Phân lập và đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase của một số vi sinh vật bản đia (2)

Tính cấp thiết của đề tài Enzyme cellulase là hệ enzyme bao gồm các loại enzyme: C1, Cx, clucosidase, có khả năng hoạt động phối hợp để phân giải cellulose thành glucose.. Enzyme cellula

Phần 1

MỞ ĐẦU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Enzyme cellulase là hệ enzyme bao gồm các loại enzyme: C1, Cx, clucosidase, có khả năng hoạt động phối hợp để phân giải cellulose thành glucose Enzyme cellulase được ứng dụng trong nông nghiệp chế biến thức ăn chăn nuôi, trong công nghiệp thực phẩm để chế biến thực phẩm, trong quá trình li trích các chất từ thực vật, trong việc phân hủy các phế liệu giàu cellulose….Theo Bhat (2000), xấp xỉ 20% trong số 1 tỷ USD thu được từ lượng enzyme công nghiệp được bán ra trên thế giới gồm các enzyme cellulase, hemicelluse và pectinase.

β-Hằng năm, nước ta phải nhập ngoại một lượng lớn những nguồn enzyme cellulase để giải quyết vấn đề sản xuất và xử lý ô nhiễm môi trường Việt Nam là nước nhiệt đới có nền nông nghiệp rất phong phú, đa dạng và đang trên đà phát triển Vì vậy, lượng phế thải nông nghiệp rất dồi dào, cùng với sự công nghiệp hóa hiện đại hóa của đất nước, ô nhiễm môi trường ngày càng trở thành nguy cơ thật sự Thành phần chính trong phế thải rắn có trong nông nghiệp, lâm nghiệp là cellulase.

Việc phức hệ cellulase trong phân giải các nguồn thức ăn giàu celluloase như rơm rạ, bã mía, gỗ mục đã và đang được triển khai ở nhiều nước, trong mọi lĩnh vực như sản xuất protein đơn bào làm thức ăn cho gia súc [3].

Do đó, vi sinh vật phân giải cellulose có vai trò quan trọng trong chu trình tuần.

Vì vậy tôi chọn đề tài “Phân lập và đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase của một số vi sinh vật bản đia”.

1.2 Mục đích nghiên cứu

- Phân lập và đánh giá được khả năng sinh enzyme cellulose từ một số vi sinh vật bản địa, làm tiền đề cho nghiên cứu xử lí các phụ phẩm chứa cellulose.

1.3 Yêu cầu của đề tài

- Phân lập được vi sinh vật có hoạt tính sinh enzyme cellulase.

- Đánh giá được vi sinh vật có hoạt tính sinh enzyme cellulase.

- Thử nghiệm được vi sinh vật có hoạt tính cellulase trong phân giải cellulose.

- Bước đầu ứng dụng vào việc hạn chế ô nhiễm môi trường và hạn chế chất thải.

- Giúp sinh viên có cơ hội tiếp cận với các quy trình, các thao tác kỹ thuật trong thực tế Qua đó kết hợp với các kiến thức lý thuyết đã được học sinh viên sẽ có những hiểu biết chuyên sâu và cái nhìn tổng quát hơn.

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Lịch sử vấn đề nghiên cứu

Các công trình nghiên cứu khả năng sinh enzym cellulase.

Khả năng sinh enzym cellulase chủ yếu được tổng hợp từ nấm sợi Trichoderma và Aspergillus Ở Mỹ, năm 1983 PTN của Quân đội Mỹ ở Natik

và trường đại học Rutgers, sử dụng chủng Trichoderma viride QM6 hoang dại để sản xuất cellulase đầu tiên Sau đó, gây biến chủng và chọn lọc được biến chủng QM9414 có khả năng sinh ra cellulase cao (theo Rehm, 1983) Năm 1998, YU đã nuôi cấy T reesei Rut 30 trong MT chứa 5% bột cellulose

và 1% cám mì, thu được hoạt lực CMCase 232,4 IU/g Năm 2000, Sonia Couri khảo sát khả năng sinh tổng hợp các enzym như polygalacturonase, cellulase, xylanase và protease từ A niger 3T5B8 trên nguồn phụ phế liệu nông nghiệp khác nhau bằng phương pháp lên men bán rắn và ứng dụng enzym trong việc tách chiết dầu thực vật

Năm 2002, theo báo cáo gần đây của CORAL, dịch nuôi cấy A niger trong MT Czapek-Dox chứa CMC1%, cho chạy điện di trên gel SDS-PAGE (chứa 0,2% CMC) phát hiện có hai vạch có hoạt tính CMCase và trọng lượng phân tử lần lượt là 83.000 và 50.000 Dalton Ở Việt Nam, năm 1989, Lê Hồng Mai nghiên cứu về sinh tổng hợp và một số đặc tính của cellulase (typ CMCase) ở A niger VS-1 trên MT lên men bán rắn Năm 2001, Huỳnh Anh nghiên cứu về nấm sợi T reesei sinh tổng hợp enzym cellulase trên MT lỏng với nguồn cacbon là CMC Năm 2002, Kiều Hoa nghiên cứu sinh tổng hợp enzym cellulase với nguồn cacbon là cellulose tinh khiết, cám trấu, bã mía,

vỏ cà phê Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp và đặc điểm cellulase của A niger Rnnl 363 Châu Hoàng Vũ cũng

nghiên cứu thu nhận và tinh sạch enzym cellulase từ nấm mốc T reesei bằng phương pháp lên men bán rắn Năm 2004, Trần Thạnh Phong khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase từ T reesei và A niger trên MT lên men bán rắn Năm 2005, Lê Thị Hồng Nga nghiên cứu sự sinh tổng hợp cảm ứng pectinase và cellulase của một số chủng nấm mốc [20].

