Tổng hợp cơ chất, chế tạo kít và nghiên cứu điều kiện tối ưu để nhuộm tế bào phục vụ chẩn đoán bệnh ung thư bạch cầu người

Độ đặc hiệu của cơ chất naphtol AS-OL α-clopropionat và kít của hãng Sigma đối với phản ứng nhuộm esteraza các loại bạch cầu trong tủy.. Mục tiêu của đề tài là xây dựng phương pháp mới,

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Chuyên nHóa hữu cơ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -

TRẦN VĂN TÍNH

TỔNG HỢP CƠ CHẤT, CHẾ TẠO KÍT

VÀ NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU ĐỂ NHUỘM TẾ BÀO PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN BỆNH UNG THƯ BẠCH CẦU NGƯỜI

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

2.3.4 Nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người bằng các cơ chất este tổng hợp

2.3.5 Nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người bằng naphtol AS-OL

2.3.6 Pha chế kít nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người bằng các cơ chất

3.1.3 Tổng hợp 3-hiđroxi-[N-(xiclohexyl/phenyl/naphtyl/antraxyl)]naphtalen

3.4 Nghiên cứu mối tương quan giữa hoạt tính và cấu trúc của các cơ

3.5 Nghiên cứu chế tạo kít bằng cơ chất mới naphtol AS-OL α-clopropionat 115

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit đã được thương

Bảng 3.1 Mối tương quan giữa điều kiện phản ứng và hiệu suất Ia tổng hợp

Bảng 3.2 Mối tương quan giữa điều kiện tiến hành phản ứng và hiệu suất

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của hiệu ứng điện tử các nhóm thế lên độ chuyển dịch

Bảng 3.7 Kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý, phổ IR và ESI-MS của

3-hiđroxi-N-( xiclohexyl/phenyl/1-naphtyl/1-antraxyl)

Bảng 3.9 Kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý, số liệu phổ IR và

Bảng 3.11 Kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý, số liệu phổ IR và

Bảng 3.13 Kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý, các dữ liệu phổ IR và

ESI-MS của 3-(xiclohexyl/phenyl/naphtyl/antraxylcacbamoyl)

Bảng 3.15 Kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý, các dữ kiện phổ IR,

Bảng 3.20 Tính đặc hiệu của 26 cơ chất naphtol AS-X cloaxetat và

α-clopropionat đối với phản ứng nhuộm esteraza các loại bạch

Bảng 3.23 Tính đặc hiệu của các cơ chất Va-h đối với phản ứng nhuộm

Bảng 3.25 Tính đặc hiệu của các cơ chất có gốc cacboxylat khác nhau đối

Bảng 3.26 Kết quả nhuộm bằng naphtol AS-D và AS-OL cacboxylat có các

Bảng 3.27 Kết quả các góc nhị diện thu được từ tính toán lượng tử và điểm

Bảng 3.30 Độ đặc hiệu của cơ chất naphtol AS-OL α-clopropionat và kít của

hãng Sigma đối với phản ứng nhuộm esteraza các loại bạch cầu trong tủy

120

Bảng 3.31 Kết quả nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người bằng kít naphtol

AS-OL α-clopropionat tổng hợp được và kít naphtol AS-D

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.10 Ảnh nhuộm enzym esteraza bạch cầu ở điều kiện tối ưu hoá với

Hình 3.13 Kết quả nhuộm esteraza bạch cầu người bằng các cơ chất naphtol

Hình 3.16 Kết quả nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người bằng các cơ

chất naphtol AS-OL α-clopropionat tổng hợp được và naphtol

CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN

Assay )

EST+NaF Nhuộm Esteraza không đặc hiệu với chất ức chế là NaF

Assay) Glu:

Gly

Glutamine Glycin

lymphoblastic)

lymphoblastic)

differentiated acute myeloid)

myeloblastic without maturation)

M2 Bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ có tế bào trưởng thành (Acute

myeloblastic with maturation)

MỞ ĐẦU

Bệnh bạch cầu cấp là một nhóm bệnh của cơ quan tạo máu chiếm tỷ lệ khoảng 38,5% các bệnh về máu [1] Cũng như các bệnh ung thư khác, bệnh có xu hướng ngày càng tăng do môi trường ô nhiễm, sử dụng các hóa chất bảo vệ thực vật không có kiểm soát và hậu quả của các chất da cam dioxin do chiến tranh để lại [2] Đặc trưng của bệnh là sự tăng sinh quá mức của các tế bào non ác tính lấn át các tế bào tủy và máu ngoại vi bình thường Đặc điểm của các tế bào này là có sự rối loạn

về protein và cấu trúc tế bào Bệnh gồm nhiều thể loại khác nhau, theo tiêu chuẩn FAB thì được ký hiệu từ M0 đến M7 và L1 đến L3 [16] Việc xếp loại đúng, nhanh chóng và chính xác thể bệnh có vai trò quyết định giúp cho bác sỹ lâm sàng áp dụng các phác đồ điều trị có hiệu quả cho người bệnh Đặc biệt trong thể M3 có nguy cơ chảy máu cao thì việc chẩn đoán nhanh chóng, chính xác còn có ý nghĩa quyết định đến sinh mạng bệnh nhân [6] Tiêu chuẩn FAB dựa trên kết quả xét nghiệm của ba phương pháp là miễn dịch, di truyền và nhuộm hóa học tế bào Phương pháp miễn dịch và di truyền sử dụng các kỹ thuật đòi hỏi máy móc hiện đại đắt tiền và nguồn lao động có trình độ cao Phương pháp nhuộm hóa học tế bào đồng bộ gồm các kỹ thuật nhuộm PAS, peroxidaza, nhuộm sudan B, photphataza axit, photphataza kiềm, esteraza đặc hiệu và không đặc hiệu ức chế với NaF và không ức chế Esteraza đặc hiệu chỉ có mặt trên các tế bào dòng tủy còn các dòng khác âm tính hoặc dương tính với cường độ rất thấp Esteraza không đặc hiệu có mặt ở nhiều dòng tế bào khác nhau nhưng ở dòng monoxit thì bị ức chế bằng NaF Ngoài hai kỹ thuật nhuộm PAS

và nhuộm Sudan dùng để phát hiện glucozit và lipit thì sáu kỹ thuật còn lại là nhuộm phát hiện enzym Do độ đặc hiệu còn thấp, việc phân loại dòng tế bào theo tiêu chuẩn FAB dựa trên phương pháp nhuộm hóa học vẫn cần phải có sự điều chỉnh tới 29,7% nhờ vào kỹ thuật miễn dịch và di truyền Phương pháp xác định tế bào thuộc dòng tủy dựa chủ yếu vào kết quả nhuộm peroxidaza và esteraza đặc hiệu Kỹ thuật nhuộm peroxidaza thường không ổn định do dễ bị phân hủy bởi ánh sáng vì thế cần bổ sung thêm kỹ thuật nhuộm esteraza có độ ổn định hơn Hiện nay,

cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu là naphtol AS-D cloaxetat được được hãng Sigma bán trên thị trường với giá thành rất cao (13 triệu/1 gam) Qua nghiên cứu tài liệu có thể thấy, cơ chất naphtol AS-D cloaxetat được tổng hợp theo phương pháp truyền

thống là ngưng tụ axit 3-hiđroxi-2-naphtoic với o-toluiđin, sau đó este hóa bằng

cloaxetyl clorua Phản ứng ngưng tụ cần thời gian dài, hiệu suất thấp; quá trình chuyển hóa naphtol AS-D thành dẫn xuất cloaxetat hiệu suất cũng không ổn định

Do việc nghiên cứu thiếu hệ thống nên chưa xác định được mối tương quan giữa cấu trúc và hoạt tính, chưa tìm được cơ chất có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất Quá trình nhuộm chưa được tối ưu hóa gây khó khăn cho cán bộ thực hiện và tốn kém cho bệnh nhân Nước ta chưa sản xuất được cơ chất, phải nhập ngoại Cơ

vận chuyển và bảo quản Những thách thức đó đã làm cho phương pháp xét nghiệm này chưa được triển khai rộng rãi ở Việt Nam

