Nghiên cứu sử dụng lectin để xác định kháng thể và kháng nguyên của một số bệnh ung thư thường gặp

Kháng thể bệnh lí xuất hiện trong đáp ứng miễn dịch thường là một lớp kháng thể riêng biệt biểu hiện bất thường về số lượng và chất lượng, chẳng hạn các kháng thể đã bị cải biến sau tổng

CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN

AFP Alpha-Feto-Protein

ConG Lectin được tinh chế từ

hạt đậu gươm (Canavalia gladiata Jacq D.C.)

ConM Lectin được tinh chế từ

hạt đậu dao biển (Canavalia maritima Aublet)

DOT - BLOT Kỹ thuật chuyển đốm (vết thấm) miễn dịch

ELISA (Enzyme- Linked -

Immunosorbent - Assay) Xét nghiệm miễn dịch hấp phụ liên kết enzyme

HTBT Huyết thanh người bình thường

HTUTG Huyết thanh bệnh nhân ung thư gan

HTĐUTX Huyết thanh bệnh nhân đa u tuỷ xương

HTUTVH Huyết thanh bệnh nhân ung thư vòm họng

Jacalin Lectin được tinh chế từ hạt mít

KN Kháng nguyên

KT Kháng thể

LECTIN-ELISA Kỹ thuật ELISA sử dụng lectin

làm kháng nguyên gắn bản

OD (optical density) Mật độ quang học

PBS (Phosphate-Buffered-Saline) Đệm Phosphate muối

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 1.1 Một số đặc tính cơ bản của 5 lớp kháng thể người 6

Bảng 3.1 Tinh chế lectin mít từ 10g bột hạt mít 42

Bảng 3.2 Hoạt độ ngưng kết hồng cầu của 50l dịch chiết thô ConM trong các

loại đệm khác nhau 43

Bảng 3.3 Hoạt độ ngưng kết hồng cầu của 50l dịch lectin ConM thô khi kết tủa

bằng các chất khác nhau 44

Bảng 3.4 Tinh chế lectin ConM từ 10g bột hạt đậu dao biển 48

Bảng 3.5 Tinh chế lectin ConG từ 10g bột hạt đậu gươm 52

Bảng 3.6 Tinh chế IgA1từ huyết thanh người bình thường và bệnh nhân ung thư 57

Bảng 3.7 Xác định độ nhạy của kỹ thuật LECTIN-ELISA trong định lượng IgA1 65

Hình 3.8 Hàm lượng IgA1từ HT của 40 bệnh nhân đa u tuỷ xương bằng 2 kỹ thuật LECTIN-ELISA và kỹ thuật đo độ đục 67

Bảng 3.9 Tổng kết các mẫu có kết quả hàm lượng IgA1 trùng lặp và sai khác khi sử dụng hai kỹ thuật định lượng LECTIN-ELISA và đo độ đục 67

Bảng 3.10 Tinh chế kháng thể IgG từ huyết thanh người bình thường bằng cột ConM-Sepharose-4B và cột ProteinA-Sepharose-4B 75

Bảng 3.11 Xác định độ nhạy của kỹ thuật LECTIN-ELISA trong định lượng IgG 82

Hình 3.12 Hàm lượng IgG từ HT của 40 bệnh nhân đa u tuỷ xương bằng 2 kỹ thuật LECTIN-ELISA và kỹ thuật đo độ đục 84

Bảng 3.13 Tổng kết các mẫu có hàm lượng IgG trùng lặp và sai khác khi sử dụng

hai kỹ thuật định lượng LECTIN-ELISA và đo độ đục 84

DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Cấu tạo chung của kháng thể 4

Hình 1.2 Cấu trúc đường phân tử AFP ở bệnh nhân ung thư gan 8

Hình 1.3 Cấu trúc đường phân tử AFP ở bệnh nhân viêm gan mạn tính 8

Hình 1.4 Cấu trúc đường phân tử AFP ở bệnh nhân ung thư túi noãn hoàng 8

Hình 1.5 Cấu trúc đường phân tử AFP ở thai phụ 9

Hình 1.6 Cấu trúc chuỗi đường của IgA2 21

Hình 1.7 Cấu trúc chuỗi đường của IgA1 21

Hình 1.8 Cấu trúc không gian của ConM 22

Hình 1.9 Cấu trúc chuỗi đường của IgG 24

Hình 2.1 Quả mít dai (Artocarpus heterophyllus Lamk) 26

Hình 2.2 Quả mít tố nữ (Artocarpus champeden Gagn.) 26

Hình 2.3 Quả mít dại (Artocarpus masticata Gagn.) 26

Hình 2.4 Hạt và quả đậu dao biển (Canavalia maritima Aublet) 27

Hình 2.5 Hạt và quả đậu gươm (Canavalia gladiata Jacq D.C.) 27

Hình 3.1 Quy trình tinh chế lectin mít 39

Hình 3.2 Các phân đoạn lectin mít từ cột sắc kí CM-cellulose 40

Hình 3.3 Điện di SDS - PAGE đánh giá độ tinh sạch của 3 loại jacalin tinh chế từ các hạt mít 41

Hình 3.4 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của lectin ConM 45

Hình 3.5 Các phân đoạn lectin ConM từ cột sắc kí Sephadex-G75 46

Hình 3.6 Điện di SDS - PAGE đánh giá độ tinh sạch của lectin ConM 47

Hình 3.7 Quy trình tinh chế lectin ConM từ

hạt đậu dao biển (Canavalia maritima Aublet) 49

Hình 3.8 Quy trình tinh chế lectin ConG từ hạt đậu gươm (Canavalia gladiata Jacq D.C.) 50

Hình 3.9 Các phân đoạn lectin ConG từ cột sắc kí Sephadex G-75 51

Hình 3.10 Điện di SDS-PAGE đánh giá độ tinh sạch của lectin ConG 51

Hình 3.11 Sơ đồ tạo cột Jacalin-Sepharose-4B 53

Hình 3.12 Quy trình tinh chế IgA1 54

Hình 3.13 Các phân đoạn IgA1từ huyết thanh người bình thường và bệnh nhân ung thư bằng cột sắc kí Jacalin-Sepharose-4B 55

Hình 3.14 Hàm lượng IgA1từ HTBT, HTUTG, HTUTVH sau tinh chế 56

Hình 3.15 Điện di SDS - PAGE đánh giá độ tinh sạch của chế phẩm IgA1 58

Hình 3.16 Đồ thị chuẩn IgA1 59

Hình 3.17 So sánh khả năng bắt giữ IgA1của 3 loại lectin mít và thăm dò độ pha loãng của huyết thanh, nồng độ jacalin gắn bản 61

Hình 3.18 Hiệu suất bắt giữ IgA1của bộ sinh phẩm xét nghiệm LECTIN-ELISA

theo thời gian bảo quản ở 40C 63

Hình 3.19 Đường biểu diễn sự thay đổi hấp phụ quang theo nồng độ IgA1trong

vùng dưới 3,5ng/ml bằng kỹ thuật LECTIN-ELISA 66

Hình 3.20 Hàm lượng kháng thể IgA1trong HTBT và bệnh nhân ung thư khi định lượng bằng kỹ thuật LECTIN-ELISA 68

Hình 3.21 Kết quả bắt giữ IgG của lectin đậu dao biển ConM 71

Hình 3.22 Sơ đồ tạo cột ConM-Sepharose-4B 72

Hình 3.23 Quy trình tinh chế IgG 73

Hình 3.24 Các phân đoạn IgG từ cột sắc kí ConM-Sepharose-4B và cột ProteinA-Sepharose-4B 74

Hình 3.25 Điện di SDS - PAGE đánh giá độ tinh sạch của chế phẩm IgG 76

Hình 3.26 Đồ thị chuẩn IgG 77

Hình 3.27 Thăm dò độ pha loãng của HT và nồng độ ConM gắn bản 78

Hình 3.28 Hiệu suất bắt giữ IgG của bộ sinh phẩm xét nghiệm LECTIN-ELISA

theo thời gian bảo quản ở 40C 80

Hình 3.29 Đường biểu diễn sự thay đổi hấp phụ quang theo nồng độ IgG trong vùng dưới 3,5ng/ml bằng kỹ thuật LECTIN-ELISA 83

Hình 3.30 Hàm lượng IgG trong HTBT và bệnh lí khi định lượng bằng kỹ thuật LECTIN-ELISA 85

Hình 3.31 ConG bắt giữ AFP 87

Hình 3.32 ConG bắt giữ IgG 88

Hình 3.33 Lectin đậu gươm ConG nhận dạng các kháng nguyên AFP từ huyết

thanh bệnh nhân ung thư gan, viêm gan siêu vi trùng và thai phụ 90

MỤC LỤC

Trang

CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 KHÁNG THỂ DỊCH THỂ 3

1.1.1 Khái niệm 3

1.1.2 Cấu trúc chung của các kháng thể 3

1.1.3 Chức năng sinh học của kháng thể 4

1.1.4 Lớp và các phân lớp của kháng thể 5

1.1.5 Biểu hiện bất thường của kháng thể trong bệnh lí 6

1.2 AFP và UNG THƯ 7

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu và sự biến đổi sinh lí của AFP huyết thanh 7

1.2.2 Tính không đồng nhất trong chuỗi đường của các loại AFP 8

1.2.3 Chức năng của AFP 9

1.2.4 Hàm lượng AFP huyết thanh ở bệnh gan mạn tính và một số bệnh khác 10

1.3 LECTIN 11

1.3.1 Lược sử nghiên cứu lectin 11

1.3.2 Sự phân bố của lectin trong sinh giới 14

1.3.3 Một số tính chất lí hoá của lectin 15

1.3.4 Một số tính chất sinh học và miễn dịch của lectin 18

1.3.5 Ứng dụng của lectin 20

1.3.6 Vài nét về nghiên cứu lectin ở Việt Nam 24

Chương 2 NGUYÊN LIỆU và PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 NGUYÊN LIỆU 26

2.1.1 Hạt mít 26

2.1.2 Hạt đậu 27

2.1.3 Huyết thanh, hồng cầu người 27

2.2 HOÁ CHẤT và THIẾT BỊ 28

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.3.1 Xác định hoạt độ lectin 28

2.3.2 Xác định hàm lượng protein 29

2.3.3 Tinh chế lectin 30

2.3.4 Điều chế các cột sắc kí ái lực 31

2.3.5 Tinh chế kháng thể 32

2.3.6 Kỹ thuật ELISA 33

2.3.7 Kỹ thuật thẩm tách miễn dịch (Western blotting) 36

2.3.8 Kỹ thuật điện di 37

Chương 3 KẾT QUẢ và BÀN LUẬN 38

3.1.TINH CHẾ LECTIN JACALIN TỪ BA LOÀI MÍT (A heterophyllus Lamk; A chempeden Gagn và A masticata Gagn.), LECTIN ConM TỪ HẠT ĐẬU DAO BIỂN (Canavalia maritima Aublet) và LECTIN ConG TỪ HẠT ĐẬU GƯƠM (Canavalia gladiata Jacq D.C.) 38

3.1.1 Tinh chế lectin jacalin từ ba loài mít (A heterophyllus Lamk; A chempeden Gagn và A masticata Gagn.) 38

3.1.2 Tinh chế lectin ConM từ hạt đậu dao biển (Canavalia maritima Aublet) 43

3.1.3 Tinh chế lectin ConG từ hạt đậu gươm (Canavalia gladiata Jacq D.C.) 50

3.2 BƯỚC ĐẦU SỬ DỤNG LECTIN MÍT ĐỂ TẠO BỘ SINH PHẨM XÁC ĐỊNH IgA 1 TỪ HUYẾT THANH NGƯỜI 53

3.2.1 Tinh chế IgA1 bằng cột Jacalin-Sepharose-4B tự chế tạo 54

3.2.2 Thiết kế bộ sinh phẩm định lượng IgA1 bằng kỹ thuật LECTIN-ELISA 59

3.2.3 Định lượng IgA1 trong HT người bằng kỹ thuật LECTIN-ELISA 68

3.3 BƯỚC ĐẦU SỬ DỤNG LECTIN ConM ĐỂ TẠO BỘ SINH PHẨM XÁC ĐỊNH IgG TỪ HUYẾT THANH NGƯỜI 70

3.3.1 Nghiên cứu khả năng bắt giữ kháng thể IgG từ huyết thanh của ConM 70

3.3.2 Tinh chế kháng thể IgG từ huyết thanh người bằng cột ConM-Sepharose-4B tự tạo 72

3.3.3 Thiết kế bộ sinh phẩm định lượng IgG từ huyết thanh bằng kỹ thuật

LECTIN- ELISA 77

3.3.4 Sử dụng lectin ConM xác định hàm lượng KT IgG bằng kỹ thuật LECTIN-ELISA 85

3.4 ỨNG DỤNG LECTIN ConG TỪ HẠT ĐẬU GƯƠM (Canavalia gladiata Jacq D.C.) ĐỂ BẮT GIỮ, PHÂN BIỆT CÁC LOẠI KHÁNG NGUYÊN AFP TỪ HUYẾT THANH NGƯỜI UNG THƯ GAN, VIÊM GAN SIÊU VI TRÙNG VÀ THAI PHỤ 87

