Nghiên cứu sử dụng các chỉ thị hóa sinh để đánh giá mức độ ô nhiễm Asen trong nước khoan và mối tương quan với thâm nhiễm Asen trên người

Sử dụng chỉ số các thành phần asen methyl hoá trong nước tiểu để đánh giá mức độ thâm nhiễm asen hiện tại và cung cấp số liệu minh hoạ cơ chế nhiễm độc asen ở người 2.2.1.. So sánh kết q

1.1.3 Nhu cầu phát triển công cụ phân tích nhanh, phục vụ cho

nhiệm vụ đánh giá hiện trạng ô nhiễm asen trong nước giếng

1.2.2.3 Ứng dụng thực tiễn của các biosensor sử dụng vi khuẩn

biến đổi gen có đáp ứng với asen

nhiễm độc 1.3.2.2 Sử dụng chỉ số hàm lượng asen trong tóc để đánh giá

mức độ thâm nhiễm lâu dài asen từ nước giếng khoan

27

1.3.2.3 Sử dụng chỉ số các thành phần asen methyl hoá trong

nước tiểu để đánh giá mức độ thâm nhiễm asen hiện tại

và cung cấp số liệu minh hoạ cơ chế nhiễm độc asen ở người

2.2.1 Nuôi, cấy chuyển và giữ giống vi khuẩn chỉ thị asen 38

2.2.2 Phân tích hàm lượng asen hoà tan trong dung dich trung tính

bằng vi khuẩn chỉ thị

38

2.2.3 Thí nghiệm chọn thời gian vi khuẩn chỉ thị E coli luxAB tiếp

xúc với asen và tối ưu hoá lượng cơ chất n-decanal

40

2.2.4 Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của hàm lượng sắt trong nước

tới khả năng sử dụng sinh học asen đối với vi khuẩn chỉ thị

40

2.2.5 Phương pháp phân tích asen trong dung dịch bằng quang phổ

hấp thụ nguyên tử nối ghép thiết bị sinh khí hydrua asin

(AsH3)

41

2.2.7 Phân tích các dạng asen hữu cơ trong nước tiểu bằng kỹ thuật

nối ghép sắc ký trao đổi ion với phổ khối cảm ứng plasma

(IC-ICPMS)

42

Chương 3 Kết quả và bàn luận

3.1 Chọn lựa và tối ưu phương pháp phân tích hàm lượng asen trong

nước giếng khoan bằng biosensor sử dụng vi khuẩn chỉ thị

43

3.1.1 So sánh khả năng phân tích asen bằng ba chủng vi khuẩn E

coli có các gen chỉ thị khác nhau là lacZ, gfp và luxAB

43

3.1.2 Tối ưu hoá và xây dựng qui trình phân tích asen trong nước

giếng khoan bằng chủng vi khuẩn E coli luxAB

50

3.1.3 Ứng dụng biosensor vi khuẩn để đánh giá ô nhiễm asen trong

nước giếng khoan tại Việt Nam

59

3.2 Mối tương quan giữa ô nhiễm asen trong nước giếng khoan với mức

độ thâm nhiễm asen trên người

65

3.2.2 Mối tương quan giữa ô nhiễm asen trong nước giếng khoan,

nước đã lọc với hàm lượng asen trong tóc

73

3.2.3 Mối tương quan giữa ô nhiễm asen trong nước giếng khoan,

nước đã lọc với hàm lượng các dạng asen methyl hoá trong

nước tiểu

76

Danh mục các công trình khoa học của tác giả liên quan tới luận án 97

Danh mục các bảng

Bảng 1.1 Ví dụ hiện trạng ô nhiễm asen trong nước ngầm tại một số quốc gia

trên thế giới Bảng 2.1 Địa điểm và số lượng mẫu thu thập cho nghiên cứu ứng dụng

biomarker Bảng 3.1 So sánh kết quả phân tích asen trong 410 mẫu nước giếng khoan Bảng 3.2 Số liệu thực địa trong nghiên cứu về mức độ thâm nhiễm asen trong

tóc Bảng 3.3 Hàm lượng asen trung bình trong tóc, nước giếng và nước sinh hoạt

(đã lọc hoặc dùng trực tiếp) Bảng 3.4 So sánh mức độ ô nhiễm asen tại nghiên cứu này với một số địa điểm

trên thế giới Bảng 3.5 Hàm lượng asen trong nước tiểu, nước giếng và nước sinh hoạt (đã

lọc hoặc dùng trực tiếp)

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Hình 1.1 Mối quan hệ giữa biomarker và bioindicator

Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hoá các chất độc trong cơ thể

Hình 1.3 Sơ đồ giả thuyết về chuyển hoá của asen trong cơ thể người

Hình 2.1 Bản đồ các vị trí lấy mẫu sinh học

Hình 3.1 Kết quả thí nghiệm đánh giá hàm lượng asen trong nước bằng vi

khuẩn chỉ thị E coli lacZ

Hình 3.2 Ảnh chụp trên kính hiển vi huỳnh quang kết quả thí nghiệm đánh giá

hàm lượng asen trong nước bằng vi khuẩn chỉ thị E coli gfp

Hình 3.3 Tương quan giữa cường độ ánh sáng phát ra và nồng độ asen trong

dung dịch khi thử nghiệm với vi khuẩn chỉ thị E coli luxAB

Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với asen lên cường độ ánh sáng phát

ra ở phản ứng xúc tác bởi luciferase của vi khuẩn chỉ thị E coli luxAB

Hình 3.5 Ảnh hưởng của lượng cơ chất n-decanal lên cường độ ánh sáng phát

ra Hình 3.6 Ảnh hưởng của lượng sắt trong dung dịch lên khả năng sử dụng sinh

học asen đối với vi khuẩn chỉ thị E coli luxAB

Hình 3.7 So sánh tác dụng của các hoá chất tới khả năng sử dụng sinh học asen

đối với vi khuẩn chỉ thị E coli luxAB

Hình 3.8 Ảnh hưởng của lượng EDTA lên cường độ ánh sáng phát ra ở phản

ứng xúc tác bởi luciferase của vi khuẩn chỉ thị E coli luxAB

Hình 3.9 Cường độ ánh sáng phát ra ở phản ứng xúc tác bởi enzym luciferase

của vi khuẩn chỉ thị E coli luxAB khi dùng dung dịch NaOH và Natri Pyrophotphat 200mM

Hình 3.10 Quy trình phân tích hàm lượng asen trong nước giếng khoan bằng vi

khuẩn chỉ thị E coli luxAB

Hình 3.11 Khoảng đáp ứng động học của vi khuẩn chỉ thị E coli luxAB đối với

asen

Hình 3.12 Đường chuẩn biểu diễn tương quan giữa đáp ứng của vi khuẩn chỉ thị

với nồng độ asen pha trong nước giếng khoan Hình 3.13 Tương quan giữa số liệu về nồng độ asen trong nước giếng khoan thu

được từ vi khuẩn chỉ thị và quang phổ hấp thụ nguyên tử Hình 3.14 Bản đồ ô nhiễm asen tại một số khu vực thuộc đồng bằng sông Hồng Hình 3.15 Hàm lượng As trong các mẫu tóc thu tại đồng bằng sông Hồng

Hình 3.16 Hàm lượng As trong các mẫu tóc thu tại đồng bằng sông Mê Kông Hình 3.17 Phân bố hàm lượng asen theo nhóm tuổi

Hình 3.18 Phân bố phần trăm số mẫu tóc với hàm lượng asen trung bình ở nam,

nữ và trẻ em

Hình 3.19 Tương quan giữa hàm lượng asen trung bình trong tóc và trong nước Hình 3.20 Sắc ký đồ thu được khi phân tích các dạng asen trong nước tiểu Hình 3.21 Tương quan giữa hàm lượng asen methyl hoá trong nước tiểu và hàm

lượng asen trong nước Hình 3.22 Tương quan giữa hàm lượng asen methyl hoá với asen tổng số trong

nước tiểu của các thể không phơi nhiễm asen Hình 3.23 Tương quan giữa hàm lượng asen methyl hoá với asen tổng số trong

nước tiểu của các thể phơi nhiễm với asen ở mức độ khác nhau Hình 3.24 Tương quan giữa mức độ ô nhiễm asen trong nước sinh hoạt, asen

trong tóc và asen methyl hoá trong nước tiểu

MỞ ĐẦU

Đảm bảo chất lượng nước ăn và nước sinh hoạt cho cộng đồng dân cư tại khu vực nông thôn là một trong những vấn đề trọng tâm của chương trình chăm sóc sức khoẻ ban đầu hiện nay tại Việt Nam Đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Mê kông là hai khu vực tập trung đông dân nhất nước ta với dân số tương ứng 17,7 triệu và 16,9 triệu, chiếm gần 42,7% trong tổng số khoảng 80,9 triệu dân của cả nước (theo số liệu điều tra dân số năm 2003 của Tổng cục Thống kê) Ngoại trừ tại các thành phố, thị trấn có hệ thống cấp nước sạch tập trung từ các nhà máy nước, còn lại hầu hết dân cư sống xa đô thị đều phải tự khai thác và sử dụng các nguồn nước khác như nước mặt (nước sông, hồ), nước ngầm (nước giếng khơi, giếng khoan), nước mưa Để tránh một số bệnh như tiêu chảy, đau mắt, giun sán, v.v…do sử dụng nước sông, nước hồ gây ra, ngày nay hầu hết các hộ dân tại hai khu vực trên đã tự khoan giếng để lấy nước ngầm sử dụng cho các sinh hoạt hàng ngày như ăn uống, tắm giặt [5] Nhưng người dân lại có nguy cơ đối mặt với một ô nhiễm mang tính tự nhiên, đó là sự có mặt của nguyên tố asen (thạch tín) trong nước ngầm [78]

Asen khi thâm nhập hàng ngày vào cơ thể kể cả ở hàm lượng thấp cũng gây ra những tác hại cho sức khoẻ như: gây hoại tử các vết loét ở tay, chân, làm rối loạn sắc tố da, sừng hoá gan bàn tay, gan bàn chân, thậm chí liên quan tới bệnh tiểu đường, tim mạch, ung thư bàng quang, ung thư gan, v.v…[97] Do những tác hại lâu dài của asen lên sức khoẻ con người, ngày nay Tổ chức Y tế thế giới đã đề nghị mức giới hạn asen trong nước uống là

10g/l, Bộ Y tế Việt Nam cũng đã ban hành tiêu chuẩn về asen trong nước uống là 10g/l thay cho tiêu chuẩn Việt Nam năm 1995 là 50g/l [1, 2]

Từ những năm cuối của thế kỷ 20, thảm hoạ nhiễm độc asen do dùng nước giếng khoan đã được phát hiện tại các nước nam Á như Ấn Độ (vùng Tây Bengan), Bănglađet và Trung Quốc (vùng cao nguyên Nội Mông) [22,

