Phân lập, nhân nuôi in vitro và bảo quản lạnh tế bào biểu mô ống dẫn trứng bò

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… iiBỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI --- --- ðỖ TRUNG KIÊN PHÂN LẬP, NHÂN NUÔI IN

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
 -

ðỖ TRUNG KIÊN

PHÂN LẬP, NHÂN NUÔI IN VITRO VÀ BẢO QUẢN LẠNH

TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẪN TRỨNG BÒ

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Hà Nội, năm 2013

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
 -

ðỖ TRUNG KIÊN

PHÂN LẬP, NHÂN NUÔI IN VITRO VÀ BẢO QUẢN LẠNH

TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẪN TRỨNG BÒ

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược công bố trong bất

kì công trình nghiên cứu nào khác

Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

ðỗ Trung Kiên

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ ii

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện luận văn, tôi xin trân trọng bày tỏ lòng

biết ơn sâu sắc ựến TS Nguyễn Hữu đức Ờ Phó Trưởng Khoa Công nghệ

sinh học, Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học ựộng vật Ờ đại học Nông nghiệp Hà Nội ựã luôn tận tình giúp ựỡ, hướng dẫn, ựồng thời bồi dưỡng cho tôi những kiến thức chuyên môn và kinh nghiệm quý báu

để thực hiện ựược nghiên cứu này, tôi xin chân thành cảm ơn sự tài trợ

từ ựề tài cấp Bộ Giáo dục và đào tạo: ỘNâng cao hiệu quả tạo phôi bò thụ tinh ống nghiệm bằng kỹ thuật nuôi cấy chung với tế bào ống dẫn trứngỢ (mã số B2011-11-01) và ựề tài cấp Nhà nước ỘỨng dụng công nghệ cấy chuyển phôi

bò sữa cao sản tại Tây NguyênỢ (mã số TN3/CO2)

để thực hiện ựược nghiên cứu này, tôi cũng xin cảm ơn sự giúp ựỡ của các nghiên cứu viên, kỹ thuật viên phòng Công nghệ phôi thuộc Viện Công nghệ sinh học Ờ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và các cán

bộ Viện Nghiên cứu khoa học Tây Nguyên Ờ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Với tình cảm sâu sắc, tôi xin cảm ơn sự ủng hộ và giúp ựỡ của các Thầy, Cô giáo thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học ựộng vật Ờ Khoa Công nghệ sinh học Ờ đại học Nông nghiệp Hà Nội trong quá trình thực hiện nghiên cứu tại ựơn vị

để việc thu mẫu phục vụ cho nghiên cứu thuận lợi, tôi xin cảm ơn toàn thể anh, chị em công nhân lò mổ gia súc quanh ngoại thành Hà Nội và khu vực lân cận, ựặc biệt là anh Nguyễn Xuân Chiều Ờ công nhân lò mổ thôn Cổ điển Ờ xã Hải Bối Ờ huyện đông Anh ựã tận tình giúp ựỡ

để hoàn thành luận văn này, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh ựạo; các Thầy, Cô giáo trường Cao ựẳng Thủy sản Ờ Từ Sơn Ờ Bắc Ninh,

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… iii

nơi tôi công tác

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn các Thầy, Cô giáo; các chuyên viên Ban quản lý ñào tạo – ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã ủng hộ, tạo ñiều kiện giúp

ñỡ tôi hoàn thành các thủ tục cần thiết ñể bảo vệ thành công luận văn này

Hà Nội, tháng 6 năm 2013 Tác giả luận văn

ðỗ Trung Kiên

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… iv

MỤC LỤC Trang phụ bìa LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

MỞ ðẦU 1

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan cơ quan sinh sản ở bò cái, ống dẫn trứng và lớp biểu mô tế bào ống dẫn trứng 4

