Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp gamma polyglutamic acid từ đồ uống boza’’

men tạo các sản phẩm giàu dinh dưỡng, trong đó chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng tổng hợp γ-PGAPGA.Với nhu cầu ngày càng cao về γ-PGAPGA, các nhà nghiên cứu khôngngừng tìm kiếm và chọn

và các lĩnh vực khác (Shih et al 2001)

γ-PGA)PGA được tổng hợp từ một số loài vi khuẩn (tất cả vi khuẩn gram

dương), trong đó chủ yếu là chủng vi khuẩn Bacillus được phân lập từ sản phẩm lên men truyền thống như: vi khuẩn Bacillus subtilis (Bacillus subtilis Natto) được phân lập từ natto ở Nhật Bản (Shih et al 2001), Thua-PGA)nao từ Thái

Lan, chungkookjang từ Hàn Quốc

Bên cạnh các sản phẩm lên men kể trên, một loại sản phẩm lên mentruyền thống đang được quan tâm tới khả năng có thể phân lập được cácchủng Bacillus có hoạt lực sinh γ-PGA)PGA cao đó là Boza

Boza được biết đến là một loại đồ uống lên men truyền thống được làm

từ lúa mì hoặc kê, có độ nhớt và nồng độ cồn thấp, thường là từ 0,5% – 1 %,

có vị ngọt và chua, đây là một sản phẩm lành tính và giàu dinh dưỡng Trongboza có chứa hỗn hợp vi khuẩn lactic và nấm men có lợi cho sức khỏe như:

Lactobacillus brevis subsp lactis, Leuconostoc citreum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Enterococcus faecium, Lactobacillus graminis, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus rhamnosus, Pediococcus sp và Lactobacillus

paracasei, Bacillus subtilis (Kivanc et al 2011) Hệ vi sinh vật trong Boza lên

men tạo các sản phẩm giàu dinh dưỡng, trong đó chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng tổng hợp γ-PGA)PGA.

Với nhu cầu ngày càng cao về γ-PGA)PGA, các nhà nghiên cứu khôngngừng tìm kiếm và chọn lọc ra các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợpγ-PGA)PGA với hiệu suất cao từ tự nhiên Xuất phát từ vấn đề trên, để phân lập và

đánh giá khả năng sinh tổng hợp γ-PGA)PGA của vi khuẩn Bacillus trong đồ uống Boza, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp gamma-polyglutamic acid từ đồ uống Boza’’.

-PGA) Phân lập được các chủng vi khuẩn Bacillus từ Boza

-PGA) Đánh giá được ảnh hưởng của pH, môi trường và thời gian nuôi cấytới khả năng sinh tổng hợp γ-PGA)PGA của vi khuẩn

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

PHẦN 2 TỔNG QUAN

Hình 2.1: Công thức cấu tạo của gamma-polyglutamic acid

Tỷ lệ L-PGA)D-PGA)glutamate phụ thuộc vào nhiều yếu tố: loài, điều kiện nuôi

cấy γ-PGA)PGA của chủng Bacillus subtilis (Natto) có tỷ lệ 50-PGA)80% là dạng D-PGA)

glutamate và 20-PGA)50% là L-PGA)glutamate (Kubota et al 1993) Nhiều yếu tố cũngảnh hưởng đến mức độ trùng hợp của phân tử γ-PGA)PGA Nồng độ của Mn2+ cóthể ảnh hưởng đến cấu hình của axit glutamic trong γ-PGA)PGA được tổng hợp bởi

Bacillus subtilis Khi môi trường có nồng độ Mn2+ cao thì trong γ-PGA)PGA cóđồng phân dạng D-PGA)glutamate >80%, môi trường có nồng độ Mn2+ thấp thì γ-PGA)PGA có đồng phân dạng D-PGA)glutamate 40% (Thorne et al 1958)

2.1.2 Tính chất vật lý

Bảng 2.1 Tính chất vật lý, hóa học của gamma-polyglutamic acid

Công thức phân tử (C5 H7 NO3) n

Công thức cấu tạo

Trọng lượng phân tử 50 kDa -PGA) 2000 kDa tùy mức độ trùng hợp

khác nhau

Tên gọi khác nhau

-PGA) Gamma-PGA)polyglutamic acid (γ-PGA)PGA)-PGA) Axit gamma polyglutamic

-PGA) Gamma polyglutamate

-PGA) Poly [imino [1-PGA)carboxy-PGA)4-PGA)oxo-PGA)1, 4-PGA)butanediyl]]

Tính chất vật lí

-PGA) Là một polymer tự nhiên-PGA) Tinh thể màu trắng, không màu, không mùi,không vị

-PGA) có khả năng phân hủy sinh học-PGA) Hòa tan trong nước

-PGA) Không độc và có thể ăn được-PGA) Có khả năng dẫn diện

Tính chất hóa học

-PGA) không phản ứng với Coomassie blue-PGA) Nhận biết γ-PGA)PGA bằng xanh methylene -PGA) không bị enzyme protease phân hủy-PGA) Có phản ứng được với kim loại để tạo muối