3.4.1 Nghiên cứu khả năng bắt giữ AFP của lectin ConG từ hạt đậu gươm

(Canavalia gladiata Jacq D.C.) 87

3.4.2 Nghiên cứu khả năng bắt giữ kháng thể trong huyết thanh của ConG 88

3.4.3 Sử dụng lectin ConG để nhận dạng các kháng nguyên AFP bệnh lí 89

3.5 BÀN LUẬN 91

KẾT LUẬN 96

ĐỀ NGHỊ 98

CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 99

TÀI LIỆU THAM KHẢO 100

PHỤ LỤC 110

MỞ ĐẦU

Sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể người bình thường và của các bệnh nhân nhiễm trùng, đặc biệt là các bệnh nhân ung thư rất đa dạng và phức tạp Khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể được biểu hiện là sự tăng cường tổng hợp kháng thể hoặc xuất hiện một số kháng nguyên chỉ thị bệnh đã được nhiều nhà khoa học Y học quan tâm nghiên cứu Mục đích của các nghiên cứu theo hướng này là xác định sự biểu hiện bất thường của một số kháng thể và kháng nguyên chỉ thị bệnh nhằm chẩn đoán bệnh sớm, theo dõi điều trị giúp cho chữa bệnh kịp thời và hiệu quả

Có rất nhiều phương pháp và kỹ thuật xét nghiệm được sử dụng để nghiên cứu sự thay đổi đáp ứng đó như: ELISA, RIA, DOT-BLOT, Western BLOT, các

kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch sử dụng kháng thể đặc hiệu nhận biết các kháng nguyên bệnh hoặc nhận biết các kháng thể bệnh lí xuất hiện, Kháng thể bệnh lí xuất hiện trong đáp ứng miễn dịch thường là một lớp kháng thể riêng biệt biểu hiện bất thường về số lượng và chất lượng, chẳng hạn các kháng thể đã bị cải biến sau tổng hợp như thoái hoá hoặc tăng khả năng glycosyl hoá (loại bỏ hoặc gắn thêm các gốc đường), thậm chí có sự thay đổi thoái hoá đứt gãy cấu trúc hoá học protein của phân tử (như mảnh peptide Bence-Jones chuỗi nhẹ ở bệnh ung thư đa u tuỷ xương dòng tế bào B)…Tất cả những thay đổi về đáp ứng miễn dịch

và hoá sinh cần phải được phân tích chính xác và bằng những kỹ thuật xét nghiệm đặc hiệu để phát hiện sớm sự biểu hiện của bệnh

Lectin, một dạng glycoprotein tự nhiên có mặt rất phổ biến ở nhiều nguồn tài nguyên sinh vật như động vật, thực vật và vi sinh vật đã được các nhà khoa học phát hiện và nghiên cứu từ trên 100 năm nay (từ năm 1888) Trong nhiều năm nghiên cứu, các nhà khoa học đã chứng minh lectin có rất nhiều ứng dụng trong Y dược học Đặc biệt trong những năm cuối cùng của thể kỉ XX, người ta đã sử dụng sự tương tác đặc hiệu rất tinh vi của lectin với các kháng thể và kháng nguyên (do bản chất hoá học của lectin là những protein liên kết đặc hiệu với các gốc đường của nhiều loại kháng thể và kháng nguyên có cấu trúc đường riêng biệt) để nghiên cứu

sự biểu hiện của kháng thể, kháng nguyên trong đáp ứng miễn dịch

Mục tiêu đề tài

Lựa chọn, tinh chế một số loại lectin từ thực vật tương tác đặc hiệu với kháng thể, kháng nguyên để xác định sự biểu hiện của kháng thể IgA1, IgG và kháng nguyên AFP từ huyết thanh của người bình thường, một số bệnh nhân: Ung thư vòm họng, đa u tuỷ xương, ung thư gan và viêm gan siêu vi trùng

Nội dung của đề tài

1 Tinh chế lectin (jacalin) từ 3 loài mít (Artocarpus heterophyllus Lamk; Artocarpus masticata Gagn và Artocarpus champeden Gagn.) của Việt Nam và sử

dụng jacalin để thiết kế bộ sinh phẩm định lượng kháng thể IgA1 từ huyết thanh người

2 Xây dựng quy trình, tinh chế lectin ConM, ConG từ 2 loài đậu (Canavalia maritima Aublet và Canavalia gladiata Jacq D.C.) của Việt Nam để thiết kế bộ sinh

phẩm định lượng kháng thể IgG từ huyết thanh người, phân biệt kháng nguyên AFP (Alpha Feto Protein) của bệnh nhân ung thư gan, viêm gan siêu vi trùng và thai phụ

Những đóng góp mới của luận án

1 Lần đầu tiên phát hiện ra lectin ConM từ hạt đậu dao biển Việt Nam

(Canavalia maritima Aublet) có khả năng bắt giữ đặc hiệu với kháng thể IgG từ

huyết thanh người

2 Lần đầu tiên phát hiện ra lectin ConG từ hạt đậu gươm Việt Nam (Canavalia gladiata Jacq D.C.) có khả năng bắt giữ và phân biệt được các loại kháng nguyên

AFP từ huyết thanh bệnh nhân ung thư gan, viêm gan siêu vi trùng và thai phụ

3 Bước đầu nghiên cứu tạo hai bộ sinh phẩm để định lượng kháng thể IgA1, IgG từ huyết thanh người và nghiên cứu điều kiện bảo quản bộ sinh phẩm trong thời gian 4 tháng vẫn cho giá trị sử dụng

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1 Nghiên cứu hoàn thiện quy trình tinh chế lectin ConM từ hạt đậu dao biển

Việt Nam (Canavalia maritima Aublet) và đặc tính liên kết đặc hiệu giữa lectin

ConM với kháng thể IgG từ huyết thanh người

2 Tinh chế lectin ConG từ hạt đậu gươm Việt Nam (Canavalia gladiata Jacq

D.C.) và chứng minh được các isolectin ConG nhận biết riêng biệt 3 dạng kháng nguyên AFP của bệnh nhân ung thư gan, viêm gan siêu vi trùng và của thai phụ

3 Đã bước đầu thiết kế được 2 bộ sinh phẩm LECTIN-ELISA (Jacalin-ELISA

và ConM-ELISA) để định lượng kháng thể IgA1 và IgG

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 KHÁNG THỂ DỊCH THỂ

1.1.1 Khái niệm

Trong quá trình đáp ứng miễn dịch của cơ thể, khi những tế bào bạch cầu của hệ miễn dịch nhận thông tin được tiếp xúc với kháng nguyên (KN) sẽ sản xuất ra những chất đặc hiệu chống lại KN ấy Những chất đó được gọi là kháng thể (KT), hay globulin miễn dịch (Immuno globulin, viết tắt là Ig) Loại KT thứ nhất được đổ vào dịch nội môi, đó là KT dịch thể, loại KT này do tế bào plasma dạng biệt hoá sau cùng

của tế bào B sản xuất Loại KT thứ hai nằm ngay trên màng của những tế bào B sinh

ra nó, đó là KT màng tế bào và đóng vai trò thụ thể của những tế bào này Phản ứng kháng thể với kháng nguyên có tính đặc hiệu hoá học cao Ở người có 5 lớp kháng thể là IgG, IgA, IgM, IgD và IgE [1]

Hàm lượng các lớp kháng thể trong hệ thống dịch thể của cơ thể phụ thuộc vào trạng thái sinh lí, tuổi, giới tính, điều kiện địa lí Ngoài ra còn có một số mối quan hệ về số lượng và chất lượng của các KT đối với sự biểu hiện bệnh lí như: Một

số bệnh ung thư, nhiễm trùng và một số bệnh tự miễn Trong huyết thanh, thành phần kháng thể chiếm khoảng 20% tổng lượng protein Ngày nay nhờ những tiến bộ trong lĩnh vực sinh học phân tử, người ta đã hiểu ngày càng sâu và đầy đủ về cấu trúc, chức năng của các phân tử KT [15],[35]

1.1.2 Cấu trúc chung của các kháng thể

Tất cả các KT đều có bản chất là glycoprotein, mỗi phân tử đều có 2 chuỗi nhẹ

và 2 chuỗi nặng [36]

* Hai chuỗi nhẹ (ngắn) kí hiệu là chuỗi L (light chain) có khối lượng phân tử

khoảng 25-28 kDa, mỗi chuỗi có khoảng 221- 312 amino acid Chuỗi L gồm 2 loại

là  hoặc 

Chuỗi nhẹ được hình thành từ hai vùng khu vực là khu vực không biến đổi (C hoặc C ) và khu vực dễ biến đổi (V và V):

- Vùng không biến đổi có các gốc amino acid từ vị trí 108 đến tận cùng C, rất

ít thay đổi về thành phần và trật tự sắp xếp các amino acid

- Vùng biến đổi có thứ tự amino acid từ vị trí 107 đến tận cùng N của chuỗi polypeptide

* Hai chuỗi nặng (dài) được kí hiệu là chuỗi H (heavy chain), mang tính chất

đặc trưng riêng của từng lớp KT Khối lượng phân tử khoảng 50-57 kDa, mỗi chuỗi chứa 440 - 460 amino acid Chuỗi nặng gồm khu vực N tận cùng dễ biến đổi (VH)

và 3 khu vực không biến đổi CH (đối với IgD, IgG và IgA) hoặc 4 khu vực không biến đổi (đối với IgM và IgE) Khu vực không biến đổi của chuỗi nặng kí hiệu là

CH Mỗi một khu vực biến đổi gồm 3 vùng siêu biến (hypervariable), còn gọi là các

vùng xác định bổ sung (CDR) Các paratop được hình thành từ những vị trí đặt kề nhau trong khoảng không của các vùng siêu biến được tách biệt nhau bằng hai vùng

bảo thủ hơn (hoặc các vùng khuôn) Vùng nằm giữa hai khu vực CH1 và CH2 của chuỗi H được gọi là vùng khớp hay vùng bản lề, đảm bảo cho tính mềm dẻo của các phân tử KT, đồng thời hai cánh tay (VL, CL,VH, CH1) của phân tử có thể di động trong không gian

Các chuỗi nặng của KT luôn luôn được kết hợp với các gốc đường ở các vị trí khác nhau Nhìn chung, các gốc đường kết hợp với KT là các oligosaccharide có chứa một hoặc nhiều gốc sialic acid Ở cùng một chuỗi nặng có thể có sự khác nhau

về kiểu kết hợp với các gốc đường, từ đó sẽ tạo ra mức độ bổ sung cho tính chất khác biệt phân tử của các KT Chẳng hạn, cấu trúc đường của IgG khác với IgA và IgD, cấu trúc đường của phân lớp IgA1 khác với IgA2 Sự thay đổi bất thường của

các gốc đường này sẽ gây ra một số bệnh tự miễn (autoimmune disease) hoặc biểu

hiện của bệnh ung thư [15],[47],[71]

1.1.3 Chức năng sinh học của kháng thể

Hình 1.1 Cấu tạo chung của kháng thể

Chức năng sinh học của phân tử KT trong hệ thống miễn dịch là nhận biết "cái lạ" được gọi chung là kháng nguyên ngoại lai và tác động lên "cái lạ" đó[67]

