Nghiên cứu tác dụng của một số chất thứ cấp từ thực vật lên vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus Mutans tt

Đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của một số chất thứ cấp từ thực vật lên vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans” của chúng tôi nằm trong xu thế nghiên cứu chung của thế giới và Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN QUANG HUY

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ CHẤT THỨ CẤP TỪ THỰC VẬT LÊN VI KHUẨN GÂY

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2009

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN QUANG HUY

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ CHẤT THỨ CẤP TỪ THỰC VẬT LÊN VI KHUẨN GÂY

MỤC LỤC

Trang

1.1.2 Tình hình bệnh sâu răng trên thế giới và Việt Nam 4

1.1.4 Mảng bám răng và sự hình thành mảng bám răng 8

1.2 Vi khuẩn Streptococcus mutans và khả năng gây sâu răng 9

1.2.1 Một số đặc trưng hình thái và phân loại của Streptococcus mutans 10 1.2.2 Một số đặc trưng sinh lý sinh hoá của S mutans 12 1.2.3 Cơ sở phân tử của đáp ứng stress ở vi khuẩn S mutans 14

1.2.3.1 Đáp ứng stress axit ở vi khuẩn S mutans 15

1.2.3.2 Đáp ứng stress oxy hóa ở vi khuẩn S mutans 19 1.2.4 Các đặc trưng trong hệ gen của S mutans đối với việc phân lập và

1.3.4.2 Vaccine phòng chống sâu răng 28

1.4.1 Phân loại, cấu tạo hoá học và tính chất của chất thứ cấp từ thực vật 29

1.4.1.1 Nhóm các hợp chất terpene 30

1.4.1.2 Nhóm các hợp chất phenolic 30

1.4.2 Hoạt tính sinh học của các hợp chất thứ cấp từ thực vật 34

1.4.2.1 Tác dụng chống oxy hoá của các hợp chất thứ cấp từ thực vật 34

1.4.2.2 Tác dụng kháng sinh, kháng khuẩn của các hợp chất thứ cấp từ

2.2.1 Nuôi cấy vi khuẩn và bảo quản tế bào vi khuẩn 41 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn gây sâu răng S

mutans từ các bệnh phẩm mắc bệnh sâu răng

41

2.2.2.1 Phân lập trên môi trường Mitis salivarius 42

2.2.2.2 Phân lập trên môi trường TSA pH 5,0 42 2.2.3 Phương pháp nhận dạng Streptococcus mutans phân lập từ người

Việt Nam

43

2.2.3.1 Kiểm tra hình thái tế bào vi khuẩn 43

2.2.3.2 Phương pháp nhuộm Gram cải tiến 43

2.2.3.3 Kiểm tra hoạt tính catalase 43

2.2.3.4 Kiểm tra các đặc tính hoá sinh (kit Api 20 Strep) 43

2.2.3.5 Phương pháp PCR nhân bản đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome

16S và kỹ thuật đa hình độ dài các đoạn giới hạn

44

2.2.3.6 Phương pháp PCR mồi đặc hiệu nhân bản đoạn gen mã hóa cho

dextranase của Streptococcus mutans

45

2.2.3.7 Phương pháp đọc trình tự đoạn gen mã hóa ARNr 16S 45

2.2.5 Phương pháp xác định mức độ sinh axit của vi khuẩn 46 2.2.6 Phương pháp xác định mức độ gây chết tế bào 46 2.2.7 Phương pháp xác định khả năng chịu axit của các chủng vi khuẩn 47 2.2.8 Phương pháp đo mức độ tiêu thụ oxy của tế bào 47 2.2.9 Xác định hoạt độ một số enzyme quan trọng của S mutans 47

2.2.9.3 Phân tích hoạt độ phosphotransferase (PTS) 49

2.2.9.4 Phân tích hoạt độ NADH oxidase 49

2.2.9.5 Phân tích hoạt độ lactate dehydrogenase 50

2.2.9.6 Phân tích hoạt độ pyruvate kinase 50 2.2.10 Phương pháp nghiên cứu định tính thành phần một số hợp chất

thực vật thứ sinh trong dịch chiết thực vật

51

2.2.11 Phương pháp phân tách các hợp chất bằng sắc ký 52 2.2.12 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 53

3.1 Nghiên cứu sàng lọc một số thực vật có khả năng kháng khuẩn

sâu răng

54

3.1.1 Khả năng ức chế sự sinh axit của một số dịch chiết thực vật 54 3.1.2 Khả năng diệt S mutans GS-5 bởi dịch chiết một số thực vật 58