Vì vậy, đề tài nghiên cứu tổng hợp cơ chất, chế tạo kít và tối ưu hóa quy trình nhuộm esteraza đặc hiệu để phân loại tế bào bạch cầu phục vụ việc khám và điều trị bệnh ung thư máu có ý nghĩa khoa học, thực tiễn và kinh tế - xã hội sâu sắc

Mục tiêu của đề tài là xây dựng phương pháp mới, hiệu quả cao để tổng hợp

cơ chất; khảo sát một cách có hệ thống mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính để tìm kiếm cơ chất mới có độ nhạy và tính đặc hiệu cao; tối ưu hóa các điều kiện nhuộm và chế tạo kít nhuộm esteraza để phân loại tế bào phục vụ việc khám và điều trị bệnh ung thư máu

Nội dung nghiên cứu

1- Nghiên cứu tổng hợp các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit làm nguyên liệu điều chế cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu người

2- Nghiên cứu tổng hợp các este 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat làm

cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người

3- Xác định cấu trúc của các hợp chất điều chế được bằng các phương pháp vật lý

độ nhạy của phản ứng nhuộm esteraza với cấu trúc phân tử cơ chất bằng phương pháp tính hóa lượng tử

4- Nghiên cứu sử dụng este 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat để nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người và tìm kiếm cơ chất mới có độ đặc hiệu

và độ nhạy cao

5- Nghiên cứu ảnh hưởng hiệu ứng electron các nhóm thế X, hiệu ứng không gian của các gốc N-hiđrocacbon nhóm amit thế và các gốc cacboxylat trong phân tử

cơ chất đến độ nhạy và độ đặc hiệu đối với phản ứng nhuộm esteraza

6- Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình nhuộm bằng phương pháp đơn hình và ứng dụng

để chế tạo bộ kít nhuộm esteraza dùng phân loại dòng tế bào trong bệnh bạch cầu người từ cơ chất tổng hợp được

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT 3-HIĐROXI-(N-THẾ)NAPHTALEN-2-CACBOXAMIT

3-Hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit có cấu trúc như sau:

2

3 1

4

6 5

7 8

NH R1OH

O 9

10

Các hợp chất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit được ứng dụng rất rộng rãi trong thực tiễn Trong công nghiệp chúng được dùng làm nguyên liệu đầu

để sản xuất phẩm màu, đặc biệt là mực in Do quy trình sản xuất đơn giản, gam màu phong phú, độ bền cao, nên loại hợp chất này đã có lúc chiếm tỷ trọng rất lớn đối với thị trường phẩm màu thế giới Vai trò của họ hợp chất này trở nên đặc biệt quan trọng khi người ta sử dụng chúng làm nguyên liệu sản xuất cơ chất để nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu người Do những ứng dụng quan trọng như vậy, nên loại hợp chất này đã thu hút sự quan tâm to lớn của các nhà khoa học Số công trình công bố trong lĩnh vực này rất lớn và đa dạng Trong khuôn khổ tổng quan này chỉ đề cập các phương pháp tổng hợp quan trọng, những tính chất hóa lý cơ bản và một số ứng dụng phổ biến liên quan đến họ hợp chất này

1.1 Tổng hợp các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit

Theo tài liệu [45] người ta tổng hợp amit chủ yếu theo phương pháp trực tiếp một giai đoạn hoặc phương pháp gián tiếp hai giai đoạn

3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacbox-1.1.1 Phương pháp một giai đoạn

Phương pháp này lần đầu tiên được Schopf là nhà hóa học người Đức dùng

để tổng hợp naphtol AS vào năm 1892 [45], dựa trên phản ứng ngưng tụ giữa axit

môi, người ta tiến hành phản ứng trong các dung môi để tăng hiệu suất sản phẩm [11] Đây còn được gọi là phương pháp tổng hợp trực tiếp Quá trình phản ứng được

mô tả trên sơ đồ 1.1

P N

Phản ứng được thực hiện bằng cách khuấy hỗn hợp của anilin, axit

ở nhiệt độ thấp, thường là dưới 400C, tốt nhất là từ 00C đến 250C Khi phản ứng xảy

2-cacboxamit đạt từ 60-70%

Theo phương pháp trực tiếp một giai đoạn, người ta còn có thể tổng hợp 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit bằng cách cho axit 3-hiđroxi-2-naphtoic

xuất anilin thế vào hỗn hợp [14] Dung môi sử dụng trong phương pháp này là axetonitrin Quá trình phản ứng được mô tả trên sơ đồ 1.2

Sơ đồ 1.2

OH

O

OH+

NH2

PCl3/SOCl2

OH

O NH

phản ứng rất mãnh liệt tạo kết tủa phenylamoni clorua làm cho hiệu suất (N-thế)naphtalen-2-cacboxamit thu được rất thấp

3-hiđroxi-1.1.2 Tổng hợp 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit bằng phương pháp

hai giai đoạn

Ngoài phương pháp một giai đoạn, 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit

còn được tổng hợp bằng phương pháp gián tiếp hai giai đoạn [10, 33, 35]

Trong giai đoạn 1, người ta tiến hành phản ứng giữa axit 3-hiđroxi-

Phản ứng được mô tả trên sơ đồ 1.3

Ở giai đoạn 2, cho naphtoyl clorua tác dụng với anilin thế tạo ra sản phẩm

cuối là 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit Quá trình phản ứng được mô tả

Do naphtoyl clorua dễ phân huỷ trong không khí, nên phản ứng phải được

thực hiện trong điều kiện bảo ôn rất nghiêm ngặt Hiệu suất phản ứng này cũng

không cao, chỉ khoảng 60%

Kock-Yee Law và cs [59] đã thực hiện phản ứng hai giai đoạn theo cách khác

Ở giai đoạn một, các tác giả đã đun hỗn hợp 2,8-đihiđroxi-3-naphtoic với phenol có

phụ đối với nhóm 8-OH, lượng dư phenol đã được sử dụng vừa làm tác nhân vừa

làm dung môi Sau 2 giờ hiệu suất phenyl 2,8-đihiđroxi-3-naphtoat đạt 76% Ở giai

đoạn 2, tiến hành đun hồi lưu hỗn hợp phenyl 2,8-đihiđroxi-3-naphtoat và các dẫn

dưới áp suất nitơ Sau 2 giờ hiệu suất N-thế-2,8-đihiđroxinaphtalen-3-cacboxamit

đạt trên 89% Quá trình phản ứng được mô tả trên sơ đồ 1.5

OH O O

O

X 1)

chảy ổn định và nhiệt độ sôi tương đối cao [45], như có thể thấy trên bảng 1.1 Tùy

theo nhóm thế trong vòng benzen mà 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit có

độ phân cực khác nhau, chúng gần như không tan trong nước, nhưng tan hoàn toàn trong các dung môi hữu cơ như clobenzen, THF, DMF, DMSO

Bảng 1.1 Các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit đã được thương mại hóa

1.2.2 Tính chất phổ

Phổ IR: Các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit có ba dao động hóa trị

đặc trưng có cường độ mạnh [36] Một dao động của nhóm νC=O amit ở vùng

là dao động của nhóm νOH ở ~3500 cm-1 Do trong phân tử của các 3-hiđroxi- (N-thế)naphtalen-2-cacboxamit chứa đồng thời nhóm OH và NHC=O có khả năng tạo liên kết hiđro nội phân tử, nên tần số dao động các nhóm NH và OH cóthể giảm xuống đáng kể