2.2 Giới thiệu về cellulose

Cellulose là polymer sinh học phong phú nhất trên trái đất (Murashima, 2002), được sinh tổng hợp chủ yếu bởi thực vật với tốc độ 4.109 tấn/năm Hàng năm có khoảng 232 tỷ tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp thành nhờ quá trình quang hợp Hàng ngày, hàng giờ một lượng lớn cellulose được tích lũy trong đất Do các sản phẩm tổng hợp của thực vật thải ra, cây cối chết

đi, cành lá rụng xuống, một phần do con người thải ra dưới dạng rác rưởi, giấy vụn, mùn cưa…[2], [3] Trong số này có đến 30% là màng tế bào thực vật mà thành phần chủ yếu là cellulose Cellulose chiếm đến 89% trong bông

và 40-50% trong gỗ.

Cellulose là polysacarit chủ yếu của thành tế bào thực vật Trong bông

nó chiếm trên 90%, còn trong gỗ hơn 50% Ngoài ra, người ta thấy chúng nó nhiều ở tế bào ở một số loài vi sinh vật Ở tế bào thực vật và ở tế bào một số loài vi sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi Khi đun sôi với axit sulfuric đặc, cellulose sẽ chuyển thành glucose còn khi thủy phân trong điều kiện nhẹ nhàng sẽ tạo thành disacarit cellobiose [11].

Hình 2.1 Cấu trúc không gian của phân tử cellulose

Cellulose không có trong tế bào động vật Chúng là một homopolimer mạch thẳng, được cấu tạo bởi các β-D-glucose-pyranose Các thành phần này liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4 glucoside Tinh bột cũng được cấu tạo bởi các glucose này và bằng liên kết β-1,4 glucoside Điểm khác biệt là tinh bột chứa các gốc glucose phân nhánh còn cellulose chứa glucose không phân nhánh Các gốc glucose trong cellulose thường lệch một góc 1800 và có dạng như một chiếc ghế bành Cellulose thường chứa 10000-14000 gốc đường và được cấu tạo như sau [11]:

Hình 2.2 Cấu trúc phân tử cellulose

Trọng lượng phân tử của cellulose khoảng từ 50000-2500000 Dalton Các phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Vadervan và liên kết hydro Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3nm Các sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi Trong điều kiện tự nhiên, các vi sợi thường không đồng nhất, chúng thường tồn tại 2 vùng:

Vùng kết tinh: Các mạch cellulose kết với nhau theo một trật tự đều đặn nhờ liên kết hydro nối nhóm hydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm hydroxyl ở mạch cacbon của mạch khác Ở vùng này cellulose rất bền vững dưới tác động của điều kiện bên ngoài Enzyme cellulose chỉ tác dụng ở bề mặt hệ sợi ở vùng này.

Vùng vô định hình: Các mạch liên kết với nhau nhờ Vandervan Ở vùng này cellulóe có cấu trúc không chặt và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài Khi gặp nước, chúng dễ bị trương phồng lên, enzyme cellulose sẽ dễ tác động, làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng.

Trong phân tử cellulose có nhiều liên kết hydroxyl tồn tại dưới dạng tự

do, hydrogen của chúng dễ bị thay thế bởi một số gốc hóa học như metyl hoặc gốc acetyl tạo nên các dẫn xuất ete hoặc este của cellulose Một trong những dẫn xuất được ứng dụng rất nhiều là CMC, trong đó một số nhóm hydroxyl của cellulose được thay thế bằng gốc –OCH2COOH.

Trong tự nhiên cellulose khá bền vững, không tan và bị trương lên khi hấp thụ nước Cellulose bị thủy phân khi đun nóng với axit hay kiềm ở nồng độ khá cao, hoặc bị phân giải dưới tác dụng của cellulose được tổng hợp bởi các vi sinh vật

2.3 Enzyme cellulase

2.3.1 Cấu trúc của enzyme cellulase

Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là axit amin, các axit amin được nối với nhau bởi liên kết peptid –CO-NH- Ngoài ra,

trong cấu trúc còn có những phần phụ khác, Cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzyme nhóm endoglucanase (EG) và exoglucanase (CBH) giống nhau trong

hệ cellulase của nấm sợi, gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận cùng, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xúc tác và được gắn thêm vùng glycosil hóa, cuối đuôi là vùng gắn kết với cellulose (CBD: Cellulose binding domain) Vùng này có vai trò tạo liên kết với cellulose tinh thể Trong quá trình phân hủy cellulose có sự tương quan mạnh giữa khả năng xúc tác phân giải cellulose của các enzyme và ái lực của enzyme này đối với cellulose Hơn nửa, hoạt tính của cellulase dựa vào tinh thể cellulose và khả năng kết hợp của CBD với cellulose Điều này chứng tỏ CBD làm gia tăng hoạt tính cellulase đối với tinh thể cellulose Sự có mặt của CBD sẽ hỗ trợ cho enzyme cellulase thực hiện việc cắt đứt nhiều liên kết trong cellulose tinh thể Vùng gắn kết với cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thường của protein và việc thay đổi chiều dài của vùng glycosil hóa có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme

Hình 2.3 Cấu trúc không gian của enzme cellulase

2.3.2 Tính chất của enzyme cellulase

Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như carboxymethyl cellulose (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEC) Cellulase cắt liên kết β-1,4-glucosid trong cellulose, lichenin và các β-D- glucan của ngũ cốc.