3.1.2.1 Khả năng diệt vi khuẩn S mutans GS-5 ở pH 4 58

3.1.2.2 Khả năng diệt vi khuẩn S mutans GS-5 ở pH 7 59 3.1.3 Khả năng ức chế sự hình thành bioflim của S mutans GS-5 bởi các 60

dịch chiết thực vật

3.1.4 Tác dụng của dịch chiết một số thực vật phối hợp với fluo 62 3.1.5 Tác dụng của dịch chiết một số thực vật phối hợp với H2O2 64 3.1.6 Tác dụng của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền lên một số vi khuẩn

đường miệng

65

3.2 Tách, tinh sạch, nghiên cứu tính chất của một số chất thứ cấp

có hoạt tính kháng khuẩn sâu răng từ vỏ cây Sao đen

67

3.2.1 Tìm hiểu nhóm chất thứ cấp có trong vỏ cây Sao đen 67 3.2.2 Tách chiết tinh sạch một số chất thứ cấp từ vỏ cây Sao đen 68 3.2.3 Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn sâu răng của hopea phenol và

malibatiol A từ vỏ Sao đen

3.2.3.3 Tác dụng của hopea phenol và malibatol A lên hoạt độ ATPase 74

3.2.3.4 Tác dụng của hopea phenol và malibatol A lên hoạt độ

phosphotransferase của S mutans GS-5

3.3 Tách, tinh sạch, nghiên cứu tính chất của một số chất thứ cấp

có hoạt tính kháng khuẩn sâu răng từ lá cây Sắn thuyền

77

3.3.1 Tìm hiểu các nhóm chất thứ cấp có trong lá Sắn thuyền 78 3.3.2 Tách chiết tinh sạch một số chất thứ cấp từ lá cây Sắn thuyền 79 3.3.3 Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn sâu răng của axit asatic 83

3.3.3.1 Tác dụng của axit asiatic lên sự sinh axit của S mutans GS-5 83

3.3.3.2 Tác dụng của axit asiatic lên sự diệt S mutans GS-5 83

3.3.3.3 Tác dụng của axit asiatic lên hoạt độ ATPase của S mutans GS-5 84

3.3.3.4 ảnh hưởng của axit asiatic lên hoạt độ phosphotransferase của S

3.3.3.7 Tác dụng của axit asiatic lên NADH oxidase của S mutans GS-5 86

3.4 Phân lập một số chủng vi khuẩn Streptococcus mutans từ người

3.4.2 Xác định một số đặc điểm hình thái, sinh lý, hoá sinh của tế bào vi

khuẩn phân lập từ người Việt Nam

89

3.4.2.1 Xác định hình thái tế bào vi khuẩn và kiểm tra hoạt tính catalase 89

3.4.2.2 Nhận dạng sơ bộ Streptococcus mutans bằng kit API 20 Strep 91 3.4.3 Nhận dạng vi khuẩn Streptococcus bằng kỹ thuật đa hình độ dài