Vùng V là vị trí của phân tử KT làm nhiệm vụ nhận biết "cái lạ" còn vùng C làm nhiệm vụ tương tác với các phân tử, tế bào khác để hoàn thành một cách có hiệu quả việc loại trừ yếu tố lạ

1.1.3.1 Chức năng nhận biết kháng nguyên

Chức năng nhận biết của kháng thể được thực hiện thông qua việc phân tử KT

kết hợp đặc hiệu với nhóm quyết định kháng nguyên (epitop) Vị trí kết hợp nằm ở vùng V của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, đầu tận cùng - NH2 Ở đó chuỗi polypeptide được gấp lại và tạo ra cấu trúc nếp gấp, trong đó có những đoạn tương đối ổn định xen giữa những vòng cực kì thay đổi Những vòng này cụm sát lại gần nhau ở đầu mút (tận cùng N) tạo ra một cái túi trong đó các phân tử nhỏ của nhóm quyết định kháng nguyên có thể lọt khít vào

Nhờ khả năng kết hợp đặc hiệu mà KT có thể tác động trực tiếp lên KN, ví dụ như trường hợp trung hoà độc tố hoà tan do vi khuẩn tiết ra Bằng cách kết hợp với các quyết định KN nằm trong hoặc gần vị trí hoạt động của độc tố, các phân tử KT phong bế phản ứng của độc tố với cơ thể Sự kết hợp kháng thể với các quyết định kháng nguyên sẽ làm thay đổi cấu hình không gian của độc tố, làm thay đổi hoạt tính

và độc tố không thể bám vào tế bào của tổ chức đích Tác dụng trực tiếp cũng có thể xảy ra khi 2 cánh tay Fab của phân tử KT tạo ra mạng lưới ngưng kết đối với vi khuẩn, kí sinh trùng,… nhờ đó hạn chế khả năng gây bệnh của chúng

1.1.3.2 Chức năng sinh học có hiệu quả thứ phát của kháng thể

Các chức năng sinh học có hiệu quả khác của KT được xem như chức năng thứ phát, vì nó xảy ra sau khi domain V kết hợp đặc hiệu với KN Các chức năng này được thực hiện thông qua trung gian mảnh Fc của phân tử KT

+ Chức năng hoạt hoá bổ thể: KT kết hợp đặc hiệu với KN hình thành phức

hợp KN- KT Việc kết hợp với kháng nguyên đã làm thay đổi cấu hình không gian của phân tử KT và bộc lộ vị trí kết hợp bổ thể Khả năng hoạt hoá bổ thể chỉ có ở IgG và IgM, nhưng không phải tất cả đều như nhau mà phụ thuộc vào cấu trúc của mỗi loại

+ Tương tác với các tế bào khác:

Phần Fc của KT có khả năng gắn vào thụ thể (receptor) trên bề mặt một số tế bào như tế bào mast, bạch cầu ái kiềm, các đại thực bào và bạch cầu trung tính

Phần Fab của KT để nhận biết, kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên lạ, trên cơ sở

đó kháng nguyên bị bao vây, khu trú lại

1.1.4 Lớp và các phân lớp của kháng thể

Căn cứ vào đặc điểm cấu tạo phân tử của các chuỗi nặng người ta phân ra làm 5 lớp KT: Chuỗi nặng gamma () cho IgG, chuỗi nặng alpha () cho IgA, chuỗi nặng muy () cho IgM, chuỗi nặng delta () cho IgD, chuỗi nặng epsilon () cho IgE

Bảng 1.1 Một số đặc tính cơ bản của 5 lớp kháng thể người[15]

Nồng độ trong huyết thanh (mg/100ml)

IgM

970, dạng

pentame

IgD 175 <10 Chủ yếu tìm thấy ở tế bào B, có thể khi tiếp

xúc với KN, truyền tín hiệu hoạt hoá tế bào B

IgE 190 <0,03 Tham gia phản ứng viêm dị ứng, quá mẫn

khi liên kết với tế bào mast

1.1.5 Biểu hiện bất thường của kháng thể trong bệnh lí

+ Biểu hiện bất thường thứ nhất là: Hàm lượng KT đơn dòng trong huyết

thanh tăng lên nhanh chóng ở nhiều bệnh ung thư Các KT đơn dòng biểu hiện thường là IgG và IgM, nhưng cũng có thể là IgA (ví dụ bệnh đa u tuỷ xương dòng IgA, bệnh ung thư cổ tử cung) Đôi khi sự tăng các KT đơn dòng cũng được thấy

đối với các lớp kháng thể IgD và IgE, nhưng rất hiếm Đối với các dưới lớp IgG thì các đơn dòng tăng ưu thế là IgG1> IgG2> IgG3> IgG4

Biểu hiện tăng đơn dòng của các KT còn thấy rõ ở tính bất thường trong cấu trúc của kháng thể Đó là sự tổng hợp quá mức các mảnh protein chuỗi nhẹ dạng dimer là protein Bence-Jones (BJP), có thể phát hiện được dễ dàng trong điện di lớp mỏng agarose [15],[28]

+ Biểu hiện bất thường thứ hai là: Sự thay đổi cấu trúc đường của phân tử KT

Việc nghiên cứu cấu trúc phân tử KT trong bệnh ung thư (tăng sinh miễn dịch) cho phép hiểu được sự thay đổi cấu trúc đường của các đơn vị dòng IgA và IgG Bệnh biểu hiện rõ nhất là chuỗi nặng  (của IgA) đơn dòng có mức độ kết hợp đường rất cao (glycosylation), nghĩa là ở chuỗi nặng được gắn thêm các gốc đường Hậu quả của bệnh chuỗi nặng của IgA trong bệnh đa u tuỷ xương đã tạo ra sự đóng cặn nhiều chuỗi nặng ở tiểu cầu thận, gây tổn thương thận nghiêm trọng Sự thay đổi cấu trúc đường của một số IgA, IgG làm biến đổi đặc tính ái lực hoá học của kháng thể đối với một số hoạt chất tự nhiên, đặc biệt là các lectin có nguồn gốc từ động vật hoặc thực vật Đó là những nghiên cứu của Allen A.C và các cộng sự [41] về sự thay đổi cấu trúc đường của phân tử KT IgA1 trong bệnh viêm cầu thận

Sự thay đổi cấu trúc đường của các IgG trong bệnh đa u tuỷ xương cũng đã được chứng minh Trên phân tử IgG của bệnh nhân đa u tuỷ xương có gắn thêm 2 phân tử đường trên chuỗi nặng, nhưng thiếu hụt sialic acid và không có nhóm Glc-NAc-1 Sự biến đổi các chuỗi đường này xảy ra ở protein Bence-Jones (BJP), bắt nguồn từ phân tử IgG và ở cả các chuỗi nặng của IgA trong một số bệnh ung thư [41] Như vậy, những biểu hiện của các kháng thể đơn dòng cũng có thể được sử dụng để theo dõi tình trạng bệnh ung thư bằng các loại lectin gây ngưng kết đặc hiệu đường đối với chúng, giúp cho việc phân biệt các loại bệnh ung thư khác nhau cũng như các bệnh truyền nhiễm khác

1.2 AFP VÀ UNG THƯ

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu và sự biến đổi sinh lí của AFP huyết thanh

Năm 1963, Abelev G.I.[38] tìm thấy AFP ở chuột nhắt bị ung thư gan trong thực nghiệm Một năm sau, Tatarinov Y.S.[97] lần đầu tiên tìm thấy AFP ở bệnh nhân ung thư gan và từ đó trở đi AFP trở thành một dấu ấn ung thư đầu tiên được ứng dụng rộng rãi giúp chẩn đoán ung thư gan AFP người là một glycoprotein có

cấu trúc phân tử là một chuỗi polypeptide khối lượng phân tử vào khoảng 70 kDa

và chứa 4% carbohydrate

Phân tử AFP là một chuỗi polypeptide gồm 550 amino acid, tạo thành 3 domain Dựa vào KT đơn dòng người ta đã phát hiện trong phân tử AFP có 7 epitop, ngoài ra AFP còn mang những epitop là các oligosaccharide liên kết với chuỗi polypeptide trong phân tử AFP Những epitop loại này được phát hiện bởi khả năng liên kết đặc hiệu của nó với các loại lectin như Lens hoặc ConA

1.2.2 Tính không đồng nhất trong chuỗi đường của các loại AFP

Cuối thập kỷ 80 của thế kỷ XX, thông qua các kỹ thuật như: Điện di gel tinh bột, điện di gel thạch, sắc kí, điện di AFP ái lực với lectin và thấm ái lực KT, người ta đã tìm thấy sự khác nhau về thành phần carbohydrate trong phân tử AFP và đó chính là tính không đồng nhất trong phân tử AFP[70] Sự có mặt và sự thay đổi các thành phần carbohydrate, mà cụ thể là sự thay đổi của các nhóm Fucose và N-Acetylglucosamine trong phân tử AFP sẽ quyết định tới ái lực của nó với lectin (hình 1.2; 1.3; 1.4) Trong khi đó AFP của thai phụ phần cấu trúc đường khác hẳn so với AFP bệnh lí, ở chúng luôn có mặt các gốc NeuAc (hình 1.5) Ở những tình trạng bệnh gan khác nhau, sự chuyển biến từ bệnh gan lành tính (viêm gan mạn, xơ gan ) sang bệnh ung thư gan ác tính có liên quan chặt chẽ tới biến đổi cấu trúc đường của phân tử AFP và có ảnh hưởng tới ái lực của AFP với lectin trong kỹ thuật điện di Sau đây là một số dạng cấu trúc đường của AFP:

Gal 1 4GlcNAc1 2Man1

Gal 1 4GlcNAc1 2Man1

Man1 4GlcNAc1 4GlcNA1 Asn

Fu1

Hình 1.2 Cấu trúc đường phân tử AFP ở bệnh nhân ung thư gan[70]

Gal 1 4GlcNAc1 2Man1

Gal 1 4GlcNAc1 2Man1

Man1 4GlcNAc1 4GlcNA1 Asn

Hình 1.3 Cấu trúcđường phân tử AFP ở bệnh nhân viêm gan mạn

tính[70]

1.2.3 Chức năng của AFP

Cho tới nay chức năng của AFP chưa được biết đầy đủ, tuy nhiên có nhiều giả thuyết cho vấn đề này:

- AFP có chức năng vận chuyển như một protein tải hoặc duy trì áp lực keo trong huyết thanh bào thai giống như albumin ở cơ thể trưởng thành

- AFP tham gia vận chuyển các acid béo nhiều liên kết đôi trong tế bào ung thư cơ vân chuột cống Đây là một yếu tố quan trọng trong chuyển hoá của bào thai

và trong một số bệnh lý, đặc biệt là ung thư

- Người ta cũng đã phát hiện thấy chức năng gắn và vận chuyển của AFP đối với một số cấu tử gắn (ligand) như flavonoid, steroid, phenylbutazone…[78]

- AFP có khả năng gắn kết với một số phân tử sinh học như bilirubin, hormone thyroid, đặc biệt là AFP người có hoạt tính kháng estrogen Điều này cho phép giải thích vai trò bảo vệ bào thai trong việc phát triển tế bào gan ở thời kì bào thai của động vật bậc cao do AFP phong bế tác dụng của estrogen có nguồn gốc từ mẹ[48],[49]

- Một số tác giả cho thấy AFP có vai trò ức chế một số đáp ứng miễn dịch in vitro: AFP phân lập từ nước ối của chuột nhắt có khả năng ức chế phản ứng chuyển

Man1 4GlcNAc1 4GlcNA1 Asn

Hình 1.5 Cấu trúc đường phân tử AFP ở thai phụ[102]

GlcNAc1

NeuAc2 Galc1 4GlcNAc1 2Man1

NeuAc2 Galc1 4GlcNAc1 2Man1

Man1 4GlcNAc1 4GlcNA1 Asn NeuAc2 Galc1 4GlcNAc1 2Man1

NeuAc2 Galc1 4GlcNAc1 2Man1

Gal 1 4GlcNAc1 2Man1

Gal 1 4GlcNAc1 2Man1

Man1 4GlcNAc1 4GlcNA1 Asn

Hình 1.4 Cấu trúc đường phân tử AFP ở bệnh nhân ung thư túi noãn hoàng [103]

