Phân lập, xác định yếu tố gây bệnh, serotype và độc lực của vi khuẩn escherrichia coli và salmonella SP gây bệnh tiêu chảy và bại huyết ở lợn sau cai sữa nuôi tại một số tỉnh phía bắc

BỘ GIÁO DỤC ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ------ NGÔ VĂN HỌA PHÂN LẬP, XÁC ðỊNH YẾU TỐ GÂY BỆNH, SEROTYPE VÀ ðỘC LỰC CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI

BỘ GIÁO DỤC ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-


 -

NGÔ VĂN HỌA

PHÂN LẬP, XÁC ðỊNH YẾU TỐ GÂY BỆNH, SEROTYPE VÀ ðỘC LỰC CỦA VI KHUẨN

ESCHERICHIA COLI VÀ SALMONELLA SP GÂY

BỆNH TIÊU CHẢY VÀ BẠI HUYẾT Ở LỢN SAU CAI

SỮA NUÔI TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ ii

LỜI CẢM ƠN

để hoàn thành luận văn này, cùng với sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi xin ựược ựặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy: PGS.TS Cù Hữu Phú, người ựã trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin ựược chân thành cảm ơn tới các thầy cô trong Ban đào tạo sau đại học Ờ Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam ựã tận tình giúp ựỡ và tạo mọi ựiều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn Ban lãnh ựạo Viện Thú y, các anh, chị, em Bộ môn Vi trùng- Viện Thú y, Lãnh ựạo công ty giống chăn nuôi Hà Nôi, Hưng Yên, Bắc Ninh, Hải Phòng, Thái Bình và các bạn ựồng nghiệp ựặc biệt là gia ựình ựã tạo mọi ựiều kiện thuận lợi nhất giúp ựỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này

Hà nội, ngày 05 tháng 10 năm 2012

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… iii

3 Ý nghĩa khoa học, ðối tượng nghiên cứu 2

1.1 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn E.coli và Salmonella ở lợn 3 1.2 Một số ñặc tính sinh hóa học của vi khuẩn E.coli và Salmonella 11 1.3 Các yếu tố gây bệnh do vi khuẩn E.coli vàSalmonella gây ra 20 1.4 Biểu hiện bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E.coli và Salmonella gây ra ở

1.5 Phòng và trị bệnh tiêu chảy và bại huyết do vi khuẩn E.coli và

Salmonella gây ra cho lợn con sau cai sữa. 32

CHƯƠNG 2 – NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… iv

3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn E.coli và Salmonella từ lợn con sau cai

3.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn E.coli và Salmonella từ các mẫu bệnh

3.1.2 Kết quả xác ñịnh tỷ lệ phân lập vi khuẩn E.coli và Salmonella từ

3.2 Kết quả giám ñịnh ñặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn E.coli

và Salmonella phân lập ñược từ lợn bệnh. 53 3.2.1 Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính nuôi cấy và sinh hoá của

chủng E.coli phân lập ñược 53

3.2.2 Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính nuôi cấy và sinh hoá của

chủng Salmonella phân lập ñược 55

3.3 Kết quả xác ñịnh serotyp của các chủng vi khuẩn E.coli và

Salmonella phân lập ñược từ bệnh phẩm. 58 3.3.1 Kết quả xác ñịnh serotyp kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn

E.coli phân lập ñược từ bệnh phẩm 58 3.3.2 Kết quả xác ñịnh serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonella phân

lập ñược từ bệnh phẩm 60

3.4.1 Kết quả xác ñịnh một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn

E.coli phân lập ñược 63 3.4.2 Khả năng gây dung huyết của các chủng vi khuẩn E.coli phân lập

ñược 65 3.4.3 Kết quả xác ñịnh một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn

Salmonella phân lập ñược 67 3.5 Kết quả xác ñịnh ñộc lực của một số chủng vi khuẩn E.coli và

Salmonella phân lập ñược tiêm qua chuột bạch 71

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ADP Adenosine Diphosphate

ATP Adenosine Triphosphate

BHI Brain Heart Infusion

BPW Buffered Pepton Water

CHO Chinese Hamster Ovary Cell

CIRAD Centre de Cooperation Internationale en Recherche

Agronomique pour le Developpement DHL Deoxycholate Hydrogen sulfide Lactose

DNA DeoxyriboNucleic Acid

DPF Delayer Permebility Factor

DT104 Definitive phage Type 104

EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid

ETEC EnteroToxigenic E coli

LT Heat- Labile Toxin

mARN Messenger Acide RiboNucleotide

RPF Rapid Permebility Factor

ST Heat- stabile Toxin

Stn Salmonella toxin

TSI Triple- Sugar- Iron

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… vi

PCR Polymerase Chain Reaction

RV Rappaports Vassiliadis

Cs Cộng sự

E.coli Escherichia coli

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… vii

DANH MỤC BẢNG

2.1 Mầu sắc, hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn E coli và Salmonella

khi nuôi cấy trên một số môi trường 38 2.2 Trình tự các cặp mồi và kích cỡ sản phẩm dùng ñể xác ñịnh một số

2.3 Trình tự các cặp mồi và kích cỡ sản phẩm dùng ñể xác ñịnh một số

3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn E coli và Salmonella từ các mẫu phân và

3.2 Kết quả phân lập vi khuẩn E.coli và Salmonella ở một số cơ quan

3.3 Kết quả kiểm tra một số ñặc tính nuôi cấy của các chủng vi

khuẩn E coli phân lập ñược 54

3.4 Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính sinh hóa của các chủng vi

khuẩn E coli phân lập ñược 55

3.5 Kết quả kiểm tra một số ñặc tính nuôi cấy của các chủng vi khuẩn

3.6 Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính sinh hoá của các chủng vi

3.7 Kết quả xác ñịnh serotyp kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn

3.8 Kết quả xác ñịnh serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonell phân

3.9 Kết quả xác ñịnh một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn E

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… viii

3.10 Khả năng gây dung huyết của các chủng vi khuẩn E coli phân lập

3.11 Kết quả xác ñịnh một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn

3.12 Kết quả kiểm tra ñộc lực của một số chủng E coli phân lập ñược 72

3.13 Kết quả kiểm tra ñộc lực của một số chủng Salmonella phân lập ñược 74

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… ix

3.5 Kết quả kiểm tra một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi kuẩn

Salmonella phân lập ñược 69

3.6 Kết quả của phản ứng PCR xác ñịnh yếu tố gây bệnh của các

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 1

MỞ ðẦU

1 Tính cấp thiết của ñề tài

Hội nhập kinh tế là xu hướng chung của thế giới Trong những năm gần ñây, nhờ áp dụng các tiến bộ kỹ thuật tiên tiến nhiều ngành kinh tế ñã có sự phát triển vượt bậc Ngành chăn nuôi nước ta ñã và ñang chiếm một vị trí quan trọng trong sản xuất nông nghiệp nói riêng và trong cơ cấu nền kinh tế của cả nước nói chung Chăn nuôi, với nhiều phương thức phong phú và ña dạng ñã góp phần giải quyết công ăn việc làm, xóa ñói giảm nghèo, nâng cao thu nhập cho người dân, tạo ra các nguồn thực phẩm cho người tiêu dùng

Trong giai ñoạn hội nhập kinh tế quốc tế hiện nay, sản phẩm chăn nuôi nói chung và sản phẩm thịt lợn nói riêng của việt Nam cần ñáp ứng ñược các tiêu chuẩn về vệ sinh an toàn thực phẩm không ảnh hưởng tới sức khỏe con người, từ

ñó thúc ñẩy xuất khẩu ra các thị trường trên thế giới ðể ñáp ứng yêu cầu trên, ðảng và Nhà nước ta ñã thực hiện nhiều dự án, chương trình như cải tạo giống lợn, xây dựng quy trình chăm sóc nuôi dưỡng, quy trình phòng dịch bệnh phù hợp ñể tạo ra sản phẩm “sạch”, có giá trị dinh dưỡng cao, ñáp ứng tiêu chuẩn của người tiêu dùng trong nước cũng như hướng tới thị trường quốc tế

Tuy nhiên trong vài năm trở lại ñây, khi ngành chăn nuôi phát triển mạnh thì dịch bệnh cũng không ngừng gia tăng trên ñàn lợn, nhất là những bệnh truyền nhiễm như: bệnh lở mồm long móng, tai xanh, dịch tả, … Một trong những bệnh

thường gặp là bệnh tiêu chảy và bại huyết do vi khuẩn Escherichia coli (E coli)

và Salmonella sp gây ra ở lợn sau cai sữa Bệnh có thể ñã làm ảnh hưởng tới chất

lượng thịt cho người tiêu dung, Theo Bryan, (1988)[53]; Berends và cs, 1998[48];

Schwartz, (1999)[90]: Các ñàn lợn bị nhiễm Salmonella không những gây thiệt hại kinh

tế cho người chăn nuôi mà còn là nguồn tàng trữ mầm bệnh gây hại ñối với con người,

theo Võ Thị Bích Thủy và cs, (2002)[39] cho biết có 82 chủng Salmonella phân lập

ñược từ 212 mẫu thịt lợn, thịt bò, thịt gà và giò sống trên ñịa bàn Hà Nội Bởi vậy

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 2

mà mỗi biện pháp ngăn chặn có hiệu quả ở gia súc ñều cần thiết và là ñiều kiện tiên quyết góp phần giảm thiểu dịch bệnh, tăng thu nhập cho người chăn nuôi, chống ô nhiễm môi trường và bảo vệ sức khoẻ cộng ñồng

Vì vậy mà việc phân lập vi khuẩn Escherichia coli (E coli) và Salmonella,

xác ñịnh serotyp, nghiên cứu về vi khuẩn này cho chúng ta những hiểu biết sâu hơn

về các ñặc tính sinh hóa, yếu tố gây bệnh của nó Từ ñó là cơ sở lựa chọn chủng vi khuẩn có tính kháng nguyên và ñộc lực cao ñể chế vắc xin nhằm chủ ñộng trong phòng và trị bệnh có hiệu quả Xuất phát từ thực tiễn nghiên cứu và yêu cầu của sản

xuất, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Phân lập, xác ñịnh yếu tố gây bệnh,