2.1.3 Ứng dụng của gamma-polyglutamic acid

Ngày nay con người có nhu cầu hướng tới sử dụng các hợp chất cónguồn gốc từ tự nhiên do nó có ưu điểm là an toàn với sức khỏe và thân thiệnvới môi trường và γ-PGA)PGA là một trong số đó γ-PGA)PGA đã được nghiên cứunhắm tối ưu hóa các phương pháp sản xuất với quy trình ít tốn kém, nâng caonăng suất, hạ giá thành sản phẩm và sử dụng nguồn cơ chất đơn giản, dễ kiếm

để có thể sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm, hóa mỹ phẩm,

y học, xử lý nước thải, sản phẩm vệ sinh, nông nghiệp, chăn nuôi và các lĩnhvực khác

2.1.3.1 Ứng dụng trong y học

γ-PGA)PGA được sử dụng trong liệu pháp gen, thuốc điều trị ung thư và cácsản phẩm da nhân tạo để chữa bỏng, γ-PGA)PGA còn được dùng tạo ra các màngtổng hợp để chống lại sự bám hút chặt giữa tế bào bình thường với lớp mô bịtổn thương do tai nạn hay quá trình phẫu thuật ( Furuta et al 2000)

a) Chất vận chuyển thuốc

γ-PGA)PGA được quan tâm về khả năng vận chuyển thuốc do có tính tươngthích sinh học và phân hủy sinh học Trong chuỗi peptide của γ-PGA)PGA có nhómcarboxyl tạo điểm gắn cho hóa trị liệu, do đó khiến thuốc hòa tan nhiều hơn

và dễ dàng kiểm soát hơn Liên kết γ-PGA)PGA và thuốc có thể xâm nhập vào vịtrí khối u và giải phóng thuốc, sau đó γ-PGA)PGA bị phân hủy thành acid glutamic

có thể thâm nhập vào quá trình trao đổi chất của tế bào và được bài tiết quathận (Li et al, 1998)

Enzym là chất xúc tác sinh học thường dễ bị ảnh hưởng bởi các tácnhân môi trường trong đó có các tia phóng xạ (Dengyi et al.,1993; Saha etal.,1995) Để giảm thiểu các tác nhân và nâng cao hiệu quả sử dụng enzym.Enzym thường được kết hợp với các chất gắn, hay các hợp chất bảo vệ khácnhau để tránh khỏi các tác nhân gây ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme Mỗi loại

hợp chất dùng để gắn enzym đều có những ưu và nhược điểm riêng (Dengyi

et al.,1993; Saha et al.,1995) Hiện nay γ-PGA)PGA đang được nghiên cứu để gắnvào enzym do chúng có ưu điểm là có thể phân hủy sinh học, không ảnhhưởng tới môi trường)(Miyachi et al.,1996; Sakamoto et al.,1997) Ở ViệtNam chưa có nhiều các nghiên cứu về ảnh hưởng của các tia bức xạ đếnenzym, cũng như vai trò của γ-PGA)PGA trong việc bảo vệ hoạt tính enzym chốnglại các tác nhân do các tia bức xạ gây nên

c) Chất mang gen chuyển

Dekie và cộng sự năm 2000 đã chỉ ra rằng liên kết giữa DNA và γ-PGA)PGAtương đối ổn định đối với albumin huyết thanh γ-PGA)PGA dễ dàng tạo ra các liênkết với DNA, kết quả là điện tích bề mặt và kích thước của DNA giảm nhưvậy có thể bảo vệ DNA không bị phân hủy bởi enzyme Dnase γ-PGA)PGA manggen chuyển giúp cho DNA không bị phân hủy và tăng hiệu quả chuyển gene(Dekie et al 2000)

d) Chất phụ tá vaccine

Năm 2006, Sung và cộng sự đã đánh giá rằng γ-PGA)PGA như một chất phụ

tá cho vaccine, người ta đã phát hiện ra tổ hợp các thành phần gây miễn dịchchứa γ-PGA)PGA cho 1 đáp ứng miễn dịch chống lại S epiderrnidis,staphylococcus và các loài liên quan γ-PGA)PGA được chỉ ra có khả năng kích

thích cơ thể sinh kháng thể cao thậm trí khi được sử dụng với một khángnguyên có tính gây miễn dịch yếu Các phân tử γ-PGA)PGA có khả năng phân hủysinh học là các thể mang vận chuyển rất tốt vaccine tới các khối u, chúng cóthể phát tán các protein kháng nguyên tới các tế bào trình diện kháng nguyên(APCs) và đưa ra các đáp ứng miễn dịch hiệu lực dựa trên các kháng nguyênđặc hiệu của tế bào lympho T Kháng nguyên được chấp nhận bởi các tế bàotrình diện kháng nguyên còn được tăng cường bằng sự liên kết với các phân

tử polyme (Sung et al 2006) Vaccine này có ưu điểm là khi tiêm dưới dakhông tạo vết sưng tại vị trí tiêm như các vaccine thông thường khác (Uto et

al 2009)