Độ bền nhiệt và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau Cellulase hoạt động ở pH từ 3-7, nhưng pH tối thích trong khoảng 4-5 Nhiệt độ tối

ưu từ 40-50 độ C Hoạt tính cellulose bị phá hủy hoàn toàn ở 80 độ C trong

10 đến 15 phút Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose và bị ức chế hoàn toàn bởi Hg Ngoài ra, cellulose còn bị

ức chế bởi các ion kim loại khác như Mn, Ag, Zn nhưng ở mức độ nhẹ Trọng lượng của enzyme cellulose thay đổi từ 30-110 KDa (Begunin, 1990; Gilkes và cộng sự, 1991).

2.3.3 Nguồn gốc của enzyme cellulase

• Được thu nhận từ các nguồn khác nhau:

– Động vật: Dịch tiết dạ dày bò, các nhóm thân mềm…

– Thực vật: Trong hạt ngũ cốc nảy mầm như đại mạch, yến mạch, lúa

mì ,mạch đen…

– Vi sinh vật: Các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men…

• Trong thực tế người ta thường thu nhận enzyme cellulase từ vi sinh vật Các chủng vi sinh vật thường sử dụng:

- Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus

candidus…

- Xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli…

- Vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacillus subtilis, Bacillus pumilis…

2.3.4 Cơ chất của enzyme cellulase

Cellulose là cơ chất của enzyme cellulase Cellulose là một polysaccharide phong phú nhất trong tự nhiên Việc phân hủy sinh học cellulose bởi vi sinh vật là một trong những bước chính của chu trình carbon trên trái đất.

2.3.5 Cơ chế hoạt động

Hoạt động của phân tử enzym được biểu hiện trong trung tâm hoạt động Trung tâm hoạt động của enzym (E) có cấu trúc không gian tương ứng với cơ chất (S) mà chúng tham gia Phản ứng không có sẳn mà được hình thành trong quá trình enzym tiếp xúc với cơ chất giống như chìa khóa vào ổ khóa tạo thành enzym - cơ chất (E-S)

Cơ chế tác động của enzym vào cơ chất qua ba giai đoạn:

Giai đoạn 1: Enzym (E) tương tác với cơ chất (S) bằng những liên kết yếu tạo thành phức enzym - cơ chất (E-S)

Giai đoạn 2: Khi cơ chất (S) tạo phức với enzym (E) sẽ bị thay đổi cấu hình không gian và mức độ bền vững các liên kết Các liên kết bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm Phức enzym cơ chất (E-S) sẽ được tách ra

Giai đoạn 3: Enzym sẽ được giải phóng, cơ chất sẽ chuyển thành sản phẩm và tách khỏi enzym

Phản ứng tổng quát:

E + S E-S E + P

E- enzym (enzyme) ; S- cơ chất (substracte) ; P- sản phẩm (Products) Tên gọi cellulose dùng để chỉ chung cho các enzyme tham gia phân cắt các chất cellulose Tất cả các enzyme cellulose đều có tác dụng phân cắt liên kết -1,4 giữa 2 đơn vị glucose và được các nhà khoa học phân

ra làm 3 nhóm chủ yếu sau đây:

1,4 –D-glucan cellobiohydrolase(EC.3.2.1.91)(CBH) Enzyme cắt đầu cuối của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose Enzyme này còn có một loạt các tên như: cellobiohydrolase, cellobiosidase và avicellase Ngày nay nó được coi là enzyme chủ đạo phân giải cellulose, bởi nó có khả năng phân cắt cellulose ở vùng kết tinh.

Hình 2.4 Vị trí cắt exoglucanase

1,4 –D-glucan -4- glucannohydrolase (EC.3.2.1.4) (EG) Enzyme này tham gia phân giải liên kết -1,4 glucoside trong cellulose và D-glucanse Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose, và glucose Enzyme này có một loại tên khác như: endoglucanase, endo 1,4 –D-glucanase, C- celluse.

Β-1,4 – glucoside glucohydrolase (EC.3.2.1.21) Enzyme này tham gia phân hủy cellobiose tạo thành glucose Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy Trong các tài liệu khoa học, chúng có tên là cellobiase

và glucosidase.

Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase

Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự thủy phân cellulose thành cellubiose và cuối cùng thành glucose.

Sự phân giải cellulose dưới tác dụng của hệ enzyme cellulase xảy ra theo 3 giai đoạn chủ yếu sau:

Trong giai đoạn thứ nhất, dưới tác dụng của tác nhân C1, cellulise bị thủy phân thành cellulose

Giai đoạn thứ 2, cellulose hòa tan sẽ bị thủy phân dưới tác dụng xúc tác của hệ enzyme Cx tạo thành đường cellobiose.

Ở giai đoạn cuối cùng dưới tác dụng của enzyme β-1,4-glucosidase cellobiose bị thủy phân thành glucose.

Hình 2.5 Cơ chế tác dụng của cellulase

Enzyme C1: Có tác dụng cắt đứt liên kết hydro biến cellulose tự nhiên thành cellulose phản ứng (cellulose vô định hình).