Serotype và ñộc lực của vi khuẩn Escherichia coli và Salmonella sp gây bệnh tiêu chảy và bại huyết ở lợn sau cai sữa nuôi tại một số tỉnh phía Bắc’’

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Phân lập, xác ñịnh serotype, ñộc lực và các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn

E coli và Salmonella phân lập ñược từ lợn sau cai sữa ở một số tỉnh phía Bắc

- Xác ñịnh cơ sở khoa học cho việc lựa chọn chủng vi khuẩn có tính kháng nguyên và ñộc lực cao ñể chế vác xin phòng bệnh cho lợn

3 Ý nghĩa khoa học

- Xác ñịnh ñược ñặc ñiểm và vai trò gây bệnh tiêu chảy và bại huyết do vi

khuẩn E coli và Salmonella gây ra

- Xác lập cơ sở khoa học cho những nghiên cứu khác về bệnh ở lợn sau

cai sữa do vi khuẩn E coli và Salmonella gây ra

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn E coli, Salmonella ở lợn:

1.1.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài:

1.1.1.1 Nghiên cứu về vi khuẩn E coli

Vi khuẩn E.coli ñược Theo bald Escherich phát hiện lầm ñầu tiên vào năm

1885, vi khuẩn này ñược coi là một loại vi khuẩn vô hại sống trong ruột già người

và ñộng vật ðến năm 1955 thì Schofield và Davis mới chứng minh ñược vai trò

gây bệnh ñường ruột của vi khuẩn E coli ở lợn

Theo Smith H.W, (1963) [93] ñã nghiên cứu và cho thấy có hai loại ñộc tố là

thành phần chính của Enterotoxin ñược phát hiện ở vi khuẩn E coli gây bệnh Hai

loại ñộc tố ñó có sự khác nhau về khả năng chịu nhiệt ðột tố ST (Heat stable enterotoxin) là ñộc tố chịu nhiệt, chịu ñược nhiệt ñộ 1000C trong 15 phút ðộc tố

LT (Heat Labile enterotoxin) là ñộc tố không chịu nhiệt, chúng bị vô hoạt ở 600C trong vòng 15 phút

Vi khuẩn E Coli cũng như một số loài vi khuẩn ñường ruột khác, trước

ñây ñược coi là những vi khuẩn cộng sinh ở ñương ruột, nhưng ngày càng thấy chúng là tác nhân gây bệnh trong các bệnh ñường ruột, nhiễm trùng huyết

Chủng vi khuẩn E coli gây bệnh phù ñầu trên lợn sau cai sữa chủ yếu thuộc

nhóm kháng nguyên 0138, 0139 và 0141 (Imberchets và cs, 1992)[68]; (Parma và cs,

2000)[84] Những chủng E coli sản sinh ra ñộc tố Vero VT2e làm hủy hoại tế

bào Vero Macleod và cs,(1991)[78], tiêm ñộc tố vero VT2e vào bắp thịt lợn sau cai sữa, ñã gây ñược bệnh phù ñầu có những triệu chứng, bệnh tích giống như ở

trên lợn mắc bệnh tự nhiên Nghiên cứu về các yếu tố gây bệnh của E coli gây

phù ñầu, thường thấy khả năng gây dung huyết của các chủng phân lập ở ngoài

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 4

ñường ruột là 48% (Minshew và cs, 1978)[86], từ phân: 8- 18% (Evan và cs, 1973)[60]

Verdonck và cs, (2003) [98], nghiên cứu sự lưu hành duy trì yếu tố

bám dính F18 của vi khuẩn E coli trong các trai lợn giống ở Bỉ, cho rằng F18 +

enterotoxin và verotoxin của vi khuẩn E coli phân bố rộng và là yếu tố gây bệnh

tiêu chảy và bệnh phù ñầu cho lợn trong trại

1.1.1.2 Nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella

Năm 1880, Eberth lần ñầu tiên quan sát thấy vi khuẩn Salmonella dưới

kính hiển vi Bốn năm sau (1984), Gaffky ñã nuôi cấy thành công vi khuẩn này

Loài vi khuẩn Salmonella typhi thời gian ñầu ñược gọi với các tên như: Bacillus

typhous, Bacterium typhi và Eberthella typhi hay Eberthella typhi tiphosa, còn

tên giống Salmonella ñược Lignires sử dụng ñặt tên cho trực khuẩn gây bệnh dịch tả “Hog-cholera bacillus” vào năm 1900 (Selbizt và cs, 1995[91])

Năm 1885, tên gọi S choleraesuis lần ñầu tiên xuất hiện trong báo cáo

năm của phòng chăn nuôi công nghiệp Mỹ Thời gian này, Salmon, D.E là trưởng phòng nghiên cứu, vì vậy mà tên ông ñược lấy ñặt cho vi khuẩn mới này Song Smith, người cộng sự của Salmon mới thật sự là người phát hiện ra vi

khuẩn Salmonella Một vài năm sau ñó, lần lượt các loài Salmonella khác ñã

ñược phát hiện và những loài vi khuẩn ñó vẫn có ý nghĩa trong y học cho tới ngày nay

Năm 1891 Jensen, ñã phân lập ñược S dublin từ bệnh phẩm của bê bị tiêu chảy Cũng vào năm ñó, S.typhimurium ñược phát hiện ở vùng Greiswald và

Breslau Hai năm sau ñó (1893), tại Breslau ñã xảy ra một vụ ngộ ñộc thịt do ăn phải thịt bò ốm, kết quả là bệnh ñã xảy ra ở người Kaensche là người tìm thấy

vi khuẩn, vì vậy vi khuẩn ñược ñặt tên là trực khuẩn Kaensche (Selbizt và cs, 1995[91])

Năm 1999, tại khóa phân loại học của trung tâm Kiểm soát và phòng ngừa

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 5

dịch bệnh (CDC: Center for Diease Control and Prevention) của Hoa Kỳ

Euzéby ñề nghị ñặt tên các typ huyết thanh Salmonella như sau: Giống

Salmonella ñược chia thành 2 loài, ñó là S enterica và S bongori Tất cả các

type huyết thanh gây bệnh cho người và ñộng vật ñều thuộc S enterica Loài S

enterica ñược chia nhỏ thành 6 dưới loài ñó là: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houterae và indica, tương ứng với số la mã: I, II, IIIa, IIIb, IV và VI

dựa trên sự tương ñồng DNA và phạm vi vật chủ Do dưới loài I có nhiều typ huyết thanh khác nhau nên dưới loài này ñược phân loại ñến typ huyết thanh ðể nhấn mạnh rằng typ huyết thanh không phải là loài riêng biệt nên tên của typ

huyết thanh không viết nghiêng và chữ ñầu phải viết hoa Vì vậy, S

choleraesuis có tên ñầy ñủ là S enterica serotyp choleraesuis, hoặc viết tắt ngắn

gọn hơn là S choleraesuis Mặc dù hệ thống phân loại mới này không ñược

công nhận một cách chính thức bởi ủy ban quốc tế về vi khuẩn học hệ thống, nhưng nó ñã ñược tổ chức y tế thế giới và hiệp hội vi sinh vật học ở Mỹ chấp nhận sử dụng (Euzéby, 1999[62])

Nguồn tàng trữ Salmonella chủ yếu là ñường tiêu hoá của người và ñộng vật mắc bệnh Một vài loài như S typhi, S paratyphi A, S paratyphi B, S

paratyphi C chỉ ký sinh ở người Những loài khác hay gặp hơn như: S choleraesuis, S enteritidis chủ yếu ký sinh ở ñộng vật nhưng cũng có khả năng

gây bệnh cho người

Do tính chất gây bệnh của vi khuẩn Salmonella không những cho gia súc,

gia cầm, ñộng vật máu nóng, máu lạnh và cả ở trên người nên từ lâu trong nhân

y và thú y, người ta ñã quan tâm nghiên cứu các ñặc tính sinh học, yếu tố gây bệnh và các biện pháp phòng và ñiều trị bệnh do chúng gây ra

Tại Nhật Bản, Asai và cs, (2002)[45] cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella ở

lợn sau cai sữa bị tiêu chảy là 12,4%; lợn vỗ béo là 17,3%; lợn con theo mẹ

4,5% Tác giả cũng cho biết S typhimurium ñược phân lập thấy nhiều nhất ở lợn

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 6

sau cai sữa là 72,6%; lợn gần xuất chuồng là 73,8%

Kishima và cs, (2008)[74] ñã ñiều tra tỷ lệ nhiễm và phân bố của vi khuẩn

Salmonella trong phân lợn khỏe mạnh bình thường trên toàn lãnh thổ Nhật Bản

giữa năm 2003 và năm 2005 là 3,1%

Theo Barnes và Sorensen, (1975)[46]; Wilcock và Schwartz, (1992)

[100]: Ở lợn, cần phân biệt 2 dạng bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra, ñó là bệnh Phó thương hàn cấp tính ở lợn con do S choleraesuis var kunzendorf và bệnh viêm ruột mãn tính do S typhimurium Ở trâu bò, bệnh chủ yếu do các loài

S dublin và S entertidis gây ra Ở cừu, do S abortus ovis, S montevideo, S dublin, S anatum gây ra Ở ngựa do S abortus equi gây ra, còn ở gia cầm và

chim do S pullorum, S gallinarum, S typhimurium và S enteritidis gây ra

Hiện nay, có rất nhiều loại thuốc kháng sinh có thể ñược sử dụng ñể ñiều trị bệnh, nhất là với lợn con trước và sau cai sữa Tuy nhiên, do việc sử dụng rộng rãi kháng sinh ñể phòng và ñiều trị bệnh nên ñã xuất hiện các chủng vi

khuẩn Salmonella kháng thuốc (Kishima và cs, 2008[74])