Phổ MS: Vì cấu trúc phân tử không phức tạp, nên nhìn chung phổ MS của các

3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit tương đối đơn giản Dưới tác dụng của chùm điện tử, xác suất phân mảnh cao nhất sẽ xảy ra tại liên kết amit và phân tử sẽ tạo thành hai gốc chính, sau đó tiếp tục phân huỷ tạo thành những mảnh nhỏ hơn Phổ MS của naphtol AS-D có 5 đỉnh chính, đỉnh thứ nhất có số khối m/z = 277 tương ứng với ion phân tử chưa phân mảnh Dưới tác dụng của chùm điện tử đã liên kết amit bị cắt đứt tạo thành hai mảnh ion m/z = 171 và 106, sau đó mảnh ion với số khối 171 tiếp tục phân huỷ tạo thành hai mảnh ion với m/z = 143 và 115 như sơ đồ 1.5 [66]

Phổ 1

H-NMR: độ chuyển dịch hóa học của các proton trong các dẫn xuất

3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit xuất hiện ở ba vùng chính [46] Ở vùng từ trường yếu nhất là cộng hưởng của proton nhóm OH ở ~11,80 ppm và nhóm NH ở

~10,60 ppm, cộng hưởng của các proton vòng naphtyl ở vùng 7,60-8,70 ppm và các proton vòng phenyl ở vùng 7,20-7,50 ppm Độ chuyển dịch hóa học của các proton vòng naphtyl ít thay đổi, trong khi đại lượng này của các proton vòng phenyl phụ thuộc vào bản chất của các nhóm thế X Nhóm thế đẩy điện tử sẽ làm tăng mật độ điện tử trong vòng phenyl và độ chuyển dịch hóa học của các proton sẽ chuyển về phía trường mạnh và ngược lại

1.2.3 Tính chất hóa học

Các phân tử 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit có chứa hai nhóm chức chính là CO-NH và –OH Là những phân tử có nhiều trung tâm phản ứng, chúng có thể tham gia các chuyển hóa khác nhau Trước hết, nhóm hiđroxyl đẩy điện tử làm

dễ dàng cho phản ứng thế ái điện tử vào vòng naphtyl, đặc biệt là nguyên tử cacbon

amit có thể bị anion hóa trong môi trường kiềm mạnh và bị axyl hóa bằng các tác nhân axyl halogenua

a) Phản ứng este hóa

Phản ứng este hóa trực tiếp các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit bằng

các axit cacboxylic thường cho hiệu suất thấp (40-50%) Vì vậy, để điều chế các este của chúng người ta thường tiến hành theo phương pháp kinh điển Schotten-Baumann được mô tả trong nhiều tài liệu hữu cơ cơ bản [4, 5, 107], tức là cho các dẫn xuất naphtol tác dụng với clorua axit hoặc anhiđrit axit hữu cơ trong môi trường kiềm hoặc piridin như mô tả trên sơ đồ 1.6

Sơ đồ 1.6

NH OH

O

R 1

NH O

O

R 1

NH O

X

RCHClCOCl

NH O OOCCHClR

X

Về nguyên tắc quá trình este hóa chia làm 2 giai đoạn Ở giai đoạn 1, trong môi trường kiềm, nhóm hiđroxyl của 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit sẽ chuyển hóa thành anion naphtolat; ở giai đoạn 2, anion naphtolat natri sẽ tác dụng

với cloaxyl clorua tạo thành sản phẩm este 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl boxylat (sơ đồ 1.8)

cac-Sơ đồ 1.8

CONH

OH

X NaOH 5N

X CONH

ONa 1)

2)

CONH

ONa

X RCHCOCl Cl

X CONH

OCOCHR Cl

…

b) Sự anion hóa trong môi trường kiềm mạnh

Hiệu suất este phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện tiến hành phản ứng Thứ nhất phải thực hiện ở nhiệt độ thấp để tránh phân huỷ sản phẩm este Thứ hai là nồng độ NaOH không quá cao (<5%) Nếu nồng độ NaOH > 5%, nhóm hiđroxyl sẽ tấn công vào nhóm amít tạo ra đinatri aminnolat theo sơ đồ 1.9, muối này sẽ kết tủa làm cho hiệu suất este giảm xuống [45]

Sơ đồ 1.9

NH O OH

X NaOH, THF/60-900C N

O ONa

X Na

c) Phản ứng điazo hóa

Nhƣ đã nói ở trên, các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit dễ tham gia

phản ứng thế ái điện tử Phản ứng đƣợc nghiên cứu tỷ mỷ và có ứng dụng thực tiễn

+

NH OH O

1.3 Ứng dụng của các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit

1.3.1 Ứng dụng để sản xuất phẩm màu

Một trong những ứng dụng quan trọng nhất của các 3-hiđroxi-(N-thế) naphtalen-2-cacboxamit là dùng làm tác nhân ghép đôi với các muối điazo để sản xuất phẩm màu azo Trong các loại phẩm màu sản xuất từ 3-hiđroxi-(N-thế) naphtalen-2-cacboxamit thì nhóm naphtol AS thế là phổ biến nhất Chúng rất phong phú về chủng loại, chiếm lĩnh thị trường phẩm nhuộm nửa đầu thế kỷ 20 nhờ có phổ màu rộng từ vàng nhạt đến hồng, đỏ boocđô, đỏ son, nâu và tím Tùy theo cấu trúc phẩm màu naphtol AS thế được chia làm 2 nhóm Ở nhóm thứ nhất, tác nhân điazo điều chế từ dẫn xuất cloanilin cho màu từ vàng đến đỏ tươi; còn từ dẫn xuất clotoluiđin chủ yếu có màu đỏ ánh xanh; từ dẫn xuất nitrotoluiđin và nitroanisiđin lại cho màu đỏ boocđô Bảng 1.2 dưới đây cho ta thấy màu sắc đa dạng của một số phẩm màu được sản xuất từ naphtol AS [45, 115]

Sự phong phú của phẩm màu naphtol AS chính là ở chỗ chúng tồn tại ở ít nhất là hai dạng tinh thể có thể chuyển hóa lẫn nhau Các nhóm thế khác nhau trong nhân aryl của muối điazo có ảnh hưởng lớn đến tính chất của phẩm màu naphtol AS thế Ví dụ như xét về khả năng hòa tan, phẩm màu naphtol AS thế nhóm I thường tan kém hơn so với nhóm II Sunfoamit và cacbonamit (nhóm II) tạo thành dung dịch một cách nhanh chóng mặc dù cấu trúc của chúng đồ sộ hơn rất nhiều so với những naphtol AS thế nhóm I

Khả năng tan trong dung môi (cũng như xu hướng chuyển hóa giữa hai dạng tồn tại) quyết định tính chất và ứng dụng của các loại phẩm màu Có những môi trường trong đó phẩm màu có khả năng chuyển từ dạng bị phai màu mạnh sang dạng không phai màu Số lượng các nhóm CONH càng nhiều thì khả năng tan của phẩm màu càng tốt, không phụ thuộc vào cấu trúc của nó (bảng 1.3)

Bảng 1.3 Mối tương quan giữa độ tan và cấu trúc phẩm màu [45]

CONH

Độ tan trong etyl axetat

N OH

N+O

O

4 N

N

OH O NH O

O NH O

NH2

O Cl

Các phẩm màu naphtol AS thế được dùng rất rộng rãi, trong đó có ba lĩnh vực chủ yếu là mực in, sơn mạ và nhựa [45] (bảng 1.4)

Bảng 1.4 Các lĩnh vực ứng dụng của phẩm màu naphtol AS

Trong lĩnh vực mực in, phẩm màu naphtol AS chiếm khoảng hơn 50% tổng lượng tiêu dùng của thế giới Lĩnh vực mà phẩm màu naphtol AS cũng được sử dụng không ít là công nghiệp mạ và sơn Các loại nhựa thường dùng phẩm màu naphtol AS thế là PVC, polystyren, polyeste… Các phẩm màu được sử dụng thường tan tốt trong dầu (dung môi hữu cơ) và có độ bền cao trong điều kiện khắc nghiệt

