Nghiên cứu nấm linh chi đa niên, nấm đa niên, các chất có hoạt tính sinh học chính của chúng nhằm góp phần bảo vệ sức khoẻ cộng đồng và tinh sạch chế phẩm TAQ P150254

- Nghiên cứu một số nhóm chất có hoạt tính sinh học chính dược sử dụng trong việc góp phần tăng cường khả năng miễn dịch và phòns chốnc uns thư.- Nghiên cứu tinh sạch enzim đặc hiệu Taq

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỂ TÀI NGHIÊN cứu KHOA HỌC

TRONG ĐIỂM ĐẠI HOC QUỐC GIA HÀ NỘI

“N G H IÊN CỨU N Ấ M LIN H CHI ĐA NIÊN, N Ấ M ĐA NIÊN, CÁC C H ẤT CÓ H O Ạ T TÍNH SIN H HỌC CHÍNH CỦA CHÚNG N H Ằ M

GÓP PH ẨN BẢO VỆ SỨC KHOẺ CỘNG ĐỔNG

VÀ TINH SẠCH C H Ế PH ẨM TAQ POLYMERAZA TÁI TÓ HỢP s ử

DUNG TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC ”

Đ ại h ụ c Qưoc gia h a NỌI

TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU N Ấ M LINH CHI ĐA NIÊN, N Ấ M ĐA NIÊN, CÁC C H Ấ T CÓ H O Ạ T TÍNH SINH HỌC CHÍNH CỦA CHÚNG

SẠCH C H Ế P H Ẩ M TAQ POLYMERAZA TÁI T ổ HỢP s ử DỤNG

TRONG CÔNG NGHỆ SIN H HỌC

M ả số: QGTĐ.03.08

C h ủ t r ì để tài: GS TSKH Trịnh Tam Kiệt

Danh sách những người thực hiện chính

ĐHQGHN

phóns xạ

HÀ NỘI - 2005

BÁO CÁO TÓM TẮT

chất có hoạt tính sinh học chính của chủng nhằm góp phần bảo vệ sức khoẻ cộng đồng và tình sạch ché phẩm Taq polymeraza tái tổ hợp sử dụng trong công nghệ sinh học"

M ả số: QGTĐ.03.08

2 Chủ trì đề tài: GS TSKH Trịnh Tam Kiệt.

3 Danh sách những người thực hiện chính

ĐHQGHN

phón^ xạ

4 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

4.1 Mục tiêu

dựa trên các đặc điểm hình thái và sinh học phân tử.

- Nghiên cứu một số nhóm chất có hoạt tính sinh học chính dược sử dụng trong việc góp phần tăng cường khả năng miễn dịch và phòns chốnc uns thư.

- Nghiên cứu tinh sạch enzim đặc hiệu Taq polymeraza dùns trong sinh học phân tử.

4.2 Nội dung

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái và sinh học phân tử của một số loài nấm Linh chi đa niên, nấm đa niên quí và bảo tồn nsuồn sen của chúng trong nuôi cấy thuần khiết.

- Nghiên cứu một số nhóm chất có hoạt tính sinh học chính và phương thức chiết xuất hoạt chất quí từ một số loài quan trọng.

- Nghiên cứu khảo nghiệm tác dụng của chế phẩm “nấm đa niên” trong việc tãng cường khả năng miễn dịch và phòng chống ung thư.

- Nghiên cứu tinh sạch Taq polymeraza tái tổ hợp từ vi khuẩn E coli dùng

cho phản ứng PCR.

5 Các kết quả đạt được

- Nghiên cứu xác định loài nấm đa niên của Việt Nam thuộc các họ Ganodermataceae (2 chi, 13 loài); Hymenochaetaceae (2 chi, 23 loài): Coriolaceae ( 7 chi, 15 loài) Các đặc điểm hình thái và hiển vi của một số loài quan trọng đã được mô tả.

- Xác định được quy trình tách chiết ADN từ nấm Linh chi đơn niên Đã nghiên cứu sử dụng enzyme giới hạn cắt gen Mn SOD để phân loại và nhận dạng nấm linh chi đơn niên và nấm linh chi đa niên Gau.

- Đã nghiên cứu sự mọc và sự hình thành quả thê của 5 chủng nấm đa niên Toh, E l, H l, Gs và Cl Sự hình thành bảo tử vô tính cũng như quả thê của các chủng trên đã được mô tả.

Cl, NI đã được nghiên cứu bằns các phương pháp sắc kí cho thấy chúna rất giàu các chất có hoạt tính sinh học.

- Tất các các dịch chiết của 5 chủng nấm đa niên cũng như hỗn họp của chúng không gây độc đối với các dòng tế bào đẫ thử nghiệm Sau khi được xử lí

2

bào ung thư phụ thuộc vào nồng độ Việc ứng dụng dịch chiết nấm cho các bệnh nhân tự nguyện bước đầu đã cho kết quả khả quan.

- Đã xây dựng được quy trình lách và tinh sạch Protein tái tổ hợp Taq

polymeraza Chế phẩm thu được đạt hoạt tính 1.5 - 2\xỊ ịil Chế phẩm trên đã

cung cấp cho một số phòng thí nghiệm sinh học phán tử để thay thế chế phẩm nhập ngoại.

hướng nghiên cứu của đề tài.

và 06 bài báo đăng trên các tạp chí chuyên ngành.

6 Tình hình kinh phí

- Kinh phí được cấp: 300 triệu đổng.

- Kinh phí đã sử dụng: 300 triệu đồng.

TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC

c ơ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI Đại học Quốc gia Hà Nội

1 The title project:

Study o f perennial Ganoderma, polypores mushroom, their main bioactive compounds fo r health protection and pufification recombinant Taq polymerase fo r biotechnological research.

Code num ber: QGTĐ.03.08

2 Prject C oordinator: Prof Dr Sc Trinh tarn kiet

3 Project members:

- Prof Dr Sc Trinh Tam Kiet - Center of Biotechnology VNU

- Dr Duong Van Hop - Center of Biotechnology, VNU

- Prof Dr Le Dinh Luong - Center of Biotechnology VNU

- Dr Dam Bach Duong - Center of Biotechnology, VNƯ

- BA Hoang Van Vinh - Center of Biotechnology, VNU

- BA Nguyen Thi Kim Ngan - Center of Biotechnology, VNƯ

- BA Trinh Thi Tam Bao - Center of Biotechnology, VNƯ

- BA Nguyen Xuan Hung - Center of Biotechnology, VNU

- MSC Tran Thi Lan - Center of Biotechnology, VNU

- MSC Doan Van Ve - College of Science, VNU

- MSC Ta Bich Thuan - College of Science, VNU

- Dr Le Xuan Tham - Center of Radio biotechnology.

4 The objectives and research contents

4.1 The objectives

mushroom base on morphological and molecular characteristica.

(stimulation immune system and antitumor).

- Pufification recombinant Taq polymerase for biotechnological research.

4.2 The research contents

mushroom base on morphological and molecular characteristica and maintaining the strains on culture collection.

- Research on main bioactive compounds and method to exstract the main bioactive compounds from some important specices.

- Study using the abouv exstractions to stimulation immune system and antitumor traitement.

- Pufification recombinant Taq polymerase for PRC reaction.

5 Main results

- There are about 51 specices of the perennial Ganoderma polypores mushroom had been found (Ganodermataceae - 2 genus 13 species Hymenochaetaceae - 2 genus, 23 species, Coriolaceae - 7 eenus 15 species).

- The morphological and micropic characteristica of some importan species are discribed and maintaining the strains on culture collection.