Gần ñây, nhiều nghiên cứu ñã tập trung vào nghiên cứu gen kháng kháng

sinh DT104 ở vi khuẩn Salmonella Chủng ña kháng thuốc S typhimurium

DT104 ñược phát hiện lần ñầu tiên ở người mắc Salmonellosis tại Anh vào năm

1980 Sau ñó ñược quan sát thấy cả ở người cũng như vật nuôi trên khắp thế giới vào những năm 90 và hiện ñang là mối quan ngại hàng ñầu ñối với sức khỏe

cộng ñồng Gen này thường xuất hiện ở các serotyp S typhimurium và ít thấy ở các serotyp khác Một tổ hợp kháng thuốc ñiển hình của S typhimurium DT104

là kháng ñồng thời với 5 loại kháng sinh, bao gồm: Ampicillin, Chloramphenicol, Streptomycin, Sulfonamide và Tetracycline (ACSSuT) (Kishima và cs, 2008[74]) Tuy nhiên, không có chiều ngược lại, tức là nếu các kết quả xác ñịnh lâm sàng cho thấy một chủng vi khuẩn kháng với cả 5 loại kháng sinh này thì vẫn chưa ñủ căn cứ ñể kết luận là chủng vi khuẩn này có

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 7

mang gen kháng kháng sinh DT104 (Kishima và cs, 2008[74] Cũng theo tác

giả, có 61,5% số chủng thuộc serotyp S typhimurium có mang gen DT104

Như vậy, vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra ñược rất nhiều

các nhà vi sinh vật trên toàn thế giới quan tâm Mục ñích của các nghiên cứu này nhằm tìm ra các biện pháp có hiệu quả ñể góp phần ngăn chặn và ñẩy lùi bệnh

do Salmonella gây ra ở ñộng vật và ở người

1.1.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước:

1.1.2.1 Nghiên cứu về vi khuẩn E coli

Khi nghiên cứu vai trò của vi khuẩn E coli trong bệnh phân trắng lợn con

nuôi tại các vùng Hà Tây, Hà Bắc, Bắc Thái, Hải Phòng, Quảng Ninh, Thanh Hóa, tác giả Nguyễn Thị Nội (1986) [20] ñã phát hiện ra các serotype chủ yếu là: O115;

O117; O138; O139; O141; O147; O149

Theo Lý Thị Liên Khai và cs, (2001) [13] ñã phân lập và xác ñịnh ñộc tố

ruột của các chủng E coli gây bệnh tiêu chảy cho lợn con, tác giả cho rằng các

chủng F4 (K88) sinh ñộc tố ñường ruột LT và ST, F5 (K99) và F6 (987P) sinh ñộc tố ñường ruột ST ðộc tố ST trở nên ñộc khi sức ñề kháng của vật chủ giảm, gây tiêu chảy cho lợn

Trịnh Quang Tuyên và cs, (2003) [42] cho biết khi nghiên cứu E coli gây

bệnh cho lợn thì ñã phân lập ñược các loại ñộc tố ở các giai ñoạn lứa tuổi khác nhau: ở giai ñoạn 1 – 21 ngày tuổi lượng LT chiếm 16,9%, Sta 37,3%, STb 45,8%; còn ở giai ñoạn 22 – 60 ngày tuổi lượng LT có 42,4%, ST 57,6% và có cả 2 loại

ST + LT là 44,6%

ðể nghiên cứu chế tạo vắc xin phòng bệnh cho lợn con, Lê Văn Tạo và cs,

(1993) [35] ñã xác ñịnh thông qua yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E coli phân lập từ

bệnh phẩm lợn con chết do ỉa chảy phân trắng, sau ñó chọn các giống vi khuẩn ñiển hình ñể chế vắc xin chết (vắc xin Bacterin) ñể cho uống Lợn con sau khi ñẻ 2 giờ ñược cho uống vắc xin với liều 1ml/ con, cho uống liên tục 3 – 5 ngày Kết quả

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 8

tỷ lệ lợn con bị bệnh phân trắng giảm từ 30 – 35% so với lô ñối chứng

Theo tác giả Nguyễn Thị Nội và cs, (1993) [22] ñã căn cứ vào tần suất xuất

hiện, tỷ lệ phân lập ñược các loài vi khuẩn ñường ruột như E coli, Streptococcus,

Salmonella từ mẫu bệnh phẩm lợn bị tiêu chảy ñể chọn các giống thuộc E coli,

Streptococcus, Salmonella nghiên cứu vắc xin ña giá (vắc xin Salsco phòng bệnh

tiêu chảy cho lợn) Sau khi nghiên cứu ñã thử nghiệm tiêm bắp cho lợn từ 21 ngày tuổi với liều 3 – 5ml/con, tiêm hai lần cách nhau 10 ngày Hiệu quả của nó sẽ làm giảm tỷ lệ lợn bị tiêu chảy 30 – 50% và giảm tỷ lệ chết do tiêu chảy là 10 – 20%

Theo nghiên cứu của ðỗ Trung Cứ và cs, (2000)[2] sử dụng chế phẩm Biosubtyl phòng bệnh tiêu chảy cho lợn con, làm giảm ñược 42% số lợn tiêu chảy

ở lợn con giai ñoạn từ 1 ñến 60 ngày tuổi

Theo Phạm Thế Sơn và cs, (2008)[31] ñã kết luận rằng: bằng phương

pháp PCR ñã xác ñịnh ñược 100% số chủng E coli sinh ñộc tố STb, số chủng

sinh Sta là 61,56%; LT là 44,15%, số chủng sinh cả 3 loại ñộc tố (Sta + STb +

LT) là 68,53% Số chủng E coli mang kháng nguyên F4 (K88) là 78%, F5

(K99) là 22% Số chủng ở Hưng Yên là 80%, Hà Nội là 76%

1.1.2.2 Nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella

Vi khuẩn Salmonella thường sống trong ñường tiêu hóa của ñộng vật và

người, khi sức ñề kháng của vật chủ bị giảm sút, số lượng vi khuẩn sinh sản tăng, chúng sẽ tác ñộng vào thành ruột và gây bệnh tiêu chảy Cũng chính vấn

ñề này mà từ xưa ñến nay có rất nhiều tác giả nghiên cứu về bệnh này

Ở Việt Nam, vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra cho người và

gia súc cũng ñã ñược bắt ñầu nghiên cứu từ những năm 50 Viện Pasteur Sài

Gòn trong những năm (1951-1953) ñã phân lập ñược 6 chủng Salmonella ở

người (4 chủng từ máu, 2 chủng từ nước tiểu) Cũng ở Sài Gòn, trong thời gian

này ñã phân lập ñược 35 chủng từ 360 lợn, trong ñó có 23 mẫu là S

cholereasuis (ðỗ ðức Diên, 1999[5])

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 9

Năm 1989, Nguyễn Thị Nội và cs, [21] ñã tiến hành ñiều tra tình hình nhiễm vi khuẩn ñường ruột tại một số cơ sở chăn nuôi lợn ở miền Bắc ñã tìm

thấy 37,5% lợn nhiễm Salmonella Trước tình hình như vậy, nhóm tác giả này

ñã nghiên cứu và chế tạo thành công vacxin ña giá Salsco phòng bệnh ỉa chảy cho lợn con Vacxin ñã ñược áp dụng ñể phòng bệnh có hiệu quả ở nhiều trại chăn nuôi lợn, tỷ lệ lợn bị tiêu chảy giảm từ 30-50%, tỷ lệ lợn chết do tiêu chảy giảm xuống còn 10-20%

Lê Văn Tạo và cs, (1994)[34] ñã phân lập và xác ñịnh serotyp của vi

khuẩn Salmonella gây bệnh ở lợn, kết quả cho thấy: 50% các chủng phân lập ñược thuộc S choleraesuis; 12,5% S enteritidis; 6,25% S typhimurium và số

còn lại thuộc các serotyp khác

Trần Xuân Hạnh (1995)[9] ñã phân lập và giám ñịnh vi khuẩn Salmonella

ở lợn tại Thành phố Hồ Chí Minh cho kết quả: S typhisuis ở lợn bệnh là 16,9%;

ở lợn bình thường 6-16 tuần tuổi là 4,2%; S paratyphi ở lợn 6-16 tuần tuổi là 2,8% ðặc biệt, vi khuẩn S choleraesuis chiếm 38,7% ở lợn bệnh và 2,8% ở lợn

bình thường

Theo Phùng Quốc Chướng (1995)[1] ở Tây Nguyên, mùa khô lợn mắc

bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra chiếm tỷ lệ là 20,03%, vụ ñông là 28,66%

Tạ Thị Vịnh và cs, (1996)[44] ñã kiểm tra 75 mẫu phân lợn khoẻ và 65 mẫu phân lợn bệnh tại một số vùng thuộc Ba Vì (Hà Tây) và Gia Lâm (Hà Nội) cho

thấy: Tỷ lệ nhiễm Salmonella cao 30-56% ở lợn khoẻ trong giai ñoạn 22-60 ngày tuổi Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở lợn mắc hội chứng tiêu chảy cao hơn lợn

bình thường và tăng dần theo lứa tuổi, dao ñộng từ 70-90%

Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella ở lợn mắc bệnh tiêu chảy tại 4 cơ

sở chăn nuôi lợn thuộc miền Bắc nước ta của Cù Hữu Phú và cs, (2000)[24] cho

biết: Tỷ lệ tìm thấy Salmonella trung bình ở lợn tiêu chảy nuôi tại 4 cơ sở trên là

80% ðây là ñiều ñáng lo ngại ñối với ngành chăn nuôi lợn ở nước ta

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 10

Theo Nguyễn Bá Hiên (2001)[12], tỷ lệ nhiễm Salmonella ở các ñàn

lợn, ngoại thành Hà Nội cao nhất là lợn trên 60 ngày tuổi (88,23%), thấp nhất

là lợn từ 1-21 ngày tuổi (73,68%)

Ngoài ra ngộ ñộc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella cũng ñã và ñang

