Người ta chú ý tới khả năng ứng dụng của PCL làm vật liệu sinh học vì trong môi trường sinh lý (cơ thể người) PCL có thể phân hủy bằng quá trình thủy phân liên kết este So với PLA, PCL phân hủy chậm hơn nên có thể làm các bộ phận/thiết bị đưa vào trong cơ thể sống Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) chứng nhận PCL có thể làm vật liệu dẫn thuốc hay chỉ khâu y tế cho con người [66]

1.4.3.4 Polyamide (PA)

Polyamide là sản phẩm mang tính hóa ho ̣c hoàn toàn , có độ bền tốt trong các phản ứng hóa học nhưng đượ c biết đến nhiều hơn bởi tính tự hủy trong môi trường tự nhiên Sự phân hủy của PA thấp hơn nhiều so với các nhựa sinh ho ̣c có nguồn gốc từ các polyester do các liên kết hiđro nội chuỗi giữa các phân tử PA rất chắc chắn

Nhựa PA 11 là một loại polyme sinh học có nguồn gốc từ dầu thực vật PA 11 thuộc về nhóm các loại polyme kỹ thuật và không phân huỷ sinh học Tính chất của PA

11 tương tự PA 12 nhưng trong quá trình sản xuất sinh ra các khí gây hiệu ứng nhà

kính và tiêu thụ các nguồn năng lượng không tái sinh ít hơn so với khi sản xuất PA 12 Khả năng chịu nhiệt hơn hẳn so với PA 12 Được ứng dụng trong các ngành kỹ thuật cao như ống dẫn nhiên liệu xe hơi, thắng dùng khí nén, dây điện chống mối ăn, vỏ cáp điện, ống mềm dẫn dầu hoặc khí, giày thể thao, bộ phận tiết liệu [77]

1.4.3.5 Polybutylene succinate (PBS) và polyethylene succinate (PES)

PBS và PES là hai da ̣ng polymer được tổng hợp từ chuỗi polyester có nhiê ̣t đô ̣ nóng chảy tương ứng là 112–114o

1.4.3.6 Polyethylene (PE)

Polyethylene (PE) được biết đến từ rất lâu là mô ̣t polymer có số lượng chuỗi lớn với đơn phân là ethylene PE cũng được biết đến từ lâu là mô ̣t sản phẩm nhựa không thể bi ̣ phân hủy bởi vi sinh vâ ̣t Tuy nhiên, theo mô ̣t số nghiên cứu với các PE có tro ̣ng lươ ̣ng phân tử thấp (MW= 600–800) có thể bị phân hủy bởi vi sinh vật thuộc chi

Acinetobacter trong khi các PE có tro ̣ng lượng phân tử cao thì không

Sự phối kết hợp của PE , tinh bô ̣t và mô ̣t số chất phu ̣ gia ta ̣o ra mô ̣t sản phẩm mới Sản phẩm này làm tăng sự oxi hóa của PE , làm giảm trọng lượng phân tử polymer

và giúp cho các vi sinh vật phân hủ y dễ dàng hơn Vi sinh vâ ̣t phân hủy PE hỗn hợp dễ dàng hơn bởi vì vi sinh vật sẽ sử dụng tinh bột do đó làm tăng độ xốp và khoảng trống giữa phân tử, làm mất tính nguyên vẹn của mạng lưới phân tử , cắt PE thành các chuỗi ngắn hơn, dễ phân hủy hơn [49]

Những mắt xích monome cơ bản của PE là ethylen Đây chỉ là quy trình hoá học nhỏ đi từ ethanol, có thể được sản xuất từ sự lên men của các sản phẩm nông nghiệp ăn

của sản phẩm vì đi từ hai nguồn nguyên liệu khác nhau thì khó tránh khỏi tạp chất còn sót lại trong quá trình chế tạo Ngoài ra nhựa Polyethylen đi từ nguồn sinh học còn có thể giảm lượng khí sinh ra gây hiệu ứng nhà kính một cách đáng kể [77]

1.4.4 Ưu, nhược điểm và hướng phát triển của polymer sinh học

1.4.4.1 Ưu điểm

Ưu điểm của các loại vật liệu nhựa sinh học là có thể gia công bằng các công nghệ sản xuất nhựa truyền thống như khuôn gia nhiệt, ép phun, đùn thổi, v.v…nhưng sau khi sử dụng, các vật liệu nhựa sinh học có thể phân hủy hoàn toàn thành C, CO2,

