Nghiên cứu đặc tính virut rota lưu hành gây bệnh tiêu chảy trẻ em vào Bệnh viện Nhi Khánh Hòa năm 2010

Các nghiên cứu bằng kỹ thuật điện di miễn dịch và kính hiển vi điện tử đã khẳng định: Capsit trong mang kháng nguyên đặc hiệu nhóm, capsit ngoài mang kháng nguyên đặc hiệu týp, nhân của

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN PHƯƠNG THÖY

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH VIRUT ROTA LƯU HÀNH GÂY BỆNH TIÊU CHẢY TRẺ EM VÀO BỆNH VIỆN NHI

KHÁNH HÕA NĂM 2010

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN PHƯƠNG THÖY

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH VIRUT ROTA LƯU HÀNH GÂY BỆNH TIÊU CHẢY TRẺ EM VÀO BỆNH VIỆN

NHI KHÁNH HÕA NĂM 2010

Chuyên ngành : Vi sinh vật học

Mã số : 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS LÊ THỊ LUÂN

Hà Nội – Năm 2013

1 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 SƠ LƯỢC LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VIRUT ROTA 3

1.2 HÌNH THÁI VÀ CẤU TRÖC 3

1.2.1 Hình thái 3

1.2.2 Cấu trúc 4

1.3 PHÂN NHÓM VÀ CÁC TÝP HUYẾT THANH 10

1.3.1 Phân nhóm 10

1.3.2 Týp huyết thanh 11

1.4 TÍNH CHẤT LÝ HÓA 11

1.4.1 Tính bền vững với PH 11

1.4.2 Tính chịu nhiệt 11

1.4.3 Tính nhạy cảm 12

1.4.4 Tính đề kháng 12

1.5 ĐẶC TÍNH VIRUT ROTA TRÊN TẾ BÀO NUÔI CẤY MÔ 12

1.6 QUÁ TRÌNH NHÂN LÊN CỦA VIRUT ROTA 13

1.7 KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VIRUT ROTA 15

1.7.1 Khả năng gây bệnh cho trẻ em 15

1.7.2 Khả năng gây bệnh ở người lớn 15

1.7.3 Cơ chế gây bệnh 16

1.8 DỊCH TỄ HỌC BỆNH TIÊU CHẢY CẤP DO VIRUT ROTA 16

1.8.1 Nguồn bệnh 16

1.8.2 Đường lây truyền 16

1.8.3 Mùa bệnh 16

1.8.4 Lứa tuổi mắc bệnh 17

1.8.6 Miễn dịch 17

1.9 SỰ PHÂN BỐ CÁC KIỂU GEN CỦA VIRUT ROTA 18

1.9.1 Phân bố trên thế giới 18

1.9.2 Phân bố tại Việt Nam 19

1.10 TÌNH HÌNH MẮC BỆNH TIÊU CHẢY CẤP VÀ VẮC XIN PHÕNG NGỪA BỆNH TiÊU CHẢY CẤP DO VIRUT ROTA 20

1.10.1Tình hình mắc bệnh tiêu chảy cấp do virut Rota trên thế giới và Việt Nam 20

1.10.1.1 Tình hình mắc bệnh do virut Rota trên thế giới 20

1.10.1.2 Tình hình mắc bệnh do virut Rota tại Việt Nam 21

1.10.2 Tình hình sử dụng vắc xin phòng ngừa bệnh tiêu chảy cấp do virut Rota 22

1.10.2.1 Các chủng virut Rota được cân nhắc để phát triển vắc xin 22

1.10.2.2 Các loại văc xin được nghiên cứu và sử dụng 23

1.11 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VIRUT ROTA 25

1.11.1 Các kỹ thuật phát hiện virut Rota……… 25

1.11.2 Các kỹ thuật phát hiện kháng thể virut Rota 26

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 27

2.2.2Phương pháp thực hiện 28

2.2.2.1 Lấy mẫu bệnh phẩm 28

2.2.2.2 Xác định virut Rota trong mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp ELISA 29

2.2.2.3 Phương pháp tách chiết ARN từ mẫu phân 32

2.2.2.4 Phương pháp xác định týp virut Rota bằng RT – PCR 34

2.2.2.5 Chạy điện di và đọc kết quả 40

2.2.2.6 Phương pháp thống kê xử lý số liệu 42

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 43

3.1 XÁC ĐỊNH TỶ LỆ TCC DO VIRUT ROTA TẠI BỆNH VIỆN NHI KHÁNH HÕA NĂM 2010 43

3.2 TỶ LỆ BỆNH NHÂN TCC DO VIRUT ROTA THEO THÁNG 44

3.3 TỶ LỆ BỆNH NHÂN TCC DO VIRUT ROTA THEO NHÓM TUỔI 47

3.4 TỶ LỆ BỆNH NHÂN TCC DO VIRUT ROTA THEO GIỚI TÍNH 50

3.5 ĐẶC TÍNH CÁC CHỦNG VIRUT ROTA LƯU HÀNH TẠI BỆNH VIỆN NHI KHÁNH HÕA NĂM 2010 51

3.5.1 Đặc tính chủng P 51

3.5.2 Đặc tính chủng G 56

3.6 Sự lưu hành các chủng tổ hợp G – P của virut Rota 61

3.6.1 Sự phân bố các chủng tổ hợp G – P tại miền Trung 61

3.6.2 Sự lưu hành các chủng tổ hợp G – P theo thời gian 62

KẾT LUẬN 64

KIẾN NGHỊ 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

2

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Deoxyribonucleic Acid Axit Deoxyribonucleic

CDC Centers for Disease Control

Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme

Gmix Mixed G-genotype Chủng virut Rota có kiểu gen G hỗn hợp

Gnt Untypable G- genotype Chủng virut Rota không thể xác định kiểu

gen G IgA Immuno globulin A Globulin miễn dịch A

IgG Immuno globulin G Globulin miễn dịch G

NSP Non-structure Protein Protein không cấu trúc

OD Optical density Mật độ quang học

Pmix Mix P-type Chủng virut Rota có kiểu gen P hỗn hợp

Pnt Untýpable P-genotype Chủng virut Rota không thể xác định kiểu

gen P ARN Ribonucleic Acid Axit Ribonucleic

RT-PCR

Reverse transcription

polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi Polymerase phiên mã ngƣợc

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới

3 DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Đặc điểm chuỗi nucleotit các đoạn gen của virut Rota [16,18] 5

Bảng 2 Các gen và protein của virut Rota [6,8] 7

Bảng 3 Týp huyết thanh của virut Rota [6,8] 11

Bảng 4 Sự phân bố các chủng lưu hành trên toàn cầu, năm 2001 – 2008 [66] 18

Bảng 5 Các chủng virut Rota được cân nhắc để phát triển vắc xin [6] 22

Bảng 6 Các primer được sử dụng để định týp G và týp P 35

Bảng 7 Bảng tra kích thước các kiểu gen G, P sau khi điện di 41

Bảng 8 Tỷ lệ TCC do virut Rota hàng năm tại Việt Nam [1,2,3] 44

Bảng 9 Phân bố theo tháng tỷ lệ trẻ mắc bệnh TCC do virut Rota 45

Bảng 10 Tỷ lệ mắc virut Rota theo nhóm tuổi tại bệnh viện Nhi Khánh Hòa năm 2010 47

Bảng 11 Tỷ lệ mắc bệnh do virut Rota theo giới tính 50

Bảng 12 Tỷ lệ lưu hành các kiểu gen P tại bệnh viện nhi Khánh Hòa năm 2010 52

Bảng 13 Sự phân bố các kiểu gen theo khu vực trong cả nước 53

Bảng 14 Tỷ lệ các kiểu gen P lưu hành theo thời gian 55

Bảng 15 Tỷ lệ lưu hành các kiểu gen G tại bệnh viện nhi Khánh Hòa năm 2010 57

Bảng 16 Sự phân bố các chủng G theo khu vực 58

Bảng 17 Tỷ lệ lưu hành các kiểu gen G theo thời gian 59

Bảng 18 Sự lưu hành các chủng G – P tại miền Trung năm 2010 61

Bảng 19 Sự lưu hành các chủng tổ hợp G – P theo thời gian 62

4 DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Hình ảnh virut Rota chụp dưới kính hiển vi điện tử [58] 4

Hình 2 Hình minh họa cấu trúc của virut Rota 5

Hình 3: Tái dựng hình ảnh của virut Rota dựa trên hình ảnh chụp qua kính hiển vi điện tử 9

Hình 4: Chu trình nhân lên của virut Rota trong tế bào 14

Hình 5 Sự phân bố số bệnh nhân tử vong theo khu vực trên thế giới và số bệnh nhân tử vong tại các quốc gia Châu Á [33] 21