ñược rất nhiều tác giả quan tâm Lê Minh Sơn (2003)[32] ñã xác ñịnh tỷ lệ

nhiễm Salmonella trong thịt lợn giết mổ tiêu dùng nội ñịa từ 10,91-16,67% và

thịt lợn xuất khẩu trung bình 1,42% Tô Liên Thu (2005)[40] ñã xác ñịnh tỷ lệ

nhiễm Salmonella của các mẫu thịt gà ở Hà Nội là rất cao: 33% các mẫu lấy tại

siêu thị, 40% các mẫu lấy từ chợ Lò mổ là một mắt xích quan trọng có nguy cơ

cao ô nhiễm Salmonella vào thân thịt sau giết mổ Trần Thị Hạnh (2009)[10] ñã công bố tỷ lệ nhiễm Salmonella tại các cơ sở giết mổ lợn công nghiệp và cho kết

quả: Chất chứa manh tràng của lợn là 59,18%, ở mẫu lau thân thịt là 70%, mẫu lau hậu môn 66%, mẫu lau nền chuồng nhốt lợn chờ giết mổ là 40%, mẫu lau

sàn giết mổ là 28%, còn các mẫu nước kiểm tra không phát hiện Salmonella Tại

các cơ sở giết mổ lợn theo phương thức thủ công cho thấy tỷ lệ nhiễm

Salmonella ở chất chứa manh tràng của lợn chờ giết mổ là 87,5%, ở mẫu lau

thân thịt là 75%, mẫu lau hậu môn là 55%, mẫu lau nền chuồng nhốt lợn chờ giết mổ là 70%, mẫu lau sàn giết mổ là 80%, mẫu nước là 50%

Cùng với quá trình nghiên cứu chi tiết về vi khuẩn, các biện pháp phòng bệnh ñã ñược nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, trong ñó có vacxin phòng bệnh Nguyễn Văn Lãm (1968)[14] ñã tiến hành nghiên cứu chế vacxin Phó

thương hàn lợn con từ chủng Salmonella chuẩn của Trung Quốc Hiện nay, các

loại vacxin phòng bệnh Phó thương hàn ñã ñược một số công ty, xí nghiệp thuốc thú y sản xuất như vacxin nhược ñộc chủng TS – 177, vacxin có bổ trợ như vacxin keo phèn hay vacxin nhũ hoá có bổ trợ dầu

Như vậy, việc nghiên cứu vi khuẩn Salmonella một cách toàn diện ñể từ

ñó ñề ra biện pháp phòng chống bệnh hiệu quả, giữ gìn vệ sinh an toàn

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 11

thực phẩm, bảo vệ sức khỏe con người là một yêu cầu rất cần thiết

1.2 Một số ñặc tính sinh hóa học của vi khuẩn E coli, Salmonella:

1.2.1 ðặc tính sinh hóa học của E coli:

1.2.1.1 ðặc tính về hình thái

E coli là một trực khuẩn hình gậy ngắn, hai ñầu tròn, kích thước 0,6 x 2-3µ

Khi ở trong cơ thể ñộng vật E coli có hình cầu trực khuẩn ñứng riêng lẻ, ñôi khi

xếp thành chuỗi ngắn, có lông ở quanh thân nên có thể di ñộng ñược

Dưới kính hiển vi ñiện tử người ta còn phát hiện ñược cấu trúc pili, là yếu tố

mang kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E coli

1.2.1.2 ðặc tính về nuôi cấy

E coli là trực khuẩn hiếu khí tùy tiện có thể sinh trưởng ở nhiệt ñộ 15-240C, nhiệt ñộ thích hợp: 370C, pH thích hợp: 7,4 Vi khuẩn E coli phát triển dễ dàng trên

các môi trường nuôi cấy thông thường:

Môi trường nước thịt: phát triển tốt, môi trường rất ñục, có cặn lắng xuống ñáy màu tro nhạt, ñôi khi hình thành màng xám nhạt Canh trùng có mùi phân hôi thối

Môi trường thạch thường: ở 370C sau 24 giờ hình thành khuẩn lạc hình tròn ướt, trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, ñường kính 2-3mm ðể lâu khuẩn lạc phát triển rộng ra và có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng R (Rough) và M (Mucoid)

1.2.1.3 ðặc tính về sinh hóa

Trong môi trường ñường vi khuẩn E coli lên men và sinh hơi lactoza,

glucoza, galactoza, mantoza, arabinoza, xyloza, ramnoza, mannitol, fructoza Có thể lên men hay không lên men: saccaroza, rafinoza, salixin, esculin, dunxit, glyxerol Không lên men dextrin, amidin, glycogen, inosit, xenlobioza

Một số phản ứng khác bao gồm: E coli làm sữa ñông sau 24-37 giờ ở 370C Phản ứng sinh Indol: dương tính (+) Phản ứng sinh H2S: âm tính (-) Phản ứng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 12

M.R: dương tính (+) Phản ứng V.P: âm tính (-) Hàn nguyên nitrat thành nitric, Nguyễn Quang Tuyên (2008) [41]

1.2.1.4 ðặc tính về cấu trúc kháng nguyên

Khi nghiên cứu vi khuẩn E coli, các nhà khoa học ñã xác ñịnh ñược cấu

trúc kháng nguyên gồm: Kháng nguyên vỏ K (Capsular) bao phủ kín kháng nguyên thân O (Somatic), Bên ngoài kháng nguyên vỏ là kháng nguyên lông H (Flagellar)

và kháng nguyên F (Fimbrae) (hay còn gọi là kháng nguyên pili)

Theo Bertschinger H.U và cs, (1992) [50], hiện nay các nhà khoa học ñã xác ñịnh ñược ít nhất có 170 type kháng nguyên O và 70 type kháng nguyên K, 56 type kháng nguyên H và một số kháng nguyên F

Sau ñây là cấu trúc của các kháng nguyên E coli mà các nhà khoa học ñã

dày công nghiên cứu:

* Kháng nguyên O (Somatic): là thành phần của thân vi khuẩn bao bọc các vật chất di truyền bên trong Theo Zinner và cs (1983) [102] kháng nguyên thân ñược coi như một loại ñộc tố, có thể tìm thấy ở màng ngoài vỏ của vi khuẩn và thường xuyên ñược giải phóng vào môi trường nuôi cấy

Các ñặc tính của kháng nguyên O là: không bị phá hủy khi ñun nóng ở nhiệt

ñộ 1000C trong hai giờ (nên người ta gọi ñây là ñặc tính chịu nhiệt); các chất cồn và acide HCL nồng ñộ 1N chịu ñược 20 giờ Kháng nguyên O rất ñộc, chỉ cần 1/20

mg ñã ñủ giết chết một chuột nhắt trắng sau 24 giờ, nhưng nó lại bị phá hủy bởi Formaline 0,5%

Kháng nguyên O ñược cấu trúc bởi các thành phần: Protein: làm cho phức hợp có tính kháng nguyên; Polyosit: Tạo ra tính ñặc hiệu của kháng nguyên; Lipit: Kết hợp với polyosit và là cơ sở của ñộc tính

* Kháng nguyên H (Flagellar): hay còn gọi là kháng nguyên lông của vi khuẩn và có bản chất là protein

Kháng nguyên H có các ñặc tính như: dễ bị phá hủy ở nhiệt ñộ 600C trong

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 13

vòng 1 giờ; dễ bị cồn, acide yếu và các enzime phân giải protein phá hủy; tuy nhiên dưới tác ñộng của formaline 0,5% thì kháng nguyên H vẫn tồn tại Kháng nguyên

H khi gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết H, trong ñó có các

vi khuẩn ñược ngưng kết lại với nhau nhờ lông dính với lông Các kháng thể kháng

H cố ñịnh trên lông và là cầu nối với các lông bên cạnh Kết quả tạo nên những hạt ngưng kết giống như những cục bông nhỏ Nhờ các sợi lông nhỏ và dài nên khi các hạt ngưng kết lại dễ bị tan và ñứt Các vi khuẩn di ñộng khi cho tiếp xúc với kháng nguyên H tương ứng sẽ trở thành không di ñộng

Theo Orskov và cs (1980) [83] cho rằng: Kháng nguyên H của vi khuẩn E

coli không có vai trò về ñộc lực, ñồng thời không có vai trò trong ñáp ứng miễn

dịch nên ít ñược quan tâm nghiên cứu, nhưng nó có ý nghĩa rất lớn trong xác ñịnh giống, loài của vi khuẩn

* Kháng nguyên K (Capsular): còn gọi là kháng nguyên vỏ Kháng nguyên này có ñặc tính ngăn cản sự ngưng kết của kháng nguyên O với kháng nguyên O tương ứng, nhưng khi ñun nóng ở nhiệt ñộ 100-1210C thì kháng nguyên K sẽ mất tác dụng ngăn cản này

Vai trò của kháng nguyên K còn có nhiều quan ñiểm khác nhau, có ý kiến

cho rằng nó không có ý nghĩa về ñộc lực Vì vậy, chủng E coli có kháng nguyên K

cũng giống như chủng không có kháng nguyên K, Orskov và cs (1980) [83]

Theo Evan và cs (1973) [60] lại cho rằng: Kháng nguyên K lại có ý nghĩa về ñộc lực vì nó tham gia bảo vệ vi khuẩn trước các yếu tố phòng vệ của cơ thể

Kháng nguyên vỏ (K) gồm ba loại kháng nguyên là L, A và B

- Kháng nguyên L: Bị phân hủy khi ñun sôi ở 1000C trong 1 giờ (Kháng nguyên không chịu nhiệt), trong ñiều kiện ñó kháng nguyên mất khả năng ngưng kết và không giữ ñược tính kháng nguyên

- Kháng nguyên A: không bị phân hủy ở nhiệt ñộ 1000C trong 2 giờ 30 phút, tính kháng nguyên vẫn giữ nguyên nên người ta gọi là kháng nguyên chịu nhiệt

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 14

- Kháng nguyên B: Loại này bị phân hủy khi ñun sôi ở 1000C trong 1 giờ (Kháng nguyên không chịu nhiệt)

Kháng nguyên K và yếu tố bám dính là yếu tố quyết ñịnh của vi khuẩn

E coli ñể gây ñược bệnh trong ñường tiêu hóa của ñộng vật ðể thực hiện chức

năng này, mỗi loại vi khuẩn ñều sản sinh ra một yếu tố ñặc trưng, yếu tố này có cấu trúc ñặc biệt phù hợp với cấu trúc của từng ñiểm tiếp nhận ở trên tế bào nhung mao ruột