các đoạn phân cắt giới hạn (RFLP) và PCR

3.4.3.3 Nhận dạng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu của

gen dextranse của Streptococcus mutans

3.4.4.3 Giải trình tự gen mã hóa ARNr 16S của S mutans H2 phân lập từ

người Việt Nam

98

3.4.5 Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền lên S

mutans H2 phân lập từ người Việt Nam

100

3.4.5.1 Tác dụng của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền lên khả năng sinh

axit của S mutans H2

100

3.4.5.2 Tác dụng của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền với việc diệt các tế

bào S mutans H2

100

3.4.5.3 Nghiên cứu tác dụng của axit asiatic, hopea phenol và malibatol A

lên hoạt độ một số enzyme của S mutans H2

1

MỞ ĐẦU

Sâu răng là một trong số các bệnh răng miệng phổ biến nhất hiện nay và đang có xu hướng tăng lên đặc biệt ở các nước đang phát triển Sự gia tăng của căn bệnh này là do những thay đổi trong lối sống, thói quen sinh hoạt, chế độ ăn uống hàng ngày và tuổi thọ trung bình Theo số liệu điều tra gần đây của Viện Răng Hàm Mặt Trung ương, khoảng 90% dân số Việt Nam mắc các bệnh về răng, miệng, trong đó phổ biến nhất là sâu răng và viêm quanh răng Bệnh sâu răng không chỉ gây ảnh hưởng tới tình trạng sức khoẻ của người bệnh mà còn gây ra nhiều chi phí tốn kém trong chữa trị.Tổ chức Sức khỏe thế giới (WHO) đã xếp sâu răng là một trong số các căn bệnh nguy hiểm của loài người Nhiều chương trình nghiên cứu cũng như khuyến cáo nhằm mục đích ngăn ngừa và phòng chống bệnh này đã được WHO thực hiện trong những năm qua Mặc dù tỷ lệ sâu răng trong cộng đồng dân cư đã giảm đi đáng kể nhưng vẫn còn duy trì ở mức cao và đòi hỏi phải có những biện pháp dự phòng tốt hơn nữa để đạt mục tiêu mà WHO đưa ra

Cách tốt nhất để hạn chế bệnh sâu răng là vệ sinh răng, miệng thường xuyên và đúng cách cùng với việc hạn chế dùng các thức ăn, đồ uống có nhiều đường Tuy vậy, phương pháp vệ sinh răng miệng, thói quen ăn uống không phải lúc nào cũng thực hiện được, vì vậy việc sử dụng các chất có khả năng kháng khuẩn như fluo, axit yếu, muối kim loại là một biện pháp để phòng chống sâu răng Trong số các chất kháng khuẩn được sử dụng thì fluo là chất có hiệu quả hơn cả.Tuy nhiên, việc sử dụng fluo lâu dài hay với nồng độ cao có thể dẫn đến chứng nhiễm fluo (fluorosis) làm men răng ố vàng và trở nên sần sùi (Hamilton, 1990; Aeba, 2002) Chính vì những lý do đó mà xu hướng hiện nay là tìm kiếm các hợp chất mới, có thể thay thế một phần fluo mà vẫn có hiệu quả chống sâu răng cao Hiện nay, việc tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên có tác dụng bảo vệ răng miệng đang là xu hướng được quan tâm nghiên cứu và có nhiều ứng dụng trong thực tiễn

Việt Nam có hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng, trong đó rất nhiều loài có chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao Từ ngàn xưa, cộng đồng các dân tộc trên đất nước ta đã có truyền thống sử dụng cây cỏ để chữa bệnh, bảo vệ sức khỏe chống lại bệnh tật trong đó có bệnh sâu răng (Đỗ Huy Bích và tập thể, 2004; Đỗ Tất Lợi, 2001; Lã Đình Mỡi và tập thể, 2001) Tuy nhiên, đến nay việc tìm kiếm các hợp chất mới chưa mang lại nhiều kết quả như mong muốn Hơn nữa, các nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng của các hợp chất thứ cấp từ thực vật lên vi khuẩn sâu răng hiện vẫn còn thiếu

Đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của một số chất thứ cấp từ thực vật lên vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans” của

chúng tôi nằm trong xu thế nghiên cứu chung của thế giới và Việt Nam.Việc tiến hành đề tài này là cần thiết và có ý nghĩa

thực tiễn, đáp ứng nhu cầu nâng cao hiệu quả phòng chống các bệnh về răng, miệng đặc biệt là bệnh sâu răng

Mục tiêu: Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là điều tra tác dụng chống sâu răng của dịch chiết một số loài thực vật ở Việt Nam

thông qua việc nghiên cứu ảnh hưởng của chúng lên các quá trình sinh lý, hoá sinh, một số enzyme và hệ enzyme có liên quan

của vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans, từ đó nghiên cứu cách tách chiết, tinh sạch một vài hợp chất thứ cấp từ thực

vật và đi sâu tìm hiểu tác dụng chống sâu răng của chúng

Nội dung nghiên cứu

 Nghiên cứu điều tra ảnh hưởng một số dịch chiết thực vật lên quá trình sinh axit gây sâu răng của Streptococcus mutans

và tác dụng giết chết vi khuẩn này của các dịch chiết

 Tách chiết, tinh sạch, xác định cấu trúc và nghiên cứu tác dụng của một số chất thứ cấp từ thực vật từ các loài được điều

tra lên các quá trình sinh lý, hoá sinh của vi khuẩn S mutans cũng như một số enzyme và phức hệ enzyme đích, liên

quan đến tính chất gây sâu răng của vi khuẩn này

 Phân lập một số chủng vi khuẩn Streptococcus mutans từ bệnh phẩm của người Việt Nam bị sâu răng và bước đầu

nghiên cứu tác dụng của một số chất thứ cấp từ thực vật thu được lên một số quá trình sinh lý, hoá sinh cũng như một

số enzyme và phức hệ enzyme liên quan của chủng vi khuẩn Streptococcus mutans phân lập được