2.1.3.2 Ứng dụng trong ngành công nghệ thực phẩm

Các nhà nghiên cứu đã chứng minh được γ-PGA)PGA có thể ứng dụng làmchất bảo quản đông lạnh mà không gây ảnh hưởng tới sức khỏe do đặc tínhcủa γ-PGA)PGA là một polyme sinh học không gây độc cho người, γ-PGA) PGA còn sửdụng làm chất ổn định mà không làm ảnh hưởng tới chất lượng sản phẩmcũng như tới sức khỏe con người Năm 2000, Sakai và cộng sự cho rằng việc

bổ sung PGA vào đồ uống để làm giảm vị đắng của một số đồ uống (chứaacid amin, peptide, quinine, cafeine…),và làm tăng vị ngon của đồ uống(Sakai et al.2000)

Ngoài ra, khi bổ sung γ-PGA)PGA còn có khả năng liên kết với một số ionhóa trị 2 như Mn2+ ( ổn định thần kinh), Cu2+ (thúc đẩy sự hấp thu và sử dụngsắt để tạo thành hemoglobin và hồng cầu), Mg2+ (tác dụng ức chế các phảnứng thần kinh và cơ)…tạo muối tan giúp cơ thể tăng tốc độ hấp thụ các chất vàkhoáng chất trong ruột non giúp cho cơ thể hấp thụ tối các chất dinh dưỡng cungcấp khoáng chất cho cơ thể (Tanimoto et al., 1995 )

Tanimoto và cộng sự năm 2007 đã chứng minh ngay cả phụ nữ saumãn kinh khi dùng γ-PGA)PGA còn giúp cho cơ thể hấp thụ canxi tốt qua ruột non

giúp ngăn cản quá trình hình thành calcium phosphate không tan, tình trạngthiếu canxi trong máu hỗ trợ chứng mất chất khoáng ở trong xương, loãngxương, còi xương và thiếu Ca tăng trưởng (Tanimoto et al, 2007.)

2.1.3.3.Ứng dụng trong công nghệ mỹ phẩm

γ-PGA)PGA có thể được sử dụng như một thành phần nâng cao tính chấtcủa các sản phẩm chăm sóc da hoặc như một loại kem dưỡng ẩm, tẩy tế bàochết và loại bỏ nếp nhăn Tính chất của γ-PGA)PGA tương đối đồng nhất, ổn định

về mặt hóa học nên thường được sử dụng là thành phần trong các loại kemdưỡng da (Ben-PGA)Zur and Goldman, 2007) γ-PGA)PGA bổ sung vào sản phẩm có tácdụng làm mịn da, đàn hồi, tự giữ ẩm và tạo độ mềm mại cho da γ-PGA)PGA liênkết với chất Aloe veraor chiết xuất từ cây lô hội đã được nghiên cứu làm tănglượng acid pyrolidonecarboxylic (là thành phần thiết yếu cho da) trên lớp biểu

bì dưới da mà không làm ảnh hưởng đến sự cân bằng của da γ-PGA)PGA còn giúpphục hồi tóc sau quá trình tẩy màu tóc và nhuộm tóc bằng cách tăng khả nănggiữ ẩm và hình thành một hàng rào bảo vệ giúp tóc giữ được màu (Ben-PGA)Zurand Goldman, 2007)

γ-PGA)PGA còn làm ức chế enzyme hyaluronidase giúp acid hyaluronickhông bị phân hủy, cùng với collagen là những thành phần thiết yếu của da γ-PGA)

PGA có khả năng hấp thụ nước nên nó có tác dụng làm ẩm da, sáng da, làm

đầy nếp nhăn và chống lão hóa, tăng độ đàn hồi da cao hơn collagen γ-PGA)PGAgiúp tăng liên kết với vitamin C và vitamin E có trong thành phần của mỹ

phẩm do γ-PGA)PGA dễ dàng hòa tan trong nước và được ion hóa Dung dịch ion hóa γ-PGA)PGA được đưa vào sâu dưới da bằng công nghệ điện chuyển ion (Shih

et al 2001)

2.1.3.4 Ứng dụng trong xử lí môi trường

Trong quá trình xử lí nước, các phương pháp loại bỏ và tách tạp chấtnhư kết tủa, tuyển nổi và lọc đều là quá trình tách chất rắn ra khỏi chất lỏng

Trong phương pháp tách các kết tủa ra khỏi chất lỏng, thì các chất kết tủađóng vai trò quan trọng trong quá trình loại bỏ các tạp chất làm giảm thời gian

xử lí Tuy nhiên các chất kết tủa thu được sau quá trình xử lí môi trường hiệnnay có chứa các thành phần độc hại gây ảnh hưởng tới sức khỏe như nhômsunfat là nguyên nhân gây ra bệnh Alzheimer, polyalumin clorua (PAC) vàmột số polyme tổng hợp như polyacrylamid thì monome của nó có độc tốmạnh gây ảnh hưởng tới sức khỏe và môi trường (Nguyễn Hương 2005)

Vượt trội hơn những chất kết tủa thông thường trên, γ-PGA)PGA được coi làmột chất kết tủa sinh học vì nó có thể kết tủa thành từng mảng gồm các hợp

chất hữu cơ và vô cơ γ-PGA)PGA có khả năng liên kết với kim loại (kim loại nặng,

chất phóng xạ) để tạo kết tủa điều đó thuận lợi cho việc cô lập các kim loạikhông cho phát tán rộng ra môi trường hơn nữa γ-PGA)PGA còn có tính chất phânhủy sinh học nên rất thân thiện với môi trường (Sung et al 2005)