* Kháng nguyên F (Fimbrae) (hay còn gọi là kháng nguyên pili): Ngoài lông

vi khuẩn E coli ra, còn có những sợi gần giống với lông ñó là pili Pili hay còn gọi

là Fimbrae và có bản chất là protein Dưới kính hiển vi ñiện tử, chúng có hình ảnh một chiếc áo lông bao bọc xung quanh vi khuẩn Pili của vi khuẩn khác với lông ở chỗ là ngắn hơn, cứng hơn, không lượn sóng và không liên quan ñến chuyển ñộng Kháng nguyên F có chức năng là giúp vi khuẩn bám giữ vào giá thể (màng nhầy của ñường tiêu hóa), hay còn gọi là bám dính Yếu tố bám dính có vai trò quan trọng trong việc tạo ra ñộc tố ñường ruột và kích thích cơ thể gia súc thực hiện ñáp ứng miễn dịch Hầu hết các chủng ETEC ñều có mang 1 hoặc nhiều các yếu tố bám dính như: F4 (K88), F5 (K99), F6 (987), F17, F18, F41 Ở lợn, các chủng vi khuẩn ETEC gây bệnh tiêu chảy chủ yếu nhất thường mang các yếu tố bám dính sau ñây:

- Kháng nguyên F4 (K88): loại này có khả năng làm ngưng kết hồng cầu và

nó có mặt ở các chủng E coli phân lập từ lợn con bị ỉa chảy, ñây là yếu tố ñộc lực

ñối với lợn và không có khả năng gây bệnh ñối với loài gia súc khác Bởi vì trên bề mặt tế bào biểu mô ruột non của các loài gia súc khác nhau chỉ cho phép một số

serotype E coli nhất ñịnh nào ñó ñược gắn kháng nguyên F mà thôi, vì ở ñó phụ

thuộc vào receptor ñặc hiệu, Gyles (1992) [67]

- Kháng nguyên F5 (K99): Trước kia tìm thấy kháng nguyên F5 chỉ gây bệnh cho bê, nghé, dê và cừu Tuy nhiên hiện nay, F5 cũng ñược tìm thấy ở các

chủng E coli thuộc nhóm ETEC phân lập từ lợn con tiêu chảy (Links và cs, 1985)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 15

[77] Sự sản sinh F5 phụ thuộc vào nhiều yếu tố của vi khuẩn như: Tốc ñộ sinh tổng hợp F5 nằm trên DNA của plasmid (Isaacson, 1977) [70]

- Kháng nguyên F41: Theo Cox E và cs, (1993) [64] ñã nghiên cứu trong phòng thí nghiệm về khả năng mẫn cảm và sức ñề kháng của lợn ñối với vi khuẩn

E coli có F41 Kết quả cho biết các chủng có F41 bám vào lông nhung của 23 lợn

trong số 30 lợn từ 4 ñến 5 tuần tuổi ñược kiểm tra Những lợn lớn tuổi hơn có sức

ñề kháng với sự bám dính của các chủng E coli có kháng nguyên F41, vì các

receptor tương ứng với F41 bị giảm ñi về số lượng

1.2.2 ðặc tính sinh hóa học của Salmonella:

1.2.2.1 ðặc tính về hình thái

Theo Bergey’s, (1994)[49], vi khuẩn Salmonella là những trực khuẩn

ngắn, hai ñầu tròn, có kích thước 0,4-0,6 x 1,0-3,0 µm, bắt màu Gram âm, không

hình thành nha bào và giáp mô ða số loài Salmonella có lông (flagella) từ 7-12 chiếc xung quanh thân (trừ S gallinarum-pullorum)

Lông giúp cho vi khuẩn có khả năng di ñộng Lông có hình tròn, dài, xuất phát từ màng cytoplasma Do có cấu trúc từ các sợi protein hình xoắn nên có thể

co giãn và di ñộng nên lông của chúng rất khó nhuộm Nếu nhuộm bằng phương pháp Haschem (1972) thì có thể nhìn thấy chúng dưới kính hiển vi ñiện tử (Lê Văn Tạo, 1993[33]) Lông có tính kháng nguyên và do các gen mã hóa tổng hợp protein riêng quy ñịnh

Ngoài ra, trên bề mặt màng ngoài của vi khuẩn Salmonella ñều có các cấu

trúc sợi nhỏ hơn, còn gọi là Fimbriae hay Pili Chúng có kích thước chừng 0,01- 0,03 x 1,0 µm Số lượng fimbriae trên 1 vi khuẩn có khoảng 250- 400 cái vươn thẳng ra xung quanh bề mặt tế bào Fimbriae có cấu trúc là protein và có tính kháng nguyên ñặc trưng Theo Jones và cs, (1981)[72]: Fimbriae tạo cho vi khuẩn khả năng bám dính (adhesion) lên các tế bào biểu mô ruột và xâm nhập vào lớp niêm mạc

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 16

1.2.2.2 ðặc tính về nuôi cấy

Salmonella là vi khuẩn vừa hiếu khí, vừa kỵ khí không bắt buộc, dễ nuôi

cấy Nhiệt ñộ nuôi cấy thích hợp là 37oC, nhưng có thể phát triển ñược ở nhiệt

ñộ từ 6- 42oC Nuôi cấy ở 43oC có thể loại trừ ñược tạp khuẩn mà Salmonella

vẫn phát triển ñược (Timoney và cs, 1988[95]) pH thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 7,6, tuy nhiên vi khuẩn vẫn phát triển ñược ở pH từ 6-9

Khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường BPW (Buffered Pepton Water) và môi trường RV (Rappaports Vassiliadis) sau vài giờ nuôi cấy thấy môi trường vẩn ñục nhẹ, sau 18 ñến 24 giờ thấy canh trùng ñục ñều, trên mặt môi trường có màng mỏng, ñáy ống nghiệm có cặn

Hiện nay có rất nhiều loại môi trường chọn lọc ñược các nhà vi sinh vật

thú y sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và phân lập Salmonella như môi trường

thạch DHL (Deoxycholate Hydrogen sulfide Lactose agar), sau 24 giờ nuôi cấy

vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc tròn, lồi, bóng láng (dạng S), có màu vàng nhạt Các chủng sinh H2S thì giữa khuẩn lạc có màu ñen

Môi trường thạch MacConkey: Vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc tròn lồi, trong không màu, nhẵn bóng

Trên môi trường thạch CHROMTM Salmonella, sau 24 giờ nuôi cấy,

vi khuẩn hình thành khuẩn lạc trơn, tròn, bóng láng (dạng S) và có màu tím hồng

Trong môi trường thạch TSI (Triple Sugar Iron), vi khuẩn Salmonella do

sản sinh alkaline nên phần thạch nghiêng có màu ñỏ (pH=7,3), ñáy ống nghiệm màu vàng (pH=6,8) do vi khuẩn chỉ lên men ñường Glucose Phần giữa ống nghiệm có màu ñen do vi khuẩn sản sinh ra khí H2S Nếu ñể lâu (quá 24 giờ), màu ñen môi trường thường làm át phản ứng tạo axit ở phần ñáy ống nghiệm (không nhìn thấy màu vàng) Vi khuẩn sinh hơi làm nứt thạch, có khi ñẩy thạch khỏi ñáy ống nghiệm (Quinn và cs, 2002[88])

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 17

Trong môi trường LIM (Lysine Indole Motility), vi khuẩn không làm chuyển màu môi trường, môi trường có màu tím nhạt

Môi trường Malonate, vi khuẩn không phát triển nên không làm thay

ñổi màu môi trường

1.2.2.3 ðặc tính sinh hoá

Theo Quinn và cs, (2002)[88], giống vi khuẩn Salmonella ñược chia thành

7 phân nhóm, mỗi phân nhóm có khả năng lên men một số loại ñường nhất ñịnh

và không ñổi Phần lớn phân loài S enterica subsp enterica gây bệnh cho ñộng

vật máu nóng Chúng lên men và sinh hơi: Glucoza, Mannit, Mantoza, Galactoza, Dulcitol, Arabonoza, Sorbitol Cũng ở nhóm này, hầu như các chủng

vi khuẩn Salmonella ñều không lên men Lactoza và Saccaroza

ða số các vi khuẩn thuộc giống Salmonella không làm tan chảy Gelatin,

không phân giải Urê, không sản sinh Indol Phản ứng MR, Catalaza dương tính

(trừ S choleraesuis, S gallinarum-pullorum có MR âm tính) Phản ứng Oxidaza

âm tính Phản ứng sinh H2S dương tính (trừ S paratyphi A, S typhisuis, S

choleraesuis) (Ewing và Edwards, 1970[61])

1.2.2.4 Sức ñề kháng của vi khuẩn Salmonella

Vi khuẩn Salmonella mẫn cảm với nhiệt ñộ và các chất sát trùng mạnh Ở

nhiệt ñộ 50oC trong 1 giờ, 70oC trong 20 phút, 100oC trong 15 phút hoặc ánh sáng mặt trời chiếu thẳng trong 5 giờ có thể diệt ñược vi khuẩn (Laval, 2000[76])

Các chất sát trùng thông thường dễ phá hủy vi khuẩn hoàn toàn như: Phenol 5%, Formon 1/500 diệt vi khuẩn trong 15- 20 phút

Theo Laval, (2000)[76], vi khuẩn Salmonella sống ñược lâu trong ñiều

kiện lạnh, chúng có thể sống trong bột thịt 8 tháng, nhưng ở ñiều kiện môi trường có ñộ pH ≤ 5 chúng chỉ sống ñược trong thời gian ngắn

Vi khuẩn Salmonella tồn tại trong chất ñộn chuồng tới trên 30 tuần, có thể

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ 18

sống ở trong ựất với ựộ sâu 0,5cm trong thời gian 2 tháng Ở sàn gỗ, tường gỗ trong ựiều kiện ắt ánh sáng là 87 ngày, máng gỗ 108 ngày (đào Trọng đạt và cs,