- Finding the method to extraction DNA of anual Linzi and identification Ganoderma using PCR - RFLP analysis of Mn SOD gene.

- The growing and fruiting of the perenial linzhi and polypores strains Toh, E l, HI, Gs and c were studied on Agar medium and Substrat.

- The main bioaactive compounds of the strains El,Toh, HI, N1 Cl were identificative by chromatography methods: MS, HPLC, TLC.

- All extracts and their mixtures do not exhibit cytotoxic effect against the tested cell lines Upon treatement with ethanolic and aqueous extracts, a concentration-dependent inhibition of cell proliferation was abserved The exstractions were using to treatement of the free willing patients and give the good results.

- The Taq polymerase for PRC was on pufificated exstract and have activity about 1.5 - 2ji/ |il This product was using in some molecular laboratorium in Vietnam.

- Six papers have been published and two presentations on National congress and one in Japan.

- Two graduate students is being under the research direction of the project.

long Van Hop

Project implementing organization

Vietnam National University, Hanoi

Prof Dr Sc T rinh Tam Kiet

5

Số lượng các loài nấm đã được định danh là 80060 loài (Từ điển nám Kirk et al, 2001) Trong đó , sô lượng loài nấm lớn (Marcro fun21) có quả thê nhìn thấy bằng mắt thường khoảng 14 nghìn loài và có thể lên tới 22 nshìn loài (Hawkworth, 2001) trong đó, khoảng 50% các loài có thể ãn được bỏ'i các mức

độ khác nhau, hơn 2000 loài an toàn (cả các hợp chất tron2 tế bào và các hợp

phụ ) và khoảng 700 loài được cho rằng có các đặc tính dược liệu Các số liệu hiện có cho thấy nấm lớn là nguồn tài nguyên vô tận ẩn chứa các hợp chất có trọng lượng phân tử lớn như: Polysaccharide, Polaccharide- Protein và đặc biệt giàu các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp có trọng lượng phân tử nhỏ hơn.ít nhất

có 651 loài và 7 dưới loài thuộc 182 chi của các Nấm có đảm đa bào (Heterobasidiomycetes) và Nấm có đảm đơn bào (Holobasidiomycetes) chứa các Polysaccharide có tác dụng dược liệu (Reshetnikov et al., 2001) Chú ne hầu hết

là các Glucan với nhiều loài liên kết Glycoside khác nhau như p -1 ->3, p -l->6 và

p - l->3) nhưng một số thực sự là Hecteroglucan Một số polysaccharide liên kết với các gốc protein như phức hợp PSP (Krestin) chiết suất từ nấm Vân chi

(Ttrametes versicolor) Các chất này có tác dụng chủ yếu chống ung thư, nhưng

nằm trong vách tế bào nấm, thường che lấp bởi thành phần chính của nấm là kitin Bên cạnh đó, từ nấm lớn hàng trăm các chất có hoạt tính sinh học có trọn 2 lượng phân tử nhỏ hơn cũng đa được tách chiết, sàng lọc, nshiên cứu cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của chúng Trước hết phải kể đến các Terpenoit như

ganoderic axit, lucideric axit, ganoderiol, ganodermodiol từ các loài Ganoderma

cũng như các lanostal, sterol, phenol từ hàng loạt các loài nấm lớn khác.

Hoạt tính chống ung thư, điều hòa hệ miễn dịch, antioxydan, chống viêm nhiễm, chống virus, vi khuẩn, nấm; làm giảm lượng choresterol mỡ đường trong máu cũng được nghiên cứu tích cực tại nhiều nước có nền công nshiệp phát triển [8, 10, 14, 15, 16, 17].

Những nghiên cún về thành phần loài nấm lớn của Việt Nam đã được Trịnh Tam Kiệt và các tác giả khác tiến hành [1, 2, 4, 11, 18, 19] và thống kê toàn bộ vao năm 2001 [3], bao gồm khoảng 1200 loài trong tổng số 2250 loài nấm được định tên khoa học Trong đó có một số loài được ghi nhận là có tác

I M ơ ĐẢƯ

dụng dược liệu nhưng chưa chỉ ra các đặc điểm sinh học cũne như tác dụnơ dược học của chúng Một số chủng nấm dược liệu khác như Linh chi, Vân chi Nấm đầu khỉ, Nấm lỗ cũng được nhập nội và nuôi trồng thử nghiệm ở một số cơ sở nghiên cứu và nuôi trồng nấm của Việt Nam Một số sản phẩm nấm như linh chi khô nguyên cái hoặc cắt lát, bột nấm, chè linh chi cũng được sản xuất thử nghiệm và cung ứng cho người tiêu dùng Tuy nhiên, những nghiên cứu kỹ lưỡng hơn về thành phần loài, sự phân bố, trữ lượng, khả năng đưa vào nuôi trồng các

tác dụng dược lí còn chưa được làm sáng tỏ.

Trong khuôn khổ dự án hợp tác với CHLB Đức: Nghiên cứa các chơi có

ỉìoat tính sinh học ở Việt Nam Các chất có hoạt tính sinh học chính của £ần 100 • • • • •

loài nấm lớn đã được nghiên cứu, hơn 50 chất đã được xác định tới cấu trúc phân

tử, trong đó có khoảng 30 chất có cấu trúc mới cho khoa học đã được mò tả [14] Một số chất có hoạt tính cao, kìm hãm sự hoạt động của tế bào ung thư, tăn2, khả nãng miễn dịch của cơ thể, kháng các vi sinh vật gây bệnh, chống viêm có khả năng ứng dụns lớn trong dược phẩm, mỹ phẩm [12] Đặc biệt gần đây “Cổ linh chi” (thưc ra chính xác hơn lànấm linh chi đa niên và nấm đa niên) đã được đặc biệt lưu ý.

ADN polymeraza là enzim xúc tác cho phản ứng nhân sen PCR (Polymerase Chain Reaction) hay là phản ứng trùng hợp chuỗi nucleotit (chiều 5’-3’) theo nguyên tắc bổ sung so với sợi ADN khuôn (template) khi có mặt các cặp mồi Kỹ thuật PCR là kỹ thuật rất quan trọng cho sinh học phân tử Phản ứns PCR không chỉ đơn giản là nhân dòng gen nghiên cứu mà còn được phát triển ra nhiều kỹ thuật khác nhau trong nghiên cứu cơ bản và ứng dụng trong mọi lĩnh vực Nông Sinh Y như RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction) AP-PCR (Arbitrarily primed - Polymerase Chain Reaction), PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism) và các kỹ thuật finger printing khác như: SSR (Single Sequence Repeat), minisatelite Trong kỹ thuật di truyền kỹ thuật PCR được dùng trong cải biến een như tạo các đột biến điểm, tạo các đầu nối (adaptor) để

hàng loạt các loại kit PCR và RT-PCR nhằm chẩn đoán nhanh các bệnh vi khuẩn, vi rút, bệnh di truyền cho người, động vật, tôm cá và thực vật vv

Rõ ràng phản ứng PCR có ứng dụng rộng lớn nhưna yêu cầu tiên quyết của phản ứng là tính đặc hiệu (hay độ chính xác) cao Đây là yêu cầu bắt buộc cho mọi enzim ADN polymeraza dùng cho phản ứng PCR ở nhiệt độ cao, tại đó đoạn mồi (primer) bám đặc hiệu vào đúng sợi khuôn Đến nay đã có rất nhiều các nghiên cứu đề cập đến đặc tính này của các loại ADN polymeraza có nguồn gốc

từ vi sinh vật ưa nhiệt như Sulfolohiis.soifuiaricns Bacillus slcì ioỉỉtcrphilus

Thenmis aquaticus, Thermits íhcrììĩoplìilus hav Pyrococus fumaricus Tuy nhiên,

cho đến nay trên thực tế enzim phổ hiến và chủ yếu nhất là ADN polymeraza được tinh sạch trực tiếp (native) hoặc sản xuất theo con đường tái tổ hợp