Do đó, các nhà khoa học đã nghiên cứu γ-PGA)PGA như một chất kết tủa có bản chất sinh học có thể thay thế những chất kết tủa thông thường γ-PGA có khả năng kết tuả cao tùy vào trọng lượng phân tử của nó, hơn nữa γ-PGA hoàn toàn không độc nên rất phù hợp cho quá trình xử lý Hiện nay các nhà

khoa học đang tiếp tục nghiên cứu khả năng ứng dụng và phát triển của nó đốivới các lĩnh vực xử lý nước, kể cả tinh chế nước và xử lý nước thải (NguyễnHương 2005)

2.1.3.5 Ứng dụng trong ngành chăn nuôi

γ-PGA)PGA được sử dụng nhiều trong ngành sản xuất thức ăn gia súc bởi cónhững tính năng như tăng cường khả năng thấp thụ canxi, photpho của gia súc,

gia cầm, giúp tăng chất lượng và trọng lượng cho thịt, xương, tăng sản lượng

trứng, làm giảm lượng chất béo không cần thiết của vật nuôi giúp cho ngành

chăn nuôi đạt hiệu quả cao nhất (Shih et al., 2001; Tanimoto et al., 2007).

2.1.3.6 Trong lĩnh vực nông nghiệp

Năm 2007, King và cộng sự đã nghiên cứu một loại phân bón chứa γ-PGA)PGA giúp cho cây trồng phát triển bộ rễ, nâng cao khả năng hấp thụ dinhdưỡng, giúp cây tăng trưởng nhanh, tán lá phát triển mạnh, quả lớn, tăng sảnlượng và chất lượng γ-PGA)PGA được sử dụng làm phân bón và cải tạo đất, bảoquản hạt giống, kiểm soát độ ẩm làm tăng chất lượng và sản lượng cho nông

sản (King et al 2007)

Kết quả rõ rệt khi sử dụng phân bón chứa γ-PGA)PGA và không sử dụng phân

bón chứa γ-PGA)PGA của 2 giống sắn

Bảng 2.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của phân bón chứa γ-PGA tới

Bón PGA Không bón

PGA Bón PGA

Không bón PGA

B A

Hình 2.2: Kết quả sử dụng phân bón γ-PGAPGA và không sử

dụng phân bón γ-PGAPGA

( Hình A: -PGA không sử dụng phân bón chứa γ-PGA, +PGA sử dụng phân bón chứa γ-PGA; hình B: bên trái sử dụng phân bón chứa γ-PGA, bên phải không

sử dụng phân bón chứa γ-PGA)

2.1.4 Phương pháp kết tủa và tinh sạch acid gamma-polyglutamic

Năm 2010, Bhavik Manocha và Argyrios Margaritis, đưa ra phương

pháp để kết tủa, tinh sạch và xác định γ-PGA)PGA theo hai con đường khác nhau làphương pháp kết tủa γ-PGA)PGA bằng dung dịch ethanol (sơ đồ B) và bằng dungdịch CuSO4 (sơ đồ A)

Hình 2.3: Sơ đồ phục hồi và tinh sạch poly γ-glutamic acid

(Manocha et al 2010) (Phương pháp kết tủa γ-PGA bằng dung dịch đồng sunfat (A), Phương pháp

kết tủa γ-PGA bằng dung dịch ethanol (B))

Theo phương pháp của Bhavik Manocha và Argyrios Margaritis (2010)cho thấy hiệu quả của phương pháp kết tủa bằng đồng sunfat (85%) hơn hẳnphương pháp kết tủa bằng ethanol (82%) Vì phương pháp etthanol kết tủalượng protein là 48%, trong khi ở đồng sulfate chỉ có 3% protein điều đó chứng

tỏ rằng phương pháp kết tủa bằng đồng sulfate tinh sạch tốt hơn, không bị lẫntạp so với phương pháp kết tủa ethanol (Manocha and Margaritis 2010)

2.2 Vi khuẩn tổng hợp gamma-polyglutamic acid

2.2.1 Đặc điểm phân loại của vi khuẩn Bacillus

Các nghiên cứu về vi khuẩn có khả năng tổng hợp γ-PGA)PGA là trực khuẩn

gram dương thuộc chủng Bacillus Bacillus là những vi khuẩn gram dương Thuộc chi Bacillaceae, có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác

bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kị

kí không bắt buộc Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động bằng tiên mao Chính nhờ khả năng sinh bào tử mà vi khuẩn Bacillus có khả

chống chịu được những điều kiện bất lợi như môi trường có nhiệt độ cao ởsuối nước nóng, nhiệt độ thấp ở bắc cực, những nơi có nồng độ muối cao như

ở mỏ muối hay ở nơi có nồng độ kháng sinh cao… (Tô Minh Châu, 2001).

Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại

sinh nhờ sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acidhữu cơ…Một vài loài có thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và

butanediol; một vài loài như Bacillus megaterium thì không cần chất hữu cơ

để sinh trưởng, một vài loài khác thì cần acid amin, vitamin B Hầu hết đều làloài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30-PGA)45oC, nhưng cũng có nhiềuloài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65oC (Rosovitz et al 1998)

Đa số vi khuẩn Bacillus sinh trưởng ở pH7, một số phù hợp với pH= 9-PGA)

10 như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH=2–6 như Bacillus acidocaldrius.