1995[7]) Trong nước tù ựọng, ựồng cỏ ẩm thấp S typhimurium có thể tồn tại trên 7 tháng Trong xác súc vật chết, Salmonella có thể sống trên 100 ngày,

trong thịt ướp muối từ 6-8 tháng (Nguyễn Vĩnh Phước và cs, 1970[27])

1.2.2.5 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella

Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Salmoenlla hết sức phức tạp, bao

gồm 3 loại chắnh:

Kháng nguyên O (O- Antigen): Kháng nguyên thân

Kháng nguyên H (H- Antigen): Kháng nguyên lông

Kháng nguyên K (K- Antigen) hay kháng nguyên vỏ

* Kháng nguyên thân O (O- Antigen)

Kháng nguyên O nằm ở thành tế bào vi khuẩn, có cấu trúc LipoPolySaccharide (LPS) là thành phần chắnh cấu tạo nên lớp màng ngoài của thành tế bào vi khuẩn Gram âm Kháng nguyên O chịu nhiệt (Heat-stable) và kháng cồn, bị biến tắnh khi sử lý bằng formaldehyde Kháng nguyên O gồm 2 nhóm chắnh:

- Polysaccharide không có nhóm hydro, không mang tắnh ựặc trưng của kháng nguyên và chỉ tạo sự khác biệt về hình thái khuẩn lạc từ dạng S (Smooth) sang dạng R (Rough) và dẫn ựến giảm ựộc lực của vi khuẩn (Selbitz, 1995[91])

- Polysaccharide nằm ở ngoài có nhóm hydro quyết ựịnh tắnh kháng nguyên

và ựặc trưng cho từng serotyp

Kháng nguyên O ựược xem như là một nội ựộc tố (Endotoxin) mà nó ựược cấu tạo bởi nhóm hỗn hợp Glyco- polypeptide có thể tìm thấy ở màng ngoài của vỏ bọc vi khuẩn

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 19

Theo CIRAD (2006)[56], kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella có 67

loại chính, ñược chia thành hơn 50 nhóm, số còn lại ñóng vai trò phụ

* Kháng nguyên lông H (H- Antigen)

- Kháng nguyên H (H-Antigen) là protein nằm trong thành phần lông của vi khuẩn, là loại kháng nguyên không chịu nhiệt (Heat labile), rất kém bền vững

so với kháng nguyên O, bị phá hủy ở nhiệt ñộ 60oC sau 1 giờ, dễ phá hủy bởi cồn và axit yếu (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001[37])

hoàn chỉnh cho Salmonella phải thay ñổi pha Có các loài Salmonella như S

typhisuis, hoặc S enteritidis thì chỉ tạo 1 pha

Kháng nguyên H không quyết ñịnh yếu tố ñộc lực của vi khuẩn, cũng như không có ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phòng bệnh, nhưng nó có ý nghĩa quan trọng trong việc xác ñịnh giống loài của vi khuẩn

* Kháng nguyên vỏ (K- Antigen)( hay Vi- Antigen)

Theo Quinn và cs, (2002)[88], kháng nguyên vỏ chỉ có ở một số loài như S

typhi, S paratyphi S dublin cũng có thể mang kháng nguyên vỏ, kháng

nguyên K có thể làm che các kháng nguyên thân O Cũng theo tác giả, nếu

ñun sôi huyễn dịch của các loài Salmonella này trong 10 ñến 12 phút sẽ phá

hủy ñược kháng nguyên vỏ

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 20

Kháng nguyên vỏ là một loại kháng nguyên cĩ khả năng ngưng kết kháng thể

O khi phát triển nhiều Kháng nguyên này chỉ gặp ở 2 serotyp là: S typhi và

S paratyphi C, ký hiệu kháng nguyên hay Vi trong cơng thức đứng sau

kháng nguyên O Theo sơ đồ của Kauffmann – White; cơng thức kháng

nguyên của S paratyphi C là: 6,7, Vi: -1,5 và S Typhi là: 9, 12, Vi: c,d

Trong 3 kháng nguyên chủ yếu trên, kháng nguyên O và kháng nguyên H là

2 loại kháng nguyên cĩ ý nghĩa quan trọng trong cơng tác chẩn đốn

1.3 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E coli, Salmonella:

Bình thường E coli và Salmonella sống trong đường ruột động vật khỏe

Khi điều kiện chăm sĩc, nuơi dưỡng, quản lý kém làm cho sức đề kháng của con

vật giảm xuống, lúc này vi khuẩn E coli, Salmonella xâm nhập vào nội tạng và

gây bệnh

1.3.1.Yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E coli

1.3.1.1.Các yếu tố khơng phải là độc tố của vi khuẩn E coli

* Khả năng bám dính của vi khuẩn E coli: đây là bước đầu tiên trong quá trình gây bệnh của vi khuẩn E coli Nhờ cĩ cấu trúc kháng nguyên bám dính

(Fimbriae antigen là những sợi gần tương tự lơng và cĩ cấu trúc đặc biệt) mà vi khuẩn cĩ thể liên kết vững chắc với tế bào vật chủ, Jones và cs (1977) [71]

Yếu tố bám dính nằm ở pili giúp cho vi khuẩn bám vào thành ruột non của lợn khu trú và nhân lên ở đường ruột, theo Imberechts H và cs, (1997) [69]

* Khả năng xâm nhập của vi khuẩn E coli: sau khi bám dính vào tế bào niêm mạc ruột của vật chủ thì vi khuẩn E coli tiếp tục thực hiện xâm nhập qua

hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy (mucosa) trên bề mặt niêm mạc để xâm nhập vào tế bào biểu mơ ruột và phát triển trong lớp tế bào này mà khơng bị tế bào thực bào của vật chủ tiêu diệt, Giannella và cs, (1976) [66]

* Khả năng dung huyết của vi khuẩn E coli: Vi khuẩn E coli chủng độc cĩ

khả năng sản sinh enzim Haemolyzin để phá hủy hồng cầu của vật chủ, giải phĩng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 21

phân tử sắt ba (Fe3+) dùng cho mình trong quá trình phát triển E coli có bốn kiểu

dung huyết nhưng quan trọng nhất là kiểu α và β, Smith (1963) [94]

Khả năng dung huyết là yếu tố quan trọng của vi khuẩn E coli Theo Kentyl

và cs, (1975) [73] cho biết: E coli ñược phân lập từ cơ quan cảm nhiễm ngoài ñường ruột thường có khả năng dung huyết cao hơn (49%) so với E coli phân lập

từ phân (18%)

* Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli: Khi sử dụng thuốc

kháng sinh trong quá trình ñiều trị, chăm sóc nuôi dưỡng, phòng bệnh cho ñộng vật không hợp lý, dẫn tới hiệu quả thấp, mức ñộ kháng thuốc của vi khuẩn tăng cao

1.3.1.2 Các yếu tố gây bệnh là ñộc tố của vi khuẩn E coli

Cùng với các yếu tố khác, ñộc tố vi khuẩn E coli tác ñộng và gây bệnh cho

ñộng vật gồm các loại sau:

* ðộc tố ñường ruột (Enterotoxin): ñây là loại ñộc tố gây bệnh tiêu chảy trầm trọng cho lợn con ðộc tố này chia thành hai loại: ñộc tố chịu nhiệt và ñộc tố không chịu nhiệt

- ðộc tố chịu nhiệt ST (Heat Stable Toxin): là ñộc tố chịu ñựng nhiệt ñộ

1000C trong vòng 15 phút Loại ñộc tố này chia thành hai nhóm STa và STb dựa trên ñặc tính sinh học và khả năng hòa tan Methanol

Vai trò của STa là kích thích hệ thống men Guanylate cyclase có mặt trên các tế bào biểu mô ruột vật chủ ñể chuyển GTP thành cGMP cGMP hoạt hóa 86 Kpa protein kinase dẫn ñến Phosphoryl hóa phasphatiglycilinnositol hình thành Diaxyglyxerol inositol 1,4,5 triphosphate từ ñó kích hoạt men C-kinase Các sản phẩm này gây tăng hàm lượng Ca2+ bên trong tế bào, Ca2+ ngăn cản quá trình hấp thu Na+, CL- từ trong ống ruột vào tế bào, ngược lại nó kích thích thải Na+, CL- từ

tế bào vào ống ruột và gây hiện tượng tiêu chảy

Vai trò của STb là kích thích gây tiêu chảy ở lợn con trong ñiều kiện thực nghiệm STb có thể làm teo nhung mao ruột lợn, Carter và cs, (1995) [54]

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 22

- ðộc tố không chịu nhiệt LT (Heat Labile Toxin): là loại ñộc tố dễ bị phá hủy bởi nhiệt ñộ 600C trong vòng 15 phút Loại ñộc tố này gắn với thụ thể trên bề mặt tế bào biểu mô ruột, kích thích tăng tiết hàm lượng nước vào ống ruột và gây ra hiện tượng tiêu chảy Quá trình tiêu chảy kéo dài có thể làm rối loạn trao ñổi chất,

dẫn ñến gia súc bị trúng ñộc và chết ðộc tố LT của vi khuẩn E coli là

một trong những yếu tố quan trọng của quá trình gây tiêu chảy cho ñộng vật,

Fairbrother và cs, (1992) [63]

* ðộc tố tế bào Verotoxin: ñầu tiên, người ta nhận thấy E coli chủng O157:

H7 (gây cho người) sản sinh một loại ñộc tố gọi là Verotoxin , sau này Verotoxin ñược gọi là Shiga Lice Toxin (SLT) do chúng giống loại ñộc Shiga cả về cấu trúc không gian, trình tự axit amin và phương thức hoạy ñộng, cả hai nhóm SLT I và SLTII ñều có cấu trúc A-β protein, trong ñó tiểu phần A ức chế quá trình sinh tổng hợp protein của tế bào Nhóm SLT có hai tác dụng: ñộc tố ñường ruột và ñộc tố tế bào SLT sản sinh ở ruột, ñược hấp thu vào máu, theo máu ñến tác ñộng lên tế bào