Hình 6 Sơ đồ tóm tắt quy trình thực hiện 28

Hình 7 Sơ đồ mô tả nguyên lý của phương pháp ELISA 29

Hình 8 Kết quả ELISA khi chưa cho chất dừng phản ứng 31

Hình 9 Kết quả ELISA sau khi cho chất dừng phản ứng 31

Hình 10 Đọc kết quả mẫu bệnh phẩm trên máy ELISA 32

Hình 11 Vị trí các Primer và bản sao ADN thu được để xác định kiểu gen G 36

Hình 12 Vị trí các Primer và bản sao ADN thu được để xác định kiểu gen P 36

Hình 13 Ảnh minh họa vị trí mẫu trên bản gel 41

Hình 14 Ảnh minh họa kiểu gen G phân tích trên gel agarose 2% 42

Hình 15 Ảnh minh họa kiểu gen P phân tích trên gel agarose 2% 42

Hình 16 Tỷ lệ bệnh nhi mắc bệnh TCC vào bệnh viện Nhi Khánh Hòa 43

năm 2010 43

Hình 17 Biểu đồ tỷ lệ trẻ em mắc bệnh TCC do virut Rota theo tháng tại các khu vực 46 Hình 18 Sự phân bố TCC do virut Rota theo nhóm tuổi 49

Hình 19 Tỷ lệ trẻ dương tính với virut Rota phân bố theo giới tính tại bệnh viện nhi Khánh Hòa năm 2010 50

Hình 20 Kết quả điện di trên gel agarose xác định kiểu gen P 51

Hình 21 Tỷ lệ các kiểu gen P tại bệnh viện nhi Khánh Hòa năm 2010 52

Hình 22: Sự phân bố các kiểu gen theo khu vực trong cả nước 53

Hình 23 Sự phân bố kiểu gen P theo thời gian 55

Hình 24 Kết quả điện di trên gel agarose xác định kiểu gen G 56

Hình 25 Sự phân bố các kiểu gen G lưu hành tại miền Trung năm 2010 57

Hình 26 Sự lưu hành các kiểu gen G tại miền Trung năm 2009 và năm 2010 60

Hình 27 Sự phân bố các tổ hợp G – P của virut Rota 61

Hình 28 Sự lưu hành các chủng tổ hợp G – P theo thời gian 62

ĐẶT VẤN ĐỀ

Virut Rota được phát hiện vào đầu những năm 70 của thế kỷ XX, là một

virut ARN sợi đôi, thuộc họ Reovitridae [37] Virut Rota là một trong những

nguyên nhân quan trọng nhất gây viêm dạ dày ruột mà không do vi khuẩn ở trẻ nhỏ

dưới 5 tuổi Tuy nhiên người ta cũng quan sát thấy ở trẻ lớn hơn và cả ở người lớn

Virus rota được đánh giá là đã gây ra 40% trong tổng số vụ nhập viện do tiêu

chảy của trẻ dưới 5 tuổi trên toàn cầu và gây ra mỗi năm 100 triệu ca tiêu chảy cấp

cùng 450 đến 800 nghìn ca tử vong [67] Ở các nước phát triển có 35% - 52% trẻ

em bị tiêu chảy cấp (TCC) do virut Rota Còn ở các nước đang phát triển, virut Rota

là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tiêu chảy và tử vong ở trẻ dưới 2

tuổi Ước tính hàng năm ở những nước này có trên 12,5 triệu trẻ em dưới 5 tuổi bị

TCC do virut Rota và khoảng 873.000 trường hợp tử vong [50],[51]

Tại Việt Nam, hàng năm tỷ lệ mắc tiêu chảy do virut Rota chiếm trên 50%

trong số trẻ dưới 5 tuổi bị tiêu chảy vào điều trị tại 1 số bệnh viện Nhi lớn của Việt

Nam Số trẻ chết do virut Rota chiếm từ 4% - 8% trong tổng số trẻ dưới 5 tuổi bị

chết vì mọi nguyên nhân [6]

Bệnh lây lan theo đường phân – miệng, từ người sang người nên trong điều

kiện vệ sinh của nước ta còn kém thì bệnh rất dễ lây lan thành vụ dịch lớn Virut

Rota khi xâm nhập vào cơ thể nhân lên ở ruột non, phá hủy tế bào trụ niêm mạc ruột

gây ra các rối loạn dẫn đến tình trạng mất nước và điện giải, bệnh nhân suy sụp rất

nhanh nếu không được chuẩn đoán và điều trị kịp thời rất dễ dẫn đến tử vong

Hiện nay, trên thế giới đã cấp phép lưu hành hai loại vắc xin là: vắc xin

Rotarix của hãng Glaxo Smith Kline và Rotateq của Merck Các vắc xin này được

sử dụng ở nhiều quốc gia nhưng hiệu lực bảo vệ lại khác nhau theo khu vực, điều

này được giải thích là do tính đa dạng về di truyền của các chủng virut Rota và sự

lưu hành các chủng có sự biến đổi theo không gian và thời gian [6,8]

Tại Việt Nam đã sản xuất được vắc xin virut Rota uống, từ chủng phổ biến

G[1]P[8] đã được làm giảm độc lực Kết quả thử nghiệm lâm sàng được đánh giá là

đạt về mức độ an toàn trên cơ thể người lớn và trẻ em [5] Việc giám sát dịch tễ học

và xác định đặc tính của các chủng virut Rota trong thời gian dài trên thế giới cũng

như tại Việt Nam, trước và sau khi sử dụng vắc xin là cơ sở đánh giá hiệu quả của

các vắc xin đang sử dụng, sự biến đổi bất thường của các chủng virut Rota để từ đó

có hướng phát triển vắc xin mới hiệu quả hơn

Xuất phát từ thực tiễn trên, để góp phần đánh giá tình hình tiêu chảy cấp do

virut Rota ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu:

“ Nghiên cứu đặc tính virut Rota gây bệnh tiêu chảy ở trẻ em vào bệnh

viện Nhi Khánh Hòa năm 2010” nhằm các mục tiêu sau:

1 Xác định tỷ lệ bệnh nhi bị tiêu chảy cấp do virut Rota tại bệnh viện Nhi

Khánh Hòa và mối liên quan của bệnh này với yếu tố mùa, tuổi, giới

2 Xác định đặc tính các týp virut Rota lưu hành tại bệnh viện Nhi Khánh Hòa

5 CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 SƠ LƯỢC LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VIRUT ROTA

Năm 1943, Jacob Light và Horace Hodes đã chứng minh rằng các tác nhân đi

qua màng lọc vi khuẩn có khả năng gây ra tiêu chảy cho bò Năm 1972, Kapikian

lần đầu tiên phát hiện ra chủng virut có liên quan đến bệnh tiêu chảy và đặt tên là

Norwalk[14] Năm 1973 Bishop R.F và cộng sự quan sát bằng kính hiển vi điện tử

mảnh sinh thiết ruột non của trẻ em chết vì bệnh tiêu chảy cấp thấy có virut giống

như Reovirus (Reovirus – like), có đường kính 70nm và ông đặt tên cho virut này là

Rotavirus vì hình thể của nó rất giống cái bánh xe với các nan hoa Năm 1974,

Flewett Bryden, Midleton cũng đề cập tới vai trò của virut Rota trong bệnh viêm dạ

dày ruột Sau này những nghiên cứu về hình thái học bằng âm bản những lát cắt cực

mỏng của tổ chức nhiễm virut Rota, quan sát dưới kính hiển vi điện tử cho phép xác

định virut Rota thuộc họ Reoviridae [15,18]

Ở Việt Nam mãi đến năm 1980 mới nghiên cứu và xác định virut này là

nguyên nhân chính gây nên bệnh tiêu chảy ở trẻ em Từ năm 1998 đến nay, được sự

hợp tác và tài trợ của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Trung tâm Kiểm soát và

Phòng ngừa bệnh tật CDC-Atlantta- Mỹ, Trung tâm nghiên cứu, sản xuất vắc xin và

Sinh phẩm y tế đã tiến hành giám sát bệnh tiêu chảy do virut Rota và xác định các

chủng lưu hành phổ biến tại Việt Nam [6,8]

1.2 HÌNH THÁI VÀ CẤU TRÖC

1.2.1 Hình thái

Hạt virut trưởng thành dạng khối cầu 20 mặt, đường kính khoảng 75nm Dưới

kính hiển vi điện tử virut Rota giống hệt như một cái bánh xe có các gai ngắn và một

cái vành rất nhẵn Tên “Rota” tiếng La tinh có nghĩa là “bánh xe” xuất phát từ hình

thái của nó.[58]