Bacillus có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease,

cellulase…), do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, bảo vệmôi trường Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose,

saccharose, xylose Bacillus là vi khuẩn gam dương, dương tính với thử

nghiệm catalase, sử dụng khí oxy làm chất nhận electron khi trao đổi khítrong quá trình trao đổi chất, nitrate (-PGA)), di động (+), hiếu khí (+) và âm tínhvới thử nghiệm sinh indol

Hình 2.4: Hình thái tế bào vi khuẩn Bacillus

2.2.2 Tổ chức di truyền của vi khuẩn Bacillus tổng hợp gamma-polyglutamic acid

Một số nhà khoa học đã chứng minh chỉ có một vài vi khuẩn, chủ yếu

là chủng vi khuẩn Bacillus như B subtilis 168, B subtilis natto, B licheniformis, B anthracis và S epidermidis là có gen để tổng hợp nên γ-PGA) PGA, trong đó có 2 loài B anthracis và B subtilis có gen đặc trưng mã hóa

để tổng hợp lên polyglutamate

Vi khuẩn B anthracis, có 4 gen capB, capC, CapA và CapE , mã hóa

cho 1 chuỗi peptide gồm 47 amino acid để tổng hợp polyglutamate(Candela et al , 2005a.)

Vi khuẩn B subtilis có 3 gen liên quan tới sự tổng hợp polyglutamate

đó là pgsB, pgsC và pgsAA (Ashiuchi et al.,1999)

Hình 2.5: Tổng hợp γ-PGA dưới sự tham gia của các gen

tương ứng ở mỗi chủng Bacillus

γ-PGA)PGA được tổng hợp dưới dạng tự do hay dưới dạng liên kết tùy thuộcvào gen tổng hợp (Candela et al ., 2005a)

-PGA) Nếu PGA được sinh ra và kết hợp với bề mặt vi khuẩn và tạo thànhmột lớp vỏ bao quanh vi khuẩn (gồm γ-PGA)PGA và liên kết hóa trị liên kết với

peptidoglycan) thì gen tổng hợp PGA là gen cap

-PGA) Nếu PGA được sinh dưới dạng tự do thì gen tổng hợp γ-PGA)PGA là gen pgs.

2.2.3 Quá trình tổng hợp γ-PGA trong vi khuẩn

Năm 2007 Shi và cộng sự nghiên cứu và xác định các enzyme tham gia vàocon đường tổng hợp sinh hóa làm tăng hàm lượng γ-PGA)PGA (Shi et al 2007)

Con đường để tổng hợp γ-PGA là từ L-PGA)glutamic acid, acid citric và

ammonium sulfate trong B.subtilis IFO 3335 (Kunioka et al., 1997), vì lượng

L-PGA)glutamic acid rất ít nên nó có thể được coi như là L-PGA)glutamic acid đượctổng hợp từ acid citric thông qua acid isocitric và acid 2-PGA)oxoglutaric trong chutrình TCA Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng bước quan trọng trong quá tình là

tổng hợp 2-PGA)oxogluturate (α-ketoglutarate), tiền thân của acid L-PGA)glutamic

được tổng hợp qua đường phân và chu trình TCA (Shi et al., 2007)

Quá trình chuyển hóa từ acid 2-PGA)oxoglutaric đến L-PGA)axit glutamic đượctiến hành 2 cách:

-PGA) Khi không có L-PGA)glutamine hoặc có 1 lượng rất ít thì axit L-PGA) glutamicđược tổng hợp từ acid 2-PGA)oxoglutaric và ammonium sulfate xúc tác bởidehydrogena glutamate GD (Stadtman, 1966)

2-Oxoglutaric acid + NH3 + NAD(P)H + H + L-glutamic acid + NAD(P)

-PGA) Khi có sự tham gia của L-PGA)glutamine, axit L-PGA) glutamic được tổng hợp

từ acid 2-PGA)oxoglutaric và L-PGA)glutamine dưới sự xúc tác bởi các enzymeglutamine synthetase (GS) và Glutamate 2-PGA)oxoglutarate aminotransferase(GOGAT) (Holzer, 1969)

2-Oxoglutaric acid + L-glutamine + (2 H) 2L-glutamic acid

L-Glutamic acid + NH3 + ATP L-glutamine + ADP + Pi

Vi khuẩn B anthracis và B subtilis có khả năng chuyển hóa trực tiếp hay

gián tiếp L-PGA)glutamic acid thành D-PGA)glutamic acid Acid 2-PGA)Oxoglutaric và L-PGA)Alanine được tổng hợp từ axit L-PGA)glutamic và acid pyruvic D-PGA)Alanine được hìnhthành bởi sự raxemic hóa từ L-PGA)Alanine Axit D-PGA)glutamic và acid pyruvic đượctổng hợp từ D-PGA)alanine và axit 2-PGA)oxoglutaric

GD

GOGAT

GS

Hình 2.6: Con đường tổng hợp γ-PGA trong

Bacillus subtilis IFO 3335

(1 glutamine: 2-oxoglutarate aminotransferase; 2 glutamine synthetase; 3 glutamic acid: pyruvic aicd axit aminotransferase; 4 alanine racemase; 5 D- glutamic aid: pyruvic acid aminotransferase; 6 PGA polymerase.TCA axit tricarboxylic)( Kunioka et al 1997)