1.3.2 Sản xuất cơ chất để nhuộm tế bào bạch cầu

Một ứng dụng quan trọng có tính đột phá của các 2-cacboxamit là dùng làm tiền chất tổng hợp các este 3-(N-thế-cacbamoyl) naphtalen-2-yl cacboxylat để làm cơ chất cho phản ứng nhuộm hóa học tế bào Đặc biệt trong phân loại thể bệnh bạch cầu cấp 3-(N-thế-cacbamoyl) naphtalen-2-yl cacboxylat được sử dụng làm cơ chất cho phản ứng nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người Thực chất đây là một phản ứng thủy phân dưới xúc tác của esteraza tạo thành các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit tương ứng Hợp chất này sẽ được ghép đôi với muối điazo để tạo thành phẩm màu azo tại các vùng có chứa enzym trong bào tương của tế bào Phương pháp nhuộm esteraza đặc hiệu giúp phân loại thể bệnh dòng tủy với các dòng tế bào khác theo tiêu chuẩn FAB, phục vụ điều trị bệnh ung thư máu

3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-1.3.2.1 Giới thiệu về esteraza trong tế bào bạch cầu

Theo phân loại của tiểu ban enzym (EC) thuộc Hội Hóa sinh quốc tế (IUB), esteraza là một enzym hiđrolaza thuộc nhóm cacboxylesteraza (E.C.3.1.1.1) [101]

xúc tác các phản ứng thủy phân este cacboxylat thành axit và ancol, trong môi trường nước được gọi là sự thủy phân:

Trong tế bào bạch cầu người, esteraza được chia làm hai nhóm là esteraza đặc hiệu và không đặc hiệu Sở dĩ được gọi là esteraza đặc hiệu vì nó chỉ có trong các tế bào dòng tủy từ nguyên tủy bào đến bạch cầu trung tính, các dòng tế bào khác

âm tính Esteraza không đặc hiệu có ở nhiều loại tế bào khác nhau, như bạch cầu mast, bạch cầu mono, bạch cầu trung tính nhưng khi ức chế bằng NaF thì chỉ có esteraza trong bạch cầu mono bị giảm hoạt tính, không hiện màu trong phản ứng nhuộm hóa học tế bào bằng xúc tác bởi esteraza Dựa vào tính chất khác nhau trong quá trình nhuộm esteraza này mà các nhà Huyết học Pháp-Mỹ-Anh (FAB) [16] đã

đề ra tiêu chuẩn phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy và các dòng tế bào khác

Esteraza có mặt ở hầu hết các mô trong cơ thể Hàm lượng esteraza cao nhất

là trong các tế bào thực bào, sau đó đến tế bào gan, ruột, dạ dày, phổi, tiền liệt tuyến, tụy và ít nhất là trong tế bào não Trong tế bào, esteraza thường phân bố chủ yếu trong lưới nội nguyên sinh chất, máy golgi, lysosom và màng tế bào [53, 90, 102]

Esteraza là một enzym serin có tâm hoạt động được cấu tạo bởi axit amin Ser đóng vai trò nucleophin, axit amin His đóng vai trò bazơ và một axit amin thứ 3, đóng vai trò axit là Asp Ở một số isoenzym thì Asp được thay bằng Glu và vì thế esteraza còn được gọi là enzym có tâm hoạt động theo cơ chế Ser-His-Asp/Glu [80, 95] (hình 1.5)

Hình 1.1 Tâm hoạt động của esteraza

Esteraza là nhóm enzym không đồng nhất về mặt cấu trúc [104] Các công trình công bố gần đây cho thấy trong các tổ chức khác nhau thì esteraza có cấu trúc khác nhau Trọng lượng phân tử từ 19.500-180.000 dalton (Da) [81, 83] Kích thước của enzym vào khoảng 2-3 Ǻ Bằng kỹ thuật sắc ký cột sephadex Kaphalia và c.s [58] đã xác định được esteraza gồm 2 chuỗi có trọng lượng phân tử là 60kDa và phần kia là 180 kDa Phần 180 kDa là một trimer và bị ức chế bởi diisopropyl flophotphat trong các phản ứng nhuộm, tức nó thuộc loại B esteraza (bị ức chế bởi hợp chất florua) [52, 78] Về mặt điện tích thì esteraza là một enzym mang điện tích

âm và các isoenzym nằm trong vùng đẳng điện (pI) từ 5,5-6,1 [94] Nhiều isoenzym

có tính đặc hiệu khá cao cho từng dòng tế bào và có thể coi nó như một giá trị tham chiếu để nhận dạng dòng tế bào SM Gignac và c.s [38] bằng phương pháp điện di

đã tìm ra 5 isoenzym khác nhau của esteraza đặc hiệu cho các tế bào máu, là esteraza mono 1/mono 2 tìm thấy trong các tế bào bạch cầu mono; My 1/My 2 dòng tủy, bệnh đa u tủy, dòng hồng cầu, dòng tiểu cầu; Lym 1/Lym 2 trong tế bào lympho và cuối cùng là Unc trong tế bào chưa biệt hóa Như vậy có thể khẳng định esteraza là một tập hợp gồm nhiều isoenzym không đồng nhất Bằng phương pháp sắc ký điện di Scott và c.s [87] đã thu được esteraza tinh khiết từ các tế bào bạch cầu dòng tủy và tìm ra hai isoenzym của esteraza A và B Hai isoenzym này thường

có mặt trong các bào quan của cả hai dòng bạch cầu đoạn và bạch cầu mono Nhiều công trình nghiên cứu gần đây cũng cho thấy hai isozym này khác nhau về sự ức chế bởi nhiệt độ và NaF [20, 27, 84, 90]

Năm 1991, bằng kỹ thuật Northern blot, Zschunke F và c.s [114] đã giải mã ARN thông tin (mARN) tinh khiết chiết xuất từ tế bào bạch cầu mono và đã tìm ra cấu trúc bậc 1 của enzym này gồm 503 axit amin Trên bản đồ gen người, esteraza bạch cầu được mã hóa trên nhiễm sắc thể thứ 16 Trọng lượng phân tử là 60kDa và

bị ức chế bởi diisopropyl flophotphat nồng độ 2 mM Tác giả cũng chỉ ra sự giống nhau đến 90% về cấu trúc của esteraza bạch cầu với esteraza ở microsome của tế bào gan Các cấu trúc bậc hai, bậc ba và bậc bốn của enzym đang tiếp tục được nghiên cứu [87]

1.3.2.2 Phản ứng thủy phân este

Esteraza xúc tác cho quá trình thủy phân các este thành axit cacboxylic và ancol Các este này có thể là các este béo, este vòng thơm [44, 77] Đây là phản ứng phổ biến trong mọi tế bào, đặc biệt trong chuyển hóa các chất nội và ngoại sinh

Các nghiên cứu gần đây đã cho thấy các gốc Ser, His, Glu, Asp và Gly ở trong tâm hoạt động của esteraza có vai trò quan trọng trong hoạt động xúc tác phản ứng thủy phân este Điều này được minh chứng bằng sự sụt giảm khả năng xúc tác trong phản ứng thủy phân este của enzym khi thiếu một hoặc một số axit amin nêu trên ở các esteraza phân lập được [53]

Hiện nay, nhiều hợp chất được sử dụng làm cơ chất cho phản ứng nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người, trong đó phổ biến nhất là naphtol AS axetat và naphtol AS-D cloaxetat Cơ chế của phản ứng thủy phân các cơ chất này dưới tác dụng của esteraza bạch cầu người xảy ra theo sơ đồ 1.11 [23, 61, 78, 101]

Sơ đồ 1.11

NH O

O

X

R O

NH OH

O

X Esteraza / H2O

- RCOOH

Trong đó: X: -H, -CH3; R: CH3, CH2Cl Đây là phản ứng thủy phân dưới xúc tác của enzym nên nó đòi hỏi phải có những điều kiện phù hợp với từng isoenzym như pH, nhiệt độ, dung dịch đệm Đặc biệt, cấu trúc của phân tử cơ chất (este) phải phù hợp với tâm hoạt động của enzym như “ổ khóa và chìa khóa” thì phản ứng mới diễn ra thuận lợi (hình 1.6)