Enzyme Cx: Hay còn gọi là β-1,4glucanase, thủy phân cellulose phản ứng thành cellobiose Enzyme này được chia làm 2 loại: endocellulase và exoglucanase.

Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện

tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển mạnh, có loài phát triển yếu Chính vì thế, việc phân hủy cellulose trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm.

2.4 Hoạt lực của enzyme cellulase (cơ chế thủy phân cellulose)

Thủy phân cellulose phải có sự tham gia của cả ba loại enzyme cellulose như endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase Thiếu một trong ba loại enzyme trên thì không thể thủy phân phân tử cellulose đến cùng.

Từ những nghiên cứu riêng lẻ đối với từng loại enzyme đến nghiên cứu tác động tổng hợp của cả ba loại enzyme cellulose, nhiều nhà khoa học đều đưa ra kết luận chung là các loại enzyme cellulose sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose Có nhiều cách giải thích khác nhau về cơ chế tác động của cellulose, trong đó cách giải thích do Erikson đưa ra được nhiều người công nhận hơn cả.

Theo Erikson và cộng tác viên (1980), cơ chế tác động hiệp đồng của

3 loại cellulose như sau: đầu tiên endoglucanase tác động vào vùng vô định hình trên bề mặt cellulose, cắt liên kết β-1,4-glucosid và tạo ra các đầu mạch

tự do Tiếp đó exoglucanase tấn công cắt ra từng đoạn cellobiose từ đầu mạch được tạo thành Kết quả tác động của endoglucanase và exoglucanase tạo ra các celloligosaccharit mạch ngắn, cellobiose, glucose β-glucosidase thủy phân tiếp và tạo thành glucose Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulose trong điều kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh, có loài lại phát triển yếu Chính vì thế, việc phân hủy cellulose trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm.

Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp, việc phân hủy cellulose bằng enzyme, ngoài các yếu tố kỹ thuật như nhiệt độ pH, nồng độ cơ chất, lượng enzyme…, một yếu tố hết sức quan trọng là tính đồng bộ của hệ enzyme cellulose từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau Quá trình thủy phân cellulose chỉ có thể được tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi sử dụng đồng bộ ba loại enzyme cellulose.

2.5 Vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase

Cellulose được thu từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như động vật (các nhóm thân mềm, lơn, bò, gà), thực vật (trong hạt ngũ cốc nảy mầm là đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật (nấm men, nấm sợi, xạ khuẩn và vi khuẩn) Tuy nhiên, vi sinh vật là nguồn thu enzyme chủ yếu vì thời gian sống ngắn nên thu được nhiều lần trong năm và chủ động sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền để nuôi cũng như dễ dàng điều khiển có định hướng nguồn enzyme hoặc gia tăng lượng enzyme Ngày nay cùng với sự phát triền mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật nên dễ dàng áp dụng các phương pháp sinh học phân tử để tạo ra những chủng mới mang đặc điểm nổi bật mà các đối tượng động vật, thực vật ít áp dụng như gây đột biến nhân tạo Trong

vi sinh vật, rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loại nấm men có khả năng sinh tổng hợp cellulose.

Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi VSV cả trong điều kiện hiếu khí và yếm khí Các loài VSV thay phiên nhau phân hủy cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose Số lượng các loài VSV tham gia sinh tổng hợp enzyme có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một số trường hợp các nhà khoa học còn thấy cả nấm men tham gia quá trình này Bảng dưới đây là một số loại VSV được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ nhất.

Bảng 2.1 Một số vi sinh vật sản xuất cellulase

Act.diastaticus Act.roseus Act.griseus Act.melamocylas Act.coelicolor Act.candidus Act.chromogenes Act.hygroscopicus Act.griseofulvin Act.ochroleucus Act.thermofulcus Act.xanthostrums Thermonospara curvata

Preudomonas Fluorescens B.megaterium B.menenteroides Clostridium sp Acetobacter xylium

Vi khuẩn dạ cỏ Ruminoccus albus Ruminabacter parum Bacteroides

Amylophillus sp Clo.butitrium Clos.locheheadil Cellulosemonas

2.6 Ứng dụng của cellulase

Hiện nay, enzyme cellulase dược ứng dụng mạnh mẽ trong các ngành công nghiệp khác nhau như : công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất bia rượu, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp dệt, sản xuất bột giặt, sản xuất giấy, trong nông nghiệp…

2.6.1 Ứng dụng của cellulase trong chế biến thực phẩm

Trong quá trình sản xuất các loại nước quả và nước uống không cồn dựa trên việc trích li dịch quả từ thịt nghiền Các loại quả sau khi tách vỏ hạt

được nghiền, thu được thịt quả nghiền có dạng dịch nhuyễn Từ thịt quả nghiền đã ép bã thu được dịch quả Dịch này thường chứa các thành phần tế bào thịt quả và các thành phần polysaccharide làm cho dịch quả có độ nhớt cao Để tăng cường hiệu suất trích li dịch quả, giảm bớt độ nhớt, tăng mức cảm quan nước quả và giảm bớt một số công đoạn, việc bổ sung endoglucanase rất quan trọng Enzyme này là điểm mấu chốt cải thiện hiệu suất dịch hóa Sự kết hợp của glucose và pectinase sẽ phá hủy hoàn toàn màng tế bào Trong quá trình sản xuất, ở giai đoạn dịch hóa bổ sung hỗn hợp enzyme cellulose, hemicellulase sẽ đem lại hiệu quả của chế phẩm, làm cho nồng độ đồng thể của nước quả có thịt sẽ tốt hơn [2],[3] Trong công nghệ sản xuất bia, các chế phẩm enzyme amylase, protease và glucanase đã được tạo thành, rút ngắn thời gian cần thiết để ủ bia Trong dịch lên men có chứa một lượng β- glucan, chất này ảnh hưởng tới khả năng lọc và gây đục bia Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, cà phê chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp khô, phương pháp này cho chất lượng cà phê không cao Để tiến hành nâng cao chất lượng cà phê, phương pháp lên men đã được áp dụng.