3

Ứng dụng thực tiễn của đề tài

Các kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần cung cấp các dẫn liệu về khả năng kháng khuẩn sâu răng của một số dịch chiết thực vật, hợp chất tinh sạch từ lá Sắn thuyền và vỏ Sao đen có ở Việt Nam góp phần ứng dụng hiệu quả hơn trong việc

bảo vệ răng, miệng

Đóng góp mới của đề tài

 Đây là công trình nghiên cứu sàng lọc một số thực vật có tác dụng chống sâu răng ảnh hưởng đến quá trình sinh lý, phát

triển của vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans GS-5

 Đây là công trình nghiên cứu có tính hệ thống về tác dụng của dịch chiết vỏ cây Sao đen và lá cây Sắn thuyền lên vi

khuẩn gây sâu răng S mutans GS-5

 Đây là công trình đầu tiên công bố về việc tách chiết, tinh sạch, xác định công thức hoá học và tác dụng chống sâu răng của hợp chất hopea phenol, malibatol A từ vỏ Sao đen và axit asiatic từ lá Sắn thuyền thông qua việc đánh giá tác dụng của chúng lên sự sinh axit, khả năng giết vi khuẩn và tác dụng của chúng lên hoạt độ một số enzyme đích trong việc

sinh và chịu axit của vi khuẩn S mutans GS-5

 Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu phân lập và nhận dạng đến loài một số chủng vi khuẩn S mutans từ người Việt

Nam

Bố cục của luận án:

Luận án gồm 136 trang, 10 bảng số liệu, 47 hình, 209 tài liệu tham khảo tiếng Việt và tiếng Anh Bố cục luận án gồm: mở đầu (3 trang), tổng quan tài liệu (36 trang), nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (14 trang), kết quả nghiên cứu và bàn luận (59 trang), kết luận và kiến nghị (2 trang), tài liệu tham khảo (21 trang) và phần phụ lục

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bệnh sâu răng và các yếu tố liên quan

Sâu răng là bệnh gây ra bởi vi khuẩn trên mảng bám răng, điển hình là Streptococcus mutans Những vi khuẩn này sử dụng các carbohydrate, chủ yếu là đường glucose để lên men tạo ra axit lactic S mutans có thể tồn tại và sinh trưởng trong

môi trường pH thấp, có thể duy trì hoạt động trao đổi chất mạnh và tạo ra axit Axit hình thành sẽ gây ra sự hòa tan các khoáng chất có trong men răng vốn được cấu tạo bởi hydroxylapatide liên kết với ion canxi tích điện dương và ion phosphate tích điện âm, dẫn đến làm mòn men răng, tạo thành các hố trên răng và gây ra sâu răng (Gibbons và Van, 1975; Nguyễn Dương Hồng, 1997)

Mặt khác, trên răng các vi khuẩn trong khoang miệng và sản phẩm của chúng cùng với những mảnh vụn thức ăn tạo thành mảng bám răng Mảng bám răng không chỉ là nguyên nhân gây ra sâu răng mà còn là một yếu tố chủ yếu gây bệnh nha chu (Kolenbrander, 2000)

Bệnh sâu răng là một trong 3 bệnh được tổ chức Sức khỏe thế giới (WHO) khuyến cáo về mức độ nguy hiểm chỉ đứng sau bệnh tim mạch và ung thư Trong các thập niên trước, tỷ lệ người mắc bệnh sâu răng khá cao đặc biệt ở trẻ em Trung bình mỗi trẻ em dưới 12 tuổi có từ 8 đến 10 răng sâu hoặc răng đã bị mất do sâu Tới năm 1997, số người mắc bệnh sâu răng ở lứa tuổi trung niên từ 35 đến 44 tuổi tại các nước công nghiệp phát triển vẫn còn ở mức rất cao, chỉ số DMFT (phản ánh số răng sâu, số răng mất hay trám răng do sâu) ở Canada, Nhật Bản, Úc và các nước Bắc Âu là 13,9, ở Mỹ là hơn 9 (Trịnh Đình Hải, 2004) Hiện nay số bệnh nhân mắc bệnh sâu răng còn cao là do mức sống ngày càng cải thiện, nhiều loại bánh kẹo và sản phẩm có đường được sử dụng