Hình 1.2 Phân tử esteraza

Cơ chế xúc tác của esteraza được trình bày trên sơ đồ 1.12 [52]

Sơ đồ 1.12

N H

N

His Glu

O R'

N H N

His Glu

R O

-N N

His Glu

O

-O Ser

R O

H

N H

O R

His Glu

O

-Ser

O H

O R

3- Hình thành liên kết tứ diện giữa Oxi - Hiđro (Ser) - O - C (este) và được bền hóa nhờ liên kết hiđro của ba axit amin His, Gly, Glu Hình tứ diện này được gọi là

“Oxianion hole” Tiếp theo là bước cắt đứt liên kết este bằng cách chuyển vị proton của Ser vào nhóm imidazol tạo thành ion His Phần axyl bị đứt ra của phân tử este lập tức liên kết với enzym tạo thành phức axyl-enzym Phần ancol

được bền hóa nhờ liên kết hiđro với axit amin His và như vậy liên kết este đã bị thủy phân hoàn toàn

4- Một phân tử nước bị phân cực do tạo liên kết hiđro với axit amin Asp sẽ tấn công vào liên kết axyl-enzym và hình thành góc tứ diện thứ hai đồng thời giải phóng phần ancol của phân tử cơ chất

Proton của His được chuyển cho nguyên tử oxi của Ser để giải phóng phần axit của phân tử cơ chất và enzym trở lại cấu hình ban đầu sẵn sàng cho phản ứng xúc tác thủy phân tiếp theo

Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra tính đa dạng trong hoạt động xúc tác của esteraza ở các tế bào để tham gia vào các chức năng sinh lý chủ yếu như sau:

- Chức năng chuyển hóa: esteraza tham gia vào các chu trình Krebs sinh năng lượng, chu trình xitric để tạo axyl - Co A, điều hòa chuyển hóa lipit và nhiều chu trình chuyển hóa khác [28, 37, 47]

- Chức năng của hệ thần kinh: Trong tế bào thần kinh esteraza có mặt trong lưới nội nguyên sinh chất và xúc tác cho phản ứng thủy phân tạo temocapril,

p-nitrophenyl axetat là các chất trung gian dẫn truyền tín hiệu thần kinh [78, 100]

- Chức năng chuyển hóa thuốc và thải độc: Esteraza có khả năng tham gia vào chuyển hóa thuốc đặc biệt là các tiền dược thông qua phản ứng thủy phân Lợi dụng tính chất này, các nhà nghiên cứu dược đã sản xuất thuốc theo công nghệ hướng đích Ngoài ra chúng còn giúp phân huỷ các sản phẩm chuyển hóa thuốc trung gian độc đối với cơ thể và vì vậy chúng cũng là nguyên nhân giảm hoạt tính

và tác dụng của nhiều loại thuốc khác nhau [40, 51, 73, 82, 113]

- Chức năng miễn dịch: Esteraza đóng vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch bảo vệ cơ thể bằng cách xúc tác phản ứng thuỷ phân các dị nguyên [62, 111] Shiotsuki và c.s dùng lipopolysaccharide của vỏ vi khuẩn E Coli tiêm vào tổ chức hạch, sau 6 giờ nồng độ của isoenzym của esteraza hCE-1 và hCE-2 tăng lên

rõ rệt [88] Như vậy các dị nguyên như vỏ vi khuẩn, các độc tố chính là các chất cảm ứng đã kích thích quá trình tổng hợp esteraza trong tế bào Trong bạch cầu, esteraza đã được chứng minh là tham gia trực tiếp vào việc thủy phân các dị nguyên xâm nhập vào cơ thể theo cơ chế kích hoạt bổ thể C3 [106]

1.3.2.3 Phương pháp phân loại dòng tế bào theo tiêu chuẩn FAB

Ung thư máu gồm nhiều thể bệnh Việc chẩn đoán đúng thể bệnh có vai trò quyết định trong việc điều trị Chính vì vậy để thống nhất việc xếp loại thể bệnh trong bệnh bạch cầu cấp, năm 1976 các nhà Huyết học Pháp-Mỹ-Anh đã nhất trí xây dựng tiêu chuẩn xếp loại thể bệnh bạch cầu cấp dùng trong chẩn đoán cũng như phương pháp điều trị được gọi tắt là tiêu chuẩn FAB Năm 2001, WHO đã đưa ra bảng xếp loại riêng, nhưng phương pháp xếp loại FAB vẫn được dùng phổ biến trong các cơ sở nghiên cứu và chữa bệnh [74] Tiêu chuẩn của FAB dựa trên ba phương pháp: miễn dịch (marker), di truyền và hóa học tế bào [16, 20, 50, 90] Phương pháp marker chủ yếu phát hiện các dấu ấn miễn dịch trên tế bào bạch cầu như CD4, CD8, CD34 Hiện nay kỹ thuật marker kết hợp phương pháp phân tích dòng chảy đã giúp cho việc nâng cao độ chính xác của việc chẩn đoán các thể bệnh bạch cầu cấp [3, 7, 8] Phương pháp di truyền phát hiện các kết quả đột biến hoặc đảo đoạn của các nhiễm sắc thể Phân tích đột biến dựa trên kỹ thuật PCR và giải trình tự gen đã nâng cao rõ rệt độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp này [6, 15] Đối với phương pháp hóa học tế bào thì tiêu chuẩn FAB dựa vào các kết quả nhuộm trình bày trên bảng 1.5

Bảng 1.5 Bảng phân loại theo tiêu chuẩn FAB về nhuộm hóa học tế bào [16]

Như đã thấy trong bảng 1.5, nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người sử dụng

cơ chất naphtol AS-D cloaxetat có thể phân loại được dòng tủy với các dòng khác

1.3.2.4 Các phương pháp nhuộm esteraza

a) Nhuộm hóa học tế bào phát hiện esteraza

Esteraza xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết este của cơ chất tạo thành các ancol và axít tương ứng Ancol phản ứng với các chất thích hợp để tạo ra các chất màu Sự có mặt của các chất màu chứng tỏ có esteraza ở tế bào nghiên cứu Một số phương pháp chính dựa trên nguyên lý của kỹ thuật này là:

- Phương pháp kết tủa muối kim loại

Được sử dụng lần đầu tiên bởi Gomori [39] nhằm phát hiện ATPaza, esteraza, lipaza nhờ sự kết tủa muối của sản phẩm thủy phân cơ chất là glycerol

được chuyển thành muối CoS có màu đen Do quá trình xử lý với cơ chất qua nhiều giai đoạn và ion canxi dễ tan trong nước nên phản ứng có độ nhạy kém Đến nay hầu hết các phòng xét nghiệm không còn sử dụng kỹ thuật này [29, 108]

- Phương pháp sử dụng phẩm màu indigo

Phương pháp do Barrnet, Seligman [14] áp dụng và phát triển nhằm phát hiện esteraza trong tế bào Indigo và dẫn xuất của nó bị thủy phân tạo ancol sau đó tiến hành oxi hóa đóng vòng tạo indigo có màu chàm Đây là một phương pháp có

độ nhạy, độ đặc hiệu khá cao Các chất 5-bromoindoxil, 5-bromo-4-cloindoxil là những chất phù hợp nhất cho phản ứng nhuộm theo cách này Đây là một phương pháp có rất nhiều triển vọng do các hợp chất chứa indoxil tăng nhanh chóng nhờ công nghệ hóa dầu [29, 43, 46, 75]

- Phương pháp sử dụng phẩm màu azo

Theo Catovsky [20] thì phương pháp này do Menten, Junge và Green nghiên cứu và phát triển dựa trên phản ứng ghép đôi dẫn xuất ancol thơm (từ cơ chất este bị thủy phân do xúc tác esteraza) với muối điazo tạo thành phẩm màu azo Màu tại vùng có enzym phụ thuộc vào cấu trúc của muối điazo sử dụng Đây là phương pháp tốt nhất trong các phương pháp nhuộm hóa học tế bào đơn thuần do có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao Cơ chất sử dụng phổ biến trong kỹ thuật này là dẫn xuất  hoặc -naphtol axetat hay butyrat Trong đó dạng - tốt hơn, do tan ít trong dung dịch nước nên khả năng kết tủa tại vùng có enzym cao hơn Các dẫn xuất