78, 98] Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về tình trạng ô nhiễm asen trong nước ngầm, nước cấp tại khu vực Hà Nội và một số tỉnh lân cận [6, 13] Mức độ ô nhiễm asen tại một số tỉnh như Hà Nam, Hà Tây, phía nam Hà Nội được coi là nghiêm trọng ngang với các quốc gia bị ô nhiễm nặng nhất Đó là các kết quả ban đầu dựa trên việc phân tích hàm lượng asen của khoảng 14 nghìn trên tổng số 620 nghìn giếng, chiếm tỷ lệ 2,2% Như vậy, số giếng đã được điều tra vẫn rất ít so với số giếng còn lại cần được biết có ô nhiễm asen hay không Đây là bài toán cần giải quyết sớm không những chỉ ở Việt Nam

mà còn ở cả các nước khác đang chịu ô nhiễm asen [22] Các thiết bị có khả năng phân tích chính xác hàm lượng asen lại tập trung hầu hết ở các phòng thí nghiệm hiện đại, các viện nghiên cứu, các trường đại học Các phương pháp phân tích asen hiện trường theo nguyên tắc hoá học hiện đang được sử dụng khá phổ biến nhưng độ tin cậy lại chưa cao Chính vì vậy, việc nghiên cứu, chế tạo các công cụ phân tích asen nhanh, hiệu quả, chính xác theo nguyên tắc sinh học là hướng đi mới của các nhà khoa học trên thế giới

Để phát triển phép đo asen nhanh, một số biosensor dựa trên vi khuẩn chỉ thị asen đã được thiết kế trong phòng thí nghiệm nhờ việc lắp ghép gen cảm ứng đặc hiệu asen với gen chỉ thị tạo ra tín hiệu đo được [15, 74, 82, 85] Tuy nhiên độ tin cậy, khả năng ứng dụng thực tiễn để phân tích asen trong nước giếng khoan vẫn chưa được thử nghiệm, nhất là khi khả năng sử dụng sinh học asen (bioavailability) đối với vi khuẩn chỉ thị bị giảm đi bởi các thành phần hoá học khác trong nước

Để đánh giá mức độ thâm nhiễm asen ở người, các biomarker như hàm lượng asen trong tóc, hàm lượng các dạng asen hữu cơ bài tiết trong nước tiểu được sử dụng khá phổ biến Vấn đề ô nhiễm asen trong nước ngầm đã

được phát hiện tại Việt Nam nhưng số lượng công trình công bố về sự thâm nhiễm asen trong quần thể có phơi nhiễm asen do dùng nước giếng khoan vẫn còn rất hạn chế

Để góp phần vào việc triển khai ứng dụng công cụ phân tích asen bằng biosensor sử dụng vi khuẩn chỉ thị asen biến đổi gen, đánh giá mức độ thâm nhiễm asen ở người và đề xuất giải pháp giảm thiểu nhiễm độc asen, luận án

đã được thực hiện với chủ đề: “NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CÁC CHỈ THỊ HÓA

SINH ĐỂ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ Ô NHIỄM ASEN TRONG NƯỚC GIẾNG

gồm hai mục tiêu sau:

1 Chọn lựa và tối ưu phương pháp phân tích hàm lượng asen trong nước giếng khoan bằng biosensor sử dụng vi khuẩn chỉ thị

2 Đánh giá mối tương quan giữa ô nhiễm asen trong nước giếng

khoan với mức độ thâm nhiễm asen trên người

Kết quả thu được của luận án góp phần vào việc ứng dụng thành quả của công nghệ sinh học vào nhiệm vụ bảo vệ môi trường thông qua việc nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích asen trong nước bằng vi khuẩn chỉ thị biến đổi gen Luận án cũng đưa ra các bằng chứng về ô nhiễm asen trong nước sinh hoạt lấy từ giếng khoan, mức độ thâm nhiễm asen trên người do sử dụng các nguồn nước này Với các kết quả đó, bản luận án đóng góp một phần nhỏ

bé vào việc thực hiện các nhiệm vụ của chương trình Quốc gia về Asen trong nước ngầm

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Vấn đề ô nhiễm asen trong nước ngầm và nhu cầu phát triển công cụ phân tích nhanh

1.1.1 Nguyên tố asen trong tự nhiên và đời sống

Asen là nguyên tố hoá học thuộc nhóm V của bảng tuần hoàn Mendeleep, cùng nhóm với các nguyên tố N, P, Sb và Bi Asen có thể tồn tại trong các hợp chất

vô cơ và hữu cơ với bốn mức hoá trị là -3, 0, +3 và +5 Nguyên tố asen không tan trong nước, các muối của asen có độ tan khác nhau phụ thuộc vào pH, lực ion và thế ôxy hoá khử của môi trường Ví dụ trong môi trường trường mang tính khử và pH thấp As(III) sẽ chiếm ưu thế, ngược lại trong môi trường mang tính ôxy hoá và pH cao As(V) sẽ là dạng bền hơn [78, 97]

Asen có mặt trong hơn 200 loại khoáng khác nhau với nồng độ trung bình khoảng 2mg/kg Phổ biến nhất là các asenopyrit như orpiment As2S3, realgar AsS, mispikel FeAsS, loellingite FeAs2, nicolite NiAs, cobalite CoAsS, tennantite

Cu12As4S13, v.v… Từ các quặng này, quá trình phun trào núi lửa đã chuyển asen từ đất vào không khí Việc khai thác mỏ cũng rửa trôi các muối asen trong quặng và gây ô nhiễm asen trong nước mặt tại các khu vực xung quanh mỏ Trong tầng nước ngầm, quá trình hoà tan asen xảy ra theo cơ chế khử, tạm thời được giải thích như sau: các phản ứng sinh học, hoá học diễn ra trong lòng đất đã tiêu hao ôxy và tạo nên môi trường mang tính khử Sắt (III) - dạng kết tủa trong quặng sẽ chuyển thành sắt (II) - dạng dễ tan trong nước Quá trình này đồng thời làm cho asen rời khỏi quặng sắt và tan trong nước ngầm Một số khu vực đồng bằng thấp trũng, thường xảy ra lụt lội là nơi nước ngầm thiếu ôxy và có thế khử thấp (Eh < 100mV), ví dụ như Bănglađet, đồng bằng sông Gange, Ấn Độ, đồng bằng sông Hồng, Việt Nam

Và cũng chính tại đây, ô nhiễm asen trong nước ngầm đã được phát hiện trong thập

kỷ vừa qua [13, 60, 78]

Trong công nghiệp, asen được tạo ra nhờ quá trình khử ôxyt asen (As2O3)với than, ôxyt asen là sản phẩm phụ của quá trình luyện kim và thường có trong bụi

khói của quá trình nung quặng, nhất là luyện đồng Khoảng 70% sản lượng asen tạo

ra trên thế giới được dùng trong ngành xử lý gỗ, đó là các hợp chất asenat crom đồng (CCA), 22% dùng trong nông nghiệp, còn lại trong công nghiệp thuỷ tinh và dược phẩm Từ vài trăm năm trước đây asen đã được dùng phổ biến trong ngành thuộc da, là thành phần quan trọng của nhiều chất tạo màu, thuốc trừ côn trùng như các muối asenate của chì, natri, canxi, kẽm Thuốc trừ cỏ cho công nghiệp trồng bông là mononatri methylasonate, axit dimethylasinic Trong dược phẩm, dung dịch 1% kaliasenate (thuốc Fowler) đã được dùng để chữa bệnh bạch cầu, bệnh vảy nến, thấp khớp, hen, giang mai, v.v… Tuy nhiên các sản phẩm trên đã bị hạn chế sử dụng từ những năm 1974 trên toàn thế giới, khi các hoá chất nông nghiệp chứa clo

ra đời và trong y học người ta đã thay thế bằng nhiều thuốc kháng sinh mới Với độc tính rất cao nên asen đã được dùng khá phổ biến làm thuốc độc giết người từ thời Trung cổ cho tới giữa thế kỷ 19 mới bị hạn chế do con người lúc đó đã có cách

để phát hiện asen Hiện nay, các hợp chất asen vẫn được dùng trong các ngành công nghiệp gỗ (chất bảo quản gỗ), công nghiệp thuỷ tinh (tạo độ trong suốt của thuỷ tinh), chế tạo vật liệu bán dẫn (galiasenit), nông nghiệp (chất làm rụng lá) [41, 97]

Do sự tồn tại vốn có trong môi trường tự nhiên nên asen có mặt ở tất cả các

bộ phận của sinh quyển, tuy nhiên với các dạng hoá học và nồng độ khác nhau Trong mẫu nước, mẫu đất asen thường ở trạng thái vô cơ, ví dụ các muối asenite, asenate Ngược lại trong mẫu thực vật, động vật thì asen ở trạng thái hữu cơ, ví dụ asenocholine, asenobetain

Nồng độ asen trung bình trong không khí tại các vùng nông thôn, xa khu công nghiệp nằm trong khoảng 0,02- 4 ng/m3, tại đô thị khoảng 3-200 ng/m3, còn ở các khu công nghiệp và vùng lân cận có thể lên tới 1000 ng/m3

, đặc biệt ở các khu công nghiệp luyện kim màu [97]

Trong phần trên của nước biển, asen có mặt với nồng độ khoảng 1-2 µg/l Hàm lượng asen cũng thấp khoảng 10 µg/l ở vùng nước bề mặt như sông, hồ Tuy nhiên, khi ở gần nguồn phát thải ô nhiễm như các vùng mỏ, nhà máy luyện kim thì lượng asen trong nước bề mặt có thể cao tới 5 mg/l Thông thường, asen có mặt trong nước ngầm với nồng độ khoảng 1-2 µg/l, trừ các khu vực có núi lửa, có quặng

sulfit thì có thể lên tới 3 mg/l Nước ngầm tại các vùng đồng bằng trầm tích trẻ có thể chứa asen tới vài trăm µg/l

Trong đất, asen thường có mặt với hàm lượng khoảng 1 - 40 mg/kg, trong bùn lắng khoảng 5 - 3000 mg/kg, các mẫu bùn đất càng ở gần vùng ô nhiễm thì hàm lượng asen càng cao [78]

Các sinh vật biển thường chứa asen trong khoảng 1-100 mg/kg và chủ yếu là asen hữu cơ như asenobetain, asenosugar, trimethylasin, v.v Lượng asen trong cá nước ngọt thường nhỏ hơn cá biển và ở khoảng 1 mg/kg Các động vật giáp xác như tôm, cua, sò cũng chứa asen hữu cơ [97]

Trong cuộc sống, con người tiếp xúc với asen qua không khí, nước uống và thức ăn Lượng asen đi vào cơ thể hàng ngày cỡ 20-300 µg với khoảng 25% là asen

vô cơ, phần còn lại là asen hữu cơ Các dạng asen hữu cơ trong thức ăn như asenobetain, asenocholin tương đối không độc, ngược lại các dạng asen vô cơ lại rất độc, với liều gây chết ở người là 100 – 200 mg ôxyt asen [41, 97]

1.1.2 Vấn đề ô nhiễm asen trong nước giếng khoan trên thế giới và ở Việt Nam

Ô nhiễm asen trong nước giếng khoan trên thế giới

Asen vốn là thành phần tự nhiên của lớp trầm tích vỏ trái đất nên nó thường

có mặt trong các tầng nước ngầm và nước mặt tuy chỉ ở hàm lượng thấp khoảng vài µg/l Tuy nhiên, ở một số khu vực trên thế giới, nước ngầm có hàm lượng asen rất cao do lớp trầm tích có cấu trúc, thành phần hoá học thuận lợi cho việc hoà tan asen

từ đất Hiện tượng này được phát hiện tại các khu vực đồng bằng châu thổ thấp trũng, xảy ra lụt lội hàng năm, dòng chảy thuỷ văn chậm Các lớp bồi tích trẻ thiếu ôxy (mang tính khử) rất thuận lợi cho việc giải phóng asen từ đất ra nước [7, 13, 60, 78]