WHO đã đưa ra mục tiêu cho toàn cầu phấn đấu đến năm 2010 chỉ số DMFT dưới 1 Tại Việt Nam, mục tiêu phấn đấu đến năm 2010 ở độ tuổi 5-6 có 50% trẻ em không bị sâu răng, ở độ tuổi 18 có 85% người giữ được toàn bộ răng, ở tuổi từ 35-

44 tuổi giảm 50% số người không còn răng và trên 65 tuổi giảm 25% số người không còn răng

1.2 Vi khuẩn S mutans và khả năng gây sâu răng

Những vi khuẩn có khả năng lên men đường thành axit lactic tồn tại trong khoang miệng được xem là nguyên nhân gây sâu răng Chúng chủ yếu thuộc 3 nhóm vi sinh vật: Streptococcus, Lactobacillus và Actinomyces Trong số những vi khuẩn

này, S mutans được coi là nguyên nhân chính gây bệnh sâu răng do vi khuẩn này luôn được phát hiện trong nước bọt, mảng bám răng của người và có số lượng rất cao ở những vùng răng bị sâu Đặc trưng gây sâu răng của S mutans chính là khả năng sinh axit mạnh và chịu axit tốt của vi khuẩn này, cho nên trong môi trường có đường, S mutans tạo ra axit làm tan men răng

dẫn đến sâu răng

Khả năng thích nghi hay chịu axit của S mutans liên quan đến nhiều cơ chế khác nhau, quan trọng nhất là hoạt động của

các bơm proton, đặc biệt là F-ATPase, nhằm bơm proton ra ngoài, duy trì pH nội sinh (pHi) luôn cao hơn so với pH môi

trường F-ATPase của S mutans được phát hiện là có sự thay đổi trong cấu trúc để thích nghi hoạt động tốt ở pH thấp (Sturr

và Marquis, 1992) Ngoài ra, S mutans còn có một số cơ chế thích nghi axit khác như: tăng cường tổng hợp các chaperonin

hỗ trợ sự hình thành cấu trúc không gian đúng của các protein (Jayaraman và tập thể, 1997), tăng cường sinh tổng hợp các enzyme sửa chữa ADN bị tổn thương do axit (Haln và tập thể, 1999) haythay đổi thành phần lipid của màng tế bào để làm

giảm khả năng thấm proton (Quivey và tập thể, 2000) Nhờ vậy, S mutans vẫn có thể tồn tại và sinh axit khi pH môi trường

giảm xuống dưới 4

Hơn nữa S mutans cũng có các đặc điểm để chống chịu các stress về oxy hóa, để tồn tại và phát triển Các vi khuẩn

đường miệng sinh axit lactic thiếu các cytochrome, các protein chứa nhân hem và enzyme catalase nhưng vẫn có thể sinh trưởng trong môi trường có chứa các gốc oxy tự do vì chúng có hệ thống các enzyme bảo vệ như NADH oxidase, Superoxide dismutase (Higuchi 1992, 1999)

Việc phân lập, phát hiện sự có mặt S mutans đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh sâu răng Nhiều kỹ thuật khác nhau đã được nghiên cứu, áp dụng trong phân lập và nhận dạng các chủng S mutans ở người Gần đây kỹ

thuật đa hình độ dài các đoạn phân cắt giới hạn (RFLP) kết hợp kỹ thuật PCR đã được áp dụng cho phép nhận dạng chính xác

và nhanh chóng loài S mutans (Sato và tập thể, 2003)

1.3 Các biện pháp chống sâu răng

Việc loại bỏ mảng bám răng bằng cơ học (như đánh răng) có tác dụng ngăn chặn sự hình thành mảng bám răng và là biện pháp phòng chống sâu răng đơn giản nhất Tuy vậy việc thay đổi thói quen ăn uống và duy trì vệ sinh răng miệng thường xuyên rất khó thực hiện Do vậy, hàng loạt các biện pháp khác nhau nhằm ngăn chặn sâu răng đã được nghiên cứu và ứng

dụng Các biện pháp này chủ yếu dựa trên việc làm giảm số lượng S mutans trên mảng bám răng, giảm khả năng sinh axit của

S mutans, hạn chế việc hình thành mảng bám răng, trám bít các hố rãnh Các biện pháp được sử dụng trong việc chống sâu

răng gồm: sử dụng chất kháng khuẩn tổng hợp; sử dụng vaccine phòng chống sâu răng; sử dụng các hợp chất tự nhiên, các