- hoặc -naphtol được giải phóng ra từ sự thủy phân cơ chất este lập tức ghép với muối điazo có trong dung dịch nhuộm tạo phẩm azo có màu đỏ hoặc màu đen Nhờ xuất hiện màu trên vùng enzym mà ta có thể xác định được có hay không có esteraza [27, 39, 90, 105]

Cơ chế phản ứng nhuộm bằng naphtol AS cacboxylat trải qua hai giai đoạn: Giai đoạn 1: esteraza bạch cầu người thủy phân cơ chất este tạo thành dẫn xuất của naphtol AS thế chứa nhóm -OH như sơ đồ 1.13

Sơ đồ 1.13

NH O

O

X

R O

NH OH

Trong đó: X1: -H, -CH3; X2: -Cl và X3: –CH3 (Fast red violet LB base);

X2, X3: -OCH3 (Fast blue BB salt)

Nếu muối điazo sử dụng fast red violet LB thì hợp chất azo tạo ra có màu đỏ còn fast blue BB thì có màu xanh đen

Phương pháp nhuộm esteraza được chia làm hai loại: nhuộm esteraza đặc hiệu và nhuộm esteraza không đặc hiệu Nhuộm esteraza đặc hiệu dùng để phân loại

tế bào dòng tủy còn nhuộm esteraza không đặc hiệu dùng để phân loại tế bào dòng mono theo tiêu chuẩn FAB [16]

Cho đến nay, cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu người vẫn là naphtol AS-D cloaxetat và chủ yếu được hãng Sigma Aldrich hoặc Merck bán trên thị trường Do độ đặc hiệu còn thấp, việc phân loại dòng tế bào theo tiêu chuẩn FAB dựa trên phương pháp nhuộm hóa học vẫn cần phải có sự điều chỉnh tới 29,7% nhờ vào kỹ thuật miễn dịch và di truyền [8]

b) Nhuộm hóa học tế bào kết hợp với phương pháp phân tích dòng chảy

Nguyên lý là tiến hành nhuộm esteraza trong các tế bào máu, sau đó cho các

tế bào này đi qua một khe đếm có chiếu một chùm tia laser hẹp, do tính chất bắt màu khác nhau của tế bào mà chùm laser bị lệch đi một góc nhất định Nhờ các sensor mà máy có thể nhận dạng được các tế bào cần phân tích Kỹ thuật này cho phép tự động hóa quá trình phân tích [19, 93]

c) Nhuộm hóa học tế bào kết hợp với hóa miễn dịch, hóa phát quang và phương pháp phân tích dòng chảy

Đây là phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất Kỹ thuật dùng kháng thể đơn dòng kẹp giữa cơ chất và chất đánh dấu theo kiểu bánh Sanwich Chất đánh dấu là các chất màu theo nguyên lý ELISA hay chất phát quang theo nguyên lý FPIA Kỹ thuật này có độ nhạy cao nhất khi kết hợp với kính hiển vi điện tử hay phương pháp phân tích dòng chảy [91, 99, 110, 112] Ngoài ra, để phát hiện vùng

có enzym theo cơ chế trung gian tiếp nhận (receptor-mediated mechanism) tại bề mặt của các tiểu bào quan, người ta sử dụng các kháng thể đơn dòng của chuột hoặc thỏ có gắn chất đánh dấu như chất màu huỳnh quang hoặc các đồng vị phóng xạ chống lại một nhóm cấu trúc đặc hiệu (receptor) của esteraza tạo một phản ứng kháng nguyên - kháng thể Qua kính hiển vi điện tử có gắn các thiết bị phát hiện các chất đánh dấu có thể phát hiện vùng có esteraza Bằng kỹ thuật này S Medda và c.s [70] đã phát hiện ra esteraza trong ống lumen của lưới nội nguyên sinh chất của tế bào

d) Kít nhuộm esteraza tế bào

Hiện nay toàn bộ các vật liệu để nhuộm hóa học esteraza đã được các công ty như Merck hoặc Sigma Aldrich sản xuất thành các kít thương phẩm Các bộ kít nhuộm esteraza thường dựa vào phản ứng tạo thành phẩm màu azo Thành phần bộ kít được chia làm 3 bộ phận chính, là dung dịch cố định, dung dịch cơ chất và dung dịch nhuộm nhân Quá trình nhuộm tiến hành tuần tự theo các bước sau đây:

- Dung dịch cố định enzym và giữ nguyên hình thái của tế bào

Đây là bước quan trọng quyết định ảnh hưởng đến độ nhạy và độ đặc hiệu của của kỹ thuật nhuộm Nếu cố định không tốt thì sẽ làm mất hoặc biến tính enzym gây mất hoạt tính dẫn đến giảm độ nhạy Ngoài ra việc cố định còn giúp giữ nguyên hình thái của tế bào, không gây trương phồng cũng như co tế bào làm sai lệch kết quả sau khi nhuộm Quá trình cố định tế bào thường bao gồm 2 bước: trước hết là

cố định enzym bằng các phản ứng hóa học, bước hai là đehiđrat hóa làm khô tế bào Dung dịch cố định thường dùng là các dung môi như ancol, andehit và axeton Các dung môi này có thể dùng dạng đơn chất hoặc hỗn hợp trong dung dịch đệm Phương pháp cố định có thể bằng cách phủ trực tiếp lên tiêu bản, nhúng tiêu bản trong bình chứa các chất cố định hoặc bay hơi bão hòa Gần đây, các nghiên cứu về chất cố định đã tìm được những công thức pha chế các chất cố định đa thành phần trong dung dịch đệm cho phép dùng cho nhiều kỹ thuật nhuộm enzym Thời gian cố định tiêu bản máu đã giảm xuống còn 30 giây - 1 phút [15, 22, 56, 71, 72]

- Dung dịch cơ chất:

Dung dịch nhuộm bao gồm cơ chất và các muối điazo để tạo màu với sản phẩm của quá trình thủy phân cơ chất este Trong phương pháp nhuộm có tạo phẩm màu azo thì thành phần của cơ chất gồm các este là dẫn xuất của naphtol AS hoặc

AS thế Muối điazo thường sử dụng là fast blue hoặc fast red, khi ghép đôi với naphtol AS hoặc AS thế sẽ tạo hợp chất azo có màu đỏ hoặc màu đen [109] Thành phần quan trọng thứ ba là dung dịch đệm, thường là hệ dung dịch photphat hoặc tris-photphat Tuỳ theo loại enzym mà chọn hệ đệm với pH thích hợp để enzym cần nhuộm có thể hoạt động xúc tác tốt nhất cho phản ứng

- Dung dịch nhuộm nhân và màng tế bào:

Chất màu dùng để nhuộm nhân tế bào đòi hỏi phải cho màu tương phản với màu nhuộm enzym để khi đọc kết quả được thuận lợi và chính xác Ví dụ, nhuộm enzym màu đen thì dung dịch nhuộm nhân có màu đỏ; enzym màu đỏ, vàng thì dung dịch nhuộm nhân màu đen Các chất màu nhuộm nhân cũng như nhuộm enzym đòi hỏi phải là màu rõ ràng và màu nhuộm nhân là màu có độ tinh khiết cao

để không che lấp màu enzym Các chất màu nhuộm nhân và màng tế bào phổ biến hay sử dụng trong kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào là hematoxylin, nuclear fast red Tóm lại, kết qủa phân tích tài liệu cho thấy, sử dụng cơ chất trên cơ sở este của 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit (naphtol AS thế cacboxylat) để nhuộm esteraza là một thành tựu quan trọng trong kỹ thuật phân loại tế bào bạch cầu người Phương pháp này dễ thực hiện, giá thành rẻ, có thể dùng để khám và chữa bệnh cho