Đó là quá trình sử dụng phức hệ enzyme cellulose và pectinase để xử lý bóc

vỏ cà phê và làm tăng khả năng ly trích dịch quả Trong khâu bóc vỏ, cellulose gây hiện tượng thẫm màu, làm giảm chất lượng sau khi sấy, đồng thời cản trở cho việc bóc vỏ Khi sử dụng chế phẩm A.niger có tên thương mại là Biovina-09 có hoạt tính pectinase và cho thấy số lượng cà phê được bóc vỏ tăng, hạt cà phê được bóc vỏ bằng chế phẩm không còn nhớt như hạt không sử dụng chế phẩm enzyme và hiệu suất bóc vỏ khá cao Trong quá trình ly trích dịch quả, cellulose và pectin cản trở sự thoát các chất hòa tan trong tế bào ra ngoài tế bào Khi sử dụng chế phẩm Biotin-09 hiệu suất trích

ly cao hơn mẫu không sử dụng là 46% [4].

2.6.2 Trong công nghệ xử lý rác thác và sản xuất phân bón vi sinh

Rác thải là nguồn chính gây nên ô nhiễm môi trường dẫn tới mất cân bằng sinh thái và phá hủy môi trường sống, đe dọa tới sức khỏe và cuộc sống con người Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử dụng công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trường rất có hiệu quả Hiện nay, có nhiều những nghiên cứu về việc sử dụng cellulose do ác chủng vi sinh vật tiết ra nhằm thủy phân cellulose trong rác thải Phức hệ cellulose được sử dụng để xử lý nguồn nước thải do các nhà máy giấy thải ra Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc cao) Sinh khối này chứa rất nhiều loại polysaccharide, trong đó các polysaccharide quan trong quyết định tới chất lượng, số lượng giấy là cellulose Vì vậy, nước thải của các nhà máy giấy, các cơ sở chế biến gỗ, các xưởng mộc bổ sung các chế phẩm chứa phức hệ cellulose đem lại hiệu quả cao [8].

2.6.3 Trong xử lý môi trường

Các chất thải hữu cơ chiếm một khối lượng rất lớn trong tổng số chất thải hữu cơ hiện nay ở các đô thị và các khu công nghiệp Trong các chất thải hữu cơ có nguồn gốc thực vật, cellulose chiếm khoảng 50% Các chất thải hữu cơ chứa cellulose thường là những chất rất khó phân hủy trong điều kiện

tự nhiên Nếu để các chất hữu cơ phân hủy trong điều kiện tự nhiên thì thời gian phân hủy rất lâu (khoảng hơn tám tháng ở điều kiện khí hậu nhiệt đới); tuy nhiên nếu bổ sung vi sinh vật giàu cellulase thì thời gian phân hủy sẽ rút ngắn chỉ còn khoảng một tháng Điều này rất có ý nghĩa trong việc bảo vệ môi trường (hạn chế sự ô nhiễm nước, không khí và đất) đồng thời thúc đẩy quá trình chuyển hóa vật chất trong tự nhiên.

Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ để xử lý rác thải thì việc tạo ra các chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật sinh ra cellulase đã được nghiên cứu và sản xuất Phức hệ cellulase được sử dụng để xử lý nguồn

nước thải do các nhà máy giấy thải ra Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc cao) Sinh khối này chứa rất nhiều loại polysaccharide, trong

đó các polysaccharide quan trọng quyết định tới chất lượng, số lượng giấy là cellulose Vì vậy, nước thải của các nhà máy giấy, các cơ sở chế biến gỗ, các xưởng mộc khi bổ sung các chế phẩm chứa phức hệ cellulase đem lại hiệu quả cao [22].

2.6.4 Trong sản xuất thức ăn gia súc

Nguồn phế liệu giàu cellulose trong tự nhiên rất đa dạng, phong phú như: Rơm rạ, bã mía, cùi bắp, Tuy nhiên, phần lớn các chế phẩm này bị vứt

bỏ, hoặc được ủ làm phân bón, hoặc được sử dụng làm chất đốt, Trong khi

đó, nguồn nguyên liệu rẻ tiền Hóa sinh thực phẩm dùng trong chế biến thức

ăn gia súc lại thiếu Vì vậy, việc ứng dụng enzyme cellulase để phân hủy nguồn phế phẩm chứa cellulose vừa dùng hoặc làm nguồn thức ăn cho gia súc, vừa góp phần bảo vệ môi trường là một vấn đề rất đáng quan tâm.Hiện nay người ta đã dùng vi sinh vật để lên men bã mía của nhà máy đường La Ngà để bổ sung vào thức ăn gia súc [22].