Sự có mặt của asen trong nước được coi là ô nhiễm khi nó vượt quá giới hạn

an toàn cho sức khoẻ của con người Dựa trên những số liệu về nguy cơ ảnh hưởng tới sức khoẻ của asen, năm 1993 Tổ chức Y tế Thế giới đã đề nghị hạ mức tiêu chuẩn của asen trong nước uống là 10 µg/l thay cho tiêu chuẩn trước đó là 50 µg/l

[43] Tuy nhiên tuỳ theo điều kiện cụ thể về cơ sở hạ tầng và năng lực cải tạo công nghệ xử lý nước, các quốc gia đã áp dụng tiêu chuẩn này một cách khác nhau Ví dụ Bănglađet, Trung Quốc, Ấn Độ, Mỹ hiện đang áp dụng tiêu chuẩn 50 µg/l, Nhật Bản, Liên minh châu Âu, Việt Nam áp dụng tiêu chuẩn 10 µg/l [6]

Nguồn nước ngầm có chứa asen trên 50 µg/l được phát hiện ở nhiều nơi trên thế giới như Achentina, Mêhicô, Chilê, Hunggary, Rumani, Mỹ, Đài Loan, Trung Quốc, Ấn Độ, Bănglađet, Nêpan, Myanma, Việt Nam, v.vv… Số lượng các địa điểm được coi là có nguồn nước ngầm ô mhiễm asen hiện vẫn gia tăng, nhất là khi chỉ số asen trong nước ngầm trở thành tiêu chuẩn xét nghiệm của các cơ sở cung cấp nước sạch Bảng 1.1 trình bày số liệu về tình hình ô nhiễm asen tại các nước Đông Á, một trong những khu vực đông dân và kém phát triển nhất thế giới [59, 77]

Bảng 1.1 Ví dụ hiện trạng ô nhiễm asen trong nước ngầm tại một số quốc gia trên thế giới [59, 77]

Tên nước Số dân chịu ảnh

hưởng (triệu)

Khoảng nồng độ asen trong nước ngầm (µg/l)

Năm phát hiện

Trong số các quốc gia có báo cáo ô nhiễm asen ở nước ngầm thì Bănglađet

và Ấn Độ là nghiêm trọng hơn cả Theo kết quả nghiên cứu của Chowdhury và cộng sự năm 2000, 9 tỉnh thuộc vùng Tây Bengan, Ấn Độ và 42 tỉnh của Bănglađet

có nước ngầm chứa asen trên 50 µg/l, cụ thể 59% trong số gần 11 nghìn giếng kiểm tra tại Bănglađet, 34% trong số 58 nghìn giếng tại Ấn Độ chứa asen trên 50 µg/l

Kết quả điều tra cho thấy 24,47% trong số 11 nghìn người tại Bănglađet và 15% trong số 29 nghìn người tại Ấn Độ được khám bệnh đã có các biểu hiện tổn thương

da Đó là kết quả sau 10 năm tiến hành điều tra tại Ấn Độ và 5 năm tại Bănglađet với rất nhiều nỗ lực của quốc gia kết hợp sự hỗ trợ quốc tế, tuy vậy các tác giả vẫn coi đó mới chỉ là một viên đá trong khối băng chìm [22] Diện tích bị ô nhiễm asen với những hậu quả nặng nề cho sức khoẻ cộng đồng vẫn cứ ngày một rộng hơn như trong cảnh báo của tác giả Chakraborti khi các nhà khoa học tiến hành nghiên cứu sang các khu vực khác thuộc Ấn Độ [18]

Báo cáo tổng kết tình hình bệnh tật do nhiễm độc asen tại Trung Quốc năm

2004 cho thấy, tám tỉnh thuộc Trung Quốc lục địa với hơn 2 triệu người đã thâm nhiễm asen từ nước giếng khoan, hàm lượng asen nằm trong khoảng 50 – 2000 µg/l Trong số đó 10 nghìn người được chẩn đoán là mắc các bệnh liên quan tới asen [98]

Các nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy vấn đề ô nhiễm asen trong nước giếng khoan và nguy cơ tác hại tới sức khoẻ người dân là rất lớn kể cả diện tích và

số người chịu ảnh hưởng Hơn thế nữa, đối tượng dùng nước giếng khoan thường là nông dân ở vùng nông thôn , cơ sở hạ tầng kém phát triển, nhận thức về an toàn vệ sinh nước ăn uống chưa cao Chính vì vậy, nhiệm vụ đánh giá hiện trạng ô nhiễm và

đề xuất các giải pháp giảm thiểu asen là những vấn đề cần được giải quyết triệt để càng sớm càng tốt [6]

Ô nhiễm asen trong nước giếng khoan tại Việt Nam

Trong những thập kỷ cuối của thế kỷ 20, UNICEF đã hỗ trợ chính phủ các nước nghèo giúp người dân tiếp cận với các nguồn nước sạch hơn để giảm tỉ lệ ốm đau do sử dụng nguồn nước kém vệ sinh Một trong những nguồn nước được coi là sạch hơn này là giếng khoan bơm tay Cũng nhờ vào các hoạt động nhân đạo này, vào những năm 1990 người dân nông thôn Việt Nam tại một số vùng đã được lắp đặt các giếng khoan để lấy nước sạch dùng cho sinh hoạt hàng ngày Tổng số giếng

do UNICEF hỗ trợ tại Việt Nam là khoảng 150.000 chiếc, tuy nhiên số lượng giếng khoan bơm tay và bơm điện hiện có đã lớn hơn rất nhiều Con số tạm ước tính có

khoảng 20,48% dân số Việt Nam (16,5 triệu người) đang dùng nước giếng khoan [6]

Theo quy định của Nhà nước Việt Nam ban hành năm 1995 về môi trường, giới hạn cho phép của asen trong nước ngầm và nước mặt dùng cho mục đích sinh hoạt là 0,05 mg/l (50µg/l) Năm 2002, Bộ Y tế Việt Nam đã ban hành tiêu chuẩn vệ sinh nước ăn uống, trong đó giới hạn tối đa cho hàm lượng asen là 0,01 mg/l (10 µg/l) Tiêu chuẩn này áp dụng cho nước dùng để ăn uống, nước dùng cho các cơ sở sản xuất, chế biến thực phẩm, nước cấp theo hệ thống đường ống từ các nhà máy nước ở khu vực đô thị, nước cấp theo hệ thống đường ống từ các trạm cấp nước tập trung cho 500 người trở lên Bộ Y tế khuyến khích các trạm cấp nước tập trung quy

mô cho dưới 500 người và các nguồn cấp nước sinh hoạt đơn lẻ áp dụng tiêu chuẩn này [1, 2]

Nghiên cứu về ô nhiễm asen trong nước tại Việt Nam đã được một số nhà khoa học tiến hành từ những năm 90 trước khi thảm hoạ asen được phát hiện tại Bănglađet Tuy nhiên các nghiên cứu này tập trung điều tra ở các vùng núi có hoạt động địa nhiệt, nguồn nước mặt với phạm vi nghiên cứu nhỏ, chưa hệ thống [4] Chỉ

từ những năm 1999 trở lại đây các nhà khoa học Việt Nam và thế giới mới tiến hành những khảo sát ô nhiễm asen quy mô rộng hơn, mang tính hệ thống hơn [6, 13] Sự

hỗ trợ kỹ thuật của các tổ chức quốc tế đã đóng góp đáng kể cho các hoạt động khoa học này Theo kết quả nghiên cứu của tác giả Berg và cộng sự, khi điều tra tại Hà Nội và các khu vực lân cận với diện tích 700 km2, mật độ lấy mẫu 1/10 km2

cho thấy, hàm lượng asen trung bình từ 68 giếng khoan là 159 µg/l, trong đó 48% có nồng độ asen cao hơn 50 µg/l, 20% cao hơn 150 µg/l Khu vực có biểu hiện ô nhiễm asen cao hơn cả là phía nam Hà Nội Mức độ ô nhiễm này cũng báo hiệu cho một qui mô ô nhiễm gần như ở Bănglađet và Ấn Độ [13, 18, 22]

Theo bản tổng hợp kết quả điều tra ô nhiễm asen trên toàn lãnh thổ Việt Nam vào tháng 10 năm 2004 của UNICEF, đồng bằng Bắc bộ và một số khu vực thuộc đồng bằng Nam bộ là những khu vực có ô nhiễm asen rõ rệt Bản báo cáo này cũng cho thấy các tỉnh có mức độ ô nhiễm cao hơn như Hà Nam, Hà Tây, phía Nam Hà Nội, Đồng Tháp và An Giang Đặc biệt tại Hà Nam mức độ ô nhiễm đạt giá trị

ngang như Bănglađet với 62,1% số mẫu vượt 50 µg/l, tại Hà Tây 24,7 % số mẫu có hàm lượng asen cao hơn 50 µg/l Cũng theo tổng kết của tổ chức này, cho đến nay ở Việt Nam chưa có những ca bị nhiễm asen được báo cáo chính thức Tuy nhiên đã

có 8 người được đưa vào danh sách những bệnh nhân bị nghi mắc bệnh nhiễm asen [6] Như vậy vấn đề ô nhiễm asen trong nước giếng khoan dùng cho sinh hoạt tại nông thôn Việt Nam là một thực trạng đáng lo ngại Tuy nhiên quy mô, mức độ ô nhiễm trên toàn quốc vẫn chưa được điều tra đầy đủ

1.1.3 Nhu cầu phát triển công cụ phân tích nhanh, phục vụ cho nhiệm vụ đánh

giá hiện trạng ô nhiễm asen trong nước giếng khoan

Như đã trình bày ở phần trên, ô nhiễm asen trong nước giếng khoan là thực trạng đáng lo ngại ở cả Việt Nam và các nước khác trong khu vực Đông Nam Á với quy mô tác hại rất lớn kể cả diện tích và số người chịu ảnh hưởng Sau khi thảm hoạ môi trường do asen gây ra tại Bănglađet và Ấn Độ được phát hiện, các tổ chức chính phủ, phi chính phủ đã bắt tay vào cuộc nhằm tích cực giảm thiểu ảnh hưởng của sự cố này Một trong những mục tiêu của chính sách giảm thiểu nhiễm độc asen

là phải xác định hàm lượng asen tại tất cả các nguồn nước ngầm dùng cho sinh hoạt càng sớm càng tốt, để có biện pháp xử lý kịp thời Tại Việt Nam, Tiểu ban chỉ đạo quốc gia về giảm thiểu asen đã được thành lập tháng 10 năm 2002 trực thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, tiểu ban này đã đề xuất kế hoạch hành động gồm 5 mục tiêu trong đó có mục tiêu xây dựng hệ thống cơ sở dữ liệu và lập bản đồ những khu vực bị ô nhiễm asen vượt trên tiêu chuẩn quốc gia Các nhiệm vụ khảo sát ngẫu nhiên, khảo sát đại trà, khảo sát thường xuyên có nhiệm vụ cung cấp dữ liệu cho mục tiêu nói trên Tuy các chương trình quốc gia về asen đã bắt đầu hoạt động, nhưng hiện nay cơ sở dữ liệu mang tính đại diện, hệ thống về ô nhiễm asen vẫn chưa có Các kết quả điều tra mới chỉ tập trung vào một số xã, huyện cụ thể, nơi được coi là có ô nhiễm cao [6] Tuy vậy một bài toán thực tiễn đặt ra là làm thế nào