1.1.1 Cơ quan sinh sản ở bò cái 4

1.1.2 Ống dẫn trứng bò 6

1.1.3 Lớp biểu mô tế bào ống dẫn trứng 8

1.2 Kỹ thuật nuôi cấy in vitro tế bào ñộng vật có vú 10

1.2.1 ðặc ñiểm của tế bào ñộng vật 10

1.2.2 Nuôi cấy tế bào ñộng vật 11

1.2.3 Môi trường nuôi cấy tế bào ñộng vật 14

1.2.4 Kiểm soát nhiễm trong nuôi cấy tế bào 16

1.3 Kỹ thuật ñông lạnh tế bào ñộng vật 19

1.3.1 Khái niệm 19

1.3.2 Mục ñích của kỹ thuật ñông lạnh 19

1.3.3 Các biến ñổi của tế bào trong bảo quản bằng phương pháp ñông lạnh 20

1.3.4 Chất bảo quản ñông lạnh 22

1.3.5 Quy trình thu nhận tế bào ñể ñông lạnh 24

1.3.6 Các phương pháp ñông lạnh 25

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… v

1.4 Kỹ thuật giải ñông tế bào ñộng vật 27

1.5 Phân lập, nhân nuôi in vitro và bảo quản lạnh tế bào biểu mô ống dẫn trứng 27

1.5.1 Lược sử nghiên cứu 27

1.5.2 Phương pháp phân lập, nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng 28

1.5.3 Các loại môi trường nuôi ñược sử dụng với lớp ñơn tế bào biểu mô ống dẫn trứng 29

1.5.4 Bảo quản lạnh tế bào biểu mô ống dẫn trứng 30

1.6 Ảnh hưởng của việc bổ sung tế bào biểu mô ống dẫn trứng vào môi trường nuôi phôi bò 30

1.6.1 Vi môi trường trong ống dẫn trứng 30

1.6.2 ðồng nuôi cấy phôi với tế bào biểu mô ống dẫn trứng bò 32

1.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 36

1.7.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 36

1.7.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 38

Chương 2 - ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, ðỊA ðIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

2.1 ðối tượng nghiên cứu 40

2.2 Nội dung nghiên cứu 40

2.3 ðịa ñiểm nghiên cứu 40

2.4 Phương pháp nghiên cứu 41

2.4.1 Tiêu chí lựa chọn phương pháp, trang thiết bị và hóa chất 41

2.4.2 Thu và bảo quản ống dẫn trứng bò 42

2.4.3 Xử lý ống dẫn trứng bò tại phòng thí nghiệm 42

2.4.4 Phân lập tế bào biểu mô ống dẫn trứng 42

2.4.5 Nuôi cấy trong ống nghiệm tế bào biểu mô ống dẫn trứng 43

2.4.6 Phương pháp ñếm tế bào 44

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ vi

2.4.7 Tạo lớp ựơn tế bào biểu mô ống dẫn trứng 45

2.4.8 đông lạnh tế bào biểu mô ống dẫn trứng 45

2.4.9 Giải ựông và kiểm tra khả năng phát triển in vitro của tế bào biểu mô ống dẫn trứng 46

2.4.10 Chọn dòng tế bào 47

2.4.11 Xử lý số liệu 47

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48

3.1 Phân lập tế bào biểu mô ống dẫn trứng 48

3.2 Khả năng phát triển in vitro của tế bào biểu mô ống dẫn trứng 60

3.3 Khả năng bảo quản lạnh tế bào biểu mô ống dẫn trứng 70

3.4 Ảnh hưởng của tế bào biểu mô ống dẫn trứng ựến sự phát triển in vitro của phôi bò 76

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 83

TÀI LIỆU THAM KHẢO 84

PHỤ LỤC:Bài báo ựang in 2013 (Tạp chắ Công nghệ Sinh học) 95

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BME

BO BOECs

Bassal Medium Eagle Bracket and Oliphant’s medium

Bovine Oviduct Epithelial Cells

BSA Bovine Serum Albumin

cs D’MEM

cộng sự Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO

E’MEM

Dimethyl Sulfoxide Eagle Medium Essential Medium

FCS Fetal Calf Serum IVF In Vitro Fertilization

IVM OCS

LH

In Vitro Maturation Oestrus Cow Serum Luteinizing Hormone PBS

SOF

Phosphate Buffered Saline

Synthetic Oviductal Fluid

TCM 199 Tissue Culture Medium 199

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… viii

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số loại môi trường phổ biến trong nuôi cấy tế bào ñộng vật 15

Bảng 3.1 Thành phần môi trường PBS 50

Bảng 3.2 Thành phần môi trường D’MEM 63

Bảng 3.3 Thành phần môi trường BO 77

Bảng 3.4 Thành phần môi trường TCM 199 79

Bảng 3.5 Khả năng phát triển của phôi bò thụ tinh ống nghiệm trong môi trường TCM 199 có và không bổ sung tế bào biểu mô ống dẫn trứng 81

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ix

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơ quan sinh sản của bò cái 4

Hình 1.2 Tổ chức cơ quan sinh dục bò cái 5

Hình 1.3 Cấu trúc ống sinh dục ở bò cái 6

Hình 1.4 Buồng trứng bò 6

Hình 1.5 Vị trí ống dẫn trứng bò 7

Hình 1.6 Cấu tạo ống dẫn trứng 8

Hình 1.7 Tế bào biểu mô và các vùng nối liên kết trong tế bào biểu mô ống dẫn trứng 9