2.6.5 Trong kỹ thuật di truyền

Chế phẩm enzyme cellulase tinh khiết được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền vì enzyme cellulase phá vỡ tế bào thực vật mà không làm tổn thương các cơ quan bên trong tế bào, đảm bảo sự nguyên vẹn của các nhân

tố di truyền Do đó, phương pháp này đã nhanh chóng thay thế các phương pháp cơ học và hóa học [22].

Ngoài ra, việc sản xuất enzyme cellulase có hoạt độ cao để phân hủy cellulose thành các nguồn nhiên liệu sinh học đang được quan tâm đặc biệt trong ngành công nghiệp năng lượng sạch của toàn thế giới.

2.7 Tình hình nghiên cứu enzyme cellulase

2.7.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Nghiên cứu và ứng dụng của cellulase bắt đầu từ những năm 1950 Cuối thế kỉ XIX đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulase từ các loại vi sinh vật Một số nghiên cứu về cellulase từ nấm của một số tác giả như: Trichoderma reseii (Ogawa và cộng sự, 1991), Aspergillus sp (Lusta và cộng sự, 1999), Schizophillum commune (Wilick & Seligy, 1985) Năm 2000, Mawadza và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp cellulase từ các loài vi sinh vật có đặc hiệu cao bao gồm phức

hệ 3 enzyme: endoglucanse, cellobihydrolase, và β- glucosidase thủy phân hoàn toàn cellulose.

Trong số những nghiên cứu về khả năng sinh cellulase của vi khuẩn thì Bacillus là chủng có khả năng sản sinh cellulase ngoại bào với số lượng lớn,

và được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn cả đặc biệt là: B.subtilis (Park và cộng sự, 1991), B.polymxa, B.cereus (Robson & Chambliss, 1989), B.pumilus (Christakopoulo và cộng sự, 1999).

Do cellulase có nhiều ứng dụng, cho nên có rất nhiều nghiên cứu về enzyme cellulase như: Nghiên cứu về các tính chất lý hóa của chúng như xác định khối lượng phân tử của Macarron và cộng sự (1993); Sang và cộng sự (1995); henriksson và cộng sự (1999); Karisson và cộng sự (2001); Coral và cộng sự (2002); Hiroshi và cộng sự (2005), xác định nhiệt độ tối ưu của Isabel

và cộng sự (1992) ; Macarron và cộng sự (1993) ; Coral và cộng sự (2002), xác định pH tối ưu (Macarrón và cộng sự, 1993 ; Coral và cộng sự, 2002), xác định ảnh hưởng của ion kim loại (Sang và cộng sự, 1995)

2.7.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong những năm gần đây ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về vi sinh vật phân hủy cellulose và cellulase (Đặng Minh Hằng,1999, Hoàng Ngọc

Minh và cộng sự, 2006) Những nghiên cứu này chủ yếu đề cập đến vấn đề phân lập các chủng vi sinh vật và đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulase như: Tuyển chọn, nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp cellulase và tinh sạch, đánh giá tính chất lý hóa của cellulase từ chủng pennicilium sp ( Trịnh Đình Khá và cộng sự ,2007) Nghiên cứu phân loại và xác định hoạt tính cellulase của chủng xạ khuẩn ưa nhiệt XKS2 ( Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự,2006).

Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Mẫu phân lập

Rác thải, lá cây, gỗ cây mục, rơm rạ mục được lấy tại huyện Phú Lương.

3.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dung cho ngiên cứu

- Máy đo pH ( Romania)

- Nồi hấp tiệt trùng (Trung Quốc)

- Tủ cấy vi sinh (Việt Nam)

- Kính hiển vi

- Máy nghiền mẫu

- Máy đo OD

Hóa chất

(1000ml)

3.2 Môi trường

Môi trường phân lập, nuôi cấy và giữ giống: Môi trường Crapek- Dox

cơ sở, thành phần như sau:

Môi trường lỏng: Để nuôi cấy thu enzyme, tôi có sử dụng môi trường

có thành phần giống môi trường Crapek – Dox cơ sở nhưng không có Agar.

CMC : 10g/l

NaNO3: 10 g/l

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp phân lập

3.3.1.1 Thu thập mẫu

Thu lá cây mục, rơm rạ mục và rác thải ở những nơi khô ráo, mỗi loại mẫu lấy khoảng 20g mỗi lần, tiến hành lấy mẫu Mẫu lấy xong sẽ được cho vào túi nilon rồi đánh dấu và ghi đầy đủ thông tin thời gian và địa điểm được lấy.

3.3.1.2 Chuẩn bị môi trường phân lập và bảo quản

Khử trùng: Khử trùng thiết bị, dụng cụ thí nghiệm và môi trường dinh dưỡng Mục đích: Tiêu diệt toàn bộ vi sinh vật ngoại lai hiện diện trong môi trường, tạo điều kiện vô trùng cho môi trường để kết quả phân lập, nuôi cấy chính xác.

Nguyên tắc khử trùng: Không làm biến tính môi trường, không làm biến tính một số môi trường Sau khi khử trùng, trong môi trường không sản sinh ra các chất độc gây chết vi sinh vật nuôi cấy, phải đảm bảo điều kiện vô trùng tuyệt đối sau khi khử trùng, bảo đảm an toàn đối với người sử dụng.