để hoàn thành nhiệm vụ khảo sát số lượng giếng quá nhiều và hầu hết nằm xa thành phố Ví dụ tại Bănglađet, trong chiến dịch khảo sát trọng điểm 5 năm tính đến năm

2002 mới chỉ phân tích được khoảng 10% trong tổng số 11 triệu giếng khoan [27, 53] Ở Việt Nam theo số liệu chưa đầy đủ của UNICEF, tổng số giếng khoan của 7 tỉnh thuộc khu vực đồng bằng Bắc bộ là khoảng 620 nghìn (Hà Nam, Hà Tây, Hải Dương, Hưng Yên, Nam Định, Quảng Ninh, Thái Bình) Với sự hỗ trợ của UNICEF, trong số này khoảng 13 nghìn giếng (2,1%) đã được phân tích asen bằng dụng cụ phân tích ngoài hiện trường kiểu hoá học Các tổ chức khác cũng đã phân tích được khoảng 0,1% Như vậy số giếng còn lại cần phân tích asen là rất lớn [6] Ngoài ra, sự phân bố của hàm lượng asen trong nước giếng khoan tại một số khu vực lại không đồng đều với nguyên nhân chưa được tìm hiểu kỹ Ví dụ, hai giếng cách xa nhau khoảng 100 m có thể có hàm lượng asen khác nhau từ vài chục đến vài trăm µg/l [13, 94] Như vậy, cần phải phân tích mẫu nước của từng giếng với công cụ có độ chính xác cao, khả năng phân tích nhanh và chi phí thấp

Về mặt nguyên tắc, trong phòng thí nghiệm người ta có thể dùng một trong các công cụ sau để phân tích asen tổng số hoặc các dạng hợp chất của asen

 Quang phổ hấp thụ nguyên tử (Atomic Absorption Spectrometry - AAS),

 Quang phổ huỳnh quang nguyên tử (Atomic Fluorescent Spectrometry - AFS),

 Khối phổ cảm ứng liên kết plasma (Induced Couple Plasma – Mass Spectrometry ICP-MS)

 Điện hoá (Voltametry)

 Quang phổ Tử ngoại-Khả kiến (UV-Vis)

 Sắc ký trao đổi ion ghép nối với khối phổ cảm ứng liên kết plasma (Ion Chromatography - Induced Couple Plasma – Mass Spectrometry, IC-ICP-MS)

Trong điều kiện phòng thí nghiệm chuẩn, các phương pháp trên đều đạt được giới hạn phát hiện asen nhỏ hơn 10 µg/l [8] và đáp ứng nhiệm vụ phân tích asen trong nước Tuy nhiên các thiết bị này thường chỉ có ở những phòng thí nghiệm hiện đại, các trung tâm nghiên cứu lớn Để đáp ứng nhiệm vụ phân tích, công sức và chi phí cho việc vận chuyển mẫu từ các tỉnh xa về thành phố là khá lớn

Chính vì vậy, khi phân tích nhiều mẫu tại địa phương với các cán bộ ít kinh nghiệm thì giải pháp sử dụng công cụ đo hiện trường đơn giản là hợp lý hơn Hiện nay các bộ dụng cụ xác định asen hiện trường kiểu hoá học được sử dụng rộng rãi tại các quốc gia có ô nhiễm asen nặng như Bănglađet, Ấn Độ, Việt Nam, v.v… Nguyên tắc hoạt động của chúng dựa trên phản ứng giữa khí asin (AsH3) và bromit thuỷ ngân, tạo ra màu vàng Độ đậm nhạt của màu sắc tỉ lệ với nồng độ asen trong mẫu, người phân tích so sánh màu tạo ra với bảng màu đối chứng cho sẵn mà kết luận hàm lượng asen nằm trong khoảng nào Tuy giới hạn phát hiện được ghi là khoảng 10 - 50 µg/l nhưng độ tin cậy của phương pháp này vẫn là câu hỏi đáng quan tâm [48, 65] Theo báo cáo của Rahman và các cộng sự vào năm 2002, khoảng 1,3 triệu giếng tại Bănglađet đã được kiểm tra với chi phí khoảng 2 đôla cho một phép phân tích kể cả xử lý số liệu (so với giá 9 đôla cho một phép phân tích bằng thiết bị hiện đại) Khi so sánh kết quả phân tích chéo 290 mẫu bằng phương pháp phân tích hiện trường và trong phòng thí nghiệm cho thấy, với vùng nồng độ từ 10 –

100 µg/l, tỷ lệ sai lệch âm là 68%, sai lệch dương là 35% Kết quả phân tích lại

2966 giếng bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử cũng cho thấy trong số 1920 giếng

đã đánh dấu là an toàn (< 50 µg/l asen) thì có tới 862 giếng là không an toàn (> 50 µg/l asen), chiếm 44,9% [65] Tại Việt Nam, theo báo cáo của Viện Công nghệ Môi

trường, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam thì trong số 511 mẫu được đối chiếu kết quả thu được bằng phân tích nhanh ngoài hiện trường và bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử cho thấy 333 mẫu có kết quả là chấp nhận được (sai số < 50%), như vậy còn lại 178 mẫu là chưa chấp nhận được (sai số > 50%) chiếm tỉ lệ 34,8% Ngoài ra độ chính xác của số liệu thu được từ các mẫu có nồng độ nằm trong khoảng 11 – 200 µg/l chỉ đạt 65 –70% [19]

Nhược điểm chủ yếu của các bộ phân tích asen hiện trường đang được lưu hành nằm ở chính phần đánh giá độ đậm nhạt của màu sắc dung dịch phản ứng Khi nồng độ asen rất thấp (nhỏ hơn giới hạn phát hiện 10 µg/l) hoặc rất cao (>200 µg/l) thì sự tương phản của màu sắc dễ nhận diện, nó là không có màu hoặc màu rất đậm Còn ở vùng nồng độ thấp (10 –100 µg/l) thì khó khăn hơn Khả năng và kinh

nghiệm so sánh độ đậm nhạt màu sắc của người quan sát ảnh hưởng tới độ chính xác của phép phân tích [19, 48, 65]

Với nhu cầu và thực trạng về công cụ phân tích asen nhanh tại các vùng xa thành phố, các nhà khoa học trên thế giới đã phát triển, hoàn thiện thêm các phương pháp phân tích asen hiệu quả và ít chi phí trong đó có biosensor sử dụng vi khuẩn chỉ thị [15, 30, 74, 82, 85]

1.2 Biosensor sử dụng vi khuẩn chuyển gen để phân tích asen trong nước 1.2.1 Biosensor sử dụng các tế bào vi khuẩn

Để đánh giá mức độ ô nhiễm môi trường của một hoá chất độc hại nào đó người ta có thể sử dụng hoặc các công cụ hoá học hoặc các công cụ cảm biến sinh học (biosensor) Một biosensor thường bao gồm phần tạo tín hiệu mang bản chất hoá sinh và phần chuyển đổi tín hiệu đó sang dạng đo lường được Phần tạo tín hiệu dựa trên đáp ứng của bộ phận cảm ứng như enzym, kháng thể, chất nhận quang tử, axit nucleic hoặc các tế bào vi khuẩn với chất cần nghiên cứu Biosensor đầu tiên được nghiên cứu bởi Clark năm 1962, chứa glucoseoxidase xúc tác cho quá trình ôxy hoá glucose thành gluconolacton và hydroperoxyt Hydroperoxyt chuyển hoá thành ôxy phân tử và nước, lượng ôxy tạo thành được phát hiện nhờ điện cực platin Như vậy lượng glucose sẽ được xác định dựa trên lượng ôxy tạo thành [56] Các biosensor có thể được dùng để quan trắc một loại hoặc một nhóm chất nào đó đã được định danh trước Biosensor có thể xác định sự thay đổi nồng độ của một chất hiện có hoặc của một sản phẩm mới sinh ra trong môi trường Trong khi các phương pháp phân tích hoá học thường chỉ cho biết hàm lượng của chất ô nhiễm trong mẫu, phương pháp biosensor còn có thể cung cấp thêm những thông tin về mức độ sử dụng sinh học và tác hại của chất ô nhiễm đối với đối tượng đáp ứng [11, 32]

Biosensor có thể là một hệ thống tế bào nguyên vẹn (whole cell biosensor), một dịch chiết chứa enzym hoặc kháng thể của tế bào Biosensor chứa enzym hoặc kháng thể đã tinh chế thường có tính chọn lọc cao và khả năng phát hiện tốt Nhưng

nó cũng có những nhược điểm là quá trình tinh sạch khá tốn kém, enzym tách ra thường kém bền, cần bảo quản nghiêm ngặt Chính vì vậy để phục vụ phân tích ngoài hiện trường người ta thường dùng các tế bào nguyên vẹn thay cho enzym đã tinh sạch Các biosensor sử dụng tế bào vi khuẩn có một số ưu điểm sau: vi khuẩn

có mặt phổ biến trên trái đất, phổ trao đổi chất rộng, phát triển nhanh, dễ bảo quản, chịu được nhiều điều kiện sống bất lợi, vi khuẩn là các đối tượng có thể được biến đổi gen nhờ kỹ thuật di truyền tạo nên các cấu trúc có đáp ứng đặc hiệu với đối

vận chuyển các chất phân tích qua màng tế bào đến thụ cảm bên trong tế bào thường chậm, tính đặc hiệu có thể thấp hơn so với biosensor sử dụng enzym do các phản ứng phụ xảy ra bởi các enzym khác có mặt trong tế bào, tính ổn định và độ lặp lại có thể chịu tác động của điều kiện bên ngoài [11, 28, 30]

Trong thực tế đã có khá nhiều nghiên cứu nhằm chọn lọc và ứng dụng các biosensor vi khuẩn để đánh giá sự ô nhiễm môi trường, ví dụ chủng vi khuẩn

Pseudomonas fluorescence NCIMB 11764 với tính năng phân giải đặc hiệu hợp chất cyanit, chủng Moraxella sp có khả năng phân giải chọn lọc hợp chất p-

nitrophenol đã được dùng làm biosensor để phân tích các hợp chất cyanit và nitrophenol Các loại biosensor này có cấu trúc gồm các tế bào vi khuẩn định vị trên màng của điện cực ôxy, sự có mặt của các chất nói trên sẽ được ghi nhận lại nhờ lượng ôxy tiêu hao cho quá trình phân giải chúng [50, 57] Để đánh giá mức ô nhiễm một số kim loại nặng trong đất, nước như asen, đồng, chì, cadmi, người ta có

p-thể sử dụng chủng vi khuẩn biển có khả năng phát quang sinh học là Vibrio fischeri

(MicroTox®) Độ phát quang của vi khuẩn sẽ giảm tỉ lệ với hàm lượng các kim loại độc hại Tuy nhiên dạng biosensor này thường kém ổn định và không có khả năng nhận dạng đặc hiệu chất gây độc [30]

Sự phát triển của các kỹ thuật chuyển gen đã cho phép tạo ra các chủng vi khuẩn có khả năng phát hiện chất ô nhiễm môi trường một cách chọn lọc nhờ gắn kết các gen đáp ứng đặc hiệu với chất ô nhiễm và gen chỉ thị có độ nhạy cao Ví dụ

tác giả Ikeno và cộng sự đã đưa plasmit pTS301-GFP chứa các gen liên quan tới sự phân giải benzen và gen chỉ thị gfp vào vi khuẩn E coli để tạo ra biosensor có đáp