Hình 1.8 Nuôi cấy sơ cấp 12

Hình 1.9 Nuôi cấy thứ cấp 13

Hình 1.10 Sự biến ñổi vật lý của tế bào khi ñông lạnh 23

Hình 1.11 Sự phân bố nhiệt ñộ trong bình nitơ lỏng 24

Hình 2.1 Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học ðộng vật – Khoa Công nghệ sinh học – ðại học Nông nghiệp Hà Nội 40

Hình 3.1 Thiết bị Cryologic 48

Hình 3.2 Môi trường PBS 50

Hình 3.3 Tách mô liên kết, tua viền của ống dẫn trứng 51

Hình 3.4 Bộc lộ lòng ống dẫn trứng 52

Hình 3.5 Tách những mảng tế bào biểu mô ống dẫn trứng 52

Hình 3.6 Cho những mảng tế bào biểu mô ống dẫn trứng vào ống ly tâmcó chứa 1 ml môi trường D’MEM có bổ sung 10% FCS 52

Hình 3.7 Ly tâm tốc ñộ 1200 vòng/phút trong 5 phút 53

Hình 3.8 Lớp tế bào lắng ñọng bên dưới sau khi ly tâm 53

Hình 3.9 Dùng pipet vô trùng loại bỏ dịch nổi bên trên, trộn lẫn tế bào lên xuống với môi trường D’MEM mới có bổ sung 10% FCS 53

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… x

Hình 3.10 Buồng thao tác vô trùng 54

Hình 3.11 Mảng tế bào biểu mô ống dẫn trứng tách từ ống dẫn trứng ngay sau khi ñưa về phòng thí nghiệm 54

Hình 3.12 Kháng sinh Penicillin và Streptomycin 56

Hình 3.13 Tủ nuôi Sanyo ñiều chỉnh cân bằngnhiệt ñộ 37ºC, 5% CO2, ñộ ẩm bão hòa 57

Hình 3.14 Hệ thống cung cấp khí cho tủ ấm 58

Hình 3.15 Hệ thống lọc nước cất vô trùng và ñề ion hóa 58

Hình 3.16 ðồ thị thể hiện khả năng bám dính và phân chia của tế bào ống dẫn trứng ñược phân lập ở các khoảng thời gian khác nhau 59

Hình 3.17 Mảng tế bào biểu mô ống dẫn trứng bám xuống ñáy ñĩa nuôi và tế bào bắt ñầu phân chia 60

Hình 3.18 Tế bào biểu mô ống dẫn trứng ñược nuôi trong ñĩa nhựa NUNC (loại 04 giếng), ñã chuẩn bị môi trường nuôi cấy 61

Hình 3.19 ðồ thị biểu diễn khả năng bám dính và tiếp tục phát triển của các mảng tế bào biểu mô ống dẫn trứng 61

Hình 3.20 Môi trường D’MEM 64

Hình 3.21 Huyết thanh bào thai bê 65

Hình 3.22 Cấu trúc không gian của Trypsin 66

Hình 3.23 Tế bào biểu mô ống dẫn trứng phát triển thành lớp ñơnsau 48 giờ nuôi in vitro 67

Hình 3.24 Buồng ñếm Neubauer và buồng ñếm Thoma 68

Hình 3.25 Cấu trúc chung của buồng ñếm 68

Hình 3.26 Kích thước mỗi ô ñếm của buồng ñếm 68

Hình 3.27 Phương pháp chọn vùng ñếm với buồng ñếm Neubauer 69

Hình 3.28 Phương pháp chọn vùng ñếm với buồng ñếm Thoma 69

Hình 3.29 Phương pháp ñếm tế bào 69

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… xi

Hình 3.30 Thao tác nhỏ trypan blue 70

Hình 3.31 Hai mức nhiệt ñộ ñược áp dụng ñể hạ dần nhiệt ñộ của tế bàobảo quản lạnh trước khi ñưa vào nitơ lỏng (-196ºC) 71

Hình 3.32 Thiết bị trữ lạnh dùng nitơ lỏng sử dụng trong nghiên cứu 72

Hình 3.33 Chất bảo quản lạnh DMSO 74

Hình 3.34 Cọng rạ dùng trong nghiên cứu 75

Hình 3.35 Tế bào biểu mô ống dẫn trứngñược bảo quản lạnh trong nitơ lỏng (-196ºC) 75

Hình 3.36 Tế bào biểu mô ống dẫn trứng tiếp tục phát triển sau ñông lạnh - giải ñông 75

Hình 3.37 ðĩa nhiệt Tokai-Hit ñược khống chế nhiệt ñộ 37ºC 78

Hình 3.38 Chọn dòng tế bào trên kính hiển vi phản pha Nikon Ti-Ucó gắn bộ vi thao tác Narishige 78