H2O… trong thời gian ngắn Do đó, nhựa sinh học không gây ô nhiễm nặng nề môi trường như các loại nhựa nguồn gốc hóa dầu và có thể được sử dụng như là nguồn thay thế cho nhựa hóa dầu

Do tính phân hủy sinh học, việc ứng dụng nhựa sinh học đặc biệt phổ biến để làm các vật dụng dùng duy nhất một lần như bao bì đựng thực phẩm Sau khi sử dụng một lần, những loại bao bì này được tái chế lại, sử dụng làm túi đựng rác, đựng chất thải hữu cơ hay bao bì ứng dụng trong nông nghiệp Sau một thời gian sử dụng, vật liệu tái chế phân hủy dần trong môi trường Các loại khay và đồ đựng thực phẩm, chai nước ngọt, chai sữa… làm từ nhựa sinh học ngày càng được sử dụng rộng rãi [73]

Đầu những năm 1950, sản phẩm Amylomaize (chứa hơn 50% lượng bột bắp) đã được phát minh và ứng dụng trong thương mại nhựa sinh học bắt đầu được đào sâu Năm 2003, công ty Sony vừa cho ra đời loại máy Walkman có sử dụng nhựa sinh học Vào năm 2004, NEC đã phát triển nhựa chống cháy, PLA, mà không sử dụng hoá chất độc hại như các hợp chất halogen, photpho Năm 2005, Fujisu trở thành công ty kỹ nghệ đầu tiên chế tạo vỏ máy tính cá nhân từ nhựa sinh học [73]

Toyota là công ty đầu tiên trên thế giới sử dụng nhựa sinh học trong chế tạo các phụ kiện của ôtô, ví dụ như phần vỏ đựng lốp dự trữ Năm 2007 Braskem của Brazil thông báo con đường phát triển đển sản xuất HDPE (polyethylene có tỉ trọng cao) dùng nguyên liệu là ethylen bắt nguồn từ cây mía đường [73]

Năm 2011, Lần đầu tiên ở Việt Nam, Viện Hóa học Công nghiệp (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã nghiên cứu, chế tạo và ứng dụng thành công vật liệu

polyme phân hủy sinh học không gây ô nhiễm môi trường Nhóm nghiên cứu đã đưa ra

thị trường sản phẩm ở ba dạng, đó là: màng phủ nông nghiệp (hình 4), bao bì bọc bầu

ươm cây giống, túi bọc bầu ươm cây giống không phân hủy [68]

Hình 4 Mảng phủ nông nghiệp bằng polymer sinh học [14]

Việc sản xuất và sử dụng nhựa sinh học nói chung được xem như có khả năng duy trì nếu so sánh với sản xuất nhựa từ dầu hoả, bởi nó ít phụ thuộc vào nhiên liệu (hình thành từ xác động vật bị phân hủy) như nguồn cacbon và cũng ít tạo ra hiệu ứng nhà kính hơn khi phân huỷ

1.4.4.2 Nhƣợc điểm

Giá thành cao: ngoại trừ công nghệ nhựa sinh học từ vật liệu là cellulose đã phát triển lâu đời, hầu hết công nghệ nhựa sinh học đều mới phát triển và khá mới mẻ với giá thành sản phẩm còn mắc hơn so với nhựa sản xuất từ dầu mỏ Nhiều loại nhựa sinh học được sản xuất bằng cách sử dụng nhiên liệu - nguồn năng lượng cho quá trình sản xuất là từ nguồn dầu mỏ nên giá thành chưa giảm so với nhựa sản xuất từ dầu hỏa

Do các yếu tố trên, nhựa sinh học hiện chưa có thể cạnh tranh được về giá cả so với loại nhựa có nguồn gốc từ dầu hỏa Tuy nhiên với gia dầu ngày càng cao cộng với nguồn tài nguyên này sẽ bị cạn kiệt trong tương lai nên nhựa sinh học sẽ là một sự lựa