ở các bộ phận khác Các chủng thuộc nhóm Verotoxin genic E coli gây các chứng

tiêu chảy, bại huyết, hội chứng ñi tiểu ra máu, phù ñầu ở lợn con O157 của vi

khuẩn E coli tiết ra, chúng có vai trò ức chế quá trình sinh tổng hợp protein của tế

bào biểu mô Loại ñộc tố này sau khi vi khuẩn tiết ra, chúng ngấm vào thành ruột, vào máu và gây bại huyết, gây bệnh phù ñầu ở lợn con, gây tiêu chảy (Gyles, 1992) [67]

* ðộc tố Enteroaggregative E coli (EAggEC) là loại ñộc tố của vi khuẩn E

coli sản sinh ra, chúng có cấu trúc một chuỗi protein gồm 38 axit amin và chúng có

tác dụng gây bệnh cho lợn, Ngeleka và cs, (2003) [81]

1.3.2 Yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella:

1.3.2.1 Các yếu tố không phải là ñộc tố

a) Kháng nguyên O

Chất lượng thành phần hóa học, cấu trúc kháng nguyên O ñều ảnh hưởng tới

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 23

ñộc lực của vi khuẩn Salmonella Cụ thể là: S typhimurium nếu thay ñổi

thành phần kháng nguyên từ công thức 1, 4, 12 sang 1, 9, 12 thì vi khuẩn từ dạng có ñộc lực chuyển sang dạng không có ñộc lực (Valtonen, 1977[97]) Kháng nguyên O là yếu tố ñộc lực giúp vi khuẩn chống lại khả năng phòng

vệ của vật chủ, giúp vi khuẩn phát triển trong tế bào tổ chức, chống lại sự thực bào của ñại thực bào (Morris và cs, 1976 [80])

Kháng nguyên O khích thích các cơ quan ñáp ứng miễn dịch hình thành kháng thể ñặc hiệu ngưng kết với kháng nguyên tương ứng Cơ chế phòng vệ này giúp cơ thể vật chủ chống lại quá trình tái xâm nhập của vi khuẩn

ðến nay, người ta ñã xác ñịnh ñược trên 3000 serotyp kháng nguyên O của

Salmonella, thành phần kháng nguyên của vi khuẩn S choleraesuis gồm: O6,

O7; S typhimurium gồm: O1, O4, O5, O12; S enteritidis gồm: O1, O9, O12 b) Kháng nguyên H

Kháng nguyên H không có ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phòng bệnh, cũng không quyết ñịnh yếu tố ñộc lực, tuy vậy nó có vai trò bảo vệ cho vi khuẩn không bị tiêu diệt bởi quá trình thực bào, giúp vi khuẩn sống và nhân lên trong các tế bào ñại thực bào, cũng như trong tế bào gan và thận (Weinstein và cs, 1984 [99])

c) Kháng nguyên K

Bản chất hóa học của kháng nguyên K là Polysaccharide, nhưng thực chất chúng chỉ là thành phần của kháng nguyên O Kháng nguyên K tạo hàng rào bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại tác ñộng ngoại cảnh và hiện tượng thực bào (Nguyễn Như Thanh, 2001 [37])

d) Yếu tố bám dính

Theo Jones và Richardson (1981)[72] khả năng bám dính của vi khuẩn

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 24

Salmonella lên tế bào nhung mao ruột là bước khởi ñầu quan trọng trong quá

trình gây bệnh Hiện tượng bám dính của vi khuẩn lên bề mặt tế bào vừa mang tính chất lý hóa, vừa mang tính chất sinh học và ñược thực hiện theo 3 bước:

Bước 1: Vi khuẩn liên kết từng phần với bề mặt tế bào, thực hiện quá trình này ñòi hỏi vi khuẩn phải có khả năng di ñộng

Bước 2: Là quá trình hấp phụ, phụ thuộc vào ñặc tính bề mặt của vi khuẩn và

tế bào mà vi khuẩn bám dính và ñược thực hiện theo hướng thuận nghịch với

sự tương hỗ của những tác ñộng khác nhau

Bước 3: Là quá trình tương tác giữa yếu tố bám dính của vi khuẩn với các ñiểm tiếp nhận trên bề mặt tế bào Yếu tố bám dính của vi khuẩn ñược sắp xếp trên các fimbriae

Theo Lê Văn Tạo (1993)[33], trên mỗi tế bào vi khuẩn Salmonella có từ 250-

400 fimbriae, chúng giúp vi khuẩn bám dính vào tế bào nhung mao ruột non

ñể gây bệnh

ðỗ Trung Cứ và cs, (2003)[4] ñã công bố: S typhimurium phân lập từ lợn

mắc bệnh Phó thương hàn có khả năng bám dính lên bề mặt tế bào Vero với

tỷ lệ cao (từ 70,76% - 93,48%) Kết quả này tương ñương với khả năng bám

dính của chủng S typhimurium chuẩn

e) Yếu tố xâm nhập

Theo Finlay và cs, (1988)[64], khả năng xâm nhập vào tế bào có nhân hoặc

lớp niêm mạc của ñường ruột là ñặc tính của một số chủng Salmonella có ñộc lực Các biến chủng Salmonella không có khả năng xâm nhập vào tế bào

thường là các chủng không có ñộc lực

Sau khi tiếp cận tế bào vật chủ, vi khuẩn Salmonella tác ñộng làm tăng hàm

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 25

lượng Ca++ nội bào, hoạt hóa Actin Depolimeriring Enzyme, làm thay ñổi cấu trúc, hình dạng các sợi actin, biến ñổi màng tế bào, dẫn ñến hình thành giả túc bao vây tế bào vi khuẩn dưới dạng các không bào chứa vi khuẩn Sau ñó

Salmonella ñược xâm nhập vào trong tế bào, tồn tại, tiếp tục nhân lên với số

lượng lớn, phá vỡ tế bào vật chủ, sản sinh ñộc tố ñường ruột (Enterotoxin), làm xuất hiện quá trình tiêu chảy của vật chủ (Frost và cs, 1997[65])

f) Khả năng tổng hợp sắt

Theo Benjamin (1985)[47], ñây là một yếu tố giúp vi khuẩn Salmonella tăng

nhanh về số lượng làm suy yếu khả năng chống ñỡ của vật chủ do bị thiếu

sắt Cũng theo tác giả, vi khuẩn Salmonella có phản ứng với sự thay ñổi cơ

chế chu chuyển sắt; khi quá trình tổng hợp sắt bị ức chế, chúng sẽ chuyển toàn bộ protein màng ñiều phối sắt lên bề mặt của tế bào vi khuẩn, làm cho khả năng hấp thu sắt tăng cường một cách rõ rệt

i) Khả năng kháng kháng sinh

Khi vi khuẩn có sẵn những yếu tố gây bệnh thì khả năng kháng kháng sinh

sẽ làm tăng tính gây bệnh của vi khuẩn lên gấp bội

Việc sử dụng rộng rãi các loại thuốc kháng sinh ñể phòng trị bệnh, kích thích sinh trưởng của gia súc, gia cầm, ñã tạo ra nhiều giống vi khuẩn có khả năng kháng thuốc, mang plasmid kháng kháng sinh, tồn tại rất lâu trong cơ thể người, vật nuôi và môi trường

Trên ñây là 7 yếu tố gây bệnh không phải là ñộc tố của vi khuẩn Salmonella

Các yếu tố này bằng những cơ chế tác ñộng khác nhau, phương thức tác ñộng khác nhau, ñã tạo ñiều kiện bất lợi cho cơ thể vật chủ, ñồng thời chúng lại tạo

ñiều kiện thuận lợi cho vi khuẩn Salmonella gây bệnh Chính vì thế các yếu

tố không phải là ñộc tố ñóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình sinh

bệnh của vi khuẩn Salmonella Vì vậy, việc nghiên cứu các yếu tố này là hết

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 26

sức cần thiết, góp phần quan trọng trong việc phòng chống bệnh do vi khuẩn

Salmonella gây nên

1.3.2.2 Các yếu tố là ñộc tố

Nếu như các yếu tố gây bệnh không phải là ñộc tố là những tác nhân gián

tiếp, quan trọng trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn Salmonella, thì các

yếu tố gây bệnh là ñộc tố lại là tác nhân trực tiếp quyết ñịnh quá trình sinh

bệnh Các yếu tố gây bệnh là ñộc tố của Salmonella bao gồm: nội ñộc tố

(Endotoxin), ngoại ñộc tố ñường ruột (Enterotoxin) và ñộc tố tế bào (Cytotoxin) (Finlay và Falkov, 1988[64])

a/ ðộc tố ñường ruột (Enterotoxin)

ðộc tố ñường ruột của vi khuẩn Salmonella có hai thành phần chính: ðộc tố

thẩm xuất nhanh RPF (Rapid Permeability Factor) và ñộc tố thẩm xuất chậm DPF (Delayed Permeability Factor) (Peterson, 1980[85])

+ Theo Clarke và cs, (1988)[57], ñộc tố thẩm xuất nhanh có cấu trúc thành

phần giống với ñộc tố chịu nhiệt của vi khuẩn E coli (Heat-stabile toxin:

ST)

Yếu tố thẩm xuất nhanh giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô của

ruột, và thực hiện khả năng thẩm xuất sau 1- 2 giờ, kéo dài 48 giờ và làm trương tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary cell) ST có khả năng chịu ñược nhiệt ñộ 100oC trong 4 giờ, bền vững ở nhiệt ñộ thấp, có thể bảo quản ở -

20oC Cấu trúc phân tử gồm nhiều polysaccharide và một số chuỗi polypeptide

ðộc tố RPF kích thích lên hệ thống men Guanylate Cyclase trong tế bào biểu

mô ruột, chuyển GTP thành GDP Trong tế bào, GDP tăng cao làm cho nồng

ñộ ion Ca++ cũng tăng cao, dẫn ñến ngăn cản hấp thu chất ñiện giải và nước ở trong xoang ruột Do vậy, lượng nước trong ruột tăng cao, kích thích niêm