Hình 3.39 Môi trường TCM 199 81

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 1

MỞ ðẦU

Tính cấp thiết của ñề tài

Một vấn ñề hay gặp phải trong việc tạo phôi bò thụ tinh trong ống nghiệm, ñó là hiện tượng “Block” mà chúng tôi tạm dịch là “Ngưng trệ” Hiện tượng này thường gặp ở giai ñoạn phôi bò ñạt 8-16 tế bào, nó làm phôi bò thụ tinh trong ống nghiệm không tiếp tục phát triển thành phôi dâu hoặc phôi nang, khiến tỉ lệ phôi dâu-phôi nang thu ñược không cao Hiện tượng “Block” này xuất phát từ sự sụt giảm ARNm có nguồn gốc từ tế bào trứng và sự khởi ñộng của quá trình phiên mã ARNm của bộ gen của phôi thụ tinh trong ống nghiệm (Eyestone W.H và First N.L.,1986) [21]

Trong nuôi phôi in vitro, ñiều này có nguyên nhân trực tiếp từ môi

trường nuôi phôi Nghĩa là, các ñiều kiện của môi trường, trong những trường hợp cụ thể, là không ñáp ứng ñầy ñủ và kịp thời cho tất cả các phản ứng sinh hóa xảy ra trong quá trình phát triển của phôi ðể giúp phôi bò thụ tinh trong ống nghiệm có thể vượt qua ñược giai ñoạn “Block” này, người ta sử dụng tế bào biểu mô ống dẫn trứng (Bovine Oviduct Epithelial Cells = BOECs) như một tác nhân bổ trợ quan trọng trong môi trường nuôi phôi (Eyestone W.H và First N.L.,1989) [22]

Ống dẫn trứng bò chính là một vi môi trường thích hợp cho quá trình thành thục cuối cùng của trứng, thích hợp cho sự thụ tinh, ñồng thời ñó cũng chính là vi môi trường thuận lợi cho sự phát triển của phôi giai ñoạn sớm Theo một số nghiên cứu trên thế giới, phôi bò thụ tinh ống nghiệm ñược nuôi chung (co-culture) với các tế bào biểu mô ống dẫn trứng bò sẽ phát triển ñến giai ñoạn phôi dâu-phôi nang với tỉ lệ cao hơn (Eyestone W.H và First N.L., 1989) [22]

Tại Việt Nam, các nghiên cứu tạo phôi bò thụ tinh trong ống nghiệm ñã

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 2

ñược tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Viện Chăn nuôi, Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội (Nguyễn Thị Ước và cs,

1999 [4]; Nguyễn Hữu ðức và cs, 2003a [1]; Bùi Xuân Nguyên và cs, 2004 [50]) Bê thụ tinh trong ống nghiệm ñầu tiên của Việt Nam cũng ñã ñược sinh

ra (Nguyễn Hữu ðức và cs, 2003a [1])

Nhằm tiếp tục cải thiện hiệu quả của công nghệ tạo phôi bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm cụ thể giải quyết hiện tượng “Block” ñã ñề cập

trên, chúng tôi tiến hành thực hiện nghiên cứu ñề tài “Phân lập, nhân nuôi in

vitro và bảo quản lạnh tế bào biểu mô ống dẫn trứng bò”

Mục tiêu nghiên cứu của ñề tài

Xây dựng thành công phương pháp phân lập, nuôi cấy in vitro, bảo

quản lạnh tế bào biểu mô ống dẫn trứng bò

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài

- Ý nghĩa khoa học

+ Kết quả nghiên cứu của ñề tài ñóng góp vào việc xây dựng công nghệ

nhân nuôi in vitro và bảo quản lạnh tế bào biểu mô ống dẫn trứng bò tại Việt

Nam ñồng thời thúc ñẩy nhanh các nghiên cứu cơ bản cũng như ứng dụng trong lĩnh vực công nghệ phôi và công nghệ sinh học sinh sản ñộng vật tại Việt Nam;

+ Kết quả nghiên cứu của ñề tài sẽ làm tài liệu tham khảo tốt cho việc nghiên cứu và giảng dạy về công nghệ phôi ñộng vật trong các trường học,

các cơ sở nghiên cứu và ứng dụng sinh học ở Việt Nam

Ý nghĩa thực tiễn

+ Kết quả của ñề tài giúp cải thiện hiệu quả của công nghệ tạo phôi bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm, cụ thể nâng cao tỉ lệ phôi dâu-phôi nang tạo thành thông qua việc bổ sung tế bào biểu mô ống dẫn trứng vào môi

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 3

trường nuôi phôi giúp phôi 8-16 tế bào vượt qua hiện tượng “Block” và tiếp tục phát triển;