Hiện tại nhựa sinh học có nhược điểm về tính chất của vật liệu và tính dễ gia công như các loại vật liệu nhựa truyền thống Tuy nhiên, với sự phát triển của công nghệ tổng hợp nhựa sinh học và công nghệ ứng dụng, nhựa sinh học sẽ rút ngắn khoảng cách này

Các Polymer sinh học tuy có khả năng tự phân hủy nhưng tốc độ phân hủy vẫn diễn ra chậm và phụ thuộc vào nhiều yếu tố Nếu được chôn trong môi trường nghèo vi sinh vật thì khả năng tự phân hủy của chúng rất thấp và cần một khoảng thời gian dài

để quá trình tự phân hủy bắt đầu diễn ra Chính đặc điểm phân hủy chậm này lại biến các polymer sinh học trở thành một nguồn rác thải khác mà người ta chưa nghiên cứu đến tác hại của nó

Các polymer sinh học chỉ có thể phân hủy tốt trong môi trường có chứa nhiều loại vi sinh vật có khả năng sử dụng các polymer sinh học này làm nguồn cacbon [28]

1.5 Các vi sinh vật có khả năng phân hủy polymer sinh học

Môi trường đang bị hủy hoại bởi những hoạt động tạo ra các sản phẩm mới của chính mình Cụ thể, các vật liệu polymer từ hóa dầu đã làm cho con người tiến xa về phía trước, nhưng người ta cũng đã nhận thấy rằng, các loại vật liệu này là mối nguy hại tiềm ẩn cho môi trường sinh thái vì nó không thể tự phân hủy Chỉ có những tác động về cơ học và nhiệt mới có thể phá hủy nó, nhưng lại tạo ra nhiều chất độc hại hơn

và đòi hỏi chi phí khổng lồ, vượt qua cả giá thành tạo ra chúng

Hàng năm còn có khoảng 150 triệu tấn polymer được sản xuất để phục vụ nhu cầu của con người và số đó ngày càng tăng theo đà tăng dân số và đời sống Song song với điều đó, số lượng rác từ các sản phẩm này cũng tăng lên đáng kể, đó sẽ là thách thức lớn cho môi trường của trái đất Chính vì thế, việc nghiên cứu và sản xuất polymer phân hủy sinh học trong giai đoạn hiện nay là mối quan tâm của toàn thể nhân loại và hết sức cần thiết nhằm giúp giảm thiểu tình trạng ô nhiễm môi trường do ảnh hưởng của các sản phẩm polymer tạo ra từ hóa dầu trước đây để lại

Trước thực trạng này, cần phải có những dạng vật liệu tương ứng tính năng của polymer truyền thống để thay thế Đó chính là polymer có khả năng phân hủy sinh học

mà khi gặp tác động của nước, không khí, nấm, vi khuẩn trong tự nhiên, các polymer này sẽ tự phân hủy thành những chất không có hại cho môi trường

Xét về mức độ đa dạng các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy polymer sinh ho ̣c, Mergaert và Swing với nghiên cứu của mình đã thu nhâ ̣ n được 695 chủng vi sinh vâ ̣t được phân lâ ̣p từ các môi trường khác nhau : đất, nước, bùn Những vi sinh vâ ̣t này gồm cả vi khuẩn Gram (-), vi khuẩn Gram (+), xạ khuẩn và nấm mốc [35]

1.5.1 Vi khuẩn

Chủng Bacillus brevis được phân lập từ đất có khả năng phân hủy PLLA ở nhiệt

độ cao 60 ºC [55] Vi khuẩn Bacillus smithii sinh trưởng trong môi trường có chứa 1%

PLLA và trọng lượng phân tử PLLA đã giảm 35,6% chỉ sau 3 ngày nuôi lắc ở nhiệt độ 60ºC [56]

Teeraphatpornchai cùng cô ̣ng sự đã tiến hành n ghiên cứu , phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy nhiều polymer sinh học khác nhau Từ 400 mẫu đất, quá trình phân lập được tiến hành ở 30o

C Sau khi tuyển chọn đã thu được chủng TB–13 có khả năng phân hủy được PLA , PBSA, PBS, PCL, PES nhưng không có khả năng phân hủy PHBV [48]

Vi khuẩn Bacillus licheniformis có khả năng phân hủy PLA được phân lập từ

phân hữu cơ Chủng này đã được ứng dụng trong sản xuất phân compost [60]