L-2.3 Boza- nguồn phân lập vi khuẩn Bacillus

Hình 2.7: Sản phẩm Boza

Boza là một đồ uống có nguồn gốc cổ xưa ở vùng Lưỡng Hà từ 8000-PGA)

9000 năm trước Bắt đầu từ thế kỷ 13, với cuộc xâm lược đế quốc Ottomancủa Anatolia, Thổ Nhĩ Kỳ đã biết tới Boza như một thức uống quen thuộcđược lên men từ lúa mì hoặc kê, có độ nhớt và nồng độ cồn thấp dưới 1% có

vị ngọt và chua Boza giành được sự công nhận ở nhiều quốc gia là đồ uốngkhông cồn và được sử dụng nhiều so với tất cả các loại đồ uống không chứacồn khác (Kivanc et al 2011) Boza không chỉ được tìm thấy ở Thổ Nhĩ Kỳ

mà còn được tìm thấy ở nhiều nước khác nhau như là Albania, Bosnia vàHerzegovina, Bulgaria…Boza ở mỗi vùng miền lại mang những hương vịkhác nhau đặc trưng cho vùng sản xuất

Ở Albania, Boza có truyền thống được sản xuất ở Kukes phía đông bắccủa đất nước này Nó bao gồm bốn thành phần: ngô, bột mì, đường vànước Boza Albania khác Boza sản xuất tại các khu vực khác, là thành phầnchính của nó là ngô và có vị chua, trong khi ở các nước khác như ở Thổ Nhĩ

Kỳ, Bulgaria, và Macedonia, thành phần chính thường là kê, lúa mạch hoặcđậu xanh Boza Albania có màu vàng kem nhẹ, có vị ngọt chua mang đặctrưng của vùng, Bulgaria có vị nhạt, loãng và có chất lượng thấp vì vậy Boza

ở Bulgaria người ta tăng độ ngọt bằng cách bổ sung thêm chất ngọt nhân tạokhác Cộng hòa Macedonia, Boza loãng và thiếu vị ngọt của đường, còn ởRomania thì Boza ngọt hơn ở Thổ Nhĩ Kỳ và Bulgaria, nhưng đặc hơn và sẫmmàu hơn so với Cộng hòa Macedonia Ở Serbia, Boza nó thường được làm bằngnước, bột mì, bột ngô, men và đường Boza được bảo quản trong những điềukiện, ở nhiệt độ từ 2 – 3oC, đồ uống có thể được bảo quản lên đến một tháng

Năm 2011, Merith Kivanc và cộng sự đã chứng minh là có khoảng 45

chủng vi khuẩn axit lactic được phân lập từ 10 mẫu khác nhau của Boza đượcsản xuất ở Thổ Nhĩ Kỳ Các chủng đã được thử nghiệm là có hoạt động ức chếchống lại vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm Vi khuẩn lactic phân lập có hoạt

tính kháng khuẩn được xác định là Lactobacillus brevis subsp lactis, Leuconostoc citreum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Enterococcus faecium, Lactobacillus graminis, Pediococcus sp và Lactobacillus paracasei subsp.paracasei; Bacillus subtilis; Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus rhamnosus.

Boza là một sản phẩm lên men nhiều dinh dưỡng và có nhiều tác dụngđối với sực khỏe con người: như là giúp cân bằng huyết áp, tăng sản lượngsữa cho phụ nữ mang thai và cho con bú tránh tình trạng trẻ sinh ra thiếu sữa

mẹ, có lợi cho tiêu hóa Boza là có thành phần của nhiều chất chất dinh dưỡng

có giá trị cho những người hoạt động thể chất, vì nó có chứa vitamin A, C, E,

B, sắt và khoáng chất Boza đặc biệt thích hợp cho người ăn kiêng vì nguyênliệu của nó hoàn toàn từ tự nhiên và cung cấp vitamin cần thiết cho cơ thể

2.4 Tình hình nghiên cứu gamma-polyglutamic acid trong nước và ngoài nước

2.4.1 Tình hình nghiên cứu gamma-polyglutamic acid trong nước

Năm 2004, Nguyễn Quang Huy bước đầu nghiên cứu về γ-PGA)PGA trongviệc bảo vệ hoạt tính của enzym papain, một enzym tách chiết từ thực vật vàthường được sử dụng trong in vitro Một số hợp chất được thử nghiệm và chokết quả dương tính về khả năng bảo vệ hoạt tính papain chống lại tác dụngcủa các tia bức xạ như tia gamma, tia X và bức xạ điện tử Trong các hợp chấtthử nghiệm có γ-PGA)PGA bảo vệ hoạt tính của enzym papain cao nhất, γ-PGA)PGA cóhoạt tính bảo vệ cao nhất ở nồng độ γ-PGA)PGA là 1,25%, γ-PGA)PGA bảo vệ tới gần60% hoạt tính ban đầu trong khi mẫu đối chứng hoạt tính giảm tới 90% saukhi chiếu xạ với cường độ 15kGy (Nguyễn Quang Huy, 2004)

Năm 2013, Lê Phước Cường và cộng sự đã nghiên cứu thành công hệthống tuyển nổi để tách chì trong nước bằng cách sử dụng γ-PGA)PGA Khi thêm γ-PGA)