1.4 Các chất thứ cấp từ thực vật

Các hợp chất thứ cấp từ thực vật là các sản phẩm của quá trình trao đổi chất được sinh ra bởi thực vật Chúng là các chất hoá học được tổng hợp và chuyển hoá từ các chất trao đổi bậc nhất như axit amin, protein, axit nucleic, carbohydrate, lipid hoặc từ các sản phẩm trung gian của quá trình đường phân, chu trình Kreb (Lã Đình Mỡi và tập thể, 2001)

Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học và các thuộc tính lý học của chúng mà các chất thực vật thứ sinh được phân loại thành 3 nhóm chất chính là nhóm terpene, nhóm các hợp chất phenolic và nhóm alkaloid Tác dụng sinh học của các hợp chất thực vật thứ sinh rất đa dạng và phong phú Một số hợp chất thực vật thứ sinh được khai thác về tác dụng chống oxy hoá, tác dụng kháng khuẩn, chống viêm và thậm chí ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư, HIV (Park và tập thể, 2006, Dai và tập thể, 1998). Chen và tập thể (1989) đã nghiên cứu tác dụng của 79 dịch chiết thực vật lên vi khuẩn S mutans và phát hiện 3 loài

M australia, L octovalvis và T orientalis chứa các hợp chất có tính kháng S mutans cao nhất Nhiều hợp chất nhóm

flavonoid trong cây Erythirina variegata, Ormosia monosperma được phát hiện có tác dụng giết nhiều loài vi khuẩn đường miệng Song và tập thể (2007) phát hiện thấy dịch chiết của cây Polygonum cuspidatum có chứa các hợp chất thuộc nhóm terpenoid, phenolic, glycoside không những có khả năng ức chế sự phát triển S mutans mà còn ức chế sự hình thành mảng

bám răng Vasconcelos và tập thể (2006) phát hiện thấy các hợp chất từ dịch chiết cây xoài và cây neem có tác dụng ức chế sự

phát triển các loài nhóm Streptococcus như S salivarius S mitis và S sanguis Gần đây ở Việt Nam, Nguyễn Thị Mai

Phương và tập thể (2005) đã phát hiện các chất polyphenol trong vỏ cây măng cụt có tác dụng ức chế các enzyme của quá

trình đường phân của S mutans Nhìn chung, các nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn sâu răng của các hợp chất thực vật

chưa đi sâu về cơ chế tác động của chúng lên vi khuẩn gây sâu răng

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

Chủng vi khuẩn S mutans GS-5, S sanguis NCTC-10904, S gordonii ATCC 10558, S rattus FA-1 là quà tặng của giáo

sư Robert E Marquis, Đại học Rochester, New York, Mỹ

Các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân bị sâu răng người Việt Nam (để phân lập vi khuẩn gây sâu răng S mutans) được lấy

từ Khoa Răng Hàm Mặt, Bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội

Các mẫu thực vật Chàm tía (CTI), Hương nhu trắng (HNT), Kim ngân (KNG), Quỷ trâm thảo (QCT), Sài đất (SDA) được thu thập từ Vườn Dược liệu của Đại học Dược Hà Nội Mẫu lá Sắn thuyền (STA) được thu thập từ vườn Thuốc Đông y ở Trung Văn, Từ Liêm, Hà Nội Mẫu vỏ Sao đen (SDE) được thu thập từ tỉnh Đồng Nai Các mẫu thực vật được định tên bởi TS.Trần Đình Nghĩa, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Các hóa chất dùng cho nghiên cứu chủ yếu được mua từ hãng Sigma (Mỹ) có độ tinh sạch dùng cho phân tích

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nuôi cấy và bảo quản tế bào vi khuẩn trên môi trường chứa tryptone 3%, cao nấm men 0,5% glucose 1% và môi trường chứa tryptic soy agar

9

2.2.2 Phân lập vi khuẩn gây sâu răng S mutans từ các bệnh nhân sâu răng người Việt Nam trên môi trường Mitis salivarius

kết hợp nuôi cấy ở pH axit

2.2.3 Nhận dạng vi khuẩn Streptococcus mutans phân lập từ mẫu bệnh nhân sâu răng người Việt Nam bằng phân tích hình

thái kết hợp các phương pháp PCR-RFLP

2.2.4 Nuôi cấy biofilm trên môi trường chứa tryptone, cao nấm men và sucrose

2.2.5 Xác định mức độ sinh axit của vi khuẩn bằng cách đo độ giảm pH môi trường trong điều kiện dư thừa glucose

2.2.6 Xác định độ gây chết vi khuẩn bởi các chất tác dụng thông qua việc đánh giá số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) của

vi khuẩn còn lại (N) sau các khoảng thời gian khác nhau so với số CFU ban dầu (No) Khi đó giá trị D là khoảng thời gian để

có giá trị Log N/No = -1 (tương ứng với mức 90% số vi khuẩn bị giết chết so với ban đầu)