(recombinant) từ gen ADN polymeraza của vi khuẩn Thenmis aquaticus Một

enzim khác ít được dùng tại một số phòng thí nghiệm trên thế giới cũng đang

Pyrococcus furiosus có tên thương mại là pfu Tính phổ biến của enzim ADN

polymeraza của Thermits aquaticus tronơ mọi nghiên cứu sinh học phân tử có

thể được giải thích bởi các đặc tính ưu việt như: enzim có hoạt tính cao và bền nhiệt hơn các enzim ADN polymeraza khác, enzim ADN polymeraza này có khả năng nhân gen với cả các cặp mồi đặc hiệu (specific primers) và mồi vạn nâng (degenerate primers) Điều này có ý nshĩa rất quan trọng cho việc tách dòng gen bằng kỹ thuật PCR dựa vào chuỗi axit amin đã biết của protein nshiên cứu Ngoài ra, nhiều nghiên cứu đã chứng minh được vai trò của enzim nói trên xúc tác cho phản ứng giải trình tự ADN (sequencing) và sao chép ngược ADN từ sợi khuôn ARN mà không một enzim ADN polymeraza nào có được.

Vì vậy việc nghiên cứu tích cực thành phần loài , định loại và mô tả các đặc điểm sinh học của chúng trong thiên nhiên cũng như phân lập thuân khiết dể bảo tồn nguồn gen, bước đầu định loại chúng bằng sinh học phân tử, nshiên cứu trong môi trường nuôi cấy, xác định các nhóm chất chất có hoạt tính sinh học chính của một số loài nấm quan trọng, khảo nghiệm việc sử dụng quả thể của các loài này trong “liệu pháp nấm đa niên” và nghiên cứu sản xuất chế phẩm Taq ADN polymeraza thay thế sản phẩm nhập ngoại có nghĩa khoa học va thực tiễn

8

II KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u

Lào Cai Sapa, Lai Châu, Sơn La, Yên Bái, Tam Đảo, Ba Vì Cúc Phươne Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng, KonTum, Đắc Lắc, Đắc Nông Tổng số mẫu thu được khoảng 500 mẫu.

+ Các mẫu vật trên đã được xử lý, sấy khô và bảo quản tại Bảo tàng Nấm Trung tâm Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội.

2.2 Nghiên cứu thành phần loài, định loại và mô tả các loài quan trọng của Việt Nam

+ Nghiên cứu đặc điểm hình thái quả thể, sợi, bào tử dưới kính hiển vi

quang học và kính hiển vi điện tử quét của khoảng 15 chủng.

+ Bước đầu định loại và mô tả các loài thường gặp Các số liệu nghiên cứu cho thấy tập đoàn nấm c ổ linh chi và nấm Đa niên chủ yếu của Việt Nam khá phong phú:

* Thànlì phần loài nấm đa niên đã ghi nhận được tại Việt Nam

(Theo Ainsworth & Bisby’: “Dictionary of the Funsi” 1995 va Trinh Tam Kiet va cac tac gia khac: “Checklist of plant species of Vietnam” Fungi p.51 - 393,2001).

Ngành Basidiomycota Lóp Basidiomycetes Dưới lóp Holobasidiomycetidae

Bộ Ganodermatales

Họ Ganodermataceae ( Donk) Donk, 1948

Chi Ganodenna Karst., 1881

Dưới chi Elfvingia (12 species)

1 Gatwderma annulare (Fr.) Gilbn.

2 G appỉanơtum (Pers.) Pat

9

3 G austraỉe (Fr.) Pat.

4 G cf brow nil (Murr.) Gilbn.

5 G gibbosum (Blume & Nees, Fr.) Pat.

6 G lobatlim (Schw.) Atk.

7 G oroflavum (Lloyd) Humph.

8 G philippii (Bres & Henn.) Bres.

9 G tornatum (Pers.) Bres.

10.Ơ cf Triangulum Zhao & Xu

11 G cf ungulatum Zhao & Zhang

12 Ganoderma sp 1 13.Ganoderma sp.2 Chi Tomophagus Murr 1905

1 Tomophagus collossus Murr.

BỘ Hymenochaetales

Họ Hymenochaetaceae Imazeki & Toki, 1954

Chi Phellinus Quell., 1886 (22 species)

1 Phellinus adamantiiuis (Berk.) Ryv.

2 Ph bambusinus (Pat.) Pat.

3 Pil cf conchatus (Pers.: Fr.) Pat.

4 Ph contignus (Pers.: Fr) Pat.

5 Ph extensus (Lev.) Pat.

6 Ph fastuosus (Lev.) Ryv.

7 Ph gilvus (Schw.: Fr.) Pat.

8 Ph hartigii (Allesch et Schnabl.) Pat.

9 Ph igniarius (L.: Fr.) Quel.

10 Ph lamaensis (Murr.) Pat.

11 Ph linteus (Berk, et Curt.) Teng

12 Ph niighenensis (Mont.) Cunn.

13 Ph noxinus (Corner) Cunn.

14 Ph pachvphloeus (Pat.) Pat.

15 Ph pectinatus (Klotzsch) Quel.

16 Ph pini (Brot.: Fr.) Ames

17 Ph puỉìns (Berl et Mont.) Ryv.

18 Ph rimosus (Berk.) Pilat

19 Ph robustus (Karst.) Bourd et Galz.

20 Ph senex (Nees et Mont.) Imaz.

21 Ph setulosus (Lloyd) Imaz.

22 Ph tonilosus (Pers.) Bourd et Galz.

Chi Phylloporia Murrill, 1904

1 Phylloporia ribis ( Schumach.:Fr.) Ryvarden

BỘ Poriales

Họ Coriolaceae (Imazeki) Singer, 1961

Chi Nigrofomes Murrill, 1904 (1 species)

1 Nigrofomes melanoporus (Mont.)Murrr.

Chi Lariciofomes Kotl & Pouzar, 1957 (1 species)

1 Lariciofomes officinalis (Vill.: Fr.) Kotl & Pouz

Chi Fomitopsis p.Karst., 1881(4 species)

1 Fomitopsispinicola (Svv.:Fr.)P.Karst.

-Ungulina marginata(Pers.:Fr.)Pat.

2 Fomitopsis rhodophaeus (Lev.)Imaz.

3 Fomitopsis dochimus (Berk.& Br.) Ryv.

4 Fomitopsis carneus Blume &Nees)Imaz.

Chi Pereniporia Murrill 1942 (4 species)

1 Perenipoha meduỉỉa-panis (Jacq.:Fr.)Donk

11

2 p.martius (Berk.)Ryv.

3 P cf Latisima (Berk.)Ryv.

4 Pereniporia sp.

Chi Pyrofomes Kotl & Pouzar, 1964 (1 species)

1 Pyrofomes aỉbomarginatus (Lev.) Rvv.

Chi Rigidoporus Murrill, 1905 (3 species)

1 Rigidoporus lineatus (Pers.) Ryv.

2 R microporus{Yĩ.) Overeem.

3 R v//7c/ws(Berk.) Ryv.

Chi Wolfiporia Ryvarden &Gilb., 1984(1 species)

1 Wolfiporia cocos (Schw.)Ryv.&Gilb

Qua bản danh lục các loài nấm đa niên đã 2ặp ỏ' trên, chúng ta thấy các loài

nhận, sau đó đến các đại diện của họ Ganodermataceae và Poriaceae với số lượng loài gần tương đương như nhau, khoảng trên dưới 10 loài.