PGA vào trong nước như là tác nhân tuyển nổi (vừa là chất đông đặc vừa làchất tạo bọt) với điều kiện tối ưu, với khối lượng các thành phần trong nước làkhối lượng 0,5 % γ-PGA)PGA, 0,1% than hoạt tính, tốc độ sục khí 4L min-PGA)1,trongthời gian 30 phút, pH ban đầu là 7 Không khí được sục vào nước sẽ tạo ra bọtkhí, PGA mang các hạt than hoạt tính lên trên bề mặt Ngoài ra hàm lượng chì(Pb) trong nước có thể giảm xuống do sự hấp phụ của chúng vào than hoạt tính

vì vậy có thể loại bỏ cả chì và than hoạt tính ra khỏi dung dịch Sự kết hợp củathan hoạt tính và γ-PGA)PGA trong quá trình tuyển nổi là một phương pháp mới cóthể loại bỏ chì trong nước với hiệu quả là 90% lượng Pb trong nước.(Lê PhướcCường và cộng sự, 2013)

2.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Năm 2003, ngành công nghệ sinh học Nhật Bản đã đạt được giải vàng

về nghiên cứu ứng dụng của γ-PGA)PGA trong ngành công nghệ mỹ phẩm, là sảnphẩm sinh học tổng hợp tự nhiên và chiết xuất từ một loại thực phẩm truyềnthống của Nhật có tên gọi là Natto, ra đời trên 800 năm Natto được sản xuất

từ đậu nành lên men bằng trực khuẩn Bacillus subtilis Natto Natto chứa các

vitamin B2, B6, B12, E, K2 γ-PGA)PGA được chiết xuất từ phần chất keo nhớtchứa trong Natto

Bác sĩ David Harrison -PGA) Trường Đại học North Durham nước Anh,chuyên gia nghiên cứu về tác dụng của oxy đối với da xác định “Chính khôngkhí và môi trường chung quanh đã cung cấp oxy vào da đến một độ sâu đángkể” Điều này mở ra triển vọng ứng dụng γ-PGA)PGA hiệu quả trong việc trị khô

da Công nghệ điện chuyển ion γ-PGA)PGA của Nhật phối hợp với công nghệ điệnchuyển ion vitamin C + E, các công nghệ Laser, công nghệ Oxyjet, công nghệsóng RF, công nghệ Botox, Restylane… sẽ giúp làn da khỏe mạnh và luôn giữđược vẻ mịn màng tươi sáng, săn chắc, trẻ trung

Năm 2007, Tanimoto đã nghiên cứu γ-PGA)PGA làm tăng lượng canxi (Ca)hòa tan cơ thể, và các nghiên cứu có liên quan tới tình trạng thiếu caxi trongmáu, mất chất khoáng ở trong xương, loãng xương, còi xương ở phụ nữ saumãn kinh của Nhật Bản Đây là nghiên cứu đầu tiên về tác động của γ-PGA)PGA ởmột nhóm người lấy ngẫu nhiên để thực hiện và xác định ảnh hưởng của γ-PGA)PGA (với 80,6% axit glutamic) tới sự hấp thu Ca, Ca được tính toán từ tỷ lệđồng vị Ca đo bằng ion hóa tứ cực nhiệt khối phổ (TIQMS) Kết quả là ởngười khi sử dụng γ-PGA)PGA thì có khăng năng hấp thụ Ca (39,1%) cao hơn sovới người không sử dụng PGA khả năng hấp thụ Ca là 34,6% (Tanimoto etal., 2007).

Năm 2008, Yang và cộng sự đã nghiên cứu những ảnh hưởng của γ-PGA)PGA đối với hoạt tính sinh học của canxi, hàm lượng canxi trong xương vàđược kiểm tra trên đối tượng chuột cái Số lượng γ-PGA)PGA tăng khi khả nănghòa tan canxi trong ống nghiệm tăng Các nghiên cứu chỉ ra rằng γ-PGA)PGA làmtăng số lượng canxi hòa tan trong ruột non Trong một thí nghiệm động học

về canxi trong huyết tương, γ-PGA)PGA kích thích cơ thể hấp thụ canxi sau 20phút và thời gian hấp thụ khoảng 2h Thí nghiệm cân bằng canxi trong thờigian dài có kết quả chỉ ra rằng γ-PGA)PGA làm tăng sự hấp thụ canxi, tăng hàmlượng canxi trong xương chuột (Yang et al., 2008)

Năm 2002, Ornek và cộng sự chứng minh nhôm 2024 giảm sự ăn mòn

do vi khuẩn Bacillus có khả năng tổng hợp γ-PGA)PGA hình thành màng sinh học Màng sinh học hình thành do vi khuẩn Bacillus licheniformis và Bacillus subtillis làm giảm tốc độ ăn mòn của nhôm 2024 tới 90% Khả năng chống ăn

mòn của nhôm 2024 tăng từ 0,15-PGA)0,44V do sự hình thành màng sinh học bởi vi

khuẩn B subtilis và B licheniformis γ-PGA)PGA tổng hợp bởi vi khuẩn cũng có

tác dụng làm giảm tỷ lệ ăn mòn của nhôm (Ornek et al., 2002)