ứng đặc hiệu với các hợp chất nhóm benzen, vi khuẩn chỉ thị biến đổi gen này có thể phát hiện dẫn xuất xylen ở nồng độ 0,1 mM [45] Để phát hiện và định lượng chất kháng sinh tetracycline, các nhà khoa học Đan Mạch đã gắn gen khởi động cảm ứng tetracycline Ptet với các gen chỉ chị lacZYA, luxCDABE hoặc gfp và đưa vào vi khuẩn E coli Chủng vi khuẩn biến đổi gen này đã được ứng dụng để xác định dư lượng tetracycline trong sữa [38] Xu hướng tạo ra các chủng vi khuẩn biến

đổi gen đã và đang được phát triển nhằm tạo ra các biosensor phát hiện kim loại nặng nói chung [30, 85] và asen nói riêng [15, 82]

1.2.2 Biosensor vi khuẩn đáp ứng đặc hiệu với asen và có gắn các gen chỉ thị

khác nhau

1.2.2.1 Gen kháng asen ở vi khuẩn E coli (arsenic resistance gene)

Asen là một nguyên tố hoá học có mặt phổ biến trong tự nhiên cũng như trong các hoạt động của con người Trong nước, asen tồn tại chủ yếu ở cả dạng asenat AsO43- (hoá trị V) và asenit AsO2- (hoá trị III) Do cấu trúc hoá học của hợp chất asenat tương tự như photphat nên nó có thể cạnh tranh vai trò của photphat và làm rối loạn quá trình trao đổi chất Sự nhiễm độc asen ở vi khuẩn có thể coi tương

tự như thiếu hụt photphat cho hoạt động sống Asenit có độc tính cao hơn asenat, trong tế bào asenit có khả năng gắn kết mạnh với các nhóm sulfhydril của protein và làm bất hoạt enzym Trải qua quá trình tiến hoá, sinh vật trên trái đất đã tích luỹ khả năng chống lại tính độc của các hợp chất chứa asen Khả năng loại bỏ các dạng asen độc hại ra khỏi cơ thể còn được gọi là tính kháng asen Tính kháng asen ở vi sinh vật nhân sơ, nhân chuẩn tương đối giống nhau và gồm các giai đoạn sau [46, 68, 69, 76]:

(i) Asenat(V) thâm nhập vào tế bào nhờ các tác nhân vốn làm nhiệm vụ vận chuyển photphat Asenit(III) thâm nhập vào tế bào nhờ các tác nhân thuộc nhóm aquaglyceroporin vận chuyển

(ii) Trong tế bào, asenat(V) được khử về asenit(III) nhờ các reductase Đã

xác định được tác nhân khử là glutaredoxin ở E coli và thioredoxin ở Staphylococcus aureus

(iii) Asenit (III) được đưa ra khỏi tế bào nhờ các protein vận chuyển màng theo nguyên tắc thẩm thấu hoặc tiêu hao năng lượng ATP

Các gen mã cho tính trạng kháng asen được tìm thấy ở cả plasmit và nhiễm sắc thể của tế bào vi khuẩn, tuy nhiên cấu trúc của các gen nằm trên plasmit được

nghiên cứu kỹ hơn cả Ví dụ plasmit R773 ở E coli [46], plasmit pI258 ở Staphylococcus aureus [25], plasmit AIU 301 ở Acidiphilium multivorum [83]

Ở E coli, operon ars mã cho các tính trạng khử asenat và vận chuyển asenit

nằm ở đoạn plasmit R773 có kích thước 91kb Operon này hoạt động khi cảm ứng

với các nguyên tố hoá học như asen, bitmut, antimony và không làm ảnh hưởng tới

sự thu nhận photphat Operon ars chứa 5 gen là arsR, arsA, arsB, arsC và arsD Gen arsR mã cho protein ArsR điều khiển hoạt động của cả operon ars theo cơ chế

ức chế Khi không có asen, ArsR liên kết với vùng điều khiển của operon ars và

kìm hãm hoạt động của operon này Các kim loại như asen, antimony khi thâm nhập

tế bào sẽ gắn với protein ArsR và tách chúng khỏi mối liên kết với vùng điều khiển,

operon ars thoát khỏi trạng thái bị kìm hãm và chuyển sang trạng thái hoạt động để chống lại sự có mặt của các kim loại độc kể trên Gen arsA mã cho ATPase, nó có

nhiệm vụ điều khiển bơm protein thông qua sự thuỷ phân ATP và cung cấp năng

lượng Gen arsB mã cho protein vận chuyển màng ArsB, tạo nên các kênh vận

chuyển As và Sb ra khỏi tế bào Hai gen này làm thành phức hệ vận chuyển asen

theo kiểu tiêu hao năng lượng hoặc thẩm thấu hoá học Gen arsC mã cho asenat reductase, xúc tác quá trình khử asenat thành asenit Gen arsD mã cho protein điều khiển sự hoạt động quá mức của cả operon ars Với chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, trên plasmit pI258 cũng tồn tại các gen arsR, arsB và arsC có cấu trúc và chức năng tương tự như các gen cùng tên ở E coli [46, 76] Theo nghiên cứu của tác giả Carlin, trên nhiễm sắc thể của E coli cũng có operon ars nhưng khả năng kháng asen của các gen này yếu hơn so với các gen ars nằm trên plasmit [16]

1.2.2.2 Các gen chỉ thị thường được sử dụng trong biosensor vi khuẩn

Gen chỉ thị là gen mã cho các protein chỉ thị Tự thân các protein này, hoặc khi đóng vai trò là enzym xúc tác, tạo ra những sản phẩm có thể nhận dạng dễ dàng,

đo lường được Các gen chỉ thị được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu biểu hiện gen và chuyển gen, cơ chế gây tín hiệu ngoại bào, ví dụ trong phát triển dược phẩm mới, chế tạo các loại biosensor phát hiện chất ô nhiễm môi trường Các gen chỉ thị

và gen cấu trúc thường được điều khiển bởi cùng gen khởi động Khi cảm ứng với tác nhân cần phân tích gen khởi động sẽ kích hoạt, điều khiển gen cấu trúc và gen chỉ thị để tạo ra protein chỉ thị Một trong những tính chất quan trọng của gen chỉ thị

là phải tạo ra các sản phẩm khác biệt rõ ràng với tín hiệu nền Sự biểu hiện của gen chỉ thị cần phải thực hiện bằng các thí nghiệm đơn giản, mang tính định lượng Có

thể kể tên một số các protein chỉ thị được ứng dụng nhiều là cloramphenicol acetyltransferase, -galactosidase, luciferase của vi khuẩn, luciferase của đom đóm, aequorin, protein huỳnh quang xanh lá cây, uroporphyrinogen III methyltransferase Mỗi loại protein chỉ thị nói trên đều có những ưu và nhược điểm khác nhau tuỳ theo điều kiện thí nghiệm và phương pháp phát hiện Việc lựa chọn gen chỉ thị phụ thuộc vào hoạt tính nền của tế bào, biểu hiện của gen và hiệu quả của việc chuyển gen, khả năng ứng dụng của phương pháp phân tích, v.v… [30, 81]

Để chế tạo các biosensor ứng dụng trong phân tích môi trường thì các tính năng như độ nhạy, khoảng đáp ứng tuyến tính, khả năng ứng dụng rộng rãi với nhiều loại mẫu là những tiêu chuẩn quan trọng khi chọn lựa gen chỉ thị [56] Thực tiễn cho thấy -galactosidase, luciferase vi khuẩn, và protein huỳnh quang xanh lá cây là những protein chỉ thị đã được ứng dụng nhiều hơn cả Tuy nhiên tuỳ thuộc vào yêu cầu phân tích định tính hay định lượng mà mức độ áp dụng của các gen chỉ thị này cũng khác nhau [68, 82]

Gen lacZ ở vi khuẩn E coli mã cho protein -galactosidase, enzym này xúc

tác cho quá trình thuỷ phân các dạng đường -galactosides tạo ra các sản phẩm có thể đo lường được Trong thực tiễn người ta có thể sử dụng nhiều loại cơ chất và kỹ thuật phân tích khác nhau để đánh giá hoạt tính của -galactosidase [30, 58], ví dụ

 Cơ chất o-nitrophenyl -galactopyranoside (ONPG) dùng với máy so màu, cách này khá đơn giản, nhanh chóng nhưng độ nhạy kém và khoảng động học hẹp

 Cơ chất 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- -galactoside (X-gal) dùng với

kỹ thuật hoá màu, có thể nhận dạng bằng mắt thường Cách này về nguyên tắc cũng giống như cách so màu nhưng thời gian thí nghiệm dài hơn

 Cơ chất 4-methylumbellieryl--galactopyranoside (MUG) dùng với máy đo huỳnh quang, cách này có ưu điểm là độ nhạy rất tốt nhưng cần dùng máy quang phổ huỳnh quang

 Cơ chất p-aminophenyl--galactopyranoside (PAPG) dùng với máy

đo điện hoá, cách này cũng có khả năng đo nhanh, nhưng lại cần cho thêm cơ chất khác phục vụ cho việc đo điện hoá

Các gen luxAB, luxFF mã cho các luciferase, đó là tên gọi chung cho các

loại enzym xúc tác cho phản ứng phát quang Quá trình phát ra ánh sáng bởi các cơ thể sinh vật chứa luciferase được gọi là sự phát quang sinh học Luciferase có mặt khá phổ biến trong tự nhiên, có thể tìm thấy ở vi khuẩn, trùng roi, nấm, sứa, côn trùng, cá, tôm, mực, v.v… trong đó ở vi khuẩn đã tìm thấy nhiều loài chứa

luciferase, ví dụ Vibrio, Photobacterium, Xenorhabdus Một trong những ứng dụng

sớm nhất của luciferase vi khuẩn là thí nghiệm Microtox Người ta đưa vi khuẩn phát sáng tự nhiên vào môi trường có chứa chất độc nào đó Dựa vào sự suy giảm của độ phát sáng ở vi khuẩn khi tiếp xúc với chất độc so với đối chứng để suy đoán mức độc hại của môi trường

Gen luxAB ở vi khuẩn mã cho luciferase xúc tác cho quá trình ôxy hoá một

flavin khử (FMNH2) và một aldehit béo thành FMN và axit béo Phản ứng này phát

ra ánh sáng màu xanh ve có cường độ cực đại ở bước sóng 490 nm Trong cơ thể vi khuẩn, aldehit tetradecanal (C13H25CHO) được tổng hợp tự nhiên bởi gen luxCDE

và là cơ chất của luciferase, tuy nhiên cũng có thể dùng một số aldehit mạch thẳng khác để thay thế như decanal (C9H19CHO) Ưu điểm nổi bật của protein chỉ thị này

là tạo ra tín hiệu có độ nhạy tốt, mang tính định lượng, chính xác, thí nghiệm nhanh, khá đơn giản Tuy nhiên, nhược điểm cần lưu ý là độ bền nhiệt kém khi tồn tại ở nhiệt độ trên 30o

C, khoảng tuyến tính hẹp < 103

[36]