Phương pháp: Đối với các dụng cụ (nút bông, ống nghiệm, que trang, hộp peptri…) sẽ được bọc giấy báo sau khi rửa sạch và làm khô, tiến hành khử trùng bằng nồi hấp ở 121o trong khoảng 20 phút rồi chuyển sang tủ sấy Đối với buồng cấy thì được khử trùng bằng UV, một số dụng cụ khác thì được khử trùng bằng cồn.

Chuẩn bị môi trường

Sau khi vô trùng dụng cụ xong, tiến hành cân môi trường (Crapek- Dox

cơ sở) để làm môi trường phân lập Môi trường được hấp khử trùng ở 1210C trong khoảng 20 phút, sau đó đổ khoảng 25ml môi trường vào mỗi hộp Petri

đã được vô trùng, để có môi trường thạch nghiên thì ta rót khoảng 3 – 4 ml môi trường vào ống nghiệm rồi đậy nút bông, đem hấp thanh trùng ở 1210C trong khoảng 20 phút sau đó đặt nghiêng ống nghiệm chứa môi trường khi còn đang nóng.

3.3.1.3 Tiến hành phân lập

Pha loãng mẫu

Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều trong quá trình định lượng cũng như phân tích

vi sinh vật.

Đối với mẫu chất lỏng: Dùng pipet hút 1ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1 Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1ml và cho vào ống chứa 9ml dung dịch pha loãng ta được độ pha loãng 10-2 Tiếp tục như vậy đến nồng độ cần thiết khác.

Đối với mẫu rắn: Cân chính xác 10g mẫu, sau đó cho vào 90ml dung dịch pha loãng để được nồng độ pha loãng 10-1 Tiếp tục pha loãng tương tự như mẫu chất lỏng.

Phân lập

Dùng pipet hút lấy 1 ít dung dịch mẫu đó, nhỏ 1 giọt vào hộp peptri đầu tiên lấy que trang trang đều, rồi vẫn dùng que trang đó trang tiếp vào khoảng 6 – 7 hộp peptri tiếp theo mà không cần nhỏ thêm dung dịch mẫu vào Làm lần lượt như vậy đối với từng mẫu Sau khi trang mẫu vào các hộp peptri xong đánh dấu và gói cẩn thận lại đem nuôi trong tủ ấm khoảng 300C.

Thường xuyên kiểm tra các hộp peptri mỗi ngày Nếu thấy khuẩn lạc mới mọc lên thì lập tức chuyển sang môi trường thạch nghiêng rồi đánh dấu cho vào tủ ấm để nuôi, theo dõi sau 3 – 4 ngày Chủng nào không lên thì loại

bỏ, chủng nào lên thì giữ lại, bảo quản trong tủ lạnh ở 0 – 400C để giữ giống dùng cho việc nghiên cứu tiếp theo, cấy truyền định kỳ và liên tục.

Cứ theo dõi các hộp peptri liên tục khoảng 4 – 5 ngày mà không thấy

có thêm khuẩn lạc mới nào xuất hiện thì đem hấp bỏ và vô trùng các hộp này

để tiến hành thí nghiệm với các mẫu khác

Phương pháp cấy truyền bảo quản giống trên môi trường thạch nghiêng.

Dán nhãn ghi: Tên giống vi sinh vật và ngày cấy Một tay cầm 2 ống nghiệm một ống là ống giống một ống là môi trường Tay còn lại cầm que cấy và đốt đỏ dây cấy trên ngọn lửa đèn cồn để khử trùng Dùng ngón út và ngón áp út rút nút bông của ống giống ra Hơ nóng khử trùng miệng ống nghiệm Đợi que cấy nguội, đưa que cấy vào ống nghiệm lấy khuẩn lạc trong ống giống Rút que cấy ra và tiến hành cấy truyền trong ống môi trường Khử trùng lại phần khong khí nơi miệng ống rồi đậy nút bông Khử trùng lại que cấy sau khi sử dụng xong.

3.3.2 Phương pháp thử hoạt tính

3.3.2.1 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp chấm điểm

Định tính cellulose bằng phương pháp chấm điểm Dùng que cấy lấy một ít chủng nuôi cấy trong môi trường thạch nghiêng Sau đó cấy chấm một diểm vào môi trường đĩa thạch chứa 1% cơ chất CMC, nuôi trong tủ ấm 3 – 4

ngày Hiện hình vòng phân giải bằng dung dịch thuốc thử lugon đỏ 1%, hoạt tính enzyme được xác định bằng hiệu số (D – d, cm).

Với D: Là đường kính vòng phân giải

Với d: Đường kính lỗ đục

D: đường kính vòng phân giải.

3.3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp

+ Phương pháp xác định thời gian nuôi cấy thích hợp

Nấm mốc được nuôi cấy lắc 200 vòng/ phút ở các khoảng thời gian: 6; 12; 18; 30; 36; 42; 48; 54 và 60h Sau đó lọc thu sinh khối và xác định hoạt

độ enzyme.

+ Phương pháp xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp

Nấm mốc được nuôi cấy trên môi trường bán rắn ở các nhiệt độ: 25; 30; 35; 40; 45; 50oC Sau 36- 48h sấy ở nhiệt độ 50oC, đem nghiền mịn bằng máy nghiền

bi rồi cho vào đó một lượng nước gấp 4-5 lần khối lượng canh trường để hòa tan protein- enzyme từ khối canh trường nấm sợi Sau đó đem xác định hoạt độ enzyme cellulase.