Năm 2006, Mark và cộng sự nghiên cứu về γ-PGA)PGA là một chất hấp thụtiềm năng trong việc loại bỏ và thu hồi kim loại nặng (Ni2+, Cu2+, Mn2+ và

Al3+) từ nước thải công nghiệp Nghiên cứu phát triển màng vi lọc với γ-PGA)PGA

liên kết hóa trị, γ-PGA)PGA được tổng hợp từ B licheniformis ATCC 9945 có khả

năng hấp phụ đồng rất tốt là 77,9 mg/g ở nồng độ 32 mg /l ở pH 4.0 và 25oC(Mark et al., 2006) Năm 2009, Inbaraj và cộng sự đã chứng minh γ-PGA)PGAcũng liên kết rất chặt chẽ với ion hóa trị hai như thủy ngân (Hg2+), ion chì(Pb2+), chính nhờ khả năng tạo kết phức với các ion hóa trị hai này mà γ-PGA)PGAđược coi như một chất hấp thụ đầy hứa hẹn để loại bỏ các kim loại nặng trongquá ô ngiễm nguồn nước γ-PGA)PGA còn là một vật liệu hấp phụ thích hợp choviệc loại bỏ các BB9 thuốc nhuộm cơ bản và BG4 từ dung dịch nước Quátrình hấp thụ xảy ra đã nhanh chóng đạt hiệu quả cao, an toàn và không gâyđộc hại Khoảng 98% số thuốc nhuộm hấp phụ trên γ-PGA)PGA có thể được phụchồi và có khả năng tái sử dụng (Inbaraj et al., 2009)

Một số nhà nghiên cứu chỉ ra rằng γ-PGA)PGA có thể hấp thụ Hg (II), Cr(III), Ni (II) và thuốc nhuộm cơ bản Crom tồn tại trong nguồn nước ở cả haidạng hóa trị sáu và hóa trị ba, trong nước uống Cr (III) hiếm khi gặp mà chủyếu là Cr (VI) Nhiều nghiên cứu đã chứng minh Cr (VI) là gây ung thư nếuhít phải hay tiếp xúc vì vậy PGA được nghiên cứu như một chất hấp phụ đểloại bỏ Cr (VI), Cr (VI) được hấp thụ mạnh ở pH thấp, với nồng độ PGA caothì hiệu quả loại bỏ Cr (VI) được nâng cao Trong nghiên cứu này số lượnghấp thụ Cr (VI) cao nhất với khối lượng γ-PGA)PGA là 21,4 mg /g, kết quả này tuythấp nhưng nó cho thấy rằng γ-PGA)PGA đóng một vai trò quan trọng trong hấpthụ Cr (VI) (Yao et al., 2007)

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn trong sản phẩm đồ uống lên men truyền thốngBoza của Bulgaria

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu

Sản phẩm đồ uống lên men truyền thống Boza của công ty Harmonica,Bulgaria

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

-PGA) Địa điểm: phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh -PGA) Khoa CNSH-PGA)CNTP– Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

-PGA) Thời gian tiến hành: Từ tháng 12 năm 2013 đến tháng 6 năm 2014

3.3 Hóa chất và thiết bị sử dụng

3.3.1 Hóa chất

Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Tryptone Trung Quốc CaCO3 Việt NamEthanol 96% Việt Nam

3.3.2 Thiết bị sử dụng

Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm

Nồi hấp

Các dụng cụ khác được sử dụng trong thí nghiêm bao gồm:micropipette 10-PGA)100μl, 100-1000 μl ( Đức ), đầu côn, bình tam giác, que cấy,l, 100-PGA)1000 μl, 100-1000 μl ( Đức ), đầu côn, bình tam giác, que cấy,l ( Đức ), đầu côn, bình tam giác, que cấy,que trang, đĩa petri, ống nghiệm, ống phancol, đèn cồn, giá đỡ ống nghiệm,…

3.3.3 Các môi trường sử dụng

-PGA) Môi trường PGM (nghiên cứu khảo sát khả năng sinh tổng hợp γ-PGA)PGA

của vi khuẩn) (Ishwar B et al., 2009): glucose 2,5%; NH4Cl 0,6%; Citric acid1,2%; L-PGA)glutamic acid 2%; NaCl 2,5%; KCl 0,07%; K2HPO4 0,1%;MgSO4.7H2O 0,68%; CaCl2.2H2O 0,02%; NaHCO3 0,018%; MgCl2.6H2O0,47% và MnSO4.7H2O 0,005%; pH 6,5

-PGA) Môi trường LBA dùng để phân lập và giữ giống vi khuẩn: Cao nấmmen 0,5%; Peptone 1,0%; NaCl 0,5%; Agar 2%; pH 7,2 -PGA) 7,4

-PGA) Môi trường LB dùng để nhân giống vi khuẩn: Cao nấm men 0,5%;Peptone 1,0%; NaCl 0,5%; pH 7,2 -PGA) 7,4

3.4 Nội dung nghiên cứu

-PGA) Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn có hoạt tính sinh tổng hợp γ-PGA)PGA từ Boza.-PGA) Nội dung 2: Nghiên cứu đặc điểm hình thái và sinh hóa của vi khuẩn

đã phân lập