Oda (1995), Takeda (1998) và các cộng sự trong những nghiên cứu của mình đã chỉ ra những vi sinh vật có khả năng phân hủy PHB ở nhiê ̣t đô ̣ cao thường thuô ̣c hai

chi Leptothrix và Paecilomyces lilacinus, đặc biê ̣t hơn các chủng vi sinh vâ ̣t thuô ̣c hai chi này đều có khả năng tổng hợp enzym phân hủy PHB [28] Takeda và cô ̣ng sự đã thu đươ ̣c chủng vi khuẩn phân lâ ̣p ở suối nước nóng có khả năng phân hủy PHB Vi khuẩn ưa nhiê ̣t có khả năng sử du ̣ng PHB ở nhiê ̣t đô ̣ 45–50oC Bằng việc xác đi ̣nh trình

tự cho kết luâ ̣n chủng vi khuẩn này l à Leptothrix discophora Chủng vi khuẩn này có

khả năng tổng hợp enzyme phân hủy PHB [46]

PHB là polymer sinh ho ̣c đang được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa ho ̣c Năm 2001, Asano cùng với Watanabe đã phân lâ ̣p được mô ̣t chủng vi sinh vâ ̣t W 6

thuô ̣c chi Arthrobacter không chỉ có khả năng sử dụng PHB mà còn có khả năng phân

Nishida và cộng sự đã phân lập được 77 chủng vi sinh vật phân hủy propiolactone) bao gồm 68 chủng vi khuẩn Trong số đó có ít nhất 41 chủng thuộc chi

poly(β-Bacillus [38]

Mô ̣t chủng ưa nhiê ̣t TT 96 thuô ̣c chi Bacillus có khả năng phân hủy PES Vi

khuẩn này cũng ta ̣o vòng sáng trên môi trường tha ̣ch có PCL và PHB làm nguồn

cacbon thay thế cho PES Điều này chứng tỏ rằng chủng vi khuẩn ưa nhiê ̣t TT 96 cũng

có khả năng phân hủy PHB và PCL

Mô ̣t số vi sinh vâ ̣t thuô ̣c chi Flavobacterium, Pseudomonas có khả năng phân

hủy các oligomer của PA6 nhưng không thể phân hủy da ̣ng polymer của PA 6 [49]

Theo mô ̣t nghiên cứu về khả năn g tự phân hủy của PA 4 ở trong đất , dưới tác

đô ̣ng của tia phóng xa ̣ PA4 bị phân hủy hoàn toàn trong khi PA 6 không bi ̣ phân hủy dưới tác đô ̣ng của tia phóng xa ̣ Gần đây, đã thu nhâ ̣n được chủng ND –10 và ND–11

có khả năng phân hủ y PA4 đươ ̣c nhâ ̣n da ̣ng thuô ̣c chi Pseudomonas Chủng ND–11 có

khả năng phân hủy hoàn toàn PA 4 dạng dung dịch sau 24 giờ, sản phẩm tạo thành là aminobutyric axit [49]

Cùng với việc phân lập , tuyển cho ̣n được các chủng vi sinh vâ ̣t có khả năng phân hủy polymer sinh ho ̣c , nhiều nghiên cứu cũng đang tâ ̣p trung vào viê ̣c tinh sa ̣ch các enzym có khả năng phân hủy polymer sinh học từ các chủng vi sinh v ật đó [19]

1.5.2 Xạ khuẩn

Jarerat và cộng sự [17] đã nghiên cứu khả năng phân hủy PLA của các chi thuộc lớp xạ khuẩn và thấy rằng các chủng xạ khuẩn có khả năng phân hủy PLA chủ

yếu là các loài thuộc họ Pseudonocardiaceae và các chi liên quan như Amycolatopsis,

Saccharothrix, Lenzea, Kibdelosporangium và Streptoalloteichus Trong đó chi Saccharothrix có khả năng phân hủy PLA mạnh nhất Paramuda và cộng sự [41] đã

phân lập chủng xạ khuẩn Amycolatopsis sp có khả năng phân hủy tới 60% PLA dạng

màng mỏng sau 14 ngày nuôi cấy

Theo nghiên cứu của Tokiwa và cô ̣ng sự , các chủng xạ khuẩn còn có thể sử dụng các loại biopolymer khác nhau PBS có thể bi ̣ phân hủy dưới tác đô ̣ng của nhóm

vi sinh vâ ̣t thuô ̣c chi Amycolatopsis HT–6 là một chủng thuộc chi này có khả năng

phân hủy không chỉ PBS mà còn phân hủy được PHB và PCL [49]