Hình 1 Hình ảnh virut Rota chụp dưới kính hiển vi điện tử [58]

1.2.2 Cấu trúc

Virut Rota có dạng khối cầu 20 mặt, đường kính khoảng 75nm, chuỗi

nucleocapsit của virut được tạo thành bởi 3 vòng xoắn đồng tâm Vỏ Capsit của

virut Rota có dạng đối xứng 20 mặt, 132 capsomer sắp xếp đối xứng xoắn

[15,19,58]

 Cấu trúc capsit của virut Rota gồm 3 lớp rõ rệt

 Lớp ngoài chứa protein cấu trúc VP4 và VP7

 Lớp trong chứa protein cấu trúc VP6 là loại kháng nguyên đặc hiệu nhóm,

chiếm 50% hạt virut và có thể được phát hiện trong kỹ thuật ELISA

 Lớp lõi chứa protein cấu trúc VP1, VP2 và VP3

Các nghiên cứu bằng kỹ thuật điện di miễn dịch và kính hiển vi điện tử đã

khẳng định: Capsit trong mang kháng nguyên đặc hiệu nhóm, capsit ngoài mang

kháng nguyên đặc hiệu týp, nhân của virut không mang tính kháng nguyên



Hình 2 Hình minh họa cấu trúc của virut Rota

Subgroup antigen : Kháng nguyên phân nhóm

 Hệ gen:

Bộ gen của virut rota gồm 11 đoạn ARN sợi kép, có độ lớn khoảng 18.555

cặp bazơ, trọng lƣợng phân tử của 11 đoạn ƣớc tính từ 10.106

- 14.106 Dalton Mỗi gen có khối lƣợng phân tử từ 2.105

- 2,2.106 Dalton và mã hoá cho một protein cấu trúc hoặc không cấu trúc, trừ gen 9 và gen 11 [8,13,28]

Bảng 1 Đặc điểm chuỗi nucleotit các đoạn gen của virut Rota [16,18]

Đoạn gen Số cặp Bazơ Tỷ lệ G + C ( %) Số axit amin

Đoạn gen Số cặp Bazơ Tỷ lệ G + C ( %) Số axit amin

Khi điện di trên gel polyacrylamit 11 gen này chia làm 4 khu vực [30,44]

- Khu vực I gồm các đoạn gen 1, 2, 3 và 4 có khối lƣợng phân tử cao nhất (theo

bảng 1 và hình 2) khi chạy trên gel polyacrylamit sẽ chạy chậm nhất

- Khu vực II gồm các đoạn 5 và 6

- Khu vực III gồm các đoạn 7, 8, 9

- Khu vực IV gồm các đoạn 10 và 11 có khối lƣợng phân tử thấp nhất, khi chạy

điện di trên bản gel sẽ chạy nhanh nhất

 Protein

Hạt virut chứa ít nhất 6 protein cấu trúc [6,21,37]:

- Các gen 1, 2, 3 và 6 mã hoá cho các protein VP1, VP2, VP3 và VP6

- Đoạn gen 4, 9 mã hoá cho các protein capsit lớp ngoài VP4 và VP7

- Các gen còn lại ( 5, 7, 8, 10 và 11) mã hoá cho các protein không cấu trúc

(NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5) Đặc điểm protein của virut Rota đƣợc trình

bày ở bảng 2 nhƣ sau:

Bảng 2 Các gen và protein của virut Rota [6,8]

Vị trí trong hạt virut

Chức năng

(125K)

Bao quanh sợi ARN

ARN polymerase phụ thuộc ARN, liên kết với ARN sợi đơn, tạo phức hợp với VP3

(94K)

Bao quanh sợi ARN Kích thích tái tạo ARN của virut

(88K)

Bao quanh sợi ARN

Enzyme Guanylyl transferase xúc tác cho quá trình gắn mũ 5‟của mARN trong quá trình cải biến trước dịch mã

(88K)

Capsít lớp ngoài

Ngưng kết hồng cầu, kháng nguyên trung hòa

(53K)

Không cấu trúc

Không có vai trò cho sinh trưởng của virut

(41K)

Capsít lớp trong Cấu trúc và kháng nguyên đặc hiệu loài

(34K)

Không cấu trúc

Làm tăng hoạt tính của mARN virut và ngừng tổng hợp protein trong tế bào vật chủ

(35K)

Không cấu trúc

NTPase tham gia đóng gói hạt virut và sao chép hệ gen

(38K)

Capsít lớp ngoài

Protein cấu trúc và kháng nguyên trung hòa

10 NSP4 20.290

(28K)

Không cấu trúc

Độc tố ruột, vai trò trong quá trình hình thành hạt virut

11 NSP5 21.725

( 26K)

Không cấu trúc Độc tố ruột

+ Protein cấu trúc

Ba protein mang tính đặc hiệu kháng nguyên của virut là VP4, VP6 và VP7

[22,25,58]:

- VP4 là một protein nhạy cảm với proteasa (P serotype) là kháng nguyên có đặc

tính ngưng kết hồng cầu Nhờ enzym protease phân hủy, VP4 được phân cắt

một cách đặc hiệu thành VP5* và VP8* giúp cho sự xâm nhập của virut vào tế

bào VP4 định ra týp P của virut Rota

- VP6 là kháng nguyên chung cho các dưới nhóm của virut Rota Chúng được sử

dụng trong các thử nghiệm phát hiện nhiễm virut Rota nhóm A

- VP7 là một glycoprotein (G serotype) là kháng nguyên trung hoà đặc hiệu cho

týp huyết thanh, định ra týp G của virut Rota [16,20,22,25,35]

Ngoài ra các protein nằm trong lõi cũng có vai trò rất quan trọng trong quá

trình nhân lên của virut Rota:

- VP1 là enzym ARN polymerase nằm trong lõi hạt virut tham gia vào quá trình

phiên mã tạo ra các phân tử mARN và tạo ra các bản sao genom ARN cho các

hạt virion mới

- VP2 có hoạt tính liên kết ARN không đặc hiệu, nhận biết cả ARN sợi đơn và

sợi kép Việc lắp ráp VP2 vào trong lõi không phụ thuộc vào protein khác và

dsARN, do VP2 mang vùng chứa Ala – 387 và vùng kẹp hóa leucine có vai trò

quan trọng trong việc tự lắp ráp vào lõi

- VP3 là một phần của màng lõi trong của hạt virion và là enzym Guanylyl

transferase, có vai trò gắn mũ vào đầu 5‟ trong quá trình cải biến sau phiên mã

phân tử mARN, bảo vệ mARN khỏi sự phân hủy của các nuclease

Ban đầu người ta gọi hạt virut hoàn chỉnh là hạt virut có 2 vỏ, mặc dù số

liệu mới đây cho thấy rằng những hạt virut này có 3 lớp Sự thiếu vỏ ngoài của phân

tử lớp kép thường được miêu tả như hạt thô ráp bởi vì mặt ngoài của chúng nhô ra

cấu trúc siêu phân tử của capsit trong (VP4) [17] Những nghiên cứu đầu tiên về cấu

trúc virut Rota đã nhất trí cho rằng hạt virut có 20 mặt đối xứng [16,44]

Theo Roseto và các cộng sự [44], bằng kỹ thuật đông khô đã có báo cáo về

sự hiện diện của 132 capsome được sắp xếp đối xứng lệch Họ cũng chỉ ra rằng lớp

ngoài có các lỗ nhỏ tương ứng với các lỗ của vỏ trong capsit Sau này Ludert và các

cộng sự cũng khẳng định cấu trúc capsit trong của virut Rota băng kỹ thuật phá vỡ

hạt virut và kỹ thuật tương tự [28] Cấu trúc lớp kép và lõi có thể là sản phẩm của

việc biến đổi liên tục của hạt 3 lớp.[16,17]

Nghiên cứu về virut Rota bằng kính hiển vi điện tử lạnh cho thấy VP4 hiện

diện trên vỏ ngoài capsit như một loạt 60 gai ngắn có kích thước 10-12nm Trọng

lượng phân tử 88.000D cấu tạo nên 1,5% protein của hạt virut VP4 đóng vai trò thứ

yếu trong việc cấu tạo nên vỏ capsit ngoài VP4 được mã hóa bởi gen 4 của các

chủng virut Rota được mô tả Phần VP4 hướng vào trong tương tác với cả VP7 và

protein capsit trong VP6 Sự tương tác VP4-VP7 và VP4-VP6 bao hàm rằng VP4

có thể tham gia duy trì chính xác hình học giữa lớp trong và ngoài vỏ capsit cũng

như phạm vi ảnh hưởng chức năng [49]