Cũng tương tự như vậy, khi xem xét về đa dạne bộ ta thấy ưu thể rõ rệt thuộc về Hymenochaetales, sau đó mới tới Ganodermatales và Poriales.

v ề đa dạng chi, ta thấy nổi bật ưu thế ưu thể tuyệt đối trons các nấm đa

Elfvingia đóne vai trò quan trọng Các chi Fomitopsis và Pereniporia đóns vai

trò trung bình Một số chi chỉ có mọt loài được ahi nhận như Nigrofomes,

Laricifomes, Tomophagus, Wolfiporia,

Nhằm bảo tồn nguồn gen nấm, các quả thể tươi đã được phân lập sơ bộ tại hiện trường và phân lập thuần khiết tại phòng thí nghiệm Các chủns giống gốc Nấm được lưu trữ tại Bảo tàng Giống Gốc Nấm, Trung tâm CNSH, Đại học Quốc gia Hà Nội (30 chủng).

2.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử

Bên cạnh việc sử dụng các phương pháp nghiên cứu hình thái giải phẫu, nghiên cứu các đặc điểm hiển vi quane học cũns như điện tử việc thăm dò định

12

loại linh chi đa niên cũng bước đầu được tiến hành tại phòng di truyền và sinh học phân tử do GS Lê Đình Lương chủ trì Các kết quả ban đầu thu nhận được cho thấy :

+ ơ các loài Linh chi đơn niên : Xác lập được quv trình tách chiết ADN

dịch chiêt (Tris 100 mM pH 8, EDTA 50 mM, SDS 1%) ở 65°c trong 30 phút; thêm 200 |Lil kali axetat 5M, ủ đá 20 phút; ly tâm thu dịch nổi; kết tủa ADN bằns một thể tích isopropanol; rửa kết tủa hai lần bằng etanol 70%; làm khô và hòa tan ADN trong 30|J.1 nước MiliQ.

+ Ở các loài Linh chi đa niên : phươne pháp tách chiết ADN áp dụns

cho nấm Linh chi đơn niên không phù hợp với nấm Linh chi đa niên: sản phẩm tách chiết chỉ có ARN, không thu được ADN.

Để khắc phục khó khăn trên, nhằm phân loại và nhận dạng 2 loài trong chi

Ganodenna bằng kỹ thuật PCR- RFLP đối với đoạn gen Mn SOD đã được nhán

bản dựa trên những n°hiên cứu trước đây của chúng tôi:

* Phương pháp nghiên cứu:

- ADN được tách chiết từ các mẫu theo Nguyễn Thị Kim Duns và Lê Đình Lương, có cải tiến [IX].

- PCR với mồi đặc hiệu cho gen Mn SOD của G.lucidum và G.australe là

FGaul và RGau2 Trình tự của cặp mồi này do Nguyễn Hoài Giang, Nguyễn Xuân Hùng, Lê Đình Lương thiết kế [XI] có trình tự như sau:

FGaul: 5 ’- GA A GCA CCA CCA GAC CTA CGT C- 3’

RGau2: 5 ’- AGA CGT CGA CGC CGA TGA TGG- 3 ’

- Cắt sản phẩm PCR bằng 11 enzym giới hạn với đệm phù hợp, ở 37°c trong 5 giờ [XII].

- Điện di kiểm tra sản phẩm PCR và cắt enzym giới hạn trên gel polyacrylamid 6% và nhuộm bạc[XII].

* Kết quả nghiên cứu:

a Nhân dang G.australe:

13

Với tất cả các enzym sử dụng, Gau luôn tạo ra số lượng và kích thước các

đoạn cắt giới hạn khác so với 3 mẫu thuộc G.ìucidum do đó G.ausĩraỉe có thế

được phân biệt rất rõ bởi tất cả các ezyme sử dụng(Bảnơ 1) Trong đó có hiệu

quả nhất là enzym Seal, Fspl, Pstl vì 3 enzym này chỉ cắt đặc hiệu đối với nó

Seal chỉ cắt Gau , tạo ra 2 băng đều có kích thước khoảng 375bp; Fsp\ tạo ra 2

băng có kích thước 600 và 150 bp; còn Pstl tạo ra 2 băng có kích thước 650 và

lOObp Tiếp theo có thể dùng Aval, Avail và Prill và chúng đều tao ra các đoan

ADN ở Gau khác xa so với G ll, G12 và HQ.

b.Nhân dang G.lucidum và các dưói loài của nổ:

G.ỉucidum có thể được nhận dạng dựa trên kiểu cắt đặc trưng bởi các

enzym Pvul, Aval, Avail, Mnỉ I, Hha I, Alul, Sa ch EcoRl như thể hiện trong

Bảng 1.

G12 có thể được phân biệt với Gll và HQ bởi sự khác biệt trong kích

thước các đoạn cắt được tạo ra, đặc biệt sự khác biệt này khá rõ ở Hìial, Mnll,

Pvul và Aval G12 rất có thể là dị hợp tử đối với locus Mn SOD nên cho hai băn 2

sản phẩm PCR có kích thước khoảng 700 và 720 bp, do đó khi cắt bởi các ezyme giới hạn tạo ra nhiều băng có tổng kích thước khoảng 1200bp.

HQ có quan hệ gẫn gũi nhất với Gll do số lượng và kích thước các đoạn cắt giới hạn của chúng rất giống nhau đối với đa số enzym Như vậy có thể xếp

HQ vào một dưới loài của G.lucidum rất gần với Gll Tuy nhiên, HQ cũng có thể được phân biệt với Gll bởi kiểu cắt của enzym Avail Gll chỉ cho 2 bang : 440

và 220 bp, còn HQ cho 4 băng: 440, 320, 220 và 115 bp Điều này có thê được giải thích do HQ cũng là dị hợp tử đối với locus này, trong đó 1 alen có 1 điểm

cắt (tạo 2 băng 440 và 220 bp giống với Gll) còn 1 alen có 2 điểm cắt cho Avail (tạo 3 băng 320, 220 và 115 bp) Ava\\ cắt đoạn ADN của G12 cũng tương tự như

của HQ.

14

Fsp\ Sea I Pst I PCR

Gau HQ GI1 GI2 Gau HQ GI1 GI2 Gau HQ GỈ1 GI2 Mr Gau HQ GI1 GỈ2

700 600 500 400

Gau HQ G11 GI2 Gau HQ GI1 GI2 Gau HQ Gil GI2 Gau HQ GI1 GỈ2 Mr

«4»-

***■*-Sản phẩin PCR (PCR) với cặp mồi F G au l và RGau2 và cắt enzym giói hạn

Chú thích: Mr: Thang ADN chuẩn (25/100 ladder - Bioneer)

15

Bảng 1 Các đoạn giới hạn (bp) dược tạo ra khi cát đoạn gen Mn SOD cùa các mảu

Ganoderma bởi các enzvm giói hạn

Enzym

Số Băng

Kích thước băng(bp)

Số băng

Kích thưóc băng (bp)

720+700 (không cắt)

-1

590+570+

130

Chú thích: *: Sản phẩm PCR với cặp mồi FGaul và RGau2

(1): tạo thành 2 băng cùng kích thước 375 bp (2): có thể giải thích sự tạo nhiều băng do các mẫu là dị hợp tử đối với locus Mn

SOD.