1.5.3 Nấm

Torres và cộng sự [52] đã phân lập và nghiên cứu trên 14 loài nấm khác nhau

trong tự nhiên sử dụng PLA bao gồm các chi: Aspergilus, Rhizopus, Penicillium,

Fusarium và Trichoderma Các chủng nấm mốc phân lập có khả năng sử dụng axit

lactic và PLA khối lượng phân tử thấp Trong số đó chủng Fusarium moniliforme có

khả năng phân hủy mạnh nhất [52]

Yuji Oda và cô ̣ng sự đã phân lâ ̣p được 5 chủng nấm có khả năng phân hủy PHB

và PCL, trong số đó chủng có ký hiệu là D218 đươ ̣c xác đi ̣nh là Paecilomyces lilacinus

có hoạt tính cao nhất Trong môi trường nuôi cấy có bổ sung 0,1% PCL hoă ̣c PHB, chỉ

trong 10 ngày chủng nấm này đã phân hủy hoàn toàn PHB và 10% lượng PCL Không chỉ có vậy chủng nấm này còn tổng hợp được enzym phâ n hủy PHB và PCL vào môi trường có PHB và PCL làm nguồn cacbon Hoạt tính của enzyme này sẽ giảm đi khi trong môi trường nguồn cacbon được thay thế bằng tin h bô ̣t tan, glucose hay lactose [39]

Nghiên cứu của Tansengco và Tokiwa đã c hỉ ra rằng: số lượng vi sinh vâ ̣t trong môi trường đất có khả năng phân hủy PCL ở 50o

C chiếm từ 3–49% (0,4–3,5x104

/1g đất) tổng số vi sinh vật có khả năng phân hủy PCL [47]

Khả năng phân hủy PCL cao phải kể đến chủng 26–1 (ATCC 36507) thuô ̣c chi

Penicillum Chủng này phân hủy PCL hoàn toàn chỉ sau 12 ngày Tokiwa và cô ̣ng sự

đã nghiên cứu, phân lâ ̣p được mô ̣t chủng nấm thuô ̣c chi Aspergillus có khả năng phân

hủy hoàn toàn PCL dạng màng phim ở 50oC trong thời gian là 6 ngày [47]

Ngoài ra , mô ̣t số loa ̣i nấm cũng có khả năng phân hủy PES Chủng nấm

Aspergillus clavatus phân hủ y đươ ̣c 21µg màng phim PES trên 1cm2 trong thờ i gian

mô ̣t giờ [49]

1.6 Cơ chế phân hủy polymer sinh học theo con đường sinh học

+ Giai đoạn đầu là phản ứng của oxi trong không khí với polymer, các mạch polymer bị cắt nhỏ (tạo thành olygomer) là kết quả của quá trình oxi hóa, giai đoạn này không có mặt của các vi sinh vật làm nhiệm vụ oxi hóa, việc sử dụng oxi sẽ biến các mạch polymer hình thành các nhóm chức như là cacbonyl, acid cacboxilic, ester, andehid, rượu Từ một polymer kị nước xuất hiện các nhóm chức ưa nước tạo điều kiện cho việc phân hủy các polymer dễ dàng hơn

+ Giai đoạn hai là phân hủy sinh học bởi sự oxi hóa của các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm… chúng sẽ phân hủy các mạch olygomer còn lại thành CO2 và nước

Trong giai đoạn đầu là giai đoạn quan trọng nhất vì nó quyết định toàn bộ quá trình, trong giai đoạn đầu của quá trình phân hủy sinh học sự giảm cấp có thể diễn ra nhanh hơn khi có mặt của tia UV hoặc nhiệt độ [67]

Bên cạnh yếu tố môi trường, cơ chế và tốc độ phân hủy polymer sinh học cũng phụ thuộc vào thành phần hóa học của polymer Đặc biệt tốc độ phân hủy sinh học phụ thuộc vào đặc tính polymer bởi vì chúng là cơ chất cho enzym Khả năng phân hủy polymer sinh học nhanh hay chậm phụ thuộc vào bản chất của liên kết hóa học hiện diện trong mạch polymer đó [54]