+ Kết quả của ñề tài sẽ phục vụ việc xây dựng ngân hàng lạnh (Cryobank) bảo quản các dòng tế bào biểu mô ống dẫn trứng có chất lượng tốt nhằm chủ ñộng trong các thí nghiệm cũng như phục vụ mục ñích thương mại

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……… 4

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan cơ quan sinh sản ở bị cái, ống dẫn trứng và lớp biểu mơ

tế bào ống dẫn trứng

1.1.1 Cơ quan sinh sản ở bị cái

Trong các cơ quan nội quan, cơ quan sinh sản của bị cái nằm ở dưới ruột thẳng và được tách ra bởi một túi sinh dục Ở bị, chính mối liên hệ phân

bố của tổ chức này cho phép người ta cĩ thể thao tác kiểm tra sờ nắn bằng tay hoặc bằng siêu âm cơ quan sinh sản ví dụ như chẩn đốn trạng thái của buồng trứng của bị cái (Senger, 2003) [61]

Hình 1.1 Cơ quan sinh sản của bị cái

“Nguồn: http://www.nongae.gsnu.ac.kr [81]”

Các cấu trúc chính của cơ quan sinh sản ở bị cái bao gồm: buồng trứng,

cơ quan sinh dục ngồi và tổ chức cơ quan sinh sản cái Tổ chức cơ quan sinh dục cái gồm các hệ thống các đường ống sinh dục liên kết với nhau, mỗi ống

cĩ một chức năng riêng biệt

ði từ ngồi vào, các bộ phận ống sinh dục là âm đạo, cổ tử cung, tử cung và ống dẫn trứng Chúng bao gồm 4 lớp riêng biệt bắt đầu từ lớp màng thanh dịch ngồi, lớp cơ, lớp dưới niêm mạc và cuối cùng là lớp niêm mạc

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 5

Lớp màng thanh dịch ngoài là một lớp phủ ngoài bao gồm các tế bào hình vảy dạng dẹt bao phủ bề mặt của tổ chức cơ quan sinh dục và nó ñược nối tiếp với lớp màng bụng

Lớp cơ là một lớp kép cơ trơn, lớp ngoài là lớp cơ dọc, lớp trong là lớp

cơ tròn giúp cho việc co thắt của các ñường ống sinh dục Mỗi cơn co thắt là rất cần thiết ñể vận chuyển giao tử, kích thích bài tiết và kích thích trong quá trình sinh ñẻ

Nằm bên trong phần dưới lớp cơ là lớp dưới niêm mạc, ñây là lớp có ñộ dày khác nhau bao gồm mạch máu, dây thần kinh và mạch bạch huyết Lớp dưới niêm mạc cũng nuôi dưỡng lớp niêm mạc

Sự hợp thành của các biểu mô niêm mạc phụ thuộc khác nhau tùy vào

vị trí của tổ chức sinh dục, trạng thái hormon và trạng thái của chu kỳ sinh sản Chẳng hạn như âm ñạo bao gồm các biểu mô phân tầng hình vảy ñể bảo

vệ chống lại sự trầy xước trong suốt quá trình giao phối, trong khi ở ống dẫn trứng, lớp biểu mô lại nhăn nheo và ñược xáo trộn giữa biểu mô có nhung mao và biểu mô không có nhung mao ñể thuận tiện cho việc tiết dịch và sự vận chuyển qua lông mao (Senger, 2003) [61]

Hình 1.2 Tổ chức cơ quan sinh dục bò cái

“Nguồn: Bai, 2011 [9]”

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 6

Hình 1.3 Cấu trúc ống sinh dục ở bò cái

“Nguồn: http://www.ansci.wisc.edu [77]”

Buồng trứng bò là cơ quan sinh sản của gia súc cái, sản sinh ra tế bào trứng và hormon sinh sản của gia súc cái (estrogen và progestins) Buồng trứng ñược treo ở cạnh trước dây chằng rộng, nằm trong xoang chậu Ở bò chúng ta có thể xác ñịnh ñược bằng tay khi khám qua trực tràng Buồng trứng

có hình ovan dẹt, song hình dáng và kích thước của buồng trứng sẽ bị thay ñổi

và biến dạng do sự phát triển của nang trứng và sự tồn tại của thể vàng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 7

hình phễu) hứng trứng bao quanh buồng trứng Về cơ bản, ống dẫn trứng gồm

3 phần: phần hoa kèn, phần phồng ống và phần eo ống (Ellington, 1991) [19]

Trong in vivo, sự thụ tinh xảy ra ở 1/3 phía trên của ống dẫn trứng Vị

trí thụ tinh này nằm ở chỗ nối giữa eo ống-phồng ống của ống dẫn trứng Ngoài các quá trình bẩm sinh, sự nhu ñộng của nhung mao phồng ống, sự thay ñổi kích thước của ống dẫn trứng, sự mát xoa của các cơ ống dẫn trứng,

và việc bổ sung một lớp glycoprotein ñược phủ bằng vật liệu ñặc biệt cho ống dẫn trứng tạo ñiều kiện cho việc thụ tinh ñược thành công (Hunter, 2003) [30]