GlcNAc1

dạng tế bào lympho gây ra bởi các chất kích thích phân bào in vitro, hoặc do nuôi

cấy hỗn hợp lympho bào từ 2 cơ thể khác nhau cũng như ức chế đáp ứng tạo KT lần

1 và lần 2 [94],[97]

1.2.4 Hàm lượng AFP huyết thanh ở bệnh gan mạn tính và một số bệnh khác

AFP trong ung thư là một vấn đề hấp dẫn nhiều nhà nghiên cứu Lúc đầu người ta chỉ tập trung vào mức độ thay đổi hàm lượng AFP của huyết thanh Nhưng

về sau, nhờ tạo các mô hình ung thư thực nghiệm trong nuôi cấy tế bào ung thư in vitro người ta đã hiểu biết thêm về AFP và sự tồn tại của receptor AFP trên tế bào

ung thư

Ở Việt Nam, nồng độ AFP của người trưởng thành khoẻ mạnh là 2,871,97ng/ml Trong điều kiện sinh lí bình thường thì nồng độ AFP ở nam giới cao hơn nữ giới và cũng tăng dần theo tuổi nhưng không nhiều[13]

Năm 1964, Tatarinov và cộng sự đã phát hiện thấy AFP tăng cao trong huyết thanh bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan, từ đó ở nhiều nước trên thế giới người

ta đã sử dụng xét nghiệm AFP huyết thanh để chẩn đoán, theo dõi kết quả điều trị

và tiên lượng cho bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan Đặc biệt phương pháp này

có giá trị để chẩn đoán sàng lọc sớm bệnh ung thư biểu mô tế bào gan khi các triệu chứng lâm sàng chưa biểu hiện đầy đủ và rõ ràng [5],[13],[99]

AFP không chỉ tăng trong ung thư gan, mà còn tăng trong một số bệnh ung thư khác như: Ung thư buồng trứng, tinh hoàn, dạ dày, đại tràng, phổi Tuy nhiên vai trò của AFP ở các bệnh ung thư ngoài gan chưa được nghiên cứu đầy đủ[39]

AFP huyết thanh không chỉ tăng trong ung thư gan mà còn tăng nhẹ trong các bệnh gan mạn tính Các công trình nghiên cứu trên thế giới cũng như ở Việt Nam đều cho thấy nồng độ AFP huyết thanh ở bệnh nhân ung thư gan tăng cao một cách đáng kể

Nồng độ AFP huyết thanh tỷ lệ thuận với kích thước của khối u Nồng độ này giảm dần khi kích thước của khối u nhỏ đi Nomura và cộng sự [83] đã xác định nồng độ AFP huyết thanh của 606 bệnh nhân ung thư gan với các kích thước khối u khác nhau, kết quả cho thấy với kích thước khối u nhỏ hơn 3 cm thì độ nhạy AFP chỉ còn là 59,6% Tuy nhiên vẫn có khoảng 6,4 % bệnh nhân với khối u nhỏ (dưới 2 cm) mà nồng độ AFP huyết thanh vẫn cao (từ 1000-5000ng/ml) Nhiều tác giả cũng

đã nghiên cứu về mối liên quan giữa nồng độ AFP huyết thanh với độ biệt hoá của

tế bào gan Kết quả cho thấy nồng độ AFP huyết thanh trong các trường hợp ung

thư gan có độ biệt hóa tế bào thấp (Poorly differentiated HCC) và độ biệt hoá vừa (Moderate differentiated HCC) tăng cao hơn so với ung thư gan có độ biệt hoá cao (Well differentiated HCC) Mặt khác ở bệnh nhân ung thư gan có kích thước khối u

nhỏ (nhỏ hơn 2 cm) thường lại có độ biệt hoá cao Do vậy trong việc tiên lượng bệnh mức độ biệt hoá của các tế bào quan trọng hơn kích thước khối u ung thư gan Thời gian sống của những bệnh nhân ung thư gan có nồng độ AFP huyết thanh tăng cao thường là ngắn hơn so với bệnh nhân có nồng độ AFP huyết thanh thấp Nomura F và cộng sự [83] còn thấy rằng nồng độ AFP huyết thanh ở bệnh nhân ung thư gan có kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B [HBsAg(+)] cao hơn so với nồng độ AFP huyết thanh ở bệnh nhân ung thư gan không có kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B [HBsAg(-)]

Nhiều tác giả đã đề cập đến vai trò của AFP huyết thanh trong việc chẩn đoán, theo dõi và tiên lượng kết quả điều trị (phẫu thuật, hoá chất ) ở bệnh nhân bị ung thư gan [13], [81] Sau khi điều trị, nếu nồng độ AFP huyết thanh giảm xuống hoặc trở về bình thường chứng tỏ việc điều trị có kết quả Ngược lại nếu nồng độ AFP huyết thanh không giảm hoặc lại tăng cao hơn trước khi điều trị thì chứng tỏ điều trị không

có hiệu quả Trường hợp sau điều trị nồng độ AFP huyết thanh đang giảm thấp nhưng sau đó tăng cao, chứng tỏ là ung thư tái phát Tuy nhiên, hiện tượng này không hoàn toàn đúng với mọi trường hợp Hiện nay đã có marker liên kết lectin đặc hiệu hơn (AFP- L3) để kiểm tra thực trạng trong trường hợp này [98],[99],[100],[102]

Giá trị của xét nghiệm AFP huyết thanh trong việc phát hiện sớm ung thư gan

ở các bệnh nhân viêm gan mạn tính, đặc biệt là các bệnh nhân có nồng độ AFP huyết thanh tăng cao cũng được nhiều tác giả nghiên cứu[9]

Tóm lại: AFP huyết thanh là một dấu ấn ung thư hữu ích giúp chẩn đoán ung thư gan Tuy nhiên, điều đáng chú ý nhất là vẫn có một số bệnh nhân ung thư gan

có AFP không tăng (<20ng/ml) và trong giai đoạn đầu ung thư gan (khi khối u còn nhỏ) hàm lượng AFP huyết thanh thấp hoặc không tăng Những đặc điểm này của AFP đã hạn chế khả năng chẩn đoán chính xác, làm giảm độ nhạy cũng như độ đặc hiệu trong chẩn đoán ung thư gan

Vì vậy nếu chỉ dựa vào việc định lượng AFP huyết thanh (kể cả thêm siêu âm) thì sẽ cho hiệu quả thấp trong việc chẩn đoán sớm bệnh ung thư gan Do đó cần phải kết hợp với những kỹ thuật xét nghiệm khác cùng với AFP huyết thanh [68]

1.3 LECTIN

1.3.1 Lược sử nghiên cứu lectin

Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học (bioactive compounds) từ các cơ thể sinh vật như các chất có hoạt tính kháng sinh, các hormone, các độc tố có ứng dụng trong thực tiễn, các enzyme và các chất kìm hãm enzyme từ nguồn động thực vật và vi sinh vật v.v… phát triển rất mạnh Lectin, một chất có hoạt tính sinh học được phát hiện từ hơn một thế kỷ nay (từ năm 1888)

đã và đang được nghiên cứu mạnh mẽ, sâu sắc về cấu trúc và chức năng của chúng Vậy lectin là gì? Tại sao các nhà Sinh học và Y học lại đặc biệt quan tâm đến chúng?

Vào những năm 1887 và 1888 tại phòng thí nghiệm Kobert của trường Đại

học Dorpat, trên đối tượng là cây thầu dầu (Ricinus communis L.), Stillmark[69] đã

chiết xuất được chất có khả năng ngưng kết tế bào hồng cầu người, làm mất chức năng vận chuyển oxy của chúng Đó là một chất độc và ông gọi là ricin Khi công trình được công bố, ricin được đông đảo các nhà Sinh học và Y học đặc biệt quan tâm[72] Sau đó cũng chính nhà khoa học Stillmark lại tìm thấy một hợp chất có

tính chất tương tự như ricin, cũng là một độc tố được chiết từ hạt cây Croton tiglium

L và ông gọi là crotin

Năm 1891, một nhà khoa học khác là Hellin[72] cũng đã tách được một độc tố

khác trong hạt của cây cam thảo dây (Abrus precatorius L.) có khả năng làm ngưng

kết tế bào hồng cầu người, đó là abrin Các độc tố ricin, crotin và abrin có nguồn gốc thực vật đã thu hút sự chú ý đặc biệt của nhiều nhà khoa học cuối thế kỷ XIX

Trong hai năm 1897 và 1898 một số nghiên cứu đã chuyển sang đối tượng là các loài động vật Người mở đầu hướng nghiên cứu này Edfstrand [72] và ông đã chỉ ra rằng trong các tế bào mô thuần khiết của một số loài động vật có xương sống cũng có những chất có đặc tính độc tố tương tự như ricin, chúng làm ngưng kết tế bào hồng cầu của một số loài động vật: Bò, lợn, cá vược v.v….[72],[50]

Đầu thế kỷ XX, các hợp chất có tính chất đặc biệt làm ngưng kết tế bào hồng cầu của người và một số loài động vật được phát hiện ngày một nhiều trong giới sinh vật từ virus đến con người [72],[80]

Bên cạnh những nghiên cứu về sự tương tác của các chất kiểu ricin với tế bào hồng cầu người theo nhóm máu, Landsteiner cùng với Raubischeck đã nghiên cứu bản chất của các độc tố có nguồn gốc thực vật nói trên Bằng thực nghiệm đầy tính thuyết phục hai ông đã chỉ ra rằng: Các chất làm ngưng kết hồng cầu người và động vật tan trong nước, bị kết tủa bởi acetone, alcohol và có thể xác định bằng phản ứng

Biure và phản ứng Xantoprotein (là các phản ứng đặc trưng của protein và các amino acid vòng) [69] Kể từ đó các chất độc tố kiểu ricin được thừa nhận có bản chất protein

Thoạt đầu các nhà khoa học nhận thấy, sự ngưng kết tế bào hồng cầu của các độc tố trên là mang tính chọn lọc Vì vậy Krupe [72] đã xem các chất này là KT tự nhiên và gọi là “protein nhận biết đặc biệt” Cũng chính năm đó, nhà khoa học Boyd dựa trên đặc tính ngưng kết chọn lọc của các loại protein này đã gọi chúng là

“Lectin” Thuật ngữ này xuất phát từ chữ Latin “Lectus” là động từ quá khứ của

“Legere” nghĩa là chọn lọc Mặc dù sau này các nhà khoa học nhận thấy số lượng các lectin có khả năng ngưng kết tế bào hồng cầu đặc hiệu nhóm máu là rất ít, chiếm khoảng 25% tổng số các dạng lectin, song thuật ngữ này vẫn được dùng như một thuật ngữ khoa học[72]

Trong 2 thập kỷ, từ 1950 đến 1970 ngoài các công trình khoa học mang tính điều tra về sự phân bố của lectin, phần lớn các nhà khoa học đều tập trung vào việc tinh chế lectin để xác định cấu tạo phân tử của chúng (cấu trúc bậc I và cấu trúc không gian của phân tử)[54],[55] Cùng với điều đó các nhà khoa học đồng thời nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến hoạt tính của lectin, trên cơ sở đó tìm cách ứng dụng lectin vào đời sống của con người Các công trình trong thời kỳ này được công bố khá nhiều từ 1954 đến 1965[72] Giá trị khoa học quan trọng bậc nhất của các công trình ở giai đoạn này là sự hoàn thiện dần qui trình tinh chế lectin Vì bản chất của lectin là protein và glycoprotein nên thoạt đầu quá trình tinh chế lectin dựa trên nguyên tắc phân lập và tinh chế protein Phương pháp được dùng chủ yếu

là sắc ký qua cột Song lectin có khả năng tương tác đặc hiệu với đường, tức là chúng có khả năng liên kết với một số loại đường như D-glucosamine, D-galactose, D-mannose v.v… nên các nhà khoa học đã ứng dụng tính chất này vào quá trình tinh chế lectin bằng sắc ký ái lực Đây là phương pháp tinh chế lectin rất hiệu quả, cho chế phẩm có độ tinh khiết cao Phương pháp này hiện nay đang được sử dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm sinh học và y học của nhiều quốc gia