+ Phương pháp xác định nồng độ cảm ứng thích hợp

Nấm mốc được nuôi cấy lỏng lắc 200 vòng/ phút trong môi trường có chứa nồng độ chất cảm ứng ở các nồng độ từ 1% - 8% Sau 36 – 48h thu dịch lọc và xác định hoạt độ enzyme cellulase.

+ Phương pháp xác định pH môi trường thích hợp

Nấm mốc được nuôi cấy lỏng lắc 200 vòng/phút trong môi trường có

pH là: 3,4,5,6,7,8 ở nhiệt độ phòng Sau 36- 48h đem xác định hoạt tính enzyme.

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 3.3.4 Phương pháp xử lý số liệu

- Các số liệu được tính bằng phần mềm Excell 2003

- Quá trình xử lý thực hiện trên máy tính theo chương trình IRRISTAT 4.0.

Nhiệt độ (0C) 25;30;35;40;

45;50

pH môi trường

4;4,5;5;5,5;6

Dịch enzyme thô

Xác định hoạt tính enzyme

Xác đinh điều kiện nuôi cấy

Vi sinh vật sau tuyển chọn

Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Phân lập chủng vi sinh vật sinh enzyme cellulase cao.

Để tuyển chọn các chủng VSV có khả năng sinh enzyme cellulase thủy phân cellulose, tôi tiến hành phân lập từ các mẫu đã thu được tại Huyện Phú Lương- Thái Nguyên

Bảng 4.1 Kết quả và đặc điểm các chủng vi sinh vật phân lập được

Mẫu ST T

Chủng vi sinh vật

Đặc điểm của chủng

Đặc điểm hình thái tế bào

Màu của khuẩn lạc

Thời gian xuất hiện

Lá

Cây

Mục

6 NM1 Đen 3 ngày Hình sợi, sợi nấm có vách ngăn,bào tử trần dạng cầu

9 NM2 Nâu đậm 4 ngày Hình sợi, có nhiều màu săc ở trên

khuẩn lạc.

Rơm

rạ

mục

11 NM4 Vàng 3 ngày Hình sợi, sợi nấm không vách ngăn, quả thể là hình quả lê màu đen.

Kết quả phân lập ở bảng 4.1 cho ta thấy đã phân lập được 13 chủng VSV bao gồm 4 chủng vi khuẩn, 4 chủng xạ khuẩn và 5 chủng nấm mốc Trong đó các chủng nấm mốc chiếm nhiều nhất chiếm 38,4%, chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chiếm 62,6% Số chủng được phân lập trên gỗ cây mục là nhiều nhất.

Hình 4.1 Một số hình ảnh phân lập vi sinh bật sinh enzyme cellulase

4.2 Kết quả thử hoạt tính

Nhằm kiểm tra khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng đã được phân lâp, chúng tôi sử dụng phương pháp cấy chấm điểm trên môi trường Crapex- dox có 1%CMC, sau 3 ngày đo đường kính phân giải cellulase Kết quả thử hoạt tính được thể hiện ở bảng 4.2.

Bảng 4.2 Kết quả thử hoạt tính

STT Chủng vi sinh

vật

Hoạt tính cellulase (D-d mm)

từ rơm rạ mục.

Hình 4.2 Hoạt tính cellulase của chủng nuôi cấy

4.3 Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của các chủng NM1, NM3 tuyển chọn được.

4.3.1 Ảnh hưởng của thời gian

Bảng 4.3 Kết quả ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

đến khả năng sinh tổng hợp cellulase ở chủng NM1, NM3

7,10 0,47

LSD0.05

6,10 2,14

4,90 0.91

Hình 4.3 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng

sinh enzyme cellulase của chủng NM1, NM3

Hình 4.4 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng

thu sinh khối của enzyme cellulase

Nhận xét

Kết quả phân tích cho thấy khả năng sinh enzyme cellulase ngoại bào của chủng NM1 tăng mạnh từ 17% (6 mm) ở 6h nuôi cấy lên 94% (33 mm) ở 30h nuôi cấy, đạt cực đại 100% (35 mm) ở 36 h nuôi cấy, sau đó giảm dần đến 91,5% (32 mm) ở 48 h và giảm mạnh xuống 83% (29 mm), 51,5% (18 mm) sau 60 h Như vậy chủng NM1 sinh enzyme cellulase ngoại bào mạnh nhất sau 30 ÷ 48 h nuôi cấy và đạt cực đại ở 36 h.

Tương tự chủng NM3 sinh cellulase ngoại bào mạnh nhất ở 30-54 h và đạt cực đại 100% (31 mm) ở 42 h nuôi cấy, sau đó hoạt tính cellulase giảm mạnh còn 71% (22 mm) ở 60 h.

Những nghiên cứu trước đây cho thấy, một số chủng vi khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 48 h nuôi cấy (Tăng Thị Chính và cộng sự, 1999) Các chủng xạ khuẩn phân lập từ bể ủ rác thải sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 48÷72 h nuôi cấy (Tăng Thị Chính

và cộng sự, 1999),

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy hai chủng nấm mốc NM1 và NM3 có thời gian sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ở 36-48 h Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2004; Nguyễn Trọng Cẩn và cộng sự, 1998 cho rằng nấm sợi phát triển từ 36-48 h đã cho hoạt tính enzyme cellulase cao, trong khi đó xạ khuẩn phải mất ít nhất 72 h mới tổng hợp cellulase.