Về mặt mô học, cũng như tất cả các ống khác của tổ chức sinh dục, ống dẫn trứng cũng bao gồm màng thanh dịch ngoài, lớp cơ, lớp dưới niêm mạc

và lớp niêm mạc (Senger, 2003) [61] Lớp niêm mạc bao gồm một lớp ñơn các biểu mô hình trụ gồm có cả các nhung mao và các tế bào kích thích bài tiết Các nhung mao hiện diện trong toàn bộ ống dẫn trứng nhưng số lượng tế bào có nhung mao tăng một cách ñột ngột về phía tua buồng trứng Cùng thời ñiểm ñó, những cơ trơn vòng phía trong của lớp cơ trở nên mỏng hơn và hầu hết không xuất hiện ở miệng phễu của phần hoa kèn Những phần của ống dẫn trứng dường như ñảm nhiệm các chức năng riêng liên quan ñến sự di chuyển của tinh trùng, sự rụng trứng, sự vận chuyển, sự thụ tinh và vận chuyển phôi giai ñoạn sớm ñến tử cung (Rodriguez-Martinez, 2007) [56]

Hình 1.5 Vị trí ống dẫn trứng bò

“Nguồn: Avilés và cs, 2010 [8]”

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 8

Hình 1.6 Cấu tạo ống dẫn trứng

“Nguồn: Hunter, 2003 [30]”

1.1.3 Lớp biểu mô tế bào ống dẫn trứng

Lớp biểu mô của ống dẫn trứng có dạng hình trụ ñơn giản và bao gồm

2 loại tế bào: tế bào có nhung mao và tế bào không nhung mao Việc có mặt của tế bào không nhung mao xen kẽ với tế bào có nhung mao giúp cho sự nhu ñộng dễ dàng và kích thích bài tiết (Senger, 2003 [61]) Giống như tất cả các

tế bào ñộng vật, những tế bào này ñược giới hạn với bên ngoài bởi lớp màng huyết tương và có các ñặc ñiểm như ñặc ñiểm chung của tế bào ñộng vật (Bai, 2011) [9]

Các tế bào biểu mô là các tế bào phân cực bởi vì màng huyết tương ñã ñược cơ cấu vào trong 2 vùng riêng biệt: vùng ñỉnh và vùng ñáy-bên (Alberts, 2008) [5] Mặt của vùng ñỉnh ở phía trong lòng ống dẫn trứng có chức năng chuyên dụng như là nhung mao có mặt ở các tế bào có nhung mao Trong khi

ñó, vùng ñáy-bên kiểm soát sự nghỉ của tế bào Những vùng này ñược phân tách bởi một ñai nối chặt Những vùng này có rất nhiều protein khác nhau hợp thành, và ñây là mục tiêu của các dạng khác nhau của bộ máy golgi Lớp biểu

mô ñược ñỡ trên một lớp lưới ngoại bào gọi là phiến mỏng cơ sở (lớp màng nền) Các tế bào liền kề ñược liên kết với nhau và ñược neo giữ trên lớp màng nền bởi một vài dạng tế bào nối (Bai, 2011) [9]

ðai nối chặt, ñược biết ñến như một nút nối, là một trong bốn dạng nối

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 9

có mặt ở tế bào biểu mô Dạng nối này giúp ñóng các vùng ñỉnh và giúp ngăn ngừa các phân tử lọt qua biểu mô theo lỗ chân lông giữa các tế bào Chúng cũng có chức năng như là một “hàng rào” phân tử, giúp ngăn ngừa sự khuếch tán các protein giữa vùng ñỉnh và vùng ñáy-bên của tế bào biểu mô, ñể duy trì

sự khác nhau mật ñộ protein giữa các vùng này (Lodish, 2008) [38]

Có sự tồn tại của 3 dạng nối neo giữ tế bào-tế bào Thể liên kết nối là vị trí neo giữ những sợi nhỏ trung gian của một tế bào với tế bào tiếp theo ñược phát hiện dưới ñai nối chặt Cả 3 dạng nối này, ñược biết như vùng nối bám chặt giữa tế bào với mạng lưới ngoại bào (bán liên kết), neo giữ các tế bào với mạng lưới phía dưới Chúng thể hiện một quy luật chủ yếu ñể giữ các tế bào với nhau và truyền sự áp lực dịch chuyển ngang qua toàn bộ khối biểu mô (Lodish, 2008) [38] Vùng nối dạng kênh, ñược biết ñến như là vùng nối hở, cho phép sự lan truyền các phân tử nước hòa tan giữa các tế bào liền kề (Bai, 2011) [9]