Sự hoàn thiện dần phương pháp tinh chế đã đẩy nhanh tiến độ nghiên cứu lectin từ những năm 1970 trở lại đây Một trong những đặc tính hóa sinh quan trọng của lectin là khả năng tương tác với các loại đường đặc biệt là các mono và disaccharide[45] Từ đặc điểm này khi đưa ra khái niệm về lectin, Goldstein đã viết:

"Lectin là protein và glycoprotein có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu"[104]

Khái niệm này đã nêu bật được bản chất hoá học của lectin và hai đặc tính hoá sinh đặc trưng của chúng Khái niệm này cũng đồng nhất với định nghĩa về lectin

mà Houston và Doyle đã đưa ra năm 1982: “ Lectin là protein tương tác đặc hiệu đường, đặc tính cơ bản của nó là khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu”

Các công trình khoa học công bố ngày một nhiều hơn, đa dạng hơn và sâu sắc hơn như[72]: Liener, Kraus, Lis và Sharon, Goldstein và Etzler v.v… (Nghiên cứu lectin có nguồn gốc thực vật bậc cao) Barondes, Olden và Parent, Yeaton, Monsigny, Cohen v.v… (Nghiên cứu lectin có nguồn gốc động vật) Các dạng lectin có nguồn gốc từ các loài nấm nhầy cũng đã được công bố: Công trình của Rosie, Barondes và Haywood v.v… lectin có nguồn gốc từ cơ thể người cũng được công bố vào thời gian này: Chilads và Feizy, Franklin, Powell và Whitmy, Monsigny

Gần đây, Pineau, Aucouturier, Brugier [86] đã công bố một số dạng lectin từ các loài mít có khả năng kích thích phân chia tế bào lympho T-CD4+ ở người Theo Marrink, Sleijfer, Koops, lectin ConA tương tác rất đặc hiệu với -Fetoprotein là dấu hiệu chẩn đoán bệnh ung thư gan và viêm gan[77],[79]

Theo các nhà khoa học Pháp, lectin từ hạt mít (Artocarpus heterophyllus Lamk) có khả năng tương tác đặc hiệu với phân tử glycoprotein CD4 ở bề mặt tế bào lympho T-CD4+ của người, là phân tử kết hợp đặc hiệu với virus HIV trong pha đầu tiên của sự nhiễm bệnh suy giảm miễn dịch (AIDS) Từ đó quá trình nhiễm virus HIV có thể bị kìm hãm, hạn chế khả năng mắc bệnh[87]

Rosamaria B.R và cộng sự [89] đã sử dụng kháng thể đơn dòng gắn bản để

nhận dạng vi khuẩn E histolytica và E dispar gây bệnh lị bằng kỹ thuật ELISA dựa

trên khả năng liên kết đặc hiệu của kháng thể với một số gốc đường galactose hay acetyl D-galactosamine của lectin trên bề mặt của 2 loại vi khuẩn này

N-Việc phát hiện ra ricin đến nay đã trên 100 năm Trong khoảng thời gian đó các nhà khoa học từ nhiều nước khác nhau trên thế giới đã phát hiện và tinh chế được nhiều dạng lectin khác nhau có nguồn gốc từ các cơ thể động vật, thực vật, vi sinh vật và cả cơ thể người Song tất cả các nhà khoa học đều thừa nhận rằng người chính thức mở đầu lịch sử nghiên cứu lectin là Stillmark và ricin được xem như là lectin đầu tiên được phát hiện Năm 1888 đã đi vào lịch sử sinh học như một mốc đáng ghi nhớ, mở đầu cho một thời kỳ mới - thời kỳ nghiên cứu và ứng dụng lectin phục vụ đời sống con người

1.3.2 Sự phân bố của lectin trong sinh giới

Lectin được phân bố rộng trong sinh giới từ thực vật, động vật, đến vi sinh vật

Allen và Brillantine [72] đã tiến hành điều tra 2663 loài thực vật thì có hơn 700 loài

ngưng kết hồng cầu nhóm máu A, B, O; trong đó cây họ Đậu chiếm nhiều nhất tới

trên 600 loài Ngoài ra, lectin còn được tìm thấy ở họ Lan (Orchidaceae), họ Trinh

nữ (Mimosaceae), họ Thuỷ tiên (Amaryllidaceae), họ Hoà thảo (Poaceae), họ Dâu

tằm (Moraceae) Lectin có mặt rất nhiều ở thực vật bậc cao, nhưng đối với thực vật

bậc thấp thì người ta mới tìm thấy ở một số loài nấm (Fungi), địa y (Lichenes) và

tảo (Algae) [56],[63]

Các công trình khảo sát lectin ở động vật phát triển khá sớm Lectin được tìm

thấy đầu tiên ở sam biển Châu Mỹ (Limulus polyphemus), sau đó là một số loài

sam biển Châu Á (Tachypleus tridentatus Leach)… thuộc ngành Giáp xác, Nhuyễn

thể hai mảnh vỏ, một số loài thuộc lớp Cá xương (Osteoithyes), lớp Lưỡng cư

(Amphibia), lớp Bò sát (Reptilia), lớp Chim (Aves) và lớp Thú (Mammalia) Đặc

biệt trong một số mô và cơ quan của người như mô cơ, tim, phổi và tế bào của hệ

miễn dịch cũng có lectin [63],[75]

Virus và vi khuẩn cũng có chứa lectin[91] Hirst [72] đã phát hiện có một loài

virus có chứa hoạt chất làm ngưng kết tế bào hồng cầu gà con Ofek phát hiện thấy

trên bề mặt vi khuẩn E.coli có chứa một hoạt chất giống lectin Các nghiên cứu của

Gilboa Gabber cũng đã chứng minh ở trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas

aeruginosa) có hai loại lectin là PAI và PAII [57]

1.3.3 Một số tính chất lí hoá của lectin

1.3.3.1 Khối lượng phân tử lectin

Các phương pháp sàng lọc phân tử, điện di trên gel polyacrylamide, siêu ly

tâm đã cho thấy khối lượng phân tử của lectin rất khác nhau, dao động từ vài nghìn

Dalton đến vài trăm nghìn Dalton Lectin thực vật có khối lượng phân tử vào

khoảng 55 - 120 kDa, còn ở động vật thì lớn hơn nhiều đến vài trăm kDa như lectin

của sam biển Châu Á (Tachypleus tridentatus Leach) là 700kDa[31],[32],[65]

1.3.3.2 Cấu tạo phân tử của lectin

Bản chất của lectin là protein [85], trong đó phần lớn là glycoprotein Thành

phần carbohydrate tìm thấy trong lectin bao gồm các đường mannose, glucose,

galactose Ngoài ra còn có Sialic acid (NANA) là dẫn xuất N - acetyl Neuramic

acid, thường nằm ở phần cuối oligosaccharide của các glycoprotein tan trong nước

Thành phần protein gồm một hay nhiều chuỗi polypeptide kết hợp với nhau nhờ

liên kết cộng hoá trị Mỗi loại lectin có chứa các thành phần amino acid khác nhau

nhưng phổ biến nhất là: Aspartic, serine, arginine và threonine Các amino acid này chiếm tới 30% toàn bộ phân tử lectin Trong đó, các amino acid chứa lưu huỳnh như cystein, methionine chỉ chứa một tỷ lệ thấp hoặc hầu như không có mặt trong lectin

Có khá nhiều công trình khoa học đã chỉ ra rằng một số phân tử lectin được cấu tạo từ một mạch polypeptide còn đa số các dạng lectin đã được nghiên cứu có cấu tạo từ hai mạch polypeptide trở lên Mỗi mạch polypeptide tạo thành 1 tiểu đơn

vị (subunit), các tiểu đơn vị này có khối lượng phân tử giống nhau hoặc khác nhau [96]

Năm 1995, Peuman và Van Dame [85] đã đưa ra một số khái niệm mới về cấu trúc liên quan đến chức năng của lectin do những tiến bộ trong việc tách dòng phân

tử các lectin và những protein có quan hệ với lectin Dựa vào cấu trúc phân tử và biểu hiện hoạt tính sinh học có thể phân chia lectin làm 3 loại:

- Merolectin có khối lượng phân tử tương đối nhỏ và chỉ có một trung tâm liên kết với đường, không có hoạt tính ngưng kết tế bào và không gây kết tủa các hợp chất liên hợp đường (glycoconjugates) Thuộc về loại này là một số protein của

các cây họ Lan (Orchidaceae)

- Hololectin có chứa ít nhất hai trung tâm liên kết với đường, làm ngưng kết

tế bào và gây kết tủa do tương tác với nhiều chất cộng hợp đường Đó chính là các lectin quen thuộc đã được nghiên cứu nhiều nhất, dễ phát hiện nhất vì khả năng gây ngưng kết tế bào của chúng và thường được gọi là haemagglutinin

- Chimerolectin là những phân tử trong đó có ít nhất một vị trí liên kết với đường và có một vùng chức năng sinh học khác (có thể là chức năng xúc tác sinh học) Thuộc về loại này là protein kìm hãm ribosom typ 2 (RIP, Type 2) ở hạt thầu

dầu (Ricinus communis L.,) và hạt cây Abrus precatorius L bao gồm hai chuỗi

polypeptide : Chuỗi A có hoạt tính xúc tác ARN-N-glycosidase, có tác động loại đi phân tử purin trên ARN của hạt riboxom gây bất hoạt riboxom và làm ngừng tổng hợp protein; chuỗi B có hoạt tính ngưng kết tế bào, và liên kết đặc hiệu với galactose, liên kết với màng tế bào để tạo điều kiện cho chuỗi A thâm nhập gây độc cho tế bào đích Hai chuỗi A và B của RIP 2 nối với nhau bằng các liên kết disulfide

và các liên kết cộng hoá trị khác Tuy nhiên theo quan niệm của Peuman và Van Dame chuỗi B ở phần lớn các phân tử RIP 2 đã được nghiên cứu chỉ có trung tâm liên kết carbohydrate(trừ ricin và abrin) nên chúng không có hoạt tính lectin như các hololectin [85] Như vậy, theo hai ông, chỉ có hololectin mới được coi là một lectin

thực sự, còn ricin và abrin tuy có hai trung tâm liên kết đường và có hoạt tính xúc tác ARN-N-glycosidase chỉ là một ngoại lệ của lectin

Bất kỳ một dạng lectin nào dù có cấu trúc bậc I hoặc có cấu trúc không gian phức tạp đều chứa trung tâm hoạt động, đó là trung tâm liên kết carbohydrate, chính trung tâm này quyết định hoạt độ lectin Nếu như ở enzyme, trung tâm hoạt động của chúng là các gốc amino acid hoặc phần phi protein (các coenzyme) thì ở hầu hết các lectin trung tâm hoạt động của chúng là do một số gốc amino acid như tyrosine, serine, threonine, tryptophan v.v….có khả năng liên kết mạnh với các gốc đường tạo nên

Trong phân tử lectin còn có các ion kim loại, hay gặp nhất là Ca2+ và Mn2+ Các ion này không trực tiếp tham gia vào trung tâm liên kết lectin - saccharide nhưng lại rất cần cho sự tương tác giữa lectin và các gốc đường, chúng có ảnh hưởng tới cấu trúc không gian của phân tử lectin và trung tâm liên kết saccharide Vậy mỗi phân tử lectin chứa bao nhiêu trung tâm hoạt động? Các nhà khoa học đã khẳng định, mỗi phân tử lectin phải có từ 2 trung tâm hoạt động trở lên Do

đó lectin là phân tử có cấu trúc đa trị (polyvalent)

Khi một trong các trung tâm hoạt động bị biến đổi thì sự tương tác giữa các trung tâm này không xảy ra, điểm tiếp nhận không hình thành và phân tử lectin mất

hoạt tính[61] Phân tử lectin từ hạt đậu tương (Glycine max L.) có hai trung tâm hoạt động, phân tử lectin từ loài Lotus tetragonolobus L có từ 2 – 4 trung tâm hoạt động, còn phân tử lectin từ ốc sên (Helix pomatia) có đến 6 trung tâm hoạt động