(3):bảng chỉ liệt kê các đoạn ADN nhìn thấy trên bản gel Những đoạn còn lại

quá nhỏ ( dươi 70bp) không thể thấy được trên bản gel do nồng độ gel 6% khống phù hợp.

(4)'do nồng độ ADN cao nên enzym chưa cắt hoàn toàn đã bị mất hoạt tính

1 6

- ơ chủng Toh ( Tom ophagus), phát triển sợi dạng bône mau xám và rất

mềm Khi hầu hết hệ sợi đã chuyền sang giai đoạn trưởns thành, chime ta cỏ thê

quan sát thấy sự tào thành bào tử vách dày, hay còn gọi la hâu bào tư

(chlamydospore) với những kiêu hoa văn điên hình Đặc biệt, trons điều kiện tối

ưu, chủng này có thê hình thành qua thê chín với nhiều lồ tươna đôi lớn Trên

bào tầng, ta có thể tìm thấy nhiều bào tứ đảm điên hình cua loài với kích thước

trong khoang 1 5 - 1 8 jam Dưới kính hiển vi điên tử quét (SEM), ta quan sát

được nhừng bào tử đã nảy mầm và cấu trúc hoa văn dạng mạng.

■i'

í

Bào tử của Tomophagus và Pereniporìa trong nuôi cấv thuán khiết.

- ơ chủng E1 ( Ganoderma sp.), hệ sợi đôi màu từ trăne sane \ ànLL sau

thấy nhiều eiọt nước Trên bề mặt có nhiều nếp nhăn và vết nứt.

- ơ chủng P1 (Pereniporia sp.), hệ sợi ban đầu màu trăna sau đó chuyên

thành màu X m đen Khi quan sát dưới kính hiển vi ta thấy sợi nám \ ói bào tư

vách dày điển hình k h ô n s có hoa văn Trons điều kiện tối ưu, chung, này có thẻ

hình thành mầm m ô n 2 quá thể (primordium).

- Ò chủng HI (.Pheỉỉỉnus), hệ sợi ban đằu cũn2, có màu trăna dạnii bôna.

sau đó chuyến sang vàng Đặc biệt, sợi nấm có thê leo men theo thành bình tam

giác (Erlenmeyer flask), đạt tới độ cao 3-5(-7) cm và đôi khi còn chạm nút hỏng.

Khi quan sát dưới kính hiển vi, hầu hết cấu trúc sợi là sợi nấm dạng lông cứng

Dưới nhùng điều kiện tối ưu, chủng nàv có thẻ hình thành qua thê bât thụ dạng

^ Đạc biẹt ơ chung P1 có hình thành hậu bào tử, đầu tiên màu xám sau chuyen sang mau đen, gây ân tượng như nuôi cấy bị nhiễm Bào tử hữu tính

hình trái xoan điển hình, đạt kích thước .

ban cau co chia thuy ít nhiêu, đâu tiên màu trăng sau chuyển sans màu vàng,

kích thươc5 -12 cm Trên quả thê hình thành ông rộng, kích thước 2-3 èns tronơ

1 mm Khi quan sát dưới kính hiên vi, các đảm bào tử điển hình được hình

thành, kích thước dạt 15-18 |am Dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM), thấy rõ

lỗ nảy mầm và trang trí dạng mạng lưới rộne.

m * * *

* , e ỵ • ị

i f * "1 » *

Sự hình thành quả thể của Phelìinus

* Sự mọc và sự hình thành của các chủng nấm khi nuôi cấy trên giá thể mùn cưa

Mùn cưa gỗ bồ đề đã có bổ sung dinh dưỡng được sử dụng để nghiên cứu

sự mọc và sự hình thành quả thể của các chủng nấm nói trên.

Trons tối, cả bốn chủng đều mọc tốt trên giá thể, hình thành sợi nấm màu trắng, đạt tốc độ từ 200 I^m - 300 Ịim.

trong điều kiện nhiệt độ phòng.

Qua đó ta thấy :

Chủne HI chỉ hình thành mô sẹo mà chưa hình thành quả thể thành thục.

19

Chủng P1 hình thành quả thê phối thai màu trắng xám sau đó h ìn h

thành lỗ màu hồng thịt nhưng chưa hình thành quả thể thành thục.

Chủng Toh hình thành quả thể màu vàng và nếu chăm súc tốt sẽ cho quả thể thành thục với mặt mũ đầu tiên màu vàng sáng sau chuyên thành vàns đạm, nhẵn bóng tương tự màu sắc quả thể ngoài tư nhiên Phía dưới hình thành ống nấm điển hình 2-3 ông trong 1 mm.Trên lớp bào tầng hình thàn bào tử nấm thành thục Thời gian hình thành quả thể thành thục tron2 điều kiên thuân lợi

40 ;60 ngày.

Chủng E1 phát triển tạo thành quả thể thành thục, hình thành ốna nấm điển hình màu trắng và bào tử giá điển hình.Thời gian hình thành quả thể thành thục dài tới 120-140 ngày.

* -yv -'*' ** fclW Wl1* *» -N , *■ *

m B zw - *•> '

>V':^ v;1- '

Sự hình thành quả thể của Ganodenna

Sự hình thành quả thể của Tonnorphagus

20

Cũng như trên môi trường thạch khoai tây, sự mọc và hình thành quà thể của các chủng nấm lồ nhiều năm trên giá thể mùn cưa cũng bị ảnh hườne bởi

điều kiện dinh dưỡng Trong số đỏ, ánh sáng và nhiệt độ là hai nhân tố tối quan trọng đối với sự phân hoá vùng sinh dưỡng và sinh sản Quá trình tạo bào từ non, quá trình phân hoá mù chịu ảnh hường tích cực của ánh sáng và nhiệt độ trong khi sự mọc của sợi trong điều kiện có ánh sáno và nhiệt độ tươne đối cao

2.5 Nghiên cứu một số nhóm chất có hoạt tính sinh học chính của một số loài quan trọng

Quả thể của 5 chủng nấm cổ linh chi và nấm Đa niên đã được tách chiết

2.5 - 4.5% trọng lượng khố của quả thể nấm Các nhóm chất tự nhiên chủ yếu đã được chỉ ra bằng những nghiên cứu trên sắc ký cột, sắc ký bản mỏns, sắc ký khí và nghiên cứu khối phổ cho thấy các chất chiết của nấm c ổ linh chi và nấm

Đa niên rất giàu các hoạt chất Ngoài các chất có trọng lượng phân tử lớn như: Polysaccharide, Polysaccharide-peptide, Peptaibol thì các chủng nghiên cứu còn chứa nhiều Steroid (esgosterin), Tepenoid Đáng kể nhất là 7 colossolacton

mới (được gọi chung là colossin), từGanoderma coỉossimr, lanostanoic, poricoic,

sp

Từ trước tới nay, khi đề cập tới nấm lồ đa niên, người ta chú ý nhiều đến tác hại của chúng, gây mục gỗ, làm thiệt hại nhiều cho lâm nghiệp Nhằm tìm hiểu giá trị dược lý của các loài nấm lồ đa niên trên, việc nghiên cứu một số nhóm chất có hoạt tính sinh học chính cũng được tiến hành bước đầu.