đa số bệnh nhân có thu nhập không cao

Tuy nhiên, như đã đề cấp ở trên, việc sử dụng phương pháp này còn bị hạn chế

vì một số nguyên nhân sau đây: một là, cho đến nay việc tổng hợp naphtol AS thế đang được thực hiện theo phương pháp truyền thống, mất nhiều thời gian, tốn năng

lượng, hiệu suất thấp, nên giá thành sản phẩm cao; thứ hai, do việc nghiên cứu chưa

có hệ thống, nên chưa tìm được mối tương quan có tính quy luật giữa cấu trúc với

độ nhạy và tính đặc hiệu của cơ chất, chưa tìm được cơ chất có tính năng tốt nhất cho quá trình nhuộm esteraza đặc hiệu; ba là, quá trình nhuộm chưa được chuẩn hóa

một khó khăn lớn cho quá trình vận chuyển và bảo quản Tất cả các yếu tố trên là nguyên nhân gây nên sự sai lệch về kết quả phân loại dòng tế bào trong bệnh bạch cầu cấp khi sử dụng phương pháp nhuộm hóa học tế bào so với các phương pháp miễn dịch và di truyền (29,7%), hạn chế việc áp dụng kỹ thuật này trong các khoa Huyết học-Truyền máu ở nước ta

Vì vậy “Tổng hợp cơ chất, chế tạo kít và nghiên cứu điều kiện tối ưu để nhuộm tế bào phục vụ chẩn đoán bệnh ung thư bạch cầu người” là đề tài có ý nghĩa khoa học, thực tiễn và kinh tế - xã hội sâu sắc

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 2.1 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp tổng hợp hữu cơ;

- Phương pháp vi sóng trong tổng hợp các chất hữu cơ;

- Phương pháp Vật lý và Hóa lý xác định cấu trúc;

-Phương pháp kế hoạch hóa thực nghiệm và thống kê xử lý số liệu;

- Phương pháp nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào;

- Phương pháp FAB phân loại dòng tế bào;

- Phương pháp tính toán Hóa lượng tử Gaussian 2003

Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu nghiên cứu:

- Mẫu máu người khỏe mạnh được lựa chọn từ người đến khám sức khỏe tại Bệnh viện 19-8, Bộ Công an dùng trong ba nghiên cứu sau:

- Mẫu tủy 20 bệnh nhân bị bệnh bạch cầu cấp đã biết dòng tế bào bạch cầu ung thư được dùng để đánh giá mức độ phù hợp của kết quả phân loại dòng tế bào sử

nhuộm hãng Sigma dùng cơ chất naphtol AS-D cloaxetat

2.2 Hóa chất và thiết bị

2.2.1 Hóa chất

- Naphtol AS-D cloaxetat 98%, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- Focmanđehit 36,5% loại ACS, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- Axit 3-hiđroxi-2-naphtoic 98% loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- 2-cloaxetyl clorua 98%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- 2-clopropionyl clorua 97%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- 2-cloaxetyl phenyl clorua 97%, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- 2-clobutyryl clorua 97%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- Butyryl clorua 98%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- Nuclear fast red dùng nhuộm nhân và hồng cầu, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- Axeton 99,5%, loại ACS, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- Xyclohexylamin 99,5%, loại PA, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- Anilin 99,5%, loại PA, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- 1-naphtylamin 98%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- 1-aminoantraxen 90% loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- 2-bromanilin 98%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- 4-bromanilin 97%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- 2-cloanilin 98%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- 4-cloanilin 98%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich,;

- 2-nitroanilin 98%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- 4-nitroanilin 98% loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- o-Anisidin 99%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- p-anisidine 99% loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- o-Toluidin 99%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- p-Toluidin 99%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- Metyl-2-aminobenzoat 98%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- Metyl-4-aminobenzoat 98%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- Axit Xitric 99%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- Natri Xitrat 99%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- THF 99%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- Pyridin 98%, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- Thionyl clorua 98%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- Muối điazo: Fast blue RR salt, sản phẩm của Acros;

- DMF 99,5%, loại PA, sản phẩm của Labosi;

- Etanol 99,9%, loại PA, sản phẩm của Merck

Tất cả những hóa chất trên đƣợc dùng ngay không phải tinh chế lại

2.2.2 Các dụng cụ và thiết bị

- Đo nhiệt độ nóng chảy trên máy Stuard STP3, Anh quốc, phòng thí nghiệm Hữu

cơ III, khoa Hóa học, trường Đại học KHTN- ĐHQGHN

- Sắc ký bản mỏng được thực hiện với bản mỏng làm từ silicagel 60 F254 tráng trên lá nhôm của hãng Merck (Đức), hiển thị bằng iốt

- Phổ hồng ngoại (IR) được đo trên máy:

 GX của hãng PerkinElmer (Mỹ) tại khoa Hóa học, trường Đại học

 SIGNA của hãnh Nicolet, Viện Hóa học -Viện Khoa học và Công nghệ Việt

- Phổ khối lượng (MS) được ghi trên máy:

 LC-MSD-Trap-SL của hãng Agilent Technologies (Mỹ), Viện Hóa học -Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

 GC-MS phân giải cao (EI, 70ev) của hãng Micromass Waters, Khoa Hóa học, trường Đại học KHTN-ĐHQGHN

 LC-MS-ORBITRAP-XL của hãng Thermo Scientific (Mỹ), tại Khoa Hóa học, trường Đại học KHTN-ĐHQGHN

- Phổ cộng hưởng từ ghi trên máy: ADVANCE Spectrometer (Bruker 500Mv), tần

số 500MHz, tại Viện Hóa học -Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam; dung môi DMSO-d6; chất chuẩn nội TMS

- Thử nghiệm hoạt tính sinh học:

Bệnh viện 19-8

 Ủ nhiệt tiêu bản nhuộm bằng máy Stat-Fax 2200, hãng Awareness Technology

 Soi tiêu bản bằng kính hiển vi hai mắt Nikon với độ phóng đại 1.000 lần, tại Bệnh viện 19-8

 Kít nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người của hãng Sigma số 91C-1KT lô 090M4337, tại Bệnh viện 19-8

2.3 Phần thực nghiệm

2.3.1 Điều chế các dẫn xuất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit

2.3.1.1 Điều chế naphtol AS (IIb) bằng phương pháp trực tiếp

Hòa tan 2 g axit 3-hiđroxi-2-naphtoic (10,4 mmol) trong 12 ml axetonitrin,

(10,4 mmol) vào hỗn hợp phản ứng Khuấy hỗn hợp ở nhiệt độ phòng, sau đó cất loại dung môi rồi hòa tan hỗn hợp trong dung dịch NaOH, lọc bỏ cặn không tan

Kết tủa naphtol AS bằng dung dịch HCl loãng, kết tinh lại trong cồn Hiệu suất IIb

bản mỏng (benzen : etylaxetat = 7 : 3) có một chấm (Rf = 0,74)

2.3.1.2 Điều chế naphtol AS (IIb) bằng phương pháp gián tiếp

Giai đoạn 1: tổng hợp 3-hiđroxi-2-naphtoyl clorua

Hòa tan 2 g axit 3-hiđroxi-2-naphtoic (10,4 mmol) trong 15 ml ete dầu hỏa,

đun hồi lưu trên nồi cách thủy trong 4h Lọc kết tủa pyridin hiđroclorua Sau đó cất loại dung môi, đuổi SOCl2 dư dưới áp suất thấp Sản phẩm thu được có nhiệt độ

(Rf = 0,82) chứng tỏ đủ độ tinh khiết để thực hiện các chuyển hóa tiếp theo

Giai đoạn 2: tổng hợp naphtol AS

Nhỏ từ từ dung dịch 3-hiđroxi-2-naphtoyl clorua trong 5 ml đioxan ở trên vào 0,97 g anilin (10,4 mmol), khuấy hỗn hợp phản ứng trong 5 phút ở nhiệt độ phòng