Có thể nói rằng, các trung tâm hoạt động trong phân tử lectin có cấu trúc giống nhau hoặc khác nhau Với những phân tử lectin mà các trung tâm hoạt động cấu tạo giống nhau thì chúng chỉ làm ngưng kết một hoặc một vài dạng tế bào, điều đó làm cho lectin có tính đặc hiệu nhóm máu cao Các dạng lectin có chứa các trung tâm hoạt động khác nhau thì hoạt tính đa dạng hơn, các lectin này thường không đặc hiệu nhóm máu, đây là dạng lectin rất phổ biến trong tự nhiên

Về cơ chế hoạt động của lectin, các nhà khoa học đều đã thống nhất như sau: Các trung tâm hoạt động của các phân tử lectin đều có khả năng liên kết các gốc đường trong các thụ thể tiếp nhận (receptor) trên bề mặt màng tế bào Các liên kết glycoside được hình thành giữa các receptor trên bề mặt màng tế bào với các

trung tâm hoạt động của lectin Nhờ các liên kết này mà lectin đã kết dính các tế bào, tạo nên hiện tượng ngưng kết tế bào Các dạng lectin khác nhau, khả năng liên kết với các receptor trên bề mặt tế bào là không giống nhau, điều đó dẫn đến đặc tính ngưng kết tế bào mang tính chọn lọc

Cũng như enzyme, các trung tâm hoạt động của lectin chỉ hoạt động khi nó nằm trong một chỉnh thể thống nhất, hoàn chỉnh của cấu trúc phân tử Bất kỳ một tác nhân nào phá vỡ cấu trúc phân tử lectin cũng đều làm giảm hoặc mất khả năng hoạt động của các trung tâm này Chính vì vậy, hoạt độ của lectin phụ thuộc chặt chẽ vào một số tác nhân lý hoá của môi trường[61]

1.3.3.3 Tính tan và kết tủa

Lectin hoà tan trong nước, dễ tan trong các dung dịch muối loãng[62], vì vậy trong quá trình nghiên cứu lectin, các dung dịch muối loãng đã được sử dụng làm dung môi để chiết rút Lectin có bản chất protein nên chúng dễ bị kết tủa bởi một số tác nhân lý hoá của môi trường như tác dụng của alcohol, acetone và một số muối trung tính ở nồng độ cao đặc biệt là amoni sulfate Hiện nay acetone và amoni sulfate được dùng phổ biến để kết tủa lectin Muối của một số kim loại nặng dễ làm cho protein biến tính, vì vậy ít được sử dụng

1.3.3.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của lectin

Lectin có bản chất là protein nên hoạt tính của nó cũng bị ảnh hưởng bởi pH, nhiệt độ, enzyme, ảnh hưởng của ion kim loại và một số đường đơn phân tử,…

1.3.4 Một số tính chất sinh học và miễn dịch của lectin

1.3.4.1 Khả năng ngưng kết tế bào

Là đặc tính sinh học điển hình của lectin mà dựa vào đó người ta phát hiện sự

có mặt của lectin ở các đối tượng nghiên cứu Đồng thời còn giúp phân biệt lectin với các hợp chất sinh học khác cũng có khả năng tương tác với đường như glycosidase và glycotransferase

Hầu hết lectin có khả năng ngưng kết hồng cầu người, một số ít lectin đặc hiệu nhóm máu Một số thì có khả năng ngưng kết hồng cầu các động vật khác như: Thỏ, cừu, khỉ, Sự khác biệt về mức độ liên kết giữa lectin với tế bào bình thường, ung thư, tế bào non và tế bào trưởng thành, với tế bào đang phân chia và tế bào giai đoạn nghỉ [72] thu hút sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học Chính vì thế mà khả năng ngưng kết tế bào của lectin có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu Y học,

Miễn dịch học và người ta có thể sử dụng lectin để phân biệt tế bào lành tính và ác tính hoặc dùng lectin để phân lập vi khuẩn, ngưng kết tinh trùng và tách tế bào…

1.3.4.2 Khả năng kích thích và kìm hãm phân bào

Một trong những đặc tính quan trọng của lectin mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn là khả năng kích thích phân bào, loại tế bào bị tác động mạnh nhất là lympho bào Khả năng này được phát hiện đầu tiên khi Nowell sử dụng lectin hạt đậu thận

đỏ (Phaseolus vulgaris L.) làm tác nhân kích thích phân bào, chúng có khả năng

kích thích phân chia tế bào lympho của hệ miễn dịch Các nghiên cứu gần đây cho

thấy một số lectin thuộc chi Artocapus và loài Urtica dioica kích thích đặc hiệu sự

sinh sản dòng lympho T- CD4+ [22],[86]

Ngoài ra, lectin còn có khả năng kìm hãm, ức chế sự phân chia tế bào nhất là

tế bào ung thư Hiện tượng này là do lectin kích thích phân tử DNA giữ nhiệm vụ khởi động việc tổng hợp interferon từ tế bào chủ, qua đó ức chế sự phát triển của tế bào ung thư

1.3.4.3 Đáp ứng miễn dịch của lectin

Trong những năm gần đây, khoa học phát hiện ra hàng loạt lectin có chức năng sinh lý và đáp ứng miễn dịch trên bề mặt tế bào động vật bậc cao và người Selectin

có khả năng liên kết với nhiều chất kết hợp đường, có vai trò chủ yếu làm kết dính các tế bào nội mô thành mạch, kiểm soát hiện tượng viêm và di căn ung thư [104] Các lectin động vật này được chia làm ba nhóm:

- Nhóm selectin - C (hoặc selectin - E) hoạt động phụ thuộc vào ion Ca2+ , xuất hiện ở màng tế bào nội mô (endothelial) có vai trò gây viêm sau khi được hoạt hoá bằng IL -1B, TNF -  và độc tố LPS của tế bào vi khuẩn

- Nhóm selectin - L cũng phụ thuộc ion Ca2+, có mặt ở tất cả các tế bào bạch cầu và ở dạng hoà tan trong huyết thanh, đóng vai trò tạo kết dính giữa các bạch cầu

và nội mô tham gia vào đáp ứng miễn dịch

- Nhóm selectin - P biểu hiện ở các tiểu cầu và các tế bào nội mô Chúng xuất hiện trên màng tế bào sau khi được kích thích bằng histamine, thrombin, các peroxide

và phản ứng với chất kết hợp phối tử có bản chất là lactosaminoglycan của các bạch cầu đơn nhân to, bạch cầu trung tính và các tế bào lympho T - CD4+, tham gia vào đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào

1.3.4.4 Các quyết định kháng nguyên nhận biết

Lectin có thể tham gia vào việc nhận biết các vi sinh vật cũng như nhận biết các tế bào của cơ thể Khả năng này cho phép giải thích hàng loạt sự tương tác giữa các tế bào như sự kết dính của tế bào vi khuẩn vào động vật, sự liên kết của vi khuẩn cố định đạm ở rễ của cây họ Đậu, sự tiếp cận tinh trùng với trứng,

Nhiều nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng, tác động của lectin ngoại sinh lên các tế

bào động vật in vitro có thể giống như tác động của protein liên kết với đường,

thường xuất hiện ở bề mặt của những tế bào lân cận

Lectin còn có vai trò như là protein bảo vệ, bảo vệ thực vật trong việc chống lại các tác nhân tác động từ bên ngoài Mặc dù lectin không phải là KT nhưng chúng lại có vai trò bảo vệ, điều này đã được khẳng định với khả năng kết dính tế bào và gây độc đối với động vật

Giống như enzyme nhận biết cấu trúc của cơ chất do chúng xúc tác, và KT nhận biết cấu trúc epitop của kháng nguyên, lectin cũng là những protein có khả năng nhận biết tinh vi trình tự carbohydrate trên bề mặt tế bào, từ đó cũng làm ảnh hưởng đến việc điều chỉnh các chức năng sinh lý của tế bào

Ngoài ra, lectin còn có vai trò trong tương tác giữa vi khuẩn cố định đạm với rễ cây họ Đậu như: Lectin chiết từ cây cỏ ba lá có khả năng tương tác với KN bề mặt tế

bào vi khuẩn Rhizobium trifollii, làm kết dính vi khuẩn này với tế bào của rễ cây

1.3.5 Ứng dụng của lectin

1.3.5.1 Ứng dụng lectin để định loại nhóm máu của người

Nhờ đặc tính ngưng kết đặc hiệu cao về nhóm máu của một số dạng lectin nên hiện nay chúng đã được sử dụng như một công cụ hữu hiệu để định loại nhóm máu theo hệ thống A, B, O, AB Phương pháp này thường cho kết quả nhanh, chính xác mà không cần huyết thanh mẫu, tuy nhiên lectin được sử dụng theo mục đích này đòi hỏi độ tinh khiết và tính đặc hiệu cao

1.3.5.2 Lectin mít (Jacalin) và sự tương tác với kháng thể của người

Jacalin là một glycoprotein có khối lượng phân tử thay đổi từ 36-65 kDa tuỳ thuộc vào kỹ thuật phân tích khác nhau Các nhà khoa học từ trước tới nay vẫn xem jacalin tồn tại dưới dạng kết hợp của hai tiểu đơn vị  và ’ thông qua liên kết không cộng hoá trị

Năm 1989, Young và cộng sự bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp đã phát hiện thấy jacalin còn một tiểu đơn vị nữa là  Tiểu đơn vị này là một peptide tương đối kị

nước gồm 20-22 amino acid Lectin mớt tồn tại dưới nhiều dạng khỏc nhau do sự khỏc nhau trong trỡnh tự amino acid của cỏc chuỗi , ’,  Trong những năm 1993-1995,

Đỗ Ngọc Liờn và cỏc cộng sự cũng đó chứng minh được sự cú mặt của cỏc chuỗi  và

 trong cỏc lectin được tinh sạch từ một số loài mớt Việt Nam [54],[55]

Cấu trỳc bậc 4 dạng tetrame của jacalin được tạo bởi 2 chuỗi , một chuỗi 

và một chuỗi ’ Một số tỏc giả cho rằng lectin mớt cú cấu trỳc hexame Bằng phương phỏp điện di miễn dịch SDS-PAGE, cỏc nhà khoa học đó phỏt hiện chuỗi 

cú Mr =15,8 kDa, chuỗi  cú Mr =2,1 kDa [54],[55]

Lectin mớt (jacalin) cú khả năng ngưng kết hồng cầu người, cho phản ứng kết tủa với một số glycoprotein trong đú cú cả IgA người, chỳng liờn kết với cỏc mono

và disaccharide Ái lực của lectin đối với từng loại đ-ờng là khác nhau, th-ờng jacalin có ái lực mạnh hoặc vừa phải với Gal, Gal-NAc và các dẫn xuất  của đ-ờng galactose, còn một số disaccharide mang liên kết  th-ờng có ái lực yếu với jacalin nh- lactose và Lac-NAc

Tính chất điển hình của lectin là có khả năng liên kết với các gốc đ-ờng tự do

và các gốc đ-ờng nằm trên bề mặt tế bào Sự t-ơng tác này đ-ợc biểu hiện ở sự t-ơng tác với các gốc đ-ờng của globulin miễn dịch nh- kháng thể IgA và IgG Năm 1979, Chaterjee đã phát hiện lectin mít có khả năng kết tủa IgA và IgD [72] Sau này vào năm 1985, Rocque và Campos đã thực hiện thí nghiệm và chứng minh lectin mít có khả năng kết tủa IgA1 mà không kết tủa Ig khác [72] Về sau các nhà khoa học đã chứng minh đ-ợc rằng lectin mít tạo kết tủa đặc tr-ng với IgA1, không tạo kết tủa với IgA2 và khả năng phản ứng rất yếu với IgD Nguyên nhân tạo

ra khả năng kết tủa lectin với IgA1 mà không tạo kết tủa với IgA2 là do cấu trúc khác nhau của các gốc đ-ờng có mặt ở hai loại IgA1 và IgA2 Theo nghiên cứu của các nhà khoa học Pháp, jacalin sở dĩ có ái lực cao với IgA1 là do phân tử KT này có chứa những vị trí gắn kết đ-ờng đặc hiệu với jacalin: Gal(1-3)-NAc [42],[46],[47][51]

Ser-Thr-Pro-Pro-Thr-Pro - Ser - Pro- Ser-Thr-Pro-Pro-Thr-Pro - Ser- Pro - Ser

Gal- NAc

Gal 1,3Gal-NAc Gal-NAc Gal- NAc

Gal 1,3 Gal 1,3 Gal 1,3

Hỡnh 1.6 Cấu trỳc chuỗi đường của IgA 2 [43]