Các chủns nshiên cứu nấm sử dụns trong nghiên cứu bao gồm :

Nấm đươc chiết đưọc chiết suất trons nước đun sôi 3 lần mồi lần 2 tiếng

và hàm lượng sinh khối thu được như sau :

21

Quả thể khô của một vài loài nấm đa niên quan trọns được chiết suất nhằm mục đích nghiên cứu về những nhóm họp chất có hoạt tính sinh học chính Hàm lượng có trong dịch chiết nước và cồn vào khoảna từ 2,5 tới 4% trọnơ lượng quả thể khô và rất giàu các họp chất có hoạt tính sinh học.

Chúng tôi chọn các phương pháp sắc kí để nghiên cứu về các hợp chất chứa trong những dịch chiết này Các phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC) và (EMS) được sử dụng Một điều không có gì đáng neạc nhiên là các dịch chiết chứa vô cùng nhiều các hợp chất có hoạt tính và chúng tôi phải tách chiết, sàng lọc rất kỹ mới có thể đi sâu nghiên cứu được.

*

■ - - i - •

; - h ị, t, ; >

< :»

í .J* <

■ a !

Khối phổ của dịch chiết cồn của E l.

Khối phổ của dịch chiết nước của El.

22

2.6 Nghiên cứu tác d ụ n g của dịch c h iế t nấm L in h chi đa niên và n ấ m đa niên lẻn t ế bào n u ô i cấy In vitro của người và k h ỉ

Chuân bị dịch chiẻt đê làm thí nghiêm về ảnh hương đối với các dònơ tế bào của người và động vặt.

Chúng tôi sử dụng 5 mẫu có nguồn gốc từ 5 loài nấm lồ đa niên cua Việt Nam, kí hiệu là H I , H3, E l , N l , P l Đe chiết suất, chúng tôi lấy 300g quả thề khô từ mỗi mẫu Đun sôi với nước 3 lần, mồi lân tronơ 2 giờ Sau đó hoà dich chiết của ba lần lại làm một, tiếp tục đun, cô đặc cho tới khi ta có chừnơ 25 - 30

Dịch chiêt sau đó được sây đông khô, rôi hoà tan trờ lại với nước Phần nguyên liệu còn lại sau khi chiết với nước được đem chiết với cồn Sau 24 giờ, chúng tôi cất quay và tiếp đó hoà tan trở lại trong cồn.

Ảnh h ư ở n g độc tế bào và kìm hãm tăng sinh tế bào của dịch chiết nước

và cồn của các n ấ m ỉỗ đa n iê n đối với tế bào người.

Hiện tại, chúng tôi điều tra về các ảnh hướng của dịch chiết nước và cồn của một số nấm lỗ lên sự sinh trưởng của một số dòng tế bào Phải kể đến, đó là Hela (tế bào ung thư cổ tử cung), Vero-B4 (tế bào thận của loài khỉ xanh châu Phi), Hep-G2 (tế bào uns thư gan), CLS-354 (ung thư tế bào hình vảy trong miệng) và M D A -M B 436 (tế bào ung thư vú cùa người) (Các chủng nấm được

■*— HeLa

MDA-MB 436

1 0 0 0

C on cen tratio n (|jg/ml)

Antiproliferative and Cytotoxic Effect of

Concentration (ụg/ml)

C o n c e n tr a tio n (ụg/ml)

Tất cả các dịch chiết cũns như hỗn họp của chúng khôn 2 thể hiện ảnh hưởng độc tế bào đối với các dònơ tế bào đã được thử nghiệm Sau khi bi xử ÌÝ *> ' • ^ • v_^ , với dịch chiết nưó'c và cồn, chúnơ ta quan sát thấv sự ức chế phụ thuộc nồns độ dịch chiết lên quá trình tăng sinh của tế bào ở nồng độ cao một số dịch chiết • X V_- w • - biểu hiện tác dụns kìm hãm quá trình tăng sinh của tế bào.

2.7 Bước đầu nghiên cứii sử dụng dịch chiết nấm trong thực tiên

Vièc nshiên cứu côn V 2 _- nshê tách chiết các chế phẩm để ứns duns trons w »—- V thực tiễn đã được tiến hành Chế phẩm kem chống viêm da và dưỡng da đã được sản xuất từ hàn? chuc k s bột tinh chất nấm Một trong nhữns sản phẩm ban đáu

đã đươc khảo nshièm trên nsười tai Bệnh viện Da liễu Đại học Tổng họp Jena V _ • • • * * *■cho kết quả tốt Quy trình côn2: nghệ tách chiêt các hoạt chàt chính của các loài nấm Cổ linh chi và nấm Đa niên khác bước đầu đã được khảo nghiệm Việc sử dụns “Liệu pháp nấm c ố iinh chi và nấm Đa niên* đẽ điéu trị cho các bệnh nh'*n

tự nguyện bị bệnh ung thư, tim mạch và tiêu đườnơ CŨI 12 được triên khai Các kẽt quả thống kê từ gần 400 bệnh nhân tự nguyện đã sử dụng liệu pháp cho thấy số bệnh nhân bị ung thư là gần 300 người và hơn 100 người là các bệnh nhân mắc bệnh tim mạch, tiết niệu, viêm gan B .Các số liệu được ghi trong nhật kí điều trị

và phiếu kiểm tra định kỳ tại các trung tám y tế cho thấy tất cả các bệnh nhân đều không có phản ứng phụ đối với cơ thể Một số chỉ tiêu sinh hóa bệnh như : a-FP, CEA, HCG, Got, Cholesteron, Triglycerit, đều giảm sau một thời gian

giảm và hóa vôi Một số khối u nhỏ, políp tiêu giảm Liệu pháp có tác dụns đặc

đường, tắc ống mật, sỏi mật Hầu như tất cả các bệnh nhân đều giảm đau, ăn nsu tốt, tăng cường khả năng hoạt động, kéo dài thời gian sống, thậm chí khỏi bệnh Các kết quả khảo nghiệm cũng cho thấy có thể sử dụng liệu pháp nấm kết hợp với giải phẫu, hóa trị, xạ trị Tuy nhiên, theo chúng tối liệu pháp này cũng cần được nghiên cứu kỹ lưỡng hơn đặc biệt ở mức độ tế bào và phân tử.

2.8 Nghiên cứu tinh sạch Taq plymeraza tái tổ họp từ vi khuẩn E coli

2.8.1 Phương pháp nghiên cứu

- Xác định protein theo phương pháp Bradford (1976)

* Các bước tiến hành

- Dựng đồ thị chuẩn

Chuẩn bị các ống chứa BSA từ 1 đến 20mg/ml BSA bổ sung nước cát cho

đủ lOOịil Thêm vào lm l đệm A Trộn đều và đo màu ở bước sóng 595nm Mẫu đối chứng là lOOul nước cất (ống trăng) Dựng

nồnơ độ protein.

- Xác định proteiỉỉ trong mau

Mẫu được chuẩn bi sao cho lượng protein năm trong khoang r>-_0mg/ml Sau đó tiến hành như trên và kết quả được xác định theo đồ thị chuẩn.

* Điện di phát hiện protein trên gel SĐS-PAGE

Điện di trên gel polyacrylamid: Theo quy trình cua J Sambrook

30

* Mục đích: Đế phát hiện protein và xác định trọng lượns phân tư cua protein

theo tỉ lệ 29:1 tạo ra chuỗi polyacrylamid có tác dụng như một râv phân tử Các protein sau khi kết hợp với chất tích điện âm SDS sẽ di chuvển được trong điện trường từ cực (-) đến cực (+) Khi cho protein di chuvển qua bản 2el trons điện

bố trên các vị trí khác nhau của bản gel Protein nào cổ irons lươn í pbaan tử nhỏ

hơn sẽ di chuyển về cực (+) nhanh hơn tuỳ vào nồng độ của polyacrylamid mà

có thể phân tách các protein với các giải trọng lượng khác nhau.