Thêm 10 ml nước cất lạnh vào, lọc kết tủa, kết tinh lại trong cồn Hiệu suất IIb đạt

etylaxetat = 7 : 3) có một chấm (Rf = 0,74)

2.3.1.3 Điều chế naphtol AS-D (Ia) bằng phương pháp truyền thống một giai đoạn a) Quy trình chung: Tỷ lệ axit 3-hiđroxi-2-naphtoic : o-toluidin : PCl3 là 1 : 1 : 0,3

Hòa tan 2 g axit 3-hiđroxi-2-naphtoic (10,4 mmol) và 1,118 ml o-toluidin

đun hồi lưu hỗn hợp trong thời gian 3 giờ Trong suốt thời gian đó HCl bay ra và

cất loại clobenzen, làm lạnh từ từ đến nhiệt độ phòng Lọc kết tủa, kết tinh lại trong

cồn Hiệu suất Ia đạt 1,736 g (60,1%) Sắc ký trên bản mỏng (benzen : etylaxetat =

chứng tỏ sản phẩm Ia đủ tinh khiết để tiến hành các bước tổng hợp tiếp theo

b) Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ các tác nhân đối với hiệu suất sản phẩm

b1) Tỷ lệ axit 3-hiđroxi-2-naphtoic : o-toluidin : PCl3 là 1 : 1 : 1 trong

clobenzen Quá trình phản ứng thực hiện như quy trình chung (xem quy trình chung 2.3.1.3.a) Sau khi xử lý, hiệu suất sản phẩm naphtol AS-D đạt 1,675 g (58,0%), Sắc

ký trên bản mỏng (benzen : etylaxetat = 7 : 3) có một chấm (Rf = 0,72) Nhiệt độ

C, chứng tỏ sản phẩm là hợp chất Ia

b2) Lặp lại phản ứng với tỷ lệ tác nhân 1:1:10 trong clobenzen Quá trình phản ứng thực hiện như quy trình chung (xem quy trình chung 2.3.1.3.a), nhưng không sử dụng dung môi Sau khi xử lý, hiệu suất sản phẩm đạt 1,441 g (50,1%) Sắc ký trên bản mỏng (benzen : etylaxetat = 7:3) có một chấm (Rf = 0,72) Nhiệt độ nóng chảy

c) Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi đối với hiệu suất sản phẩm

c2) Lặp lại phản ứng này với các điều kiện tương tự như quy trình chung

Sau khi phản ứng kết thúc, lọc kết tủa, kết tinh trong cồn Hiệu suất sản phẩm đạt 0,719 g (22%) Sắc ký trên bản mỏng (benzen : etylaxetat = 7 : 3) có một chấm

c3) Lặp lại phản ứng với các điều kiện tương tự như quy trình chung

khi phản ứng kết thúc, lọc kết tủa, kết tinh trong cồn Hiệu suất sản phẩm đạt 1,496g (52%) Sắc ký trên bản mỏng (benzen : etylaxetat = 7 : 3) có một chấm (Rf = 0,72)

d) Nghiên cứu ảnh hưởng quy trình xử lý nhiệt độ lên hiệu suất phản ứng

Hòa tan 2 g axit 3-hiđroxi-2-naphtoic (10,4 mmol) và 1,118 ml o-toluidin tỷ

(10,4 mmol) vào 16 ml clobenzen khan Hỗn hợp được khuấy, làm lạnh đến khoảng

clobenzen, làm lạnh từ từ đến nhiệt độ phòng Lọc kết tủa, kết tinh trong cồn Hiệu suất sản phẩm đạt 2,016 g (69,8%) Sắc ký trên bản mỏng có một chấm (Rf = 0,72; benzen : etylaxetat = 7:3) Nhiệt độ nóng chảy 194-1950C, chứng tỏ sản phẩm là

hợp chất Ia

Như vậy, bằng phương truyền thống thu được sản phẩm Ia với hiệu suất cao

nhất ở thí nghiệm 2.3.1.1.d với tỷ lệ axit 3-hiđroxi-2-naphtoic : o-toluidin : PCl3 là

1 : 1 : 0,3 và phản ứng được làm lạnh ở giai đoạn đầu trước khi đun hồi lưu

2.3.1.4 Điều chế naphtol AS-D bằng phương pháp sử dụng lò vi sóng

a) Quy trình chung: Tỷ lệ axit 3-hiđroxi-2-naphtoic : o-toluidin : PCl3 là 1 : 1 : 0,3

Hòa tan 1g axit 3-hiđroxi-2-naphtoic (5,208 mmol) và 0,559 ml o-toluidin

thúc khi HCl bay hết, để nguội đến nhiệt độ phòng Lọc sản phẩm, kết tinh lại trong

cồn Hiệu suất sản phẩm Ia đạt 0,942 g (65,2%) Sắc ký bản mỏng có một chấm

b) Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đối với hiệu suất phản ứng

b1) Phản ứng được tiến hành trong các điều kiện tương tự quy trình chung (mục 2.3.1.4.a), thời gian phản ứng trong lò vi sóng là 15 phút Sau khi xử lý hiệu

suất sản phẩm Ia đạt 1,118 g (77,5%) Sắc ký trên bản mỏng có một chấm

b2) Phản ứng được tiến hành trong các điều kiện tương tự quy trình chung (mục 2.3.1.4.a), thời gian phản ứng trong lò vi sóng là 20 phút Sau khi xử lý hiệu

suất sản phẩm Ia đạt 1,166 g (80,8%) Sắc ký trên bản mỏng có một chấm

b3) Phản ứng được tiến hành trong các điều kiện tương tự quy trình chung (mục 2.3.1.4.a), thời gian phản ứng trong lò vi sóng là 20 phút, thời gian phản ứng

trong lò vi sóng là 30 phút Sau khi xử lý hiệu suất sản phẩm Ia đạt 1,168 g

(80,9%) Sắc ký trên bản mỏng có một chấm (Rf = 0,72; benzen : etylaxetat = 7 : 3)

C

c) Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi đối với hiệu suất phản ứng

c1) Phản ứng tiến hành trong các điều kiện tương tự quy trình (mục 2.3.1.4.a), thời gian phản ứng trong lò vi sóng là 20 phút với dung môi axetonitrin Sau khi xử

trên bản mỏng có một chấm (Rf = 0,72; benzen : etylaxetat = 7 : 3)

c2) Phản ứng tiến hành trong các điều kiện tương tự quy trình (mục 2.3.1.4.a), thời gian phản ứng trong lò vi sóng là 20 phút với dung môi toluen Sau khi xử lý,

trên bản mỏng có một chấm (Rf = 0,72; benzen : etylaxetat = 7 : 3)

c3) Phản ứng tiến hành trong các điều kiện tương tự quy trình (mục 2.3.1.4.a), thời gian phản ứng trong lò vi sóng là 20 phút, không dùng dung môi Sau khi xử lý,

hiệu suất sản phẩm Ia đạt 0,729 g (51%) Sắc ký trên bản mỏng có một chấm

d) Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ các tác nhân đối với hiệu suất sản phẩm

d1) Phản ứng được tiến hành trong các điều kiện tương tự quy trình chung (mục 2.3.1.4.a), thời gian phản ứng trong lò vi sóng là 20 phút, tỷ lệ axit 3-hiđroxi-

1,010 g (70%) Sắc ký trên bản mỏng có một chấm (Rf=0,72; benzen : etylaxetat =

d2) Phản ứng được tiến hành trong các điều kiện tương tự quy trình chung (mục 2.3.1.4.a), thời gian phản ứng trong lò vi sóng là 20 phút, tỷ lệ axit 3-hiđroxi-

0,721 g (50%) Sắc ký trên bản mỏng có một chấm (Rf=0,72; benzen : etylaxetat =

C

d3) Tỷ lệ axit 3-hiđroxi-2-naphtoic : o-toluidin : PCl3 = 1 : 1 : 0,3 (xem

2.3.1.4.a)