Ser-Thr-Pro-Pro-Thr-Pro - Ser - Pro- Ser-Thr-Pro-Pro-Thr-Pro - Ser- Pro - Ser

Gal- NAc

Gal 1,3Gal-NAc Gal-NAc Gal- NAc

Gal 1,3 Gal 1,3 Gal 1,3

Hỡnh 1.7 Cấu trỳc chuỗi đường của IgA 1 [43]

Gal-NAc

Hàm lượng kháng thể là một trong những thông số đáng quan tâm lưu ý trong một số bệnh có liên quan đến sự thay đổi các kháng thể miễn dịch Vì vậy, việc định lượng kháng thể từ huyết thanh người là điều cần thiết, có ý nghĩa thực tiễn Ứng dụng khả năng liên kết đặc hiệu của jacalin với IgA1 mà một số nhà khoa học trên thế giới và ở Việt Nam đã sử dụng jacalin làm kháng nguyên gắn bản để định lượng IgA1bằng kỹ thuật ELISA Ngoài ra họ cũng sử dụng jacalin để tinh chế IgA1 từ huyết thanh người, ứng dụng trong điều trị một số bệnh thiếu hụt kháng thể[40]

1.3.5.3 Lectin đậu, sự tương tác với kháng nguyên AFP và kháng thể

Đậu dao biển (Canavalia maritima Aublet) thuộc chi Canavalia, tên thường

gọi là đậu biển, có nguồn gốc từ Brazil, thường sống ở các vùng nhiệt đới, được du nhập trồng ở một số tỉnh ven biển của nước ta từ lâu Đậu dao biển thường có rễ dài

là nơi có chứa các vi khuẩn cộng sinh cố định nitơ Vì vậy đậu dao biển cũng góp phần vào việc cố định nitơ từ không khí Hạt đậu dao biển có hàm lượng protein cao, cung cấp dinh dưỡng cho người và động vật Đậu dao biển có một số giống

trồng (Cultivars) biến dạng như Canavalia obtusifolia Lamk D.C và Canavalia rosea Swartz D.C

Lectin đậu dao biển (ConM)

cũng giống như lectin thuộc các cây

họ Đậu khác, có trình tự amino acid

giống đến 90% so với lectin ConA của

đậu rựa (Canavalia ensiformis Jacq

Hình 1.8 Cấu trúc không gian của ConM

D.C.) Đặc biệt lectin ConM có hai trung tâm hoạt động, ở đó cần sự có mặt của hai

ion Ca2+ và Mn2+ để đảm bảo hoạt tính của nó [52],[59],[60]

Lectin đậu dao biển gần đây đã được sử dụng nhiều trong các công trình nghiên cứu khoa học trên thế giới và Việt Nam Hiện nay ở Việt Nam chúng tôi đã

và đang bắt đầu nghiên cứu một số tính chất của lectin đậu dao biển và ứng dụng của nó trong nhiều lĩnh vực Đặc biệt là bước đầu điều tra khả năng ứng dụng của lectin để định loại vi khuẩn và chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh trong Y học dựa trên phản ứng tương tác giữa lectin với tế bào vi khuẩn

Đậu gươm (Canavalia gladiata Jacq D.C.) hay còn gọi là đậu kiếm có nguồn

gốc từ Ấn Độ, nhưng từ lâu đã được trồng ở một số tỉnh miền núi nước ta và được gọi là đậu mèo đỏ Đây là loài đậu cho năng suất cao và là nguồn thức ăn giàu protein cho người và gia súc[14]

Lectin đậu gươm (ConG), giống như lectin đậu dao biển (ConM) và lectin từ hạt đậu rựa (ConA) đều là các protein được cấu tạo bởi 4 tiểu đơn vị, mỗi tiểu đơn

vị có khối lượng phân tử khoảng 31 kDa Trung tâm hoạt động của chúng đều chứa ion Ca2+ và Mn2+[76],[82]

Lectin đậu rựa (ConA) đã được sử dụng để phân biệt nhanh chóng 2 căn bệnh ung thư buồng trứng và viêm gan ngay ở giai đoạn sớm Cả 2 bệnh này đều có biểu hiện AFP trong máu ở hàm lượng rất thấp (10ng/ml), song AFP có tỷ lệ liên kết đặc hiệu với ConA từ 12-43% trong bệnh ung thư buồng trứng và dưới 10% trong bệnh viêm gan [66]

Theo Taketa có 8 loại lectin được ứng dụng trong điện di AFP liên kết lectin

để chẩn đoán ung thư gan [90],[92] Tuy nhiên, có hai loại lectin: Lens culinaris agglutinin (LCA) [58] và Erythro phytohemagglutinin (E-PHA) được sử dụng nhiều

nhất trong lâm sàng để giúp chẩn đoán, phân biệt ung thư gan với viêm gan mạn tính[73],[79] Taketa và cộng sự[99] dùng kỹ thuật điện di để nghiên cứu ái lực của AFP với LCA và kết quả phân tách thành 3 dải: AFP có ái lực mạnh với LCA (kí hiệu (LCA-L3), AFP có ái lực yếu với LCA (kí hiệu (LCA-L2), và AFP không có ái lực với LCA (kí hiệu LCA-L1) Trong đó phức hệ AFP-L3 gặp nhiều trong ung thư gan nguyên phát; AFP-L2 gặp nhiều trong ung thư noãn hoàng, ung thư gan thứ phát, ung thư đại trực tràng, ung thư dạ dày còn tỷ lệ AFP-L1 gặp nhiều trong viêm gan mạn và xơ gan Với kết quả này tác giả cho biết AFP-L3 có thể giúp chẩn đoán phân biệt giữa ung thư gan nguyên phát với bệnh viêm gan mạn tính

Hiệp hội Ung thư Nhật Bản đã lấy tỷ lệ AFP-L3>15% và AFP-P4>12% là mốc và là dấu hiệu (marker) chẩn đoán ung thư tế bào gan Trong nghiên cứu của Taketa và cộng sự[101], lấy tỷ lệ AFP-L3>15% là mốc chẩn đoán ung thư tế bào gan cho biết độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác của AFP-L3 tương ứng là: 76%, 99,9% và 84,6% Cũng đối với nghiên cứu của Taketa và cộng sự, lấy tỷ lệ AFP-P3>12% là mốc chẩn đoán ung thư tế bào gan thì độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác của AFP-L3 tương ứng là: 76%, 99,9% và 84,6% Như vậy AFP-L3 và AFP-P4

có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong chẩn đoán ung thư gan

Do AFP-L3 và AFP-P4 là những dấu hiệu độc lập trong chẩn đoán ung thư gan, Taketa và cộng sự đã kết hợp cả hai dấu hiệu này để chẩn đoán ung thư gan với

độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác tương ứng là: 95%, 99,7% và 96,6%

Tại Việt Nam, tiến sĩ Vũ Văn Khiên và cộng sự[13] đã sử dụng KIT chẩn đoán ung thư gan của giáo sư Taketa, cho biết dấu hiệu AFP-L3 của 65 bệnh nhân ung thư gan có độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác tương ứng là: 96,9%; 92% và 96,9%

Tuy nhiên, cũng giống như AFP huyết thanh, các dấu hiệu AFP-L3 và AFP-P4 và nồng độ AFP đều có liên quan chặt chẽ đến độ biệt hoá tế bào và kích thước khối u Trong nghiên cứu của Taketa và cộng sự, với khối u có kích thước <2cm thì độ nhạy của AFP-L3 tương ứng là 48% Tính ưu việt lớn nhất của các marker AFP-L3 và AFP-P4 là có khả năng chẩn đoán, phân biệt và phát hiện sớm ung thư gan từ những bệnh nhân gan mạn tính có AFP huyết thanh tăng nhẹ Nghiên cứu của Taketa và cộng sự[101], Shiraki và cộng sự[93], Aoyagi [44] đều thấy rằng AFP-L3 là một marker tốt giúp chẩn đoán phân biệt giữa ung thư gan với bệnh viêm gan mạn tính

Các tác giả cũng thấy rằng tỷ lệ AFP-L3 dương tính (AFP-L3>15%) trước khi khối u gan xuất hiện từ 3-18 tháng rất có ý nghĩa, vì nó định hướng cho điều trị khi khối u gan còn nhỏ Như vậy, thông qua xác định tỷ lệ AFP-L3 đã giúp cho các thầy thuốc lâm sàng phân biệt được các trường hợp tăng AFP ở bệnh viêm gan mạn tính,

mà ta vẫn thường gọi là "dương tính giả" và chỉ rõ bản chất cấu trúc, tính chất AFP bệnh lý ở các bệnh nhân này Từ đó, định hướng cho sàng lọc, theo dõi và phát hiện sớm ung thư gan

Năm 1970 Spiegelberg và cộng sự [95] đã tinh chế IgG từ huyết thanh người

6

4 Man1

3

4GlcNAc1 4GlcNAc Asn

Hình 1.9 Cấu trúc chuỗi đường của IgG[64]

GlcNAc1 Neu5Ac2 6Galc1 4GlcNAc1 2Man1

Neu5Ac2 6Galc1 4GlcNAc1 2Man1

Fuc1

6

và ông thấy rằng mỗi phân tử IgG chứa các gốc đường liên kết với asparagine của protein IgG, trong đó chủ yếu liên kết với Asn297, phần còn lại liên kết ở vùng biến đổi của chuỗi H và L Kháng thể IgG cũng đã được chứng minh là có khả năng liên

kết với lectin như lectin đậu rựa ConA được tách chiết từ hạt đậu rựa (Canavalia ensiformis Jacq D.C.)

1.3.6 Vài nét về nghiên cứu lectin ở Việt Nam

Năm 1983, lần đầu tiên có các nghiên cứu về lectin sau chuyến đi trao đổi khoa học của PGS Nguyễn Thị Thịnh tại cộng hoà Pháp[30].Việc nghiên cứu lectin

đã được triển khai và mở rộng trên 20 năm nay Mặc dù với thời gian chưa dài nhưng những nghiên cứu lectin của các nhà khoa học Việt Nam đã có kết quả bước đầu Có thể nói rằng, trong khoảng thời gian trên các nhà khoa học Việt Nam đã nghiên cứu lectin ở 3 hướng cơ bản:

+ Hướng nghiên cứu thứ nhất: Điều tra sự phân bố của lectin trong các loài

động vật và thực vật của Việt Nam Các kết quả nghiên cứu đã khẳng định: Lectin khá phổ biến trong các loài động vật, thực vật và vi sinh vật vốn rất phong phú của nước ta

Năm 1983 nhóm tác giả Nguyễn Thị Thịnh, Nguyễn Quốc Khang và cộng sự

đã tiến hành điều tra sơ bộ các loài đậu đang được trồng phổ biến ở Việt Nam và thấy rằng có tới 60% các loài được điều tra có chứa lectin [30] Tất cả các loài mít

và một số loài khác như chay (Artocarpus tonkinensis Gagn.), sakê (Artocarpus incia Gagn.) thuộc chi Artocarpus đều chứa lectin có hoạt độ rất cao [17],[21] Năm

1993 Đỗ Ngọc Liên và cộng sự đã tiến hành điều tra sự phân bố của lectin ở các cây thuốc Đông y [27]

+ Hướng nghiên cứu thứ hai: Tách, tinh chế và nghiên cứu tính chất, cấu trúc

phân tử của một số dạng lectin có tính đặc hiệu cũng như một số dạng lectin mới, có ứng dụng trong Y học và Miễn dịch học từ các loài động vật, thực vật và vi sinh vật của Việt Nam Nhiều công trình về lĩnh vực này đã cho thấy, hàng chục loại lectin

có nguồn gốc từ Việt Nam, có độ tinh khiết cao, mang nhiều tính chất đặc trưng đã bước đầu được sử dụng trong nghiên cứu cấu trúc phân tử, ứng dụng Y học và Miễn dịch học [17],[18],[20],[21],[29]