Gen gfp mã cho quá trình tạo ra các protein phát huỳnh quang xanh lá cây (Green Fluorescent protein - GFP) Ví dụ, aequorin tạo ra ở loài sứa Aequorea Victoria, green fluorescent protein ở cây hoa păngxê biển Renilla reniformis Phổ

kích thích của GFP có cực đại ở bước sóng tử ngoại khoảng 395nm và phổ phát xạ

có cực đại ở bước sóng 509 nm Như vậy các tế bào có chứa GFP sẽ phát ánh sáng huỳnh quang khi được kích thích bởi tia tử ngoại Sự phát sáng huỳnh quang có thể quan sát bằng mắt, nhìn dưới kính hiển vi huỳnh quang hoặc đo bằng máy quang phổ huỳnh quang GFP được ứng dụng rộng rãi làm protein chỉ thị trong nghiên cứu

sự biểu hiện gen, xác định các tế bào đã chuyển gen Ưu điểm cơ bản của GFP là khả năng tự phát quang, nên khi sử dụng nó không cần thêm cơ chất, có độ bền sinh học cao, thí nghiệm đơn giản Nhược điểm của GFP là có thể bị nhiễu bởi các phân

tử phát huỳnh quang khác vốn có trong tế bào GFP có độc tính đối với một số dòng

tế bào động vật nên phạm vi ứng dụng bị hạn chế Khi sử dụng trong các biosensor

vi khuẩn GFP có độ nhạy kém hơn luciferase và thời gian cảm ứng dài hơn [30, 36,

trên), hai gen này cùng hoạt động khi có mặt asen Vi khuẩn E coli tự nhiên có plasmit R773 chứa operon kháng asen gồm 5 gen arsA arsB, arsC, arsD, arsR Trong đó gen arsR là gen mã cho protein ức chế vùng khởi động của cả operon ars Tuy nhiên, khi vi khuẩn E coli tiếp xúc với asen, operon ars sẽ hoạt động nhưng không tạo ra các tín hiệu đo được Dựa vào khả năng kháng asen tự nhiên của E coli, các tác giả đã thiết kế các plasmit chứa cả gen arsR và gen chỉ thị Hệ gen này

sẽ tạo ra tín hiệu khi tế bào E coli tiếp xúc với asen Sau đây là những ví dụ về các

chủng vi khuẩn chỉ thị asen đã được tạo ra

 Tác giả Tauriainen đã tạo ra các chủng E coli MC1061 (pTOO31) và

E coli AW3110 (pTOO31) do kết hợp gen arsR từ plasmit R773 và gen luc ở đom đóm, các chủng này có tín hiệu đáp ứng rõ rệt tại nồng

E coli pMV- arsR có chứa gen chỉ thị lacZ, chủng thứ hai là E coli pJAMA-arsR chứa gen chỉ thị luxAB, chủng thứ ba là E coli pPR- arsR chứa gen chỉ thị gfp Các chủng vi khuẩn chỉ thị này có đáp ứng

rất tốt với asenit, giới hạn phát hiện asenit trong dung dịch chuẩn là 4

g/l, đáp ứng với asenat có yếu hơn Các chủng này đã thể hiện tiềm năng ứng dụng trong thực tiễn rất lớn [82]

 Tác giả Rabbow đã tạo ra các chủng Salmonella typhimurim TA1535 chứa plasmit pPLS-1 (ký hiệu là SOS-LUX-TEST) và plasmit pGFPuv (ký hiệu là LAC-FLUORO-TEST) Các chủng vi khuẩn này

thể hiện khả năng đáp ứng định lượng với các muối kim loại nặng trong đó có asen [62]

Hiện nay hầu hết các sản phẩm vi khuẩn chỉ thị asen mới chỉ được kiểm nghiệm trong điều kiện phòng thí nghiệm khi sử dụng dung dịch chứa asen tinh khiết Lúc này tính sử dụng sinh học của asen đối với vi khuẩn là nguyên vẹn, không chịu tác động của các yếu tố khác nên thường đạt giá trị đáp ứng cực đại, khả năng phát hiện asen trong mẫu khá tốt Ngược lại trong thực tiễn, độ hoà tan của asen trong mẫu nước giếng khoan chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố, đặc biệt là

sự có mặt của sắt Sự khác biệt rất lớn giữa hàm lượng asen với các thành phần hoá học khác cũng là yếu tố cần lưu ý Thông thường trong nước giếng khoan, asen ở mức phần tỉ (g/l), trong khi các thành phần hoá học có ảnh hưởng khác như sắt, amonium lại ở mức phần triệu (mg/l), tức là lớn hơn 1000 lần [13] Việc sử dụng vi khuẩn chỉ thị asen ở nồng độ rất thấp như vậy thường gặp nhiều khó khăn [73]

Độ tan của sắt trong dung dịch nước thấp (hằng số K = 1,84 x 10–3 ở pH<1),

ở pH trung tính Fe(III) thường tạo thành các gel keo tụ màu vàng [26] Nước giếng khoan ô nhiễm asen thường có hàm lượng sắt cao từ 5- 30 mg/l Khi còn ở trong tầng nước ngầm với tính khử, Fe 2+

ở trạng thái hoà tan Nhưng khi bơm lên khỏi giếng Fe2+

được ôxy hoá bởi ôxy không khí và chuyển thành Fe(OH)3 kết tủa, kéo theo sự hấp thụ asen trên các hạt keo tụ đó Quá trình này có thể làm giảm nồng độ asen hoà tan trong nước từ 50 – 80% Như vậy khả năng sử dụng sinh học asen đối

với tế bào vi khuẩn giảm đi rất nhiều mặc dù asen vẫn có mặt trong mẫu, nhưng không thâm nhập vào tế bào vi khuẩn

Để góp phần đưa tiến bộ khoa học vào ứng dụng thực tiễn, một trong những nhiệm vụ trọng tâm của luận án là nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích asen trong nước giếng khoan tại Việt Nam bằng biosensor sử dụng vi khuẩn chỉ thị Các nội dung nghiên cứu đã được tiến hành trong phần này là:

 Chọn lựa hệ gen chỉ thị phù hợp,

 Tối ưu thời gian cảm ứng của biosensor với asen,

 Tối ưu hàm lượng cơ chất cho enzym chỉ thị,

 Chọn lựa phương pháp hạn chế sự kết tủa của sắt trong nước giếng khoan

 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp sử dụng biosensor để phân tích asen trong thực tiễn

1.3 Sử dụng các biomarker trong nghiên cứu thâm nhiễm asen trên người

1.3.1 Tác hại tới sức khoẻ gây ra bởi nhiễm độc asen

Nhiễm độc asen cấp tính

Asen có mặt ở khắp nơi trong môi trường với hàm lượng rất thấp Nhưng asen lại là một loại thuốc độc mạnh khi đưa vào cơ thể với liều cao Trong lịch sử, asen đã được dùng làm thuốc độc giết người nhất là thời Trung cổ cho tới giữa thế

kỷ 19 Liều gây chết ở người là 100 – 200 mg ôxyt asen Ngộ độc cấp tính asen gây nôn mửa, khô họng, co cứng cơ, đau bụng, ngứa tay chân, rối loạn mạch, suy nhược thần kinh, vã mồ hôi, đi ngoài, ảo giác, hỏng thận và tử vong Nếu sống sót sau nhiễm độc cấp tính thì cũng mắc một số bệnh như giảm tuỷ xương, thiếu máu, to gan, rối loạn sắc tố da, viêm dây thần kinh, viêm não, v.vv…[41, 97]

Nhiễm độc asen trường diễn

Thâm nhiễm với hàm lượng asen thấp, nhưng trong thời gian dài cũng gây nên nhiều tác hại nghiêm trọng cho sức khoẻ Những biểu hiện chung của nhiễm độc asen trường diễn là mệt mỏi, uể oải, mất cảm giác ngon miệng, sút cân Với thời gian thâm nhiễm dài, trên da sẽ xuất hiện những biến đổi sắc tố dạng chấm nhỏ như các giọt mưa Ngoài ra cũng có thể xuất hiện các nốt sần bằng hạt ngô ở lòng bàn tay và bàn chân Các bệnh mạch vành và mạch ngoại vi dẫn tới sự hoại tử ở chân (bệnh chân đen) cũng đã được báo cáo Asen được xếp vào nhóm các chất gây ung thư với rất nhiều bằng chứng từ nghiên cứu dịch tễ học ở người Asen được chứng minh là có liên quan tới sự gia tăng tỉ lệ các bệnh ung thư ở da, bàng quang, gan và phổi tại các khu vực có ô nhiễm [59]

Những tác hại tới sức khoẻ do sử dụng các nguồn nước có hàm lượng asen cao đã được nghiên cứu rất nhiều tại Đài loan, Bănglađet và Ấn Độ Tác giả Tseng

đã chứng minh được mối tương quan giữa sự nhiễm độc asen do dùng nước giếng đến bệnh thiếu máu cục bộ ở tim khi lấy mẫu tại vùng có bệnh nhân bị bệnh chân đen thuộc bờ biển tây nam Đài loan [89] Tiến hành nghiên cứu với 8102 cá thể

vùng đông bắc Đài loan, tương quan giữa thâm nhiễm asen với tỉ lệ mắc các bệnh ung thư bàng quang, thận và niệu quản đã thể hiện rất rõ rệt [21] Ảnh hưởng của sự nhiễm độc asen trường diễn đến sự phát triển của hệ thần kinh, tiểu đường type II cũng đã được phát hiện tại Đài loan và Bănglađet [64, 88, 90]

Năm 1983 tại khoa da liễu, trường y học nhiệt đới ở Calcuta người ta đã phát hiện những trường hợp tổn thương da do asen đầu tiên, đó là dân cư sống tại Tây Bengan, Ấn Độ và sau đó là những bệnh nhân đến từ Bănglađet Các đặc điểm tổn thương da chủ yếu gặp phải là biến đổi sắc tố ở ngực, cánh tay, cẳng chân, sừng hoá

ở khuỷu tay, gan bàn chân, gan bàn tay Sau khi loại bỏ một số nguyên nhân thì nước ăn của các bệnh nhân đã được mang đi kiểm tra và thủ phạm asen từ nguồn nước ngầm dùng làm nước ăn đã được khẳng định Kết quả điều tra cho thấy thời gian ủ bệnh do asen có thể là 10 năm hoặc lâu hơn, ví dụ đối với dạng sừng hoá nhưng cũng có thể là ngắn hơn nếu liều tiếp xúc cao hơn kết hợp với chế độ dinh dưỡng kém [22, 79]

1.3.2 Sử dụng các biomarker trong nghiên cứu thâm nhiễm asen trên người 1.3.2.1 Vai trò của các biomarker trong đánh giá nguy cơ nhiễm độc

Thuật ngữ biomarker mới được đưa ra trong những năm gần đây để chỉ bất

cứ một đáp ứng sinh học thể hiện sự thay đổi khỏi trạng thái bình thường của cá thể đối với một loại hoá chất gây hại môi trường ở mức độ cá thể hoặc thấp hơn Như vậy các biểu hiện hoá sinh, sinh lý, tế bào, hình thái, hành vi của sinh vật đều được coi là biomarker Các đáp ứng ở mức độ cao hơn cơ thể như quần thể, cộng đồng,

hệ sinh thái được coi là các bioindicator Mối quan hệ giữa biomarker và bioindicator được biểu diễn trong hình 1.1 Có thể chia biomarker thành hai loại, một loại liên quan tới sự thâm nhiễm và một loại liên quan tới tác động của chất ô nhiễm Biomarker cho sự thâm nhiễm là các biểu hiện cho thấy cơ thể đã thâm nhiễm với các hoá chất nhưng nó không cho biết mức độ của tác hại tới cơ thể Biomarker của tác động biểu hiện ảnh hưởng bất lợi của hoá chất tới cơ thể Biomarker có thể là đặc trưng và không đặc trưng, biomarker không đặc thù xuất hiện với tác động của nhiều chất ô nhiễm, trong khi biomarker đặc hiệu chỉ xuất

hiện khi có tác động của một loại hoá chất nào đó Việc xác định được mối tương quan giữa mức độ biến đổi sinh học và