* Hoá chất: Acrylamid 30%; SDS (Sodium Dodecyl Sulphat) 10%; Tris-

HC1 1,5M, pH 8,8; Tris-HCl IM, pH 6,8; ammoniumpersulphat 10%; TEMED.

* Đ ổ gel: Sử dụng thiết bị điện di Mini-protean.

kính và 2 bản nhựa Sau đó để gel ờ 37°c quá trình polỵme hoá xảy ra trong 30

phút.

- Đổ gel cô 5% có thành phần sau:

Acrvlamid 30% 0,33 ml Tris-HCl 1.0M, pH 6.8 0.25 ml

u e i ỡược cttạy trong dẹm chạy gel có các thành phán sau:

* Nhuộm protein

- Đệm nhuộm protein:

Cooomassie R250 0,025%

Methanol 40%

Acid acetic 1% ( lọc qua giấy trước khi dùng)

Cho gel vào đệm nhuộm gel, lắc nhẹ trên máy lắc tronơ 40 phút Sau đó gel được tẩy trong acid acetic 7% và methanol 5% cho đến khi nhìn thấy các băng protein.

* Nghiên cứu biêu hiện Taq A D N polimeraza:

Cấy vi khuẩn E coli mang gen Taq ADN polimerraza tái tổ hợp vào ống nghiệm chứa 5ml LB chứa kháng sinh, lắc qua đêm ở 37°c.

Lấy 0,4ml dịch nuôi cấy đưa vào bình tam giác chứa 20 ml LB và kháng sinh (ampicilin 100ng/ml), lắc 220v/ phút ỏ' 37°c sau 150

Lấy mẫu tại thời điểm 16h

Ly tâm 150 ịú dịch nuôi cấy với tốc độ 5000 vòng/ phút trong 10

phút để thu sinh khối Thêm 40 ui nước cất và 4 ul đệm chạy mẫu protein Chạy điện di protein tổng số trên gel polyacrylamid

* Phương pháp tỉnh sạch Taq A D N polymerase:

- Tách chiết T aq AND poiimeraza ĩ ái í ổ hợp.

32

Từ 100 ml dịch nuôi vi khuẩn E.coli biểu hiện Taq AND polimera’ a

Ly tâm thu tế bào (5000 v/phút/15 phút) Thêm vào 5ml đệm tách : Tris- HCl:50ml=M,pH;8.0, 50mM D-glucoza, ImM EDTA 2mg/ml lysozym Làm tan đều, giữ nhiệt độ phòng (25-30°C) trong 30 phút Phá tế bào bầns siẻu âm 40%, 3sx4 lần.

Ly tâm 15 000 v/phút/30 phút Thu dịch trên tủa cho các bước tinh sạch tiếp

t h e o

- xỉ( lý nhiệt:

Dich enzim thu được từ bước 2.3.1 được xử lý nhiệt tại 75oC trong 45 phút.

Ly tâm 15 000 v/phút/30 phút Thu dịch trên tủa cho các bước tinh sạch tiếp theo.

- Kết tủa phân đoạn với (NH 4)2S 0 4

Bổ sung dần (NH4)2S 0 4 vào mẫu, khuấy đều trong lạnh (4°C) để đạt mức bão hoà 40% (242g/l) Tiếp tục khuấy 30 phút Ly làm 10.000 vòng/phút X 15 phút, thu lấy kết tủa Dịch trên tủa lại tiếp tục bổ sung (NH4)2S 0 4 để đạt độ bão hoà 60% (130g/l) Tiếp tục thu lấy kết tủa phân đoạn 60%, 80% và 100% Loại

glyceryl 15% theo tỷ lệ 1 mẫu/30 đệm (thay đệm 3 lần) Tiến hành điện di dịch protein sau thẩm tích trên gel polyacrylamid để phát hiện protein tạp.

- Sắc kỷ trao đổi anion DEAE — A52.

Nhưa trao đổi anion đươc rửa trong nước cất 2 lần và xử lý theo hướns dẫn của nhà sản xuất rồi loại khí và nhồi vào cột thuỷ tinh có kích thước 2cm X 30cm

với thể tích 20 cm3 Sau đó tiến hành:

• Cân b ằn s cột với 10 thể tích đệm, có thành phần sau: Tris-HCl 50mM,

pH 8.0 Tốc độ 20ml/h.

• Mẫu được đưa lên cột khoảng 200 - 400 mg protein.

• Rửa protein tạp với 5 lần thể tích cột bằng đệm cân bằng có chứa 50

m M NaCl vói cùng tốc độ.

• Giải phóng protein bám vào cột với 5 lần thể tích đệm trên nhưng với

n ổ n ơ độ NaCl thay đổi theo gradient (100 - 600 mM) ỏ' tốc đỏ 30 ml/h Thu mỗi phân đoạn 3 ml.

Tiến hành kiểm tra các phân đoạn có protein Điện di trên gel polyacrylamid xác đinh Ta.c| ADN polymerase (94 kDa) Thu tOcin bọ mau co

Taq ADN polymerase và thâm tích đê loại muối Kết tua với (NH.);SO SOrc Thu tủa protein Hoà tan trong đệm bảo quản đến nổns độ thích họp ơi ừ ở 20°c dùng dần.

* Đánh giá hoạt tính enzim:

vào kết quả so sánh hoạt tính tương đương với enzim Taq ADN polimeraza thương phẩm (Fermentas, Mỹ) căn cứ vào lượng sản phẩm PCR đưọc nhân lẻn trong cùng điều kiện.

2.8.2 Kết quả và bàn luận

- Nghiên cứu biểu hiện gel Taq AND polimeraza:

Chúng tôi tiến hành thí nshiệm như đã trình bày trong phần phương pháp

( 2 2 ).

Kết quả nghiên cứu lựa chon nhiệt dộ và thời gian cảm ứng của chúng tôi cho thấy nhiệt độ thích hợp cho biểu hiện Taq ADN polymeraza tái tổ họp là 37°c

trong thời gian 16h Tuy nhiên tại nhiệt độ thấp hơn (30-35°C) , enzim biểu hiện

tốt nhưng thời gian cảm ứns phải kéo dài dén 20 h-28h Vì vậy chúng tồi chọn

nhiệt độ 37°c cho các nghiên cứu tiếp theo.

Kết quả được trình bàv trong hình 1:

đ *■ ' >, ’

Hình 1 Lưa chọn thời gian cảm ứng

34

- Tinh sạch Taq A N D polimeraza tái tổ hợp

Chế phẩm enzim thô thu được sau bước tách chiết và xử lý nhiệt ( như đã trình bày trong phần phương pháp),sẽ được dùng cho các bước tinh sạch tiếp theo.

+ Kết quả tinh sạch một phần Taq ADN polymerase sán xuất bàng kết

íủa phân đoạn (NH 4) t S 0 4

Điện di trên gel polyacryamid 5% từng phân đoạn kết tủa (NH4):SO 40%, 60%, 80% và 100% cho thấy Taq sản xuất tập trung chủ yếu ở phân đoạn 60% ( kết quả không trình bày ở đây).

+ Kết quả tinh sạch một phần Taq ADN polymerase sản xuất bảng sắc ký

trao đổi anion (DEAE-A52)

Điện di protein trên gel polyacrylamid 5% cho thấy Taq sản xuất tập trune

chủ yếu ở phân đoạn 3 với NaCl nồng đọ 200 mM, sau bước tinh sạch bằng

DEAE-A52.