PHB và PLA có các đơn phân tương ứng là axit 3-hydroxybutyric và axit lactic Bản chất liên kết giữa các đơn phân trong mạch polymer là liên kết este Các liên kết này sẽ bị bẻ gẫy trong phản ứng thủy phân và gây đứt mạch polymer Do đó cả PHB và PLA đều có thể bị phân hủy bởi các enzym thủy phân (hình 5)

Hình 5 Phản ứng thủy phân PLA [36]

Đến nay việc tìm kiếm các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng polymer sinh học nói chung hay PLA nói riêng vẫn thu hút được nhiều nhà khoa học trên thế giới và

ở Việt Nam Việc phát hiện các chủng vi sinh vật mới không những mang lại ý nghĩa

về mặt khoa học, mà còn có ý nghĩa thực tiễn trong việc tạo ra các chế phẩm sinh học góp phần giải quyết ô nhiễm môi trường

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

Các mẫu đất được thu thập từ khu vực nhà máy xử lý rác thải Cầu diễn-Từ

liêm-Hà Nội và bãi rác thuộc khu vực thôn Đình thôn-Mỹ đình-Từ liêm-liêm-Hà Nội trong thời gian tháng 4/2011 Các mẫu sau khi thu thập được bảo quản chuyển về phòng thí nghiệm và phân tích trong vòng 24 tiếng

2.2 Hóa chất và thiết bị

2.2.1 Hóa chất

Poly lactic axit (PLA), Poly (-hydroxybulyrate) (PHB), poly(-caprolactone) (PCL) được mua từ hãng Sigma (Mỹ) và Takara (Nhật Bản) Các hóa chất này đều đạt

độ tinh sạch cho mục đích nghiên cứu

Iodonitrotetrazolium chloride (INT), chloroform (CHCl3), NaH2PO4, Na2HPO4, casein, gelatin, pepton, cao nấm men, và các hoá chất khác đạt độ tinh khiết trong phân tích

2.2.2 Thiết bị

Nồi khử trùng (ALP–Nhâ ̣t)

Máy lắc (Satorius–Đức)

Box cấy vi sinh vật (Aura vertical–Ý)

Máy đo mâ ̣t đô ̣ quang ho ̣c (Bionate–Anh)

Máy đo pH (Horiba–Nhật Bản)

Cân Kern (Satorius–Đức)

Cân Precisa XT 220A (Ý)

Tủ ấm (Sartorius–Đức)

Máy ly tâm sigma 3K30 (Memmert–Đức)

Tủ sấy (Memmert–Đức)

Máy khuấy từ (IKA RET–Đức)

Kính hiển vi điện tử quét JEOL–5410LV (Nhâ ̣t)

Máy giải trình tự tự động 3100-Avant Genetic Analyzer, AB-Applied Biosystem (Mỹ)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu thập mẫu

Mẫu được lấy vào các ống Falcon đã khử trùng Tiến hành lấy mẫu trên cả 2 khu vực: Nhà máy xử lý rác thải Cầu diễn-Từ liêm-Hà Nội và Khu vực bãi rác Đình thôn-Mỹ đình-Từ liêm-Hà Nội Mẫu đất được lấy ở phía dưới cách bề mặt 5-10 cm

2.3.2 Môi trường phân lập nuôi cấy

2.3.2.1 Môi trường khoáng cơ bản

Một lít môi trường đặc bao gồm các thành phần:

2.3.3 Phân lâ ̣p trên môi trường khoáng có bổ sung 0,2% PLA

2.3.3.1 Phương pha ́ p cấy trải

Môi trường khoáng có bổ sung PLA làm nguồn các bon duy nhất (20 mg PLA/1ml CHCl3)

Dùng các đĩa petri có c hứa môi trường khoáng bổ sung 0,2% PLA đã khử trùng Dùng pipet lấy 100µl di ̣ch mẫu cho lên bề mă ̣t tha ̣ch Dùng que cấy gạt đã vô trùng gạt đều mẫu trên bề mặt thạch cho đến khi nào mặt thạch khô thì dừ ng la ̣i