Hình 3: Tái dựng hình ảnh của virut Rota dựa trên hình ảnh chụp qua kính

hiển vi điện tử

VP7 là lớp vỏ ngoài bao gồm 780 phân tử, VP7 tương tác với phần chóp của

VP6 VP7 là một loại glycoprotein cũng là kháng ngyên trung hòa chủ yếu của virut

Rota, là kháng nguyên đặc hiệu cho tuýp huyết thanh VP7 có trọng lượng phân tử

34.000D nhưng lại cấu tạo nên 30% protein của hạt virut VP7 nằm ở vỏ capsit

ngoài định hình nên bề mặt nhẵn của vỏ ngoài

+ Protein không cấu trúc [6 ]

- NSP1 được mã hóa bởi từ gen 5 ,có đặc tính liên kết ARN Người ta chứng

minh được rằng các chuỗi cystein của NSP1 có vai trò quan trọng cho hoạt tính

liên kết ARN NSP1 có đặc hiệu với tất cả 11 đoạn ARN của virut Rota Đích

liên kết là vị trí gần đầu 5‟ của mARN và có thể thuộc 34 nucleotit đầu tiên của

mARN

- NSP2 là một protein liên kết ARN tích lũy trong thể vùi của virut (viroplasms)

và cần thiết cho quá trình sao chép genom của virut NSP2 có đặc tính liên kết

ARN tuy nhiên không đặc hiệu virut, đầu cacboxyl của NSP2 chứa vùng bảo

thủ cao có 37 acid amin và được dự đoán là domain liên kết ARN

- NSP3 liên kết mARN của virut trong những tế bào nhiễm và ức chế tổng hợp

protein trong tế bào vật chủ

- NSP4 là một độc tố trong ruột của người bị bệnh tiêu chảy và là độc tố ruột do

virut đầu tiên được phát hiện

- NSP5 và NSP6 được mã hóa nhờ gen 11 bởi hai khung đọc mở (ORF) khác

nhau

1.3 PHÂN NHÓM VÀ CÁC TÝP HUYẾT THANH

1.3.1 Phân nhóm

Virut Rota được phân chia theo nhóm, phân nhóm dựa trên các protein vỏ

capsit của virut.Theo Lambert J.P (1992) virut rota được chia thành 5 nhóm A, B,

C, D và E Nhóm A có 2 phân nhóm là 1 và 2, phân nhóm 1 có týp huyết thanh 2,

phân nhóm 2 có týp huyết thanh 1, 3 và 4 [6,8]

Baoming (1995) chia thành 7 nhóm là A, B, C, D, E, F và G, trong đó chỉ có

nhóm A, B, C gây bệnh cho cả người và động vật Nhóm D, E, F, G chỉ thấy ở động

vật Nhóm A hay gặp nhất, gây ra hầu hết các vụ dịch tiêu chảy nặng ở trẻ em

Nhóm B, C thường gây những vụ dịch lẻ tẻ, hay gặp ở trẻ lớn và người trưởng

thành [6,8]

1.3.2 Týp huyết thanh

Trong mỗi phân nhóm virut Rota được phân loại theo các týp huyết thanh

dựa trên protein capsit là VP4 và VP7 VP4 là một loại protein chống phân tách

proteaza - protein P, định ra týp huyết thanh P và VP7 một loại glycoprotein -

protein G, định ra týp huyết thanh G Hai gen mã hoá cho những protein này theo lý

thuyết có thể phân chia độc lập với nhau Đặc điểm týp huyết thanh được trình bày

Kiểu gen phổ biến G1, G2, G3, G4, G9 P4, P8, P6

Các protein capsit VP4 và VP7 có liên quan tới tính sinh miễn dịch của cơ

thể khi virut Rota xâm nhiễm Trên thế giới có 4 chủng virut Rota phổ biến nhất là

G1P[8], G3P[8], G4P[8], G2P[4] Tuy nhiên, sự lưu hành của các chủng virut Rota

có khác nhau đáng kể ở các vùng khí hậu khác nhau, một số chủng không thông

thường lại phân bố ở một vài quốc gia đang phát triển, chẳng hạn P6 kết hợp với

týp huyết thanh G9 chiếm 9,50% tổng số các chủng virut Rota ở Ấn Độ Do vậy,

việc giám sát dịch tễ týp huyết thanh G và P nhằm xác định týp phổ biến đóng vai

trò rất quan trọng trong việc phát triển vắc xin Rota mới [6, 16]

1.4 TÍNH CHẤT LÝ HÓA

1.4.1 Tính bền vững với PH

Virut Rota bền vững với pH ở diện rộng (pH từ 3 đến 10) nhờ đó mà có

virut Rota thể tồn tại và phát triển tốt trong ruột người [8]

1.4.2 Tính chịu nhiệt

Virut Rota có thể sống nhiều giờ trên bàn tay và nhiều ngày trên bề mặt rắn,

virut vẫn ổn định và có khả năng gây bệnh khi sống trong phân một tuần Ở 40C

thậm chí ở 200C với sự có mặt của 1,5 mM CaCl2 virut rota vẫn giữ được tính gây

nhiễm trùng trong nhiều tháng [10,20], ở - 200

C virut có thể tồn tại nhiều năm [6]

Virut dễ bị bất hoạt ở nhiệt độ cao trên 450C Nếu đông tan băng nhiều lần

thì virut mất khả năng gây nhiễm trùng Virut có khả năng tồn tại lâu trong buồng

bệnh nhân nên tỷ lệ nhiễm trùng bệnh viện khá cao [6]

1.4.3 Tính nhạy cảm

Khả năng gây nhiễm trùng của virut Rota tùy thuộc vào sự có mặt của lớp vỏ

capsít [6,8]

Virut Rota nhạy cảm với EDTA (Ethylen Diamin Tetra Acetic), do EDTA có

khả năng phá vỡ lớp vỏ capsit và làm mất khả năng nhiễm trùng của virut Sodium

thyocianate biến hạt virut có 2 lớp thành hạt virut chỉ có 1 lớp capsit Sodium

dodecyl sulfate 0,1%, phenol, formalin, betapropiolacton và đặc biệt là ethanol 95%

là chất khử trùng hiệu quả nhất làm mất lớp vỏ capsít của virut [16,17]

1.4.4 Tính đề kháng

Virut Rota nói chung đề kháng với fluorocacbon, ete, chloroform,

deoxycholate và dung dịch không ion Virut Rota cũng không chịu tác dụng của

kháng sinh, chỉ dùng kháng sinh trong trường hợp bội nhiễm hay nhiễm khuẩn phối

hợp [6]

Kháng thể IgA trong sữa mẹ có khả năng kháng lại virut rota, nhiều thử

nghiệm giám sát trên thế giới cũng như tại Việt Nam đã chứng minh được sữa mẹ

có mức hiệu giá cao và trung bình có khả năng trung hòa virut trong vắc xin thử

nghiệm [6]

1.5 ĐẶC TÍNH VIRUT ROTA TRÊN TẾ BÀO NUÔI CẤY MÔ:

Virut Rota có thể nuôi cấy trên tế bào ruột bào thai người hoặc nuôi cấy trên

tế bào thận bào thai người

Một vài dòng tế bào thường trực có nguồn gốc là tế bào biểu mô như tế bào

thận bò Madin-Darby, tế bào thận lợn PK15 và tế bào thận khỉ xanh Châu Phi CV1,

cũng thích hợp cho việc nuôi cấy virut Rota

Tỷ lệ gây nhiễm virut Rota người trên tế bào nuôi thường bị giảm ở những

lần cấy truyền sau Sau 2 đến 5 lần cấy truyền thì chủng virut Rota sẽ bị mất đi

Theo một số tác giả, enzyme phân giải protein bình thường có mặt ở ruột có thể

giúp cho virut Rota xâm nhập vào tế bào Một số tác giả đã thành công trong việc

phân lập virut Rota người từ bệnh nhân bị viêm dạ dày ruột cấp trên tế bào thận khỉ

Cynomolgus tiên phát và kỹ thuật nuôi quay trong môi trường có trypsin Nhiều tác

giả cũng công nhận phương pháp có hiệu quả để nuôi cấy và phân lập virut Rota

người là việc sử dụng enzym phân giải protein như tripsin, elatin, pancreatin để làm

tăng tính gây nhiễm của virut Rota người đối với tế bào nuôi [16,17]

1.6 QUÁ TRÌNH NHÂN LÊN CỦA VIRUT ROTA

Các điểm đặc trưng nhất của quá trình virut Rota nhân lên trong tế bào như sau [6]:

 Quá trình sao chép xảy ra hoàn toàn trong tế bào chất

 Tế bào không chứa các enzym dùng cho sao chép sợi kép ARN, vì thế virut

phải tự cung cấp các enzym cần thiết

 ARN sợi (-) được dùng làm khuôn để sao chép sợi (+) nhờ enzym ARN

polymeraza phụ thuộc ARN Sợi (+) này dùng để tổng hợp các protein, đồng

thời phiên mã tạo ARN sợi (-) Khi sợi (-) được tổng hợp hoàn toàn, nó thực

hiện việc liên kết với sợi (+)

 Sự phân giải tế bào sẽ giải phóng các hạt virut khỏi các tế bào nhiễm

Các giai đoạn chính của quá trình sao chép virut Rota bao gồm: giai đoạn

hấp phụ, xâm nhập và cởi áo; quá trình tổng hợp và sao chép; giai đoạn lắp ráp và

giải phóng virut ra khỏi tế bào vật chủ

Hình 4: Chu trình nhân lên của virut Rota trong tế bào

*Giai đoạn hấp phụ, xâm nhập và cởi vỏ [6]

Sự xâm nhập của virut Rota người phụ thuộc vào việc tách lớp vỏ ngoài của

virut bằng trypsin Virut đã được xử lý trước bằng trypsin sẽ trực tiếp xâm nhập qua

màng tế bào vào trong bào tương của tế bào

Một giả thuyết khác cho rằng, những hạt virut đã được hoạt hoá bằng trypsin

dính vào màng tế bào sẽ bơm trực tiếp axít nucleic qua khe hở hình thành giữa

capsomer và lỗ trên màng tế bào Cơ chế này tương tự như phóng axít nucleic vào tế

bào vi khuẩn của phage

Những hạt virut chưa được xử lý bằng trypsin sẽ vào tế bào bằng con đường

thực bào, những virion này sau khi gắn vào màng tế bào khoảng 20 phút sẽ vào

trong lysosome

*Giai đoạn tổng hợp và sao chép

Khi ARN của virut đã vào trong bào tương tế bào cảm thụ thì quá trình sao

chép sẽ được tiến hành Quá trình dịch mã không đồng đều, các bản sao là những

sợi ARN dương sao chép từ sợi ARN âm [11]

Nhân mARN phiên mã

Dịch mã

Virut có vỏ bao bọc tạm thời

Loại bỏ

vỏ ngoài

Các protein của virut được tổng hợp đồng thời với sự sao chép ARN của

virut Các protein cấu trúc bao gồm VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 và VP7 có tác dụng

tạo capsit của virut Các protein không cấu trúc bao gồm NSP1, NSP2, NSP3,

NSP4, NSP5 tham gia vào quá trình sinh tổng hợp ARN [11]

*Giai đoạn lắp ráp và giải phóng

ARN sợi kép tạo thành sẽ được lắp ráp với các protein cấu trúc tạo thành hạt

virut hoàn chỉnh trong bào tương tế bào và được giải phóng ra ngoài tế bào bằng

cách ly giải tế bào chủ hoặc nảy chồi [11]

1.7 KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VIRUT ROTA

1.7.1 Khả năng gây bệnh cho trẻ em

Virut rota nhóm A là nguyên nhân hàng đầu gây viêm dạ dày ruột cấp dẫn

đến tiêu chảy ở trẻ em, đặc biệt là trẻ từ 6 đến 24 tháng tuổi Trẻ sơ sinh hiếm khi bị

bệnh, chủ yếu là nhiễm trùng không triệu chứng hoặc biểu hiện bệnh rất nhẹ [8, 11],

có khoảng 10% - 20% trẻ sơ sinh bị nhiễm virut rota có biểu hiện lâm sàng [6]

Nhiễm trùng không triệu chứng ở trẻ sơ sinh có thể liên quan tới kháng thể từ mẹ

truyền qua nhau thai cho con hoặc kháng thể và các yếu tố ức chế trypsin trong sữa

mẹ, enzym pancreatic chưa hoàn chỉnh Như vậy, mặc dù sữa mẹ không phải là

phòng được nhiễm virut rota nhưng có thể phòng được bệnh tiêu chảy nặng [6]

Ngoài gây viêm dạ dày ruột cấp, virut rota còn có thể gây viêm ruột hoại tử,

lồng ruột, tắc mật ngoài gan, xuất huyết đường niệu, nhiễm trùng huyết Tuy

nhiên, hiện nay chưa có bằng chứng điển hình có tính thuyết phục về vấn đề này

1.7.2 Khả năng gây bệnh ở người lớn

Nhiễm trùng do virut Rota cũng khá phổ biến ở người lớn, thường do virut

nhóm B gây ra, tuy nhiên người mắc có thể không có triệu chứng hoặc bị tiêu chảy

mãn tính Theo một nghiên cứu khoảng 55% người lớn khi tiếp xúc với trẻ em nằm

viện vì viêm dạ dày ruột do virut Rota có lượng kháng thể tăng trong thời gian con

cái họ nằm viện [6] Một nghiên cứu khác cho thấy 11% - 70% người lớn bị nhiễm

trùng đã biểu hiện thành bệnh tiêu chảy

1.7.3 Cơ chế gây bệnh

Virut Rota vào cơ thể người theo đường phân - miệng và virut nhân lên

chủ yếu ở niêm mạc tá tràng Ở đây, virut nhân lên trong bào tương và phá huỷ

tế bào, tế bào bị tổn thương có các vi nhung mao teo ngắn, các bể lưới nội sinh

căng phồng, ty lạp thể phồng, vi nhung mao thưa thớt, không đều Tổn thương tế

bào dẫn đến rối loạn hấp thu các chất dinh dưỡng, nước và điện giải Các chất

carbonhydrat ứ đọng bên trong ruột làm tăng áp suất thẩm thấu, kéo nước vào

lòng ruột, hậu quả dẫn đến rối loạn tiêu hoá, gây tiêu chảy làm mất nhiều nước

và mất nhiều chất điện giải [2, 6,8]

1.8 DỊCH TỄ HỌC BỆNH TIÊU CHẢY CẤP DO VIRUT ROTA

1.8.1 Nguồn bệnh

Người và một số loài động vật như bò, cừu, khỉ, chó là vật chủ của virut

Rota Virut có trong phân bệnh nhân và được thải ra ngoài với số lượng lớn trong

thời kỳ tiêu chảy cấp Số lượng virut trong ruột ở thời kỳ tiêu chảy cấp có thể đạt

cao điểm là 1011

/ml phân Sau khi thải ra ngoài, chúng còn tồn tại trong phân và môi trường khá lâu đủ để gây nhiễm cho người khác

1.8.2 Đường lây truyền

Virut Rota chủ yếu lây truyền theo đường phân - miệng, ngoài ra còn có thể

lây theo đường hô hấp Bệnh hiếm khi truyền từ động vật sang người Virut Rota có

thể tồn tại lâu trong môi trường và đề kháng với các chất tẩy rửa thông thường như

cồn, nước javen nên khả năng lây nhiễm cao, đặc biệt trẻ từ 6 – 24 tháng tuổi dễ

nhiễm bệnh nhất do các bé thường tiếp xúc với đồ vật bằng tay, miệng Đôi khi

virut Rota có thể gây bệnh cho những thành viên khác trong gia đình và những

người có tiếp xúc gần gũi với trẻ mắc bệnh [6]

1.8.3 Mùa bệnh

Ở các nước khí hậu ôn đới, tiêu chảy do virut rota thường xuất hiện vào mùa

đông [6,7] Theo thống kê có tới hơn 50% trẻ nhập viện mắc bệnh TCC là do virut

Rota gây nên.Ở các nước nhiệt đới và các nước đang phát triển, yếu tố mùa ít rõ rệt

hơn, bệnh có thể gặp quanh năm [6]

Ở Việt Nam theo báo cáo của chương trình giám sát( 07/2000 đến 06/2001)

tại các bệnh viện miền Bắc [7] tỷ lệ trẻ mắc bệnh tiêu chảy cấp do virut Rota nhiều

nhất vào các tháng 1,2,3,4,5,6 với tỷ lệ từ 62,5% đến 80,55% Các tháng khác đều

có bệnh nhân bị nhiễm bệnh tuy nhiên với tỷ lệ thấp từ 15%-17%

Theo chương trình giám sát này tại các bệnh viện miền Nam thì tỷ lệ trẻ bị

tiêu chảy cấp do virut Rota không có sự thay đổi nhiều giữa các tháng kể cả đó là

mùa mưa hay mùa khô Hầu hết các tháng trong năm đều có bệnh nhân bị nhiễm với

tỷ lệ khá cao từ 55%-70% [5]