Hình 1.1 Mối quan hệ giữa biomarker và bioindicator

tác hại của chúng rất quan trọng, nó liên quan tới việc đầu tư chi phí cho các giải pháp khắc phục Nghiên cứu và sử dụng các biomarker đóng vai trò quan trọng trong đánh giá mức độ thâm nhiễm, nguy cơ tác động tới sức khoẻ của tác nhân ô nhiễm môi trường Biomarker có thể là công cụ trực tiếp hoặc gián tiếp phản ánh thực trạng của một sự cố môi trường và góp phần tìm hiểu cơ chế gây độc cho cơ thể từ ô nhiễm đó [95]

Trong nhiễm độc trường diễn asen, các biểu hiện lâm sàng đặc thù như rối loạn sắc tố, tăng sản biểu bì, ung thư da thường xuất hiện sau một thời gian thâm

Chất

ô nhiễm

Biến đổi sinh hoá

Biến đổi sinh lý

Phản ứng của cơ thể

Biến đổi quần thể

Cấu trúc cộng đồng

Hệ sinh thái Thời gian đáp ứng dài

Mức độ tác hại tăng lên

Khả năng đánh giá tác động theo từng chất ô nhiễm càng khó

nhiễm dài, mức độ thâm nhiễm càng cao thì thời gian xuất hiện bệnh càng ngắn Trong các giai đoạn ủ bệnh và mức ô nhiễm vừa phải, các triệu chứng tổn thương lâm sàng khó được phát hiện, chính vì vậy các biomarker đã được đề xuất và áp dụng để đánh giá sớm mức độ thâm nhiễm và nguy cơ ảnh hưởng tới sức khoẻ Đó chính là hàm lượng asen trong máu, nước tiểu, tóc, móng tay, móng chân Tuy nhiên, mức độ ứng dụng phổ biến trong thực tế có khác nhau trong số các biomarker nêu trên

Do thời gian lưu lại của asen trong máu chỉ khoảng một vài ngày, nên máu chủ yếu được dùng trong các vụ ngộ độc cấp tính, khi lượng asen vào cơ thể khá lớn Hơn thế nữa, việc lấy mẫu thường không dễ dàng nhất là trong các nghiên cứu trên quần thể dân cư đông, nên chỉ thị máu không được dùng rộng rãi trong nghiên cứu thâm nhiễm asen

Nước tiểu là loại mẫu chứa khá nhiều asen vì sau khi vào người, phần lớn asen đi ra ngoài qua nước tiểu trong khoảng vài ngày tới một tuần Nước tiểu thường được dùng trong điều tra nhiễm độc cấp tính và thâm nhiễm hiện tại Chỉ thị nước tiểu có ưu điểm là dễ lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển cũng không gặp nhiều khó khăn như chỉ thị máu Tuy nhiên, asen hữu cơ như asenobetain từ thức ăn nhất

là hải sản cũng được đào thải qua nước tiểu, nên chỉ số asen tổng trong nước tiểu có thể không hoàn toàn liên quan tới thâm nhiễm asen từ nước uống Chính vì vậy, khi dùng chỉ thị nước tiểu người ta phải phân tách được các thành phần asen vô cơ, hữu

cơ trong mẫu nhằm phân biệt dạng asen có nguồn gốc thức ăn là asenobetain và dạng asen methyl hoá từ asen vô cơ trong nước uống Việc tách các dạng asen hữu

cơ và vô cơ cần sử dụng thiết bị phức tạp, đắt tiền là sắc ký ion ghép với khối phổ cảm ứng kết hợp plasma nên nó thường chỉ được thực hiện tại những phòng thí nghiệm hiện đại

Do asen thường tích tụ trong những mô giàu keratin như tóc, móng nên mẫu tóc được dùng làm chỉ thị cho việc đánh giá thâm nhiễm lâu dài với asen Việc lấy mẫu tóc khá đơn giản, quy trình xử lý và phân tích mẫu có thể thực hiện dễ dàng tại các nước đang phát triển, đặc biệt trong các nghiên cứu đánh giá nguy cơ nhiễm độc asen trên diện rộng [20, 22, 51, 97]

Tại Việt Nam, thời gian người dân sử dụng nước giếng khoan chưa dài lắm, chủ yếu dưói 10 năm, số lượng bệnh nhân asenicosis điển hình được khẳng định chưa nhiều [6] Điều đó hoàn toàn không có nghĩa là chúng ta không chịu ảnh hưởng của nhiễm độc asen Việc sử dụng các biomarker đặc thù cho nhiễm độc asen như sự tích luỹ asen trong tóc, các dạng chuyển hoá của asen trong nước tiểu sẽ cung cấp những bằng chứng về mức độ thâm nhiễm asen trong cộng đồng Các thông tin này sẽ góp phần vào việc đưa ra chứng cứ nhằm đẩy mạnh công tác y tế

dự phòng và phục vụ cho công tác giáo dục tuyên truyền, phòng tránh các ảnh hưởng xấu của asen từ nước ngầm

1.3.2.2 Sử dụng chỉ số hàm lượng asen trong tóc để đánh giá mức độ thâm

nhiễm lâu dài asen từ nước giếng khoan

Với đặc điểm dễ phân tích và khá đặc trưng cho thâm nhiễm asen, chỉ thị tóc luôn được sử dụng trong các nghiên cứu đánh giá mức độ thâm nhiễm asen do dùng nước giếng khoan trong những năm vừa qua, nhất là tại Ấn Độ, Bănglađet và Trung Quốc Theo báo cáo của Chowdhury và các cộng sự năm 2000, 59% trong số 11 nghìn giếng tại Bănglađet và 34% trong số 58 nghìn giếng tại Ấn Độ khi kiểm tra có hàm lượng asen cao hơn 50 g/L Trong hàng nghìn mẫu tóc thu thập từ dân cư sống trong vùng ô nhiễm đó, tính trung bình tại Bănglađet có 93% và Ấn Độ có 77% số mẫu chứa hàm lượng asen trên mức nhiễm độc là 1mg asen/kg tóc (mức bình thường là khoảng 0,2 mg asen/kg tóc) Khi kiểm tra ngẫu nhiên tại các vùng có

ô nhiễm asen về tỉ lệ mắc các bệnh liên quan tới da cho thấy 15,2% trong số 29 nghìn người tại Tây Bengan, 24,5% trong số 11 nghìn người tại Bănglađet có những biểu hiện tổn thương da liên quan tới nhiễm độc asen [22] Gần đây tác giả Rahman

và cộng sự khi nghiên cứu chi tiết tại cụm dân cư Jalangi, Tây Bengan, Ấn Độ đã thấy 1488 người trong số 7221 người khám bệnh bị mắc các bệnh trên da liên quan tới asen Kết quả phân tích 1600 mẫu sinh học cho thấy 88% số mẫu tóc có hàm lượng asen cao hơn mức nhiễm độc (1 mg/kg) Giá trị trung bình của asen trong tóc

là 2,3 mg/kg, trong nước tiểu là 155 µg/l, trong móng tay là 5,2 mg/kg [66]

Vùng Changquing Guizhou (Trung Quốc) là nơi có ô nhiễm asen trong không khí rất trầm trọng do đốt than đá để nấu thức ăn, sấy nông sản và sưởi ấm mùa đông Ở đây, các bác sĩ đã chẩn đoán được hàng nghìn bệnh nhân asenicosis trong số 200.000 người Hàm lượng asen trung bình trong tóc là 7,99 mg/kg, trong nước tiểu là 71,4 µg/g creatinine [75] Một nghiên cứu khác tại Croatia cũng cho thấy có sự tăng rõ rệt của hàm lượng asen trung bình trong tóc từ 0,26 mg/kg lên 4,31mg/kg tại các khu vực có asen trong nước là 38 µg/l và 612µg/l [17]

Như vậy tóc là một biomarker đã được dùng khá phổ biến trong đánh giá thâm nhiễm asen lâu dài Tuy nhiên quy trình phân tích asen trong tóc vẫn đang được cải tiến thêm để đạt mục tiêu phân tích chính xác và hiệu quả kinh tế cao Kỹ thuật xử lý mẫu kín bằng lò vi sóng hiện đang được áp dụng để thay thế kỹ thuật xử

lý mẫu hở bằng bình Kjeldahl [29, 34, 63]

Vấn đề ô nhiễm asen tại một số khu vực tại Việt Nam đã được công bố với mức độ khá cao, hàm lượng asen trung bình trong nước giếng tại một số nơi lên tới hơn 100 µg/l, cao gấp 2 lần tiêu chuẩn nước ngầm và 10 lần tiêu chuẩn nước uống [4, 6, 13] Người dân nông thôn Việt Nam lại thường dùng nước giếng khoan làm nước ăn, tắm giặt và đôi khi cả tưới cây Như vậy sự thâm nhiễm chắc chắn là có nhưng mức độ như thế nào lại chưa được nghiên cứu và công bố nhiều Trong luận

án này chúng tôi ứng dụng một quy trình phân tích tóc có cải tiến để đánh giá mức

độ thâm nhiễm lâu dài asen trong nước giếng khoan tại Việt Nam

1.3.2.3 Sử dụng chỉ số các thành phần asen methyl hoá trong nước tiểu để

đánh giá mức độ thâm nhiễm asen hiện tại và cung cấp số liệu minh hoạ cơ chế nhiễm độc asen ở người

Theo quan điểm của các nhà độc học khi một chất độc xâm nhập cơ thể sống, tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học và phản ứng của cơ thể mà nó sẽ đi qua các quá trình trao đổi chất khác nhau Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng quá trình trao đổi chất của hầu hết các chất độc xảy ra theo hai giai đoạn như trong hình 1.2

Chất độc

Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hoá các chất độc trong cơ thể

Trong pha I của quá trình chuyển hoá, có thể xảy ra các phản ứng như ôxy hoá, khử, thuỷ phân, hydrat hoá dẫn đến sự tạo thành các sản phẩm trao đổi chất có khả năng tan trong nước cao hơn, dễ dàng loại bỏ khỏi cơ thể qua dịch mật hoặc nước tiểu Sự chuyển hoá trong pha I có thể làm giảm độc tính của hoá chất và bảo

vệ cơ thể, nhưng cũng xảy ra những trường hợp ngược lại khi mà độc tính của các sản phẩm trung gian lại tăng lên Ví dụ, quá trình ôxy hoá tạo ra các sản phẩm hoạt hoá dễ tham gia tạo liên kết với các đại phân tử trong tế bào Như vậy, từ những hợp chất ban đầu có ít độc tính có thể tạo ra các hợp chất có hoạt tính sinh học cao hơn do chuyển hoá sinh học Thông thường các dạng chuyển hoá của pha I có thời gian tồn tại trong tế bào rất ngắn, gây khó khăn trong việc nghiên cứu sự tồn tại và hoạt tính của chúng Tuy thời gian bán huỷ ngắn nhưng với hoạt tính sinh học cao thì các dạng trao đổi chất vẫn có thể gây ra những tổn hại cho tế bào và cơ thể [95]