2.3.3.2 Phương pha ́ p nuôi cấy lắc

5g đất của mẫu nghiên cứu được đưa vào bình tam giác dung tích 250ml, chứa 50ml môi trường muối khoáng với 0,2% thể tích PLA đã vô trùng Các bình tam giác sau đó được lắc ở nhiệt độ 37°C, tốc độ lắc 170 vòng/phút

2.3.3.3 Phương pháp cấy điểm

Sử dụng các đĩa petri đã đựng sẵn môi trường khoáng bổ sung 0,2% PLA vô trùng Để mặt thạch khô, dùng que cấy vô trùng chạm nhẹ vào bề mặt khuẩn lạc trong ống giống để bào tử tách ra và bám vào que cấy Cấy một điểm trên mặt thạch của đĩa petri Sau đó đưa các đĩa đã cấy vào tủ ấm 37°C nuôi trong 4-7 ngày Quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc

2.3.4 Phương pha ́ p xác đi ̣nh, nhâ ̣n da ̣ng chủng nghiên cứu

2.3.4.1 Phương pha ́ p nhuô ̣m Gram

Nguyên tắc: Dựa vào sự khác biê ̣t giữa thành tế bào vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) Vi khuẩn Gram (+) có peptidoglican hoạt động như một hàng rào thẩm thấu ngăn cản sự thất thoát của tím kết tinh Ban đầu vi khuẩn đươ ̣c nhuô ̣m bằng tím kết t inh sau đó được xử lý bằng iôt để tăng đô ̣ giữ màu Sau đó được tẩy màu bằng cồn làm co các lỗ của lớp peptidoglican dày la ̣i Do vâ ̣y phức chất tím kết tinh và iot được giữ la ̣i , vi khuẩn có màu tím Peptidoglican ở vi khuẩ n Gram (-) rất mỏng, ít liên kết chéo và có lỗ lớn Sự xử lý bằng cồn có thể loa ̣i lipit khỏi thành Gram (-) đủ để làm tăng hơn kích thước của lỗ Do vâ ̣y, ở bước rửa bằng cồn đã loại bỏ phức chất màu tím của tím kế t tinh-iôt Khi nhuộm la ̣i bằng safain thì vi khuẩn có màu hồng [1]

Phương pháp tiến hành [9]:

Tạo vết bôi bằng cách nhỏ một giọt nước lên lam kính sạch , đốt nóng que cấy trên ngo ̣n lửa đèn cồn, dùng que cấy lấy khuẩn lạc tr ên đĩa tha ̣ch hoă ̣c trong ống giống , đưa vào gio ̣t nước, cố đi ̣nh vết bôi bằng cách hơ khô trên ngo ̣n lửa đèn cồn

Cho mô ̣t gio ̣t tím kết tinh bao phủ hoàn toàn vết bôi , nhuô ̣m trong thời gian 1 phút Sau đó rửa bằng nước cất và thấm khô

Nhuô ̣m với lưugôn tương tự như với tím kết tinh

Rửa bằng cồn trong 30 giây Thấm khô

Nhuô ̣m safain trong 2 phút Rửa bằng nước cất, thấm khô

Soi trên kính hiển vi quang ho ̣c có đô ̣ phóng đa ̣i 100 lần

Quan sát kết quả và đưa ra kết luâ ̣n

2.3.4.2 Chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét

Mẫu vi sinh vật được xử lý trước khi soi trên kính hiển vi điê ̣n tử quét

Đánh tan mẫu vào dung di ̣ch cố đi ̣nh Glutaraldehyte trong 2 giờ

Ly tâm 3.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC

Rửa tủa bằng đê ̣m CaCodylate 2 lần

Cố đi ̣nh tế bào bằng axit Osmic (OsO4) 1% trong 1 giờ

Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4o

C

Rửa la ̣i bằng đê ̣m CaCodylate

Loại nướ c bằng cồn với nồng độ tăng dần lần lươ ̣t: 30o, 50o, 70o, 90o, 100o Mỗi nồng đô ̣ trong 10 phút

Gắn mẫu lên đế: sử du ̣ng giấy ba ̣c ta ̣o thành mô ̣t giếng trên đế , nhỏ mẫu sau khi đã khử nước bằng cồn lên giếng vừa ta ̣o