Hình 1.7 Tế bào biểu mô (A) và các vùng nối liên kết trong tế bào biểu mô

ống dẫn trứng (B)

“Nguồn: Alberts, 2008 [5]”

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 10

1.2 Kỹ thuật nuôi cấy in vitro tế bào ñộng vật có vú

1.2.1 ðặc ñiểm của tế bào ñộng vật

Tất cả các tế bào ñều có chung cấu trúc cơ bản gồm màng (membrain), nguyên sinh chất (protoplasm), nhân (nucleus) và các bào quan (organelle) Trong nuôi cấy in vitro, tế bào ñộng vật nhìn chung có các ñặc ñiểm sau:

- Tính cơ học yếu: tế bào ñộng vật không có vách, nhưng kích thước khá lớn (khoảng 10 µm) nên tính bền cơ học yếu Do ñó, tế bào ñộng vật

trong in vitro rất dễ vỡ bởi các lực tác ñộng khi khuấy trộn ñể tách tế bào,

thao tác… Thời gian tiến hành các thao tác với tế bào ñộng vật nên cố gắng sao cho ngắn nhất Trong bảo quản, di chuyển các mẫu tế bào cũng cần thật nhẹ nhàng

- Tăng trưởng và phân chia chậm: thời gian tăng gấp ñôi số lượng của tế bào ñộng vật trong ñiều kiện sinh lý là 20-40 giờ Hiệu suất sản sinh các chất

có hoạt tính sinh học của tế bào ñộng vật rất thấp và chậm Do ñó cần có thời gian dài và khối lượng tế bào lớn khi muốn sản xuất các chất có hoạt tính từ tế bào ñộng vật

- Cơ chế kìm hãm ngược (negative feed-back): cơ chế ức chế sự tổng hợp và tiết ra ngoài môi trường của một chất nào ñó, sẽ ñược thực hiện bởi chính sự gia tăng nồng ñộ của chất này trong môi trường Do ñó, việc thay mới môi trường sau một thời gian nuôi cấy nhất ñịnh là rất cần thiết, nhằm tránh sự hoạt ñộng của cơ chế kìm hãm ngược nói trên Trong phòng thí nghiệm, cơ chế kìm hãm ngược còn có thể gây tổn thương tế bào, thậm chí làm chết hàng loạt

- Tính chất cần giá ñỡ: trừ tế bào máu và một số giai ñoạn của tế bào sinh dục, hầu hết các mô và tế bào ñộng vật cần bám vào giá ñỡ ñể có thể sống và phân chia Thông thường tế bào tăng trưởng tốt khi gắn vào bề mặt rắn Tế bào sẽ ngừng phân chia khi ñã hình thành lớp ñơn liên tục trên bề mặt

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 11

của dụng cụ nuôi

- Thay ñổi kiểu gen và kiểu hình: các tế bào ñộng vật có thể thay ñổi kiểu gen và kiểu hình, thông qua quá trình dung hợp hai tế bào có nhân khác nhau tạo thành tế bào lai (hybridoma) hoặc quá trình biến nạp (ví dụ: chủng tế bào bình thường có thể ñược cảm ứng thành tế bào có các tính chất của tế bào ung thư, thông qua quá trình biến nạp ñược thực hiện bởi một virus cảm ứng ung thư hoặc bằng hóa chất)

- Có thể ñược bảo quản lâu dài bằng phương pháp lạnh sâu: các dòng tế bào ñộng vật có thể ñược bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng (-196ºC) suốt nhiều năm Khi ñược giải ñông và hoạt hóa, tế bào phục hồi khả năng tăng trưởng và phân chia như ban ñầu

- Ngoài các ñặc ñiểm trên, tế bào ñộng vật còn có các ñặc ñiểm khác như kém thích nghi với môi trường, nhạy cảm với ion kim loại và ña số tế bào ñộng vật cần huyết thanh, hormon…ñể tăng trưởng và phân chia