+ Hướng nghiên cứu thứ ba: Nghiên cứu ứng dụng Nếu như hai hướng

nghiên cứu trên thu được nhiều kết quả thì nghiên cứu ứng dụng còn rất khiêm tốn Tuy vậy các nhà khoa học Việt Nam cũng đã thu được một số dẫn liệu đáng

khích lệ Tác giả Đỗ Ngọc Liên và Nguyễn Lệ Phi (1992) đã sử dụng lectin từ hạt

mít tố nữ (Artocarpus chempeden Gagn.) để tinh chế IgA1 trong huyết thanh của người bằng phương pháp sắc ký ái lực [19] Phối hợp với các nhà khoa học Pháp

là Cesari, Hoebeke của Trường đại học Tours (Cộng hoà Pháp), tác giả Đỗ Ngọc

Liên và cộng sự (1992), đã sử dụng lectin chay (Artocarpus tonkinensis Gagn.) để

chẩn đoán kháng thể miễn dịch trong bệnh nhiễm ký sinh trùng sán máng

(Schistosoma mansoni) ở người [21] Năm 1996, tác giả Nguyễn Quốc Khang và

các cộng sự đã bước đầu sử dụng lectin trong xác định sớm thai nghén[12] Tác giả Bùi Phương Thuận đã sử dụng lectin để xác định vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm và vi khuẩn có tầm quan trọng trong nông nghiệp [7],[33],[34]

Mặc dù ở hướng nghiên cứu ứng dụng, kết quả thu được còn khiêm tốn, chúng

ta vẫn hy vọng trong thời gian tới số lượng lectin được tinh chế ở Việt Nam sẽ nhiều hơn và sẽ được sử dụng rộng rãi hơn trong các nghiên cứu Y học, Miễn dịch học và các lĩnh vực khác

2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Hạt mít

- Hạt mít dai (Artocarpus heterophyllus Lamk) được thu thập ở tỉnh Vĩnh Phúc [4]

- Hạt mít dại (Artocarpus masticata Gagn.) được thu thập ở vườn bách thảo Hà

Nội

- Hạt mít tố nữ (Artocarpus champeden Gagn.) được thu thập tại thành phố Hồ

Chí Minh

Hình 2.1 Quả mít dai (Artocarpus

heterophyllus Lamk) Hình 2.2 Quả mít tố nữ (Artocarpus

champeden Gagn.)

2.1.2 Hạt đậu

- Hạt đậu dao biển (Canavalia maritima Aublet) thu thập tại khu vực chân núi

Ngũ Hành Sơn thuộc Quảng Nam - Đà Nẵng [14]

- Hạt đậu gươm (Canavalia gladiata Jacq D.C.) được thu thập tại vùng núi

Tuyên Quang

Hình 2.4 Hạt và quả đậu Dao biển

(Canavalia maritima Aublet)

Hình 2.5 Hạt và quả đậu Gươm (Canavalia gladiata Jacq D.C.)

Hình 2.3 Quả mít dại (Artocarpus masticata Gagn.)

Hình 2.3 Quả mít dại (Artocarpus masticata Gagn.)

2.1.3 Huyết thanh, hồng cầu người

- Huyết thanh và hồng cầu người bình thường đã qua xét nghiệm các bệnh HIV, HCV, HBV, HCC, HbsAg… do viện Huyết học và Truyền máu Trung ương cung cấp

- Huyết thanh bệnh nhân đa u tuỷ xương đã được xác định là mắc bệnh do viện Huyết học và Truyền Máu Trung Ương cung cấp

- Huyết thanh bệnh nhân ung thư gan, viêm gan siêu vi trùng đã được xác định là mắc bệnh do bệnh viện Quân đội Trung ương 108, bệnh viện E Trung ương và bệnh viện Ung bướu Hà Nội cung cấp

- Huyết thanh bệnh nhân ung thư vòm họng đã được xác định là mắc bệnh do bệnh viện Bạch Mai cung cấp

- Huyết thanh thai phụ do bệnh viện E Trung ương cung cấp

2.2 HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ

- Các hoá chất của hãng SIGMA, MERK, LKB, INVITROGEN, FERMENTAS Các hoá chất này đạt độ tinh khiết, tin cậy cao Bản nhựa đáy bằng Microplate, Nunc Norway

- Máy ly tâm Eppendorf Centrifuge 5417C

- Máy đo quang phổ Shimadzu UV 11201

- Máy điện di mini Bio-Rad

- Bộ ổn nhiệt Lauda A100

- Cân phân tích Precisa 250A

- Máy đo pH 520A- USA

- Máy đọc ELISA 550 Bio-Rad

- Máy khuấy từ IKA

- Máy Olympus AU640- Nhật

- Máy Hitachi 902

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

+ Hoạt độ tổng số (HĐTS): Được tính theo công thức:

Trong đó: - V: Thể tích mẫu thí nghiệm tính bằng l

- n: Mức pha loãng lớn nhất vẫn gây ngưng kết hồng cầu

- HĐTS: Hoạt độ tổng số đơn vị là HAA

+ Hoạt độ riêng (HĐR): Số đơn vị hoạt độ lectin có trong 1mg protein, được

tính theo công thức:

mg

HDTS HDR 

Trong đó: - HĐTS: Hoạt độ tổng số tính theo công thức trên

- mg : Khối lượng protein tính bằng mg

- HĐR: Hoạt độ riêng của lectin, đơn vị HAA/mg protein

2.3.2 Xác định hàm lượng protein

2.3.2.1 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry

+ Nguyên tắc:

Protein tác dụng với thuốc thử Folin tạo thành sản phẩm màu xanh Dùng máy

so màu quang phổ để xác định cường độ màu của dịch phản ứng ở bước sóng 660 nm trong các mẫu và so sánh với dịch protein chuẩn (ở đây sử dụng protein tiêu chuẩn albumin huyết thanh bò (BSA) - hãng Sigma USA) Phương pháp có độ nhạy tương

V.2n H§TS=

50

V.2n HĐTS=

50

đối cao cho phép xác định nồng độ protein tới vài chục g protein, do vậy được sử dụng rộng rãi để định lượng nhiều loại protein ở dạng tương đối tinh khiết[26]

+ Cách làm:

Hút chính xác vào ống nghiệm 0,5 ml dung dịch nghiên cứu, thêm vào 2.5ml dung dịch C (49ml dung dịch Na2CO3 2% + NaOH 0,1M và 1ml dung dịch Cu2SO40,5%), lắc đều và giữ ở nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút Sau đó thêm chính xác 0,25 ml dung dịch Folin 1N pha loãng 2 lần lắc đều, sau 30 phút đem so màu ở bước sóng 660 nm

Song song với mẫu thí nghiệm trên, chúng tôi làm thí nghiệm đối chứng, trong

đó thay dịch protein bằng đệm PBS và làm các bước tương tự

+ Lập đồ thị chuẩn protein:

Chuẩn bị các dung dịch protein chuẩn (thường là BSA- Albumin huyết thanh

bò tinh khiết) Từ một dịch gốc ban đầu có nồng độ 1mg/ml pha loãng thành các dung dịch khác nhau chứa hàm lượng protein tương ứng là 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1mg/ml Tiến hành làm phản ứng màu với dịch chuẩn theo thứ tự, thành phần và tỉ lệ các hóa chất như với dịch nghiên cứu Dựng đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ protein[37]

Từ kết quả mật độ quang phổ của mẫu thí nghiệm đối chiếu với đồ thị chuẩn tính ra hàm lượng protein trong 1ml dịch nghiên cứu và tính ra hàm lượng % protein trong nguyên liệu

Từ đó xây dựng đồ thị chuẩn theo BSA khi đo ở bước sóng 280nm hoặc sử dụng hệ số tắt của BSA là 0,67 để tính hàm lượng protein trong mẫu

Hàm lượng protein được tính theo công thức:

Hàm lượng protein (mg/ml) = OD280nm x độ pha loãng/0,67

2.3.2.2 Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp quang phổ

đo ở bước sóng 280nm

+ Nguyên tắc: Các amino acid thơm như tryptophan, tyrosine, và

phenylalanine trong chuỗi polypeptide có phổ hấp thu cực đại ở bước sóng 280nm Biết rằng ở bước sóng 280nm thì 1ml BSA có nồng độ 1mg/ml có mật độ quang học là 0,67; 1ml jacalin có nồng độ 1mg/ml có mật độ quang học là 1,22; 1ml IgA

có nồng độ 1mg/ml có mật độ quang học là 1,32; 1ml IgG có nồng độ 1mg/ml có mật độ quang học là 1,36[69]

Dựa vào đó ta có thể tính được hàm lượng protein, jacalin, IgA, IgG trong mẫu thí nghiệm theo các công thức sau:

- Với protein tính theo công thức: Y= B.a.V/0,67

- Với jacalin tính theo công thức: Y= B.a.V/1,22

- Với IgA tính theo công thức: Y= B.a.V/1,32

- Với IgG tính theo công thức: Y= B.a.V/1,36

2.3.3.1 Kỹ thuật sắc kí trao đổi ion

Nguyên tắc của phương pháp này là phân tách dựa trên sự khác biệt về ion Protein gắn thuận nghịch với các chất trao đổi bằng tương tác ion giữa các nhóm mang điện tích trái dấu, sau đó được chiết rút riêng biệt, thường là nhờ việc tăng dần lực ion của đệm hoặc bằng cách thay đổi pH khiến các nhóm tương tác trên protein bị mất điện tích

2.3.3.2 Kỹ thuật sắc kí ái lực

Sắc kí ái lực là một kỹ thuật rất đơn giản để tinh chế các phân tử có hoạt tính sinh học Nguyên tắc của phương pháp dựa trên sự tương tác đặc hiệu giữa cấu tử không tan và một phân tử tan khiến phân tử tan tạm thời trở nên không tan và cho phép tách nó khỏi các tạp chất hoà tan

2.3.3.3 Tinh chế lectin mít

Lectin mít được chiết bằng đệm PBS pH 7,4; kết tủa bằng (NH4)2SO4 65% bão hoà, ly tâm lạnh ở 8000 vòng/phút/20 phút, dịch chiết thô được đưa lên cột CM-Cellulose, rửa cột bằng đệm PB pH 5,6; phản hấp phụ bằng đệm PBS pH 8,0; thẩm tích bằng đệm PBS

2.3.3.4 Tinh chế lectin ConM từ hạt đậu dao biển

Lectin từ bột hạt đậu dao biển được chiết trong đệm TBS pH 7,4 có ion Ca2+

và Mn2+ 3mM, ly tâm 9000 vòng/phút thu dịch trong Đưa mẫu lên cột sắc ký Sephadex G-75, rửa cột bằng đệm TBS pH 7,4 có Mn2+ và Ca2+ 3mM cho đến khi

OD280nm= 0 thì đẩy cột bằng đệm trên có hoà tan glucose 0,5M Điện di SDS-PAGE kiểm tra độ tinh sạch của chế phẩm và sử dụng chế phẩm cho các hướng nghiên cứu tiếp theo

2.3.3.5 Tinh chế lectin ConG từ hạt đậu gươm

Lectin ConG từ bột hạt đậu được chiết bằng đệm PBS pH 7,4; kết tủa bằng (NH4)2SO4 65% bão hoà, ly tâm lạnh ở 8000 vòng/phút/20 phút, thẩm tích bằng đệm PBS, phản hấp phụ bằng glucose 0,2M

2.3.4 Điều chế các cột sắc kí ái lực

2.3.4.1 Tạo cột sắc kí ái lực Jacalin-Sepharose-4B[69]

Bước 1: Cân 5g gel Sepharose-4B đã được hoạt hoá bằng CNBr, ngâm trong HCl 1mM/15 phút Rửa bằng đệm bicarbonate natri pH 8,3 chứa NaCl 0,5M

Bước 2: Hoà 50mg jacalin đã được hoà tan trong đệm bicarbonate với gel Sepharose-4B ở bước 1 Lắc nhẹ nhàng hỗn hợp ở 40C/ 8 giờ

Bước 3: Bao vây nhóm hoạt tính còn lại bằng đệm bicarbonate pH 8,3 chứa glycine 0,2M

Bước 4: Rửa loại protein không gắn vào gel bằng đệm acetate 0,1M chứa NaCl 0,5M pH 4 Rửa đệm bao vây bằng đệm PBS pH 7,4

Bước 5: Nạp cột Lưu ý không được để tạo bọt, đệm PBS dùng nạp cột có chứa azit 0,02%