+Kiểm tra kết quả tinh sạch một phần Taq ADN polymerase

Taq sản xuất thu được sau các bước tinh sạch được điện di trên cel

polyacrylamid 5% để xác định protein tạp.

Sau các bước tinh sạch, kết quả điện di trên gel polyacrylamid 5% cho thấy sắc

ký trao đổi anion đã loại được nhiều protein tạp hơn so với bước kết tủa phân đoạn ammonium sulphate Tuy nhiên Taq sản xuất vẫn chưa tinh sạch bằng AmpliTaq

• "V rv

VÍ Ár'-^v*

Kết quả kiểm tra độ sach của Taq And polimeraza qua cac bưoc:

1 Taq AND polimeraza thương phẩm (Fermentas, Mỹ)

35

2 Taq AND polimeraza tinh sạch qua DEAE-52

* Thang chuẩn protein

bước tinh sạch qua sắc kí trao đổi ion DEAE-52 đẫ loại gần hếtt các protein

mẫu tinh sạch bằng kết tủa phân đoạn với (NH4)2S04 (60%), vẫn còn phát hiện lượng lớn protein tạp Như vậy ché phẩm enzim Taq AND polimeraza tinh sạch

có thẻ dùng cho nghiên cứu đánh giá hoạt tính trong các nghiên cứu tiếp theo

Tóm tắt các bước tỉnh sạch Taq AND polimeraza

Các bước tinh

sach •

S ổ lượng (ml)

Protein ('mgỉ ml)

Protein tổng so (mg)

Hoat đô • • Riêng Ư/mí>P

Hoaĩ đô • • tỏng sỏ (li)

Tỷ lẻ thu ' m r % hồi (%) \

thấp : khoảng 1800 Ư/ml hay 1,8 ƯẠil trong khi đó của thương phẩm là 5Ư//|il

* Đánh giá kết quả nhân gen của Taq AND polimeraza so vói enzim thương

phẩm

+Hoạt tính nhân gen sử dụng ADN E coỉỉ của Taq ADN polymerase

Sử dụng Taq sản xuất dạng thô và tinh sạch cho phản ứng PCR nhân đoạn sen kích thước 672 bp từ AND E.coli Sau khi điện di trên gel agarose 1,5%, kết

36

quả nhận được một băng ADN E coli duy nhất có kích cỡ 672 bp không xuất

2: Sản phẩm khuyếch đại ADN E coìi sử dụng Taq thương phẩm

3: Sản p h ẩm k h u y ế c h đại A D N E coìi sử dụng Taq sản xuất tinh sạch

4: Sản phẩm khuyếch đại ADN E coli sử dụng Taq thô

Sử dụng Taq sản xuất dạng thô và tinh sạch cho phản ứng PCR nhân sen

từ ADN người Sau khi điện di trên gel agarose 1,5%, chúng tỏi nhân dược sản

phẩm là một bãng có kích thước 196bp tr ons cả các trườns hợp Taq thương

phẩm 3 ( Fermentas, Mỹ), Taq tinh sạch 2và Taq thôi.

So sánh khả năng nhân gen của Taq AND polimeraza tinh sạch

và Taq thương phẩm (Fennentas, Mỹ)

2.8.3 Nhận xét chung

1 Kết quả nghiên cứu của chúng tôi đà chon được điều kiện biểu hiẹn Taq

AND polimeraza tái tổ hợp từ vi khuản E.coli: Nôns độ chất cám ứna IPTG: lm M /m l, nhiệt độ cảm ứng 37ưc , thời gian cảm ứns là 16 h.

2 Hoàn thiện qui trinh tinh sạch một phần Taq AND polimeraza tái tô hợp

qua 4 bước, tách chiết enzim, xử lý nhiệt, kết tủa phân đoạn với 60% bão hoà (N H 4)2S 0 4 và sắc kí qua cột trao đối anion DEAE-52 Hiệ suất thu hồi 20%, hoạt độ riêng đạt 11 000 u /m g protein.

3 Kết quả đánh giá khả nâng nhân gen bằng kĩ thuật PCR của Taq AND

polimeraza tái tổ hợp cho thấy chế phấm có thể dùng cho nshièn cứu sinh

học phân tử, tuy n h iên hoạt dộ kém hơn so với chế phám thươns phám

(Fermentas, Mỹ).

3.1 Các công trình đ ã công b ố trên các tạp chí khoa học:

Các công trình d ã công b ố trên các tạp chí khoa học Quốc gia:

+ Nghiên cứu dưới chi Elfwingia và chi Tomophagus ờ Việt Nam Tạp chí

Di truyền & ứng dụng - Chuyên san Công nghệ Sinh học 2003 - 2004.

+ Nghiên cứu chi Phellinus ở Việt Nam Tạp chí Di truyền & ứng dụng Chuyên san Công nghệ Sinh học 2003 - 2004.

-+ Nghiên cứu thành phần lòai Nấm đa niên thuộc họ Coriolaceae Tạp chí

Di truyền & ứng dụng — Chuyên san Cồng nghệ Sinh học 2003 — 2004.

+ N gh iên cứu SƯ m o c v à SƯ hình thành CỊUâ the cuâ num linh chi Hãi micn

Tomophagus colossus Tạp chí Di truyền & ứng dụng - Chuyên san Công nghệ

Sinh học 2003 - 2004.

+ N ơhiên cứu sự ITKDC và sự hình thành quá thổ cua nâm linh ch 1 đa men

(cổ linh chi) G anoderm a australc Tạp chi Di truyền & ứng dung - Chuyên san Công nghệ Sinh học 2003 - 2004.

+ Trịnh Tam Báo Trịnh Tam Kiệt, H.-M Dahse and H.p Saluz, Cytotoxic

and antiproliferative effects o f aquaeous and ethunolic extracts o f Vietnamese perennial Polypores on hum an cells Tạp chi Di truyền hoc và ứng dung T34-

41 So 2, 2005.

3.2 Các báo cáo khoa học tại các hội nghị:

3.2.1 Các báo cáo khoa học tại các hội nghị Quốc tế:

Báo cáo tậi hội nghị khoa học Quốc tế Innovative Roles of Biological

Resource Centers: New and interesting macrofungi o f Vietnam and theirs

bioactive compounds.

3.2.2 Các báo cáo khoa học tại các hội nghị Quốc gia:

đa niên của Việt N a m “ Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự

sống, (đang in) Nhà xuất bản KHKT, 2005.

cứu sử dụng enzyme giới hạn cắt gen Mn SOD d ể phân loại và nhận dạng

Gciìĩoderma, Hội nghị KH toàn quốc về CNSH hướng 8.2, 151 - 156.

4 Kết quả đào tạo

4.1 Thạc Sỹ - Cử nhân KHTN: Trịnh Thị Tam Bảo, “Research on taxonomy o f the main perennial polypores and biological characteristics on

some imporortant species in Vietnam.” Graduation dissertation honor

programme biology Hanoi - Jena.

4.2 Tiễn Sỹ: Ngô Anh, Nghiên cứu thành phần loài nấm lớn vùng Thừa Thiên Huê

Đã tiếp nhận toàn bộ kinh phí năm 2003 là: 150 triệu (VNĐ), năm 2004 là

150 triệu (VNĐ) và tiến hành chi tiêu theo đúng quy định hiện hành cua Nha

nước.

Chúng tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới lãnh đạo ĐHQGHN

và các quý ban đ ã tạo điêu kiện thuận lợi và giúp đỡ đề tài được tríén khai.

39