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 27

mạc ruột, tăng co bóp, làm gia súc ỉa chảy

+ Yếu tố thẩm xuất chậm của Salmonella có cấu trúc, thành phần giống ñộc

tố không chịu nhiệt của vi khuẩn E coli (Heat Labile Toxin: LT) Nó thực

hiện chức năng thẩm xuất chậm từ 18- 24 giờ, có thể kéo dài 36- 48 giờ DPF bị phá hủy ở 70oC trong vòng 30 phút và ở 56oC trong vòng 4 giờ Cấu trúc phân tử gồm 3 chuỗi polypeptide và một số hợp chất khác, phân tử lượng 40.000- 50.000 dalton

ðộc tố thẩm xuất chậm của Salmonella làm thay ñổi quá trình trao ñổi nước

và chất ñiện giải, dẫn ñến tăng cường bài xuất nước và chất ñiện giải từ mô bào vào lòng ruột, cản trở sự hấp thu, gây thoái hóa lớp tế bào villi của thành ruột gây tiêu chảy

b/ Nội ñộc tố (Endotoxin)

Nội ñộc tố nằm ở lớp màng ngoài của tế bào vi khuẩn và ñược cấu tạo bởi thành phần cơ bản là Lipopolysaccharide (LPS) LPS có cấu tạo phân tử lớn, gồm 3 vùng riêng biệt với các ñặc tính và chức năng riêng biệt: Vùng ưa nước, vùng lõi và vùng lipit A

Vùng ưa nước bao gồm một chuỗi Polysaccharide chứa các ñơn vị cấu trúc kháng nguyên O Vùng lõi có bản chất là acid heterooligosaccharide, ở trung tâm, nối kháng nguyên O với vùng lipit A Vùng lipit A ñảm nhận chức năng nội ñộc tố của vi khuẩn Cấu trúc nội ñộc tố gần giống với cấu trúc của kháng nguyên O Cấu trúc nội ñộc tố biến ñổi sẽ dẫn ñến sự thay ñổi ñộc lực của

Salmonella Các ñột biến gen ở vùng lõi, vùng ưa nước làm cho Salmonella

không còn ñộc lực

Lipit A có ái lực với màng tế bào, với lipit khác và với Protein ðiều ñó chứng tỏ lipit A chính là trung tâm hoạt ñộng của nội ñộc tố Vùng ña ñường Polysaccharide, chỉ giữ vai trò là vật mang các lipit không hòa tan (Bradley,

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 28

1979[52])

Nội ñộc tố là LPS ñược tiết ra từ vách tế bào vi khuẩn khi bị dung giải Trước khi thể hiện ñộc tính, LPS cần phải liên kết với các yếu tố liên kết tế bào hoặc các receptor bề mặt các tế bào như: Tế bào lâm bao cầu B, lâm bao cầu

T, tế bào ñại thực bào, tiểu cầu, tế bào gan lách

c/ ðộc tố tế bào (Cytotoxin)

ðặc tính chung của Cytotoxin là có khả năng ức chế tổng hợp Protein của tế bào có nhân và làm trương tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary cell) ða phần ñộc tố của chúng bị phá hủy bởi nhiệt ñộ

Theo Clarke và cs, (1988)[57], làm tổn thương tế bào biểu mô là ñặc tính quan trọng của Cytotoxin Có ít nhất là 3 dạng Cytotoxin:

+ Dạng 1: Không bền vững với nhiệt và mẫn cảm với Trypsin ðộc tố này có trọng lượng phân tử khoảng 56 - 78 kDa, nó tác ñộng theo cơ chế là ức chế tổng hợp Protein của tế bào Hela và làm teo tế bào

+ Dạng 2: Có nguồn gốc từ Protein màng ngoài tế bào vi khuẩn, có cấu trúc

và chức năng gần giống với các dạng ñộc tố tế bào do Shigella và các chủng Enterotoxigenic E coli (ETEC) sản sinh ra Dạng ñộc tố này cũng có ở hầu hết các serovar Salmonella gây bệnh

+ Dạng 3: Dạng này có liên quan với Hemolysin Dạng ñộc tố này tác ñộng lên tế bào theo cơ chế dung giải các không bào nội bào Trong phòng thí nghiệm, ñộc tố này gây chết tế bào Vero, tế bào Hela và tế bào CHO (Rahman và cs, 1992[89])

Trên ñây là 3 loại ñộc tố gây bệnh chính của vi khuẩn Salmonella, chúng là

các tác nhân trực tiếp, quyết ñịnh khả năng gây bệnh của vi khuẩn

Một số serotyp như: S choleraesuis, S typhimurium, S enteritidis, S dublin, S

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ 29

gallinarum, S pullorum có mang các plasmid có kắch thước lớn (khoảng từ 50-

100 kb) Chắnh những plasmid này có mang các yếu tố di truyền quyết ựịnh khả năng sản sinh các yếu tố ựộc lực gây bệnh cho người và gia súc với tỷ lệ ốm và chết cao (Krause và Fang, 1995[75])

1.4 Biểu hiện tiêu chảy do vi khuẩn E coli, Salmonella ở lợn sau cai sữa:

1.4.1 Bệnhdo vi khuẩn E coli ở lợn sau cai sữa

1.4.1.1 Biểu hiện triệu chứng ở lợn do bị nhiễm vi khuẩn E coli

Khi ựàn lợn con bị phân trắng, trên nền chuông quan sát thấy những cục, bãi phân màu trắng như phân cò, lợn con tụm vào một góc chuồng Lợn con xù lông, gầy còm, suy nhược, yếu ớt, các ựầu xương hông nhô ra, mắt trũng sâu, run rẩy, ựi ựưng siêu vẹo Khi mới mắc bệnh lợn con còn bú sữa, về sau bỏ bú Phân thay ựổi từ màu sáng trong sang màu trắng hoặc xám Ban ựầu lợn ựi ngoài phân thành bãi, về sau phân tự do chảy nhỏ giọt từ hậu môn ra ngoài làm phắa sau lợn dắnh bê bết phân ( đào Trọng đạt và cs, 1996) [8]

Theo Lê Văn Tạo và cs, (1993) [35], một số trường hợp lợn có triệu chứng nôn mửa Do tiêu chảy nên cơ thể mất nước nhiều, trọng lượng cơ thể lợn giảm nhanh 30-40%, cơ vùng bụng run rẩy, nhão, không còn trương lực Thường lợn con sinh ra từ lợn mẹ ựẻ lứa ựầu mắc tỷ lệ cao và chết nhiều hơn lợn con sinh từ lợn mẹ ựẻ nhiều nứa

1.4.1.2 Biểu hiện về bệnh tắch ở lợn do bị nhiễm vi khuẩn E coli

Theo Lê Văn Tạo và cs, (1993) [35], khi mổ khám thấy toàn bộ ựường tiêu hóa bị xuất huyết, xuất hiện nhiều nhất là ở ruột non và thành dạ dày Chất chứa trong ruột có lẫn máu Hệ thống hạch lâm ba màng treo ruột bị tụ huyết Các cơ quan nội tạng khác như: tim, gan, thận, phổi thì ắt bị biến ựổi

Cũng theo Nguyễn Văn Tạo (2006) [36] trắch dẫn công trình của tác giả

Fauber và cs, (1992) cho biết: khi lợn mắc bệnh E coli bị chết, mổ khám thấy

bệnh tắch ở dạ dày giãn rộng, các bờ ở ựường cong lớn bị nhồi máu, chất chứa

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 30

trong dạ dày không tiêu Ruột non căng phồng chứa ñầy hơi với những ñám xuất huyết ở thành ruột nhìn từ ngoài vào thấy những ñám niêm mạc ruột bị tróc làm cho thành ruột bị mỏng ra

1.4.2.Bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn sau cai sữa

1.4.2.1.ðặc tính sinh bệnh

Mầm bệnh sau khi nhiễm vào ñường tiêu hoá, nhanh chóng ñi vào hệ lâm

ba của ruột gây viêm sưng hạch, từ ñó vào hệ tuần hoàn, gây bại huyết, làm cho

lá lách sưng to, lúc ñầu do tụ máu, về sau do tăng sinh, sản sinh nội ñộc tố, gây viêm hoại tử gan và hạch

Bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn có 2 dạng chủ yếu: Thể nhiễm trùng huyết do S choleraesuis var kunzendorf gây ra và thể viêm ruột do S

typhimurium

1.4.2.2.Thể nhiễm trùng huyết do S choleraesuis var kunzendorf gây ra

Bệnh Phó thương hàn lợn thể nhiễm trùng máu xảy ra chủ yếu ở lợn

sau cai sữa do S choleraesuis var Kunzendorf gây nên (Laval, 2000[76]) Lợn

bệnh bỏ ăn, ủ rũ, thích nằm tập trung lại với nhau ở góc chuồng tối hay chui vào

ổ rơm, thân nhiệt tăng cao 40,5 – 41,6oC Mí mắt sưng mọng có nốt tím bầm, viêm kết mạc Khi bị biến chứng, gây viêm phổi, ho khan, có dịch ñờm Xuất huyết lấm tấm dưới da, tụ lại thành những vết ñỏ thẫm trên da bụng và tai Sau 3 – 4 ngày bị mắc bệnh, lợn ỉa chảy có màu vàng Tác ñộng lâm sàng của bệnh Phó thương hàn thể nhiễm trùng máu rất nghiêm trọng và gây chết Trong các ổ dịch, tỷ lệ lợn bệnh chết ở mức cao, tỷ lệ những con ốm không cố ñịnh, thường dưới 10% tổng ñàn (Wilcock, 1995)[101]

Ở thể á cấp tính, hiện tượng ỉa chảy xuất hiện sau 2 – 3 ngày, rồi kéo dài cho ñến khi lợn chết hoặc khỏi bệnh Phân bài xuất nhiều lần trong ngày, sau ñó phân chảy ra liên tục, phân có màu vàng, vàng xám, vàng nâu ở lợn con, còn ở lợn trưởng thành phân nhão, phân nước có lẫn máu Lợn gầy sút nhanh (Laval,