2.2.7 Xác định khả năng chịu axit của các chủng vi khuẩn thông qua việc đếm số CFU sau các khoảng thời gian khác nhau ở

pH thấp

2.2.8 Xác định mức độ tiêu thụ oxy của tế bào trong điều kiện dư thừa glucose bằng điện cực oxy

2.2.9 Xác định hoạt độ một số enzyme chính liên quan đến đặc trưng sinh axit và chịu axit thông qua sự chuyển hóa của các chất đặc hiệu

2.2.10 Xác định thành phần một số hợp chất tự nhiên có trong dịch chiết thực vật bằng các phản ứng đặc trưng

2.2.11 Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất bằng phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) với sự giúp đỡ của Viện hoá học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học Việt Nam

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1 Nghiên cứu sàng lọc một số thực vật có khả năng kháng khuẩn sâu răng

3.1.1 Khả năng ức chế của dịch chiết một số thực vật lên sự sinh axit của S mutans

Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng 7 loài thực vật là: Chàm tía Strobilanthes cusia B (CTI), Hương nhu trắng

Ocimum gratissimum L (HNT), Kim ngân Lonicera japonica T (KNG), Quỷ trâm thảo Bidens pilosa L (QCT), Sài đất Verbesina calendulaceae L (SDA), Sắn thuyền Syzygium resinosum G (STA) và Sao đen Hopea odorata R (SDE) Cả 7 loài

này đều là những cây thuốc có khả năng chống viêm và được ứng dụng trong các bài thuốc dân gian để chữa các bệnh có liên quan đến răng miệng (Đỗ Tất Lợi, 2001; Đỗ Huy Bích và tập thể, 2001) Bộ phận được sử dụng để thu dịch chiết là lá, riêng với Sao đen bộ phận sử dụng là vỏ

Cơ chế gây bệnh sâu răng của S mutans là do tác dụng làm mòn men răng bởi axit được vi khuẩn sinh ra trong quá trình

phân giải đường Do vậy, để xác định tác dụng chống sâu răng của các dịch chiết thực vật, bước đầu chúng tôi tìm hiểu ảnh

hưởng của chúng tới quá trình sinh axit của S mutans Kết quả thu được (bảng 3.2) cho thấy dịch chiết bằng H2O và ethanol

của cả 7 loài thực vật đều có tác dụng ức chế sinh axit của S mutans GS-5, thể hiện ở giá trị pH cuối cùng cao hơn mẫu kiểm

tra không có dịch chiết Dịch chiết bằng ethanol có tác dụng ức chế mạnh hơn, chứng tỏ hoạt chất chính gây ức chế sự sinh

axit của S mutans hoà tan tốt hơn trong ethanol Đặc biệt, dịch chiết ethanol của Sao đen (SDE) và Sắn thuyền (STH) thể hiện khả năng ức chế sự sinh axit tốt nhất Huyền dịch tế bào S mutans sau khi loại bỏ các dịch chiết SDE và STH, vẫn còn tác

dụng ức chế sự sản xuất axit, chứng tỏ tác dụng ức chế là không thuận nghịch Trong điều kiện trên mảng bám răng, các chất

tác dụng thường xuyên bị pha loãng bởi nước bọt, tác dụng ức chế không thuận nghịch sự sinh axit của S mutans của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền có giá trị ứng dụng cao

Bảng 3.2 Tác dụng của một số dịch chiết thực vật lên sự sinh axit của S mutans GS-5

STT Loại dịch chiết

ở nồng độ 10% (w/v)

Giá trị pH cuối cùng Chiết bằng ethanol Chiết bằng nước

Các giá trị sau  là giá trị SD với n =5

3.1.2 Khả năng diệt vi khuẩn S mutans GS-5 bởi các dịch chiết thực vật

Kết quả thí nghiệm diệt khuẩn S mutans GS-5 ở pH 4 (hình 3.5) và pH 7 (hình 3.6) cho thấy ở nồng độ 10%, dịch chiết

cả 7 loài thực vật trong nghiên cứu đều có tác dụng diệt vi khuẩn S mutans GS-5 ở các mức khác nhau Trong đó dịch chiết