1.8.4 Lứa tuổi mắc bệnh

Theo chương trình giám sát đã công bố thì hầu hết trẻ em đều bị mắc tiêu

chảy cấp do virut Rota ít nhất 1 lần cho tới khi 3 – 5 tuổi Theo kết quả nghiên cứu

giám sát trên thế giới cũng như tại Việt Nam, bệnh xảy ra chủ yếu ở trẻ em độ tuổi

từ 6 – 24 tháng tuổi, các nhóm tuổi còn lại chiếm tỷ lệ thấp hơn

1.8.5 Sự liên quan giữa giới tính và tỉ lệ mắc bệnh

Ở miền Bắc Việt Nam trong số 702 bệnh nhân vào viện do virut Rota thì số

trẻ em nam có tới 459 trường hợp gần gấp 2 lần số trẻ em nữ vào viện cùng nguyên

nhân[7] Còn ở miền Nam thì tỷ lệ trẻ em nam nhiều hơn số trẻ em nữ mắc bệnh là

1,47 lần [5]

1.8.6 Miễn dịch

Trẻ dưới 3 tháng tuổi ít bị bệnh vì có sẵn kháng thể do mẹ truyền cho, kháng

thể trong huyết thanh cao ở thời kỳ sơ sinh, trẻ từ 3 đến 6 tháng kháng thể giảm rồi

tăng dần sau đó đạt cao điểm vào 2 tuổi và duy trì trong nhiều năm Điều này cũng

giải thích tại sao trẻ mắc bệnh chủ yếu ở độ tuổi từ 6 tới 24 tháng tuổi

Hiện nay đã xác định 2 loại kháng thể đóng vai trò trong quá trình bảo vệ là:

- Kháng thể tiết: IgA tiết trong sữa mẹ chiếm tỷ lệ khá cao và có thể tồn

tại đến 24 tháng, do đó trẻ bú sữa mẹ có thể được bảo vệ trước sự tấn công của

virut Rota IgA tiết ở niêm mạc ruột non có vai trò bảo vệ chính chống nhiễm

virut Rota týp 2, vì vậy văc xin sử dụng theo đường uống sẽ tạo được miễn dịch

cao hơn [6]

 Kháng thể dịch thể: IgM xuất hiện sớm trong máu, cao nhất vào giai đoạn

cấp tính của bệnh và giảm sau 10 ngày IgG đạt mức thấp trong giai đoạn cấp tính

và tăng cao ở giai đoạn hồi phục

 Vai trò của miễn dịch trung gian tế bào chưa được điều tra cụ thể [6]

1.9 SỰ PHÂN BỐ CÁC KIỂU GEN CỦA VIRUT ROTA

1.9.1 Phân bố trên thế giới

Theo thống kê dịch tễ trên toàn cầu từ năm 2001 đến 2008 kết quả thu được theo

Châu Âu Đông Địa

Từ bảng 4 cho thấy sự phân bố các chủng virut Rota trên thế giới có sự khác nhau

theo khu vực địa lý, cụ thể như sau:

Chủng G1P[8] chiếm chủ yếu trên thế giới như Châu Phi (36%), Châu Mỹ

(32%), Châu Âu (32%), chủng này chiếm tỷ lệ thứ hai tại Châu Á - Thái Bình

Dương (21%) và Đông Địa Trung Hải (17%) Tiếp theo là các chủng G2P[4] và

G9P[8] chiếm tỷ lệ tương đối cao tại các khu vực, trong đó chủng G2P[4] cao nhất

tại Đông Địa Trung Hải (24%), chủng G9P[8] cao nhất tại Châu Á - Thái Bình

Dương chiếm 29%

Các chủng G3P[8] và G4P[8] chiếm tỷ lệ thấp tại các khu vực, tại Châu Phi

chủng này không xuất hiện trong 8 năm giám sát, tại các khu vực còn lại chủng

chiếm tỷ lệ nhỏ dao động từ 1% đến 18%

Các chủng chưa xác định týp huyết thanh còn chiếm tỷ lệ cao chiếm từ 8% -

50% Có nhiều nguyên nhân không thể định týp G và P: có thể do xuất hiện các

chủng mới ít gặp như G10, G12, G15… nhưng chưa có Primer đặc hiệu để nhận

biết chúng Hoặc do đột biến điểm tại những vị trí bắt cặp với Primer ở những

chủng quen thuộc, dẫn tới đoạn mồi không thể bắt cặp với gen bị đột biến đó Do

đặc điểm tính đa dạng về di truyền của virut Rota ở các khu vực địa lý, Tổ chức y tế

thế giới đã tổng hợp các phương pháp và cặp mồi phổ biến đặc trưng theo khu vực

để xác định týp hiệu quả nhất Tuy nhiên với bất kỳ một phương pháp, cặp mồi đặc

hiệu nào đều có một tỷ lệ chủng không thể định týp Khi phát hiện có sự bất thường

cần nghiên cứu thêm, có thể thay đổi mồi và điều kiện phản ứng nếu cần

1.9.2 Phân bố tại Việt Nam

Theo kết quả giám sát bệnh tiêu chảy do virut Rota năm 2009 tại 3 bệnh viện

đại diện cho 3 miền đó là Bệnh viện Nhi Trung ương, Bệnh viện đa khoa Khánh

Hòa và Bệnh viện Nhi đồng I Thành Phố Hồ Chí Minh kết quả thu được có sự khác

biệt về các chủng lưu hành theo khu vực như sau:

- Đánh giá G týp[3]:

Xu hướng biến đổi đặc tính lưu hành các chủng virut Rota cũng có sự khác

biệt theo thời gian Từ năm 1998 – 2009 Trung tâm nghiên cứu sản xuất vắc xin và

Sinh phẩm y tế đã xác định được gần 2000 chủng virut Rota lưu hành theo từng

năm Theo phân tích týp G, chủng G1, G2, G3 là chủng lưu hành chính và tỷ lệ tùy

thuộc các năm khác nhau Trong đó G1 là chủng lưu hành gây bệnh chính trong

suốt những năm qua với tỷ lệ trung bình 38,8%, tuy nhiên trong những năm gần đây

chủng G3 lại là nguyên nhân chính gây bệnh tiêu chảy cấp cho trẻ em dưới 5 tuổi

chiếm tỷ lệ cao (44,70%) năm 2008 - 2009

- Đánh giá P týp:

Chủng lưu hành gây bệnh chủ yếu là P8 trên cả 3 miền.Theo phân tích týp P,

chủng P8 là chủng lưu hành gây bệnh với tỷ lệ cao mang tính ổn định trong 12 năm

qua với tỷ lệ trung bình 76,10% [3]

1.10 TÌNH HÌNH MẮC BỆNH TIÊU CHẢY CẤP VÀ VẮC XIN PHÕNG

NGỪA BỆNH TIÊU CHẢY CẤP DO VIRUT ROTA

1.10.1Tình hình mắc bệnh tiêu chảy cấp do virut Rota trên thế giới và Việt Nam

1.10.1.1 Tình hình mắc bệnh do virut Rota trên thế giới

Virut Rota là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tiêu chảy cấp ở trẻ sơ sinh và

trẻ nhỏ dưới 5 tuổi trên toàn thế giới Theo ước tính chiếm khoảng 40% tất cả các

trường hợp TCC ở trẻ em [68] Khoảng 527.000 bệnh nhân tử vong mỗi năm (từ

475.000 đến 580.000 trường hợp tử vong), hẩu hết ở trẻ em dưới 2 tuổi [69], chủ

yếu là miền nam và Đông nam Châu Á, Châu Phi cận Sahara, với gần 100.000 ca tử

vong mỗi năm ở Ấn Độ và hơn 200.000 bệnh nhân tử vong ở các nước Châu Phi

[70] Chương trình giám sát dịch tễ thực hiện tại Châu Á gổm 14 quốc gia hợp tác

với PATH, WHO, Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh (CDC) tại

Atlanta, GA (Mỹ) ước tính có khoảng 73,00% trẻ em nhập viện do TCC ở Hàn

Quốc dương tính với virut Rota, Nhật Bản (58,00%), Myanma (53,00%), Trung

Quốc (46,00%), Thái Lan (43,00%), Hong Kong (30,00%) [70]

Trước khi vắc xin ra đời, tiêu chảy do virut Rota ước tính tại Mỹ có

khoảng hơn 50.000 bệnh nhân phải nhập viện và có từ 20 đến 40 ca tử vong mỗi

năm Tại Châu Á sự ra đời của vắc xin đã ngăn chặn khoảng 110.000 người chết

mỗi năm, giảm 1.400.000 bệnh nhân phải nhập viện và 7.700.000 bệnh nhân

khám ngoại trú [27]