Các nghiên cứu trên động vật thực nghiệm và dịch tễ học ở người trong nhiều thập kỷ qua đã giúp các nhà khoa học đề xuất mô hình giả thiết về quá trình trao đổi chất của asen ở động vật có vú Giả thiết này được sử dụng rất rộng rãi trong các nghiên cứu về cơ chế gây độc của asen [9, 44, 86, 92], theo đó asen vô cơ khi vào cơ thể sẽ chuyển hoá theo sơ đồ ở hình 1.3

Hình 1.3 Sơ đồ giả thuyết về chuyển hoá của asen trong cơ thể người [9]

Theo hình 1.3, As vô cơ hoá trị (V) sẽ được khử thành dạng hoá trị (III) Asen hoá trị (III) sẽ tham gia phản ứng methyloxy hoá để gắn một nhóm methyl và ôxy hoá thành là axit monomethylasonic MMAs(V) Trước khi tham gia phản ứng gắn nhóm methyl thứ hai, As trong hợp chất này lại được khử về dạng As(III) và tồn tại ở dạng axit monomethylasonous MMAs(III) Sản phẩm này tiếp tục methyloxy hoá thành axit dimethylasinic DMAs(V) Dạng này lại được khử một phần về axit dimethylasinous DMAs(III) [9] Như vậy, quá trình trao đổi chất của asen trong cơ thể bao gồm các phản ứng ôxy hoá-khử và methyl hoá nối tiếp nhau Các phản ứng ôxy hoá-khử chuyển đổi hoá trị của asen từ asenit As(III) và asenat As(V) và các phản ứng methyl oxy hoá đưa các dạng asenit As(III) thành mono, di

và trimethylasenat As(V)

H3AsO4

axit asenic

H3AsO3 axit asenous

(CH3)H2AsO3monomethylasonic

MMAs(V)

(CH3)H2AsO2monomethylasenous MMAs(III)

(CH3)2HAsO2

dimethylasinic

DMAs(V)

(CH3)2HAsO dimethylasinous DMAs(III)

methyltransferase

Nhìn vào sơ đồ của quá trình trao đổi chất trên ta thấy có thể có tới sáu loại sản phẩm trong cơ thể Độc tính và sự phân bố trong nước tiểu của các dạng asen hữu cơ kể trên là vấn đề đang được các nhà khoa học rất quan tâm Tuy nhiên, khả năng xác định được các thành phần asen kể trên chỉ thực hiện được trong những năm gần đây sau khi phương pháp phân tích được phát triển và hoàn thiện [23]

Độc tính của các dạng asen là sản phẩm của quá trình trao đổi chất trong cơ thể

Như đã trình bày ở trên, khi cơ thể thâm nhiễm asen thì thực chất đó chính là

sự thâm nhiễm với các sản phẩm trao đổi chất từ asen chứ không phải chỉ là asen vô

cơ trong nước Các dạng asen vô cơ và hữu cơ đều có độc tính nhưng ở những mức

độ khác nhau Trong một tài liệu tổng quan, tác giả Kenyon đã cho thấy hợp chất DMAs(V) là chất gây ung thư Hợp chất này kích thích sự bẻ gãy các ADN sợi đơn

trong tế bào mô phổi chuột nhắt, chuột đồng và người khi nghiên cứu in vitro Cơ

chế gây ung thư ở đây được cho là do sự tạo thành các gốc peroxyl của DMAs và các dạng ôxy hoạt động [47] Sử dụng các mô hình động vật khi nghiên cứu bản chất gây ung thư của asen, tác giả Wanibuchi cũng cho thấy DMAs là tác nhân độc cho hệ gen như gây đứt gãy ADN, tạo trao đổi chéo ở nhiễm sắc thể [96] Khi nghiên cứu một số tác động của các dạng asen vô cơ và hữu cơ lên tế bào trứng chuột đồng Trung Quốc, tác giả Dopp và các cộng sự thấy rằng có sự tăng số lượng các nhân con, biến đổi nhiễm sắc thể, tăng tần số trao đổi nhiễm sắc tử chị em khi

xử lý tế bào với DMAs(III) và MMAs(III) Tiềm năng gây độc cho hệ gen tế bào trong nghiên cứu này được sắp xếp theo thứ tự giảm dần như sau: DMAs(III) > MMAs(III) > Asen vô cơ (III và V) > MMAs(V) > DMAs(V) > TMAsO(V) Sự khác biệt về độc tính này được giả thiết liên quan tới tính thấm qua màng tế bào của các chất kể trên [33]

Nghiên cứu về các dạng asen trong nước tiểu ở quần thể dân cư tại các vùng

có ô nhiễm asen trong nước cũng đã được tiến hành trong thời gian qua Việc tách

và định lượng các sản phẩm trao đổi chất của asen được thực hiện nhờ phương pháp phân tích sử dụng hệ thiết bị ghép nối IC – ICPMS Đó là sắc ký trao đổi ion (Ion

chromatography) có nhiệm vụ tách các hợp chất asen ra khỏi nhau Khối phổ cảm ứng kết hợp plasma (Induced couple plasma mas spectrometry) có nhiệm vụ nhận dạng và định lượng các hợp chất asen kể trên ở hàm lượng thấp cỡ ppb (10-9

~ g/l) [23, 54]

Phân tích mẫu nước tiểu của trẻ em tại Bắc Achentina, nơi có asen trong nước uống ở nồng độ khoảng 200 µg/l, tác giả Concha cho thấy hàm lượng asen trong nước tiểu là 380 µg/l và cao gấp 10-30 lần so với khu vực đối chứng, nơi có hàm lượng asen là 65 µg/l Thành phần asen vô cơ là 47%, MMAs 3%, DMAs 50% [29] Ở người, thông thường các tỉ lệ này có giá trị như sau: asen vô cơ 10 - 30%, MMAs 10 – 20% và DMAs 60 – 70% [91, 42] Tác giả Tokunaga đã phân tích 44 mẫu nước tiểu thu từ 13 hộ gia đình tại Mushidabad, Tây Bengan Ấn Độ Các mẫu nước uống có asen trong nằm trong khoảng 18,0 - 408,4 µg/l Kết quả cho thấy tổng hàm lượng asen trong nước tiểu trung bình là 227 µg/g creatinin với khoảng dao động 20,5 – 2890,0 µg/g creatinin Trong đó As(III) là 28,7; DMAs là 168,6, MMAs là 25,0 và As(V) là 4,6 µg/g creatinin, tỉ lệ MMA+DMA là 86,7% [87] Trong một nghiên cứu tại Mêhicô, tác giả Valenzuela đã cung cấp bằng chứng cho thấy sự có mặt của tất cả 6 dạng asen trong nước tiểu, kể cả loại có độc tính cao như MMAs(III) và DMAs(III) Dạng MAsIII đã được tìm thấy trong 98% số mẫu (n=104) Đặc biệt hàm lượng MMAs(III) là cao hơn ở những cá thể có biểu hiện tổn thương da so với cá thể cùng dùng nguồn nước, nhưng không bị mắc các bệnh về da [93] Tất cả các kết quả nghiên cứu trên cho thấy asen từ nước uống vào cơ thể đã được bài tiết qua nước tiểu với các thành phần chủ yếu là asen hữu cơ với các dạng hoá trị khác nhau Tuy nhiên sự phân bố của các thành phần asen trong nước tiểu lại không giống nhau giữa các quần thể, cá thể khác nhau, với lý do chưa được tìm hiểu

kỹ Mối tương quan giữa thành phần asen hữu cơ trong nước tiểu với hàm lượng asen vô cơ trong nước uống vẫn đang là vấn đề thời sự Nó có thể liên quan tới sự thâm nhiễm, chế độ dinh dưỡng, lối sống, giới tính và có thể cả yếu tố di truyền v.v… [44, 52, 91]

Ở Việt Nam, ô nhiễm asen trong nước giếng khoan dùng cho sinh hoạt, nhất

là tại khu vực nông thôn, đã được phát hiện Tuy nhiên, những nghiên cứu tiếp theo

về mức độ thâm nhiễm, xây dựng mối tương quan giữa thâm nhiễm và tích luỹ sinh học, sự trao đổi chất là những vấn đề chưa được đề cập Để góp phần tìm hiểu vấn

đề này, nội dung nghiên cứu thành phần các dạng asen hữu cơ trong nước tiểu ở một số quần thể dân cư đã được tiến hành nhằm đánh giá mức thâm nhiễm asen hiện tại, đồng thời đóng góp thêm bằng chứng minh hoạ cho giả thuyết về trao đổi chất và cơ chế gây độc do asen ở người

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

Mẫu nước giếng khoan, mẫu tóc và mẫu nước tiểu

Mẫu nước giếng khoan dùng cho nghiên cứu ứng dụng biosensor asen được lấy ngẫu nhiên một lần với tổng số 410 mẫu, mật độ lấy mẫu khoảng 1 mẫu /6 km2

Trong đó, 194 mẫu lấy tại các tỉnh Hà Nội, Hà Tây, Hưng Yên, Hà Nam, An Giang, Đồng Tháp (tháng 5 - 7/2004), 216 mẫu lấy tại Thái Bình, Ninh Bình, Vĩnh Phú, Nam Định (tháng 5 - 7/2005)

Mẫu tóc, mẫu nước tiểu, mẫu nước giếng khoan, mẫu nước đã lọc dùng cho nghiên cứu ứng dụng biomarker được lấy ngẫu nhiên, tại các huyện Từ Liêm (R1), Thanh Trì (R2), Hoài Đức/xã Sơn Đồng (R4) – tháng 12/2003, Tri Tôn (M1), Tân Hồng (M2) - tháng 7/2004, Lý Nhân (R3), lần thứ hai tại Hoài Đức/xã Yên Sở (R4)

- tháng 12/2004 Tất cả các mẫu đều được lấy một lần tại các hộ gia đình khác nhau Các vị trí lấy mẫu được minh hoạ trong hình 2.1

Số lượng chi tiết mỗi loại mẫu dùng cho nghiên cứu sử dụng biomarker được trình bày trong bảng 2.1 Trong quá trình thu mẫu, chúng tôi đã kết hợp với các cán

bộ chính quyền và y tế địa phương tổ chức lấy mẫu tập trung tại trạm y tế xã Người dân tham gia cho mẫu trên cơ sở tự nguyện đạt tỉ lệ 85-90% theo giấy mời phát ra Các mẫu nước, mẫu tóc và nước tiểu được thu thập từ các thành viên trong

một số hộ gia đình thuộc các địa điểm đã nêu

Nước giếng khoan được bơm hút khoảng 5-10 phút để bỏ phần nước đầu đi, sau đó mới lấy mẫu Nước giếng khoan lọc qua bể cát được lấy trực tiếp từ bể

chứa nước đã lọc Các mẫu nước nói trên được chảy qua màng 0,45m để loại hạt cát và đất nhỏ, chứa đầy trong lọ nhựa PVC sạch (đã rửa bằng axit loãng và tráng bằng nước đã loại ion), thể tích 500 ml, axit hoá tới pH < 2 bằng HNO3 [8]

Tóc được cắt sát da đầu (khoảng 2 g) tại các phần tóc mọc sau gáy và đỉnh đầu Mẫu tóc được đựng vào các túi polyetylen sạch có khoá chặt Nước tiểu

(khoảng 100