KNG, SDE và STH có tác dụng cao hơn so với các dịch chiết còn lại, và tác dụng này ở pH 4 cao hơn ở pH 7, thể hiện ở chỗ thời gian để 90% quần thể tế bào bị tiêu diệt bởi dịch chiết ứng với giá trị D từ 5 đến 7 phút trong khi ở các mẫu dịch chiết

khác giá trị D là trên 10 phút Khả năng diệt S mutans GS-5 của các dịch chiết ở pH 4 cao hơn pH 7 là một điều khá thú vị vì

đây là một tác dụng mong muốn của các hợp chất chống sâu răng, bởi pH thấp (dưới 4) mới có tác dụng bào mòn men răng dẫn đến sâu răng (Gibbons và Van, 1975)

-8 -6 -4 -2 0

-2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0

13

3.1.3 Khả năng ức chế sự hình thành biofilm S mutans GS-5 của các dịch chiết thực vật

Sự hình thành biofilm ở mẫu thí nghiệm kém hơn rõ rệt so với đối chứng Ở mẫu đối chứng vi khuẩn S mutans mọc dày

đặc tạo thành lớp màng bám trên tấm kính, còn mẫu thí nghiệm vi khuẩn mọc thưa và ít hơn So sánh sinh khối tế bào trên biofilm nhận thấy sinh khối biofilm của mẫu thí nghiệm tăng lên ít hơn so với mẫu đối chứng (bảng 3.3) Đặc biệt với mẫu xử

lý bằng dịch chiết Sao đen hay Sắn thuyền, lượng sinh khối tế bào tăng lên tương ứng 12,1% và 20,5% của mẫu đối chứng (tức là sự hình thành biofilm đã bị ức chế tương ứng 87,9% và 79,5%) Đây là phát hiện có ý nghĩa thực tiễn, do có nhiều chất

có tính kháng khuẩn ở dạng huyền dịch nhưng không có tác dụng với các tế bào ở dạng biofilm vì bị hạn chế về khả năng khuyếch tán và rất khó kiểm soát khi sử dụng các chất kháng khuẩn thông thường như hiện nay

Bảng 3.3 Tác dụng của dịch chiết thực vật lên sự hình thành biofilm ở S mutans GS-5

3.1.4 Tác dụng của các dịch chiết thực vật phối hợp với fluo lên S mutans GS-5

Trong các chất kháng khuẩn bảo vệ răng miệng, fluo được Tổ chức Y tế thế giới khuyến cáo sử dụng do vừa có khả năng kháng khuẩn vừa có khả năng tái tạo làm bền men răng Florua natri (NaF) là thành phần chính được sử dụng trong thuốc đánh răng hay nước súc miệng Dựa trên các kết quả nghiên cứu trước đây của Phan và tập thể (2001) về tác dụng của fluo,

chúng tôi đã lựa chọn và sử dụng các dịch chiết với nồng độ 10% phối hợp với NaF ở nồng độ 0,25 mM (thấp hơn nhiều lần nồng độ fluo được sử dụng trong các sản phẩm bảo vệ răng miệng thông thường)

Kết quả trình bày ở bảng 3.4 cho thấy khi phối hợp các dịch chiết với NaF hiệu quả ức chế quá trình sinh axit của tế bào cao hơn khi sử dụng dịch chiết hay NaF ở dạng riêng lẻ thể hiện ở giá trị pH trong các mẫu kết hợp dịch chiết với NaF đều cao hơn mẫu chỉ chứa dịch chiết hay NaF Kết quả ở bảng 3.4 còn cho thấy tác dụng của dịch chiết khi kết hợp với NaF là tương

tự như tác dụng khi phối hợp fluo indomethacin trong nghiên cứu của Belli và tập thể (1995) hay với một số axit yếu khác trong nghiên cứu của Phan và tập thể (2000)

3.1.5 Tác dụng của dịch chiết thực vật phối hợp với H2O2 lên sự sinh axit của S mutans GS-5

Kết quả trình bày ở bảng 3.4 cho thấy khi phối hợp dịch chiết với H2O2 (0,3 mM) tác dụng ức chế sự sinh axit của S

mutans GS-5 cao hơn so với khi sử dụng dịch chiết hay H2O2 ởdạng riêng lẻ Tác dụng này là tương tự như khi phối hợp dịch

chiết với NaF