Hình 5 Sự phân bố số bệnh nhân tử vong theo khu vực trên thế giới và số bệnh

nhân tử vong tại các quốc gia Châu Á [33]

1.10.1.2 Tình hình mắc bệnh do virut Rota tại Việt Nam

Theo kết quả giám sát tại Việt Nam của một nhóm tác giả khác từ năm 1981

đến 1985 tỷ lệ mẫu nghiên cứu dương tính với virut Rota chiếm 26,5% Theo kết

quả giám sát của Trung tâm nghiên cứn, sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế trong 11

năm từ 1998 đến 2009 tỷ lệ mẫu dương tính chiếm tới 57,96%, gấp 2 lần so với kết

Các nước Châu Á khác

Ấn Độ

SriLanka Hàn Quốc

Châu Á

quả nghiên cứu trước đó Như vậy, trong những năm gần đây tỷ lệ trẻ nhiễm virut

Rota có xu hướng tăng mạnh và là nguyên nhân hàng đầu gây TCC tại Việt Nam

1.10.2 Tình hình sử dụng vắc xin phòng ngừa bệnh tiêu chảy cấp do virut Rota

1.10.2.1 Các chủng virut Rota được cân nhắc để phát triển vắc xin

Bệnh viêm dạ dày ruột do virut Rota là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến căn

bệnh tiêu chảy ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ trên toàn thế giới Hiện nay chưa có biện

pháp hiệu quả nào để thanh toán hoàn toàn bệnh do nhiễm virut Rota hay sự lây

truyền của nó Điều đó cho thấy tầm quan trọng của việc phát triển các văcxin ngăn

chặn căn bệnh này Các chủng virut Rota của người và động vật được cân nhắc sử

dụng như các nhà tài trợ gen để phát triển văcxin được đề cập tới ở bảng sau:

Bảng 5 Các chủng virut Rota được cân nhắc để phát triển vắc xin [6]

Tạo các chủng mới từ việc sắp xếp lại gen của chủng WC3

(Các gen virut Rota người đã được thay thế):

Những nghiên cứu nhằm phát triển một văcxin virut Rota an toàn và hiệu

quả đã bắt đầu từ giữa những năm 1970 Bệnh do virut Rota thường liên quan

đến nhiễm trùng biểu mô đường ruột, do vậy việc phát triển văcxin bảo vệ là quá

trình tìm ra kháng nguyên có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với virut

Người ta đã hy vọng rằng một văcxin virut Rota sống, giảm độc lực sẽ là văcxin

hiệu quả nhất

1.10.2.2 Các loại văc xin được nghiên cứu và sử dụng

a Các loại vắc xin trên thế giới

Ứng cử viên văcxin virut Rota đầu tiên là các văcxin đơn giá "Monovalent

vaccines" sử dụng chủng virut Rota WC3 được phân lập từ vật chủ là bò hoặc từ khỉ

Rhesus Đây là loại văcxin sống giảm độc uống một liều duy nhất Văcxin này an

toàn và có thể ngăn chặn được bệnh tiêu chảy do virut Rota ở trẻ em [6]

Văcxin thứ hai là các văcxin đa giá "Multivalent vaccines" được sản xuất

năm 1985 bằng cách sử dụng sự thay thế gen [6] Một gen trong hệ gen của chủng

virut Rota động vật được thay thế bởi gen của virut Rota người, gen này mã hoá cho

protein VP7

Rota Shield là vacxin tứ liên "Tetravalent vaccines" được phát triển bởi

chủng virut rota MMU18006, là văcxin sống giảm độc lực uống được sản xuất từ

chủng virut Rota ở khỉ Rherus Vacxin này được cấp phép tháng 10 năm 1998 tại

Mỹ, 600.000 trẻ được sử dụng vắc xin tương đương với 1,2 triệu liều Văcxin này bị

đình chỉ sử dụng vì có liên quan đến tăng nguy cơ lồng ruột sau 3 tuần sử dụng liều

đầu tiên với tỷ lệ ước tính 1/10.000 liều

Vắc xin dòng sơ sinh, bác sĩ Ruth Bishop đã phát triển chủng này trong

phòng thí nghiệm của bà Chủng này là chủng virut Rota người (G3, P6) được phân

lập từ một trẻ sơ sinh và làm giảm độc lực qua nhiều lần cấy truyền Vắc xin này có

thể tạo ra khả năng phòng bệnh đồng týp chống lại dòng G1[6]

Vắc xin được tạo ra trong phòng thí nghiệm nghiên cứu của Merck Văcxin

phối hợp dựa trên chủng của người và bò (WC) tạo ra khả năng phòng chống bệnh

rất tốt (70%) và phòng bệnh tiêu chảy cấp nặng (95-100%) Văcxin này là văcxin 5

týp phối hợp chủng của người (G1, G2, G3, G4 và P1(8) và chủng của bò(WC3)

Vắc xin của hãng Glaxo Smith Kline, bác sĩ Georges Thiry đưa ra những

kế hoạch về phát triển văcxin rota của hãng này, ứng cử viên của họ là chủng

G1P[8] Hiện nay văcxin này đã được cấp phép sử dụng tại Mexico Vắc xin này

đã được thử thực địa tại Singapore, sử dụng 2 liều vào tháng tuổi thứ 2 và 3 của

trẻ Với thời gian sử dụng văcxin này tránh tăng nguy cơ lồng ruột của trẻ và

những tác dụng phụ khác

b Vắc xin Rota đã được phê chuẩn sử dụng

Hội nghị về virut Rota quốc tế lần thứ 6 được tổ chức ngày 7, 8 tháng 1 năm

2005 tại Mexico đã thông qua và phê chuẩn 2 vắc xin Rota đó là vắc xin RotaTeq

của Meck và vắc xin Rotarix của Smith Line, cả hai vắc xin này đã được WHO phê

chuẩn cho sử dụng tháng 1/2006 [6]

Rota Teq là văcxin sống uống giảm độc lực sử dụng 3 liều được bắt đầu

nghiên cứu từ 1991 Nó là văcxin phối hợp giữa chủng rota của người và bò,

chứa 5 kháng nguyên G1, G2, G3, G4 và P1 Thực địa lâm sàng chỉ ra rằng

vacxin này rất an toàn và hiệu lực, nó phòng được >70% sự xâm nhập của bất kỳ

týp virut Rota nào

Rotarix là văcxin sống giảm độc lực được sử dụng 2 liều, có nguồn gốc từ 1

chủng virut Rota người G1P[8] Kết quả thử nghiệm cho thấy khoảng 73% phòng

được viêm dạ dày ruột do bất kỳ týp virut Rota nào và > 90% chống lại nhiễm cấp

tính do virut Rota và đặc biệt văcxin này có hiệu lực phòng bệnh >83% do virut

Rota không phải do týp G1, không có dấu hiệu chỉ ra rằng lồng ruột ở trẻ em liên

quan đến việc sử dụng văcxin này

c Vắc xin sản xuất tại Việt Nam

Vắc xin Rotavin-M1 sản xuất từ chủng G1P[8] – WS (KH0118) được phân

lập tại Việt Nam đã được sản xuất và thử nghiệm lâm sàng trên 30 người lớn khỏe

mạnh [1], thời gian từ 8/2009 đến 10/2009, và trên 799 trẻ khỏe mạnh từ 6-12 tuần

tuổi (thời gian từ 04/2010 đến 12/2011), kết quả thu được là đạt yêu cầu về mức độ

an toàn trên người lớn và trẻ từ 6 – 12 tuần tuổi

1.11 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐOÁN VIRUT ROTA

Có thể nuôi cấy trên tế bào thận của bào thai người, tế bào thận khỉ, tế bào

thận bò tuy nhiên việc nuôi cấy virut rota trên tế bào còn gặp nhiều khó khăn nên

chỉ sử dụng trong nghiên cứu vì vậy người ta phải dùng các phương pháp khác để

chẩn đoán

1.11.1 Các kỹ thuật phát hiện virut Rota

- Kỹ thuật miễn dịch gắn enzym (ELISA) xác định kháng nguyên virut rota

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc sử dụng kháng thể đơn dòng để tìm ra

kháng nguyên virut Rota có trong mẫu phân người [28] Kỹ thuật miễn dịch enzym

là một phương pháp đơn giản, có độ nhạy cao dùng cho việc xác định kháng nguyên

virut rota, và rất phù hợp cho việc phân tích một lượng mẫu lớn [6]

- Kỹ thuật RT-PCR xác định týp virut rota

PCR được sử dụng để xác định kiểu gen của virut rota dựa trên các ARN

được tách chiết từ các mẫu phân có virut rota dương tính, nhằm xác định đặc điểm

của các protein capsit lớp ngoài G và P [6]

- Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang xác định kháng nguyên virut rota

Để xác định hiệu giá của virut nhóm A, có 2 phương pháp xác định đó là

phương pháp miễn dịch enzym (EIA) với kết quả là chỉ số OD, chỉ số này không có

ý nghĩa quyết định liều gây nhiễm của virut Phương pháp miễm dịch huỳnh quang

là phương pháp tối ưu xác định hiệu giá virut Rota nhóm A, đơn vị xác định hiệu

giá là đơn vị huỳnh quang phát sáng của tế bào gây nhiễm trên ml hỗn dịch virut

Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, cho kết quả nhanh trong vòng 24 giờ và

chính xác [6]

- Kỹ thuật kính hiển vi điện tử

Đây là phương pháp phát hiện trực tiếp virut trong bệnh phẩm và là kỹ thuật

chẩn đoán nhanh, đặc hiệu, tuy nhiên độ nhạy không cao và khá đắt tiền, rất khó

thực hiện khi có nhiều bệnh phẩm [6]

- Kỹ thuật ngưng kết hạt Latex

Hạt latex được gắn với kháng thể kháng virut Rota để chẩn đoán kháng nguyên của

virut Đây là kỹ thuật chẩn đoán nhanh, không cần nhiều trang thiết bị [27]

- Kỹ thuật điện di

Nguyên lý các mảnh kép phân tử ARN của virut rota có trọng lượng phân tử khác

nhau nên dễ dàng tách ra khi điện di trên gel polyacrylamid hoặc agarose Kỹ thuật

này có độ nhạy, đặc hiệu cao, dễ áp dụng trên nhiều bệnh phẩm

1.11.2 Các kỹ thuật phát hiện kháng thể virut Rota

- Phản ứng kết hợp bổ thể

Dùng kháng nguyên là virut Rota người tinh khiết, phân lập từ phân bệnh nhân để

phát hiện kháng thể virut Rota [6]

- Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu thụ động

Có thể dùng phản ứng này để định lượng IgG, phân biệt được lần nhiễm thứ nhất

với lần nhiễm thứ hai Phản ứng này nhạy hơn phản ứng kết hợp bổ thể [6]

6 CHƯƠNG 2

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu là những trẻ em thỏa mãn các tiêu chí sau:

- Độ tuổi từ 0 – 59 tháng tuổi (< 5 tuổi)

- Nhập viện với nguyên nhân TCC: đi ngoài ≥ 3 lần trong ngày (24h), phân

lỏng, không máu

- Khởi bệnh ≤ 7 ngày

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

a Thời gian và địa điểm giám sát

Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 1/2010 đến tháng 12/2010 tại bệnh viện

Nhi Khánh Hòa

b Quy trình thực hiện

- Các mẫu phân của trẻ bị tiêu chảy cấp thỏa mãn đủ các tiêu chí được lấy mẫu

trong vòng 48 giờ sau khi nhập viện Mẫu sau khi lấy xong phải được bảo quản ở -200

C

- Tất cả các bệnh nhi đều có phiếu theo dõi ghi rõ các chỉ tiêu: tên, tuổi, giới tính,

địa chỉ, ngày vào viện, ngày lấy bệnh phẩm, số thứ tự bệnh phẩm, các triệu chứng

lâm sàng kèm theo

- Hàng tháng, các cán bộ tập hợp các mẫu và biên bản ghi chép đầy đủ thông tin

yêu cầu và gửi về phòng kiểm nghiệm thuộc Trung tâm nghiên cứu, sản xuất vắc

xin và sinh phẩm y tế Tất cả các mẫu này đều được chẩn đoán virut Rota bằng kit

ELISA Lựa chọn các mẫu dương tính có chỉ số OD cao tiến hành tách chiết ARN

và xác định kiểu gen G và P của virut Rota bằng phản ứng RT – PCR Tổng hợp,

phân tích số liệu dịch tễ học và đánh giá đặc tính các chủng virut Rota tại Việt Nam

Hình 6 Sơ đồ tóm tắt quy trình thực hiện

2.2.2Phương pháp thực hiện

2.2.2.1 Lấy mẫu bệnh phẩm

* Nguyên vật liệu:

 Tất cả các mẫu phân của trẻ từ 0 đến 5 tuổi nhập viện do TCC vào các bệnh

viện Nhi Khánh Hòa

 Các ống nhựa vô trùng 15ml có nút đậy, nhãn, đá khô (ice – box)…

 Phích đá

 Thiết bị tủ lạnh âm sâu -200

C để bảo quản mẫu

 Phiếu điều tra

* Các bước tiến hành:

Người nhà bệnh nhi được hướng dẫn lấy mẫu vào ống nhựa vô trùng, dung

tích 15ml có nút đậy, có nhãn ghi đầy đủ thông tin tên, tuổi, ngày lấy mẫu, số bệnh

phẩm.Mẫu được bảo quản ở -200C sau đó được vận chuyển tới phòng kiểm nghiệm

trong điều kiện được bảo quản lạnh

Đối tượng nghiên cứu Lấy mẫu nghiên cứu

Chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA Mẫu âm tính Mẫu dương tính

Chọn mẫu có chỉ số OD

cao

Tách ARN và chạy RT - PCR Kiểu gen P Kiểu gen G

Mỗi bệnh nhi đều có phiểu theo dõi ghi đây đủ các thông tin: tên, tuổi, giới

tính, địa chỉ, ngày vào viện, ngày lấy bệnh phẩm, các triệu chứng lâm sàng, số lần

tiêu chảy trong ngày, kéo dài bao lâu, tính chất phân, độ mất nước, sốt, nôn…

2.2.2.2 Xác định virut Rota trong mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp ELISA

a Nguyên lý của phương pháp

Hình 7 Sơ đồ mô tả nguyên lý của phương pháp ELISA

Kháng thể gắn trên các giếng sẽ kết hợp với kháng nguyên có trong mẫu

bệnh phẩm Kháng nguyên này sẽ kết hợp với cộng hợp kháng thể gắn enzym tạo

thành phức hợp Kháng thể – Kháng nguyên – Kháng thể gắn enzym Khi có cơ chất

của enzym thì cơ chất sẽ bị đổi màu Nếu trong mẫu bệnh phẩm không có kháng

nguyên thì phức hợp Kháng thể – Kháng nguyên – Kháng thể gắn enzym không

được tạo thành, cơ chất không bị đổi màu

b Các bước tiến hành

* Chuẩn bị hóa chất và thiết bị

Bộ kit chẩn đoán virut Rota ProSpecT (Anh) gồm các thành phần:

Phiến chuẩn độ 96 giếng Phủ kháng thể đa dòng thỏ đặc hiệu virut Rota

nhóm A Dung dịch pha loãng Đệm muối tris

Đối chứng dương virut Rota bò bất hoạt

Cộng hợp Kháng thể đa dòng thỏ đặc hiệu virut Rota gắn với

horseradish peroxidase

Cơ chất TMB Cơ chất chứa chỉ thị màu: 3,3‟ – 5,5‟

-tetramethylbenzidine Dung dịch dừng phản ứng H2SO4 0,46 mol/lit

 Dụng cụ và nguyên vật liệu khác: chai đựng nước, đệm, cồn, đồng hồ, giấy

thấm…

 Thiết bị: máy đọc đĩa 96 giếng (Microwell plate reader), hãng themrmo

Labsystems (Nhật) có thể đọc được bước sóng 450nm

* Các bước tiến hành:

 Pha loãng mẫu 10% (100l mẫu + 900l dung dịch pha loãng)

 Nhỏ 2 giọt (100l) mẫu đối chứng dương vào giếng đã đánh dấu đối chứng

dương

 Nhỏ 2 giọt (100l) mẫu đối chứng âm vào giếng đã đánh dấu đối chứng âm

 Nhỏ 2 giọt (100l) các mẫu đã pha loãng vào các giếng đã đánh dấu

 Nhỏ 2 giọt (100l) cộng hợp enzym vào tất cả các giếng, vỗ nhẹ trên thành

giếng để hỗn hợp trên được trộn lẫn, đậy nắp và phủ giấy bạc

Dương tính: có màu xanh Âm tính: không màu

Hình 8 Kết quả ELISA khi chưa cho chất dừng phản ứng

 Sau khi đã nhỏ dung dịch dừng phản ứng:

Dương tính: có màu vàng

Âm tính: không màu

Hình 9 Kết quả ELISA sau khi cho chất dừng phản ứng

 Đọc kết quả trên máy ELISA: tại bước sóng 450nm, giá trị hấp phụ hiển thị

trên máy tính

 Tính kết quả ngưỡng dương tính:

X = 0,1 + giá trị OD của chứng âm