1.2.2 Nuôi cấy tế bào ñộng vật

1.2.2.1 Những khác biệt chính của tế bào trong ñiều kiện in vitro so với in- vivo

Có nhiều khác biệt về tập tính giữa tế bào nuôi cấy và tế bào cùng loại trong cơ thể, do chúng chuyển từ sự kết hợp theo dạng không gian ba chiều sang mặt phẳng hai chiều Không còn ñặc tính tương tác tế bào chuyên biệt của mô, vì khi dòng tế bào hình thành, nó có thể hiện diện chỉ một, hay hai

dạng tế bào nên nhiều tương tác ña chiều bị mất ñi

Môi trường nuôi cấy cũng thường thiếu vài thành phần liên quan ñến sự ñiều hòa in vivo, như các chất dẫn truyền thần kinh và hệ nội tiết Thiếu sự

kiểm soát này, chuyển hóa của tế bào trong ñiều kiện in vitro ổn ñịnh và dễ kiểm soát hơn trong in vivo, nhưng có thể không thực sự ñại diện cho mô, nơi

mà các tế bào này ñược tách ra Từ thực tế này, người ta ñã ñưa các hormon

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 12

khác nhau vào môi trường nuôi cấy và ñây là một phương hướng sẽ ñược tiếp tục nghiên cứu

Có nhiều hình thức nuôi cấy khác nhau tùy ñặc tính của tế bào, hay tùy thuộc vào phương pháp: nuôi cấy sơ cấp (primary culture), nuôi cấy thứ cấp (secondary culture), nuôi cấy huyền phù (suspension culture) và nuôi cấy lớp ñơn (monolayer culture)

1.2.2.2 Nuôi cấy sơ cấp

Nuôi cấy sơ cấp là phương pháp sử dụng các tế bào sau khi ñược tách

từ các mảnh mô và trước lần cấy chuyển ñầu tiên Quy trình ñược tiến hành bắt ñầu từ việc thu nhận các mảnh sinh phẩm, các mảnh mô sống Sau ñó, các mảnh mô ñược xử lý sơ bộ ñể loại bỏ vi khuẩn, nấm cũng như các thành phần không mong muốn khác Tiếp theo, chúng ñược tách ñể tạo huyền phù tế bào ñơn trước khi nuôi cấy

Nói chung, nuôi cấy sơ cấp thường ñược sử dụng ñể khai thác các tế bào ban ñầu trong những mảnh mô, nhằm tạo ra các dòng tế bào mới

Hình 1.8 Nuôi cấy sơ cấp

“Nguồn: http://microb-virology.blogspot.com [80]”

1.2.2.3 Nuôi cấy thứ cấp

Nuôi cấy thứ cấp ñược tiến hành sau khi tế bào ñược tạo dòng từ nuôi

sơ cấp Nhiều dòng tế bào ñã ñược thiết lập và thương mại hóa Phần lớn các

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 13

dòng này ñược thu nhận từ khối u (ví dụ tế bào Hela, RD…) hay từ các tế bào

bị biến ñổi in vitro Các tế bào nuôi cấy thứ cấp là ñối tượng chính cho các

nghiên cứu cũng như ứng dụng của công nghệ tế bào ñộng vật

Hình 1.9 Nuôi cấy thứ cấp

“Nguồn: http://microb-virology.blogspot.com [80]”

1.2.2.4 Nuôi cấy huyền phù

Nuôi cấy huyền phù thường ñược tiến hành với các tế bào thu nhận từ máu (bạch cầu…) Có thể coi ñây là phương pháp nuôi cấy trong không gian

ba chiều với kỹ thuật nhân sinh khối bằng fermenter, thông qua hệ thống bioreactor, nhằm thu nhận một lượng lớn các tế bào mong muốn

1.2.2.5 Nuôi cấy lớp ñơn

Nuôi cấy lớp ñơn ñược ứng dụng với những dòng tế bào khác thu nhận

từ các mô rắn (phổi, thận, cơ, xương, mỡ…) cần nuôi phát triển thành lớp ñơn Các dòng tế bào bám dính có thể ñược phân loại như tế bào nội mô: BAE-1; tế bào biểu mô: Hela; mô thần kinh: SH-SY5y hay fibroblast: MRC-

5 Thông thường, hình dạng in vitro của các tế bào sống nói trên luôn phản

ánh nguồn gốc của mô

Ngoài ra, một số dòng tế bào khi nuôi sẽ biểu hiện trạng thái bán bám dính (semi-adheret) như B95-8 Khi ñó, trong dụng cụ nuôi sẽ xuất hiện hỗn hợp hai quần thể tế bào: các tế bào bám và các tế bào huyền phù

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 14

1.2.3 Môi trường nuôi cấy tế bào ñộng vật

 Một trong những yếu tố quyết ñịnh sự thành công của nuôi cấy tế bào

in vitro là thành phần thích hợp của môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy phải ñảm bảo các tiêu chuẩn sau:

- Môi trường phải có ñầy ñủ các chất dinh dưỡng của tế bào;

- Phải duy trì pH của môi trường từ 7,0-7,4 (cần có dung dịch ñệm thích hợp);

- Môi trường phải là ñẳng trương với tế bào chất của tế bào;

- Môi trường phải vô trùng

 Môi trường nuôi cấy cơ bản là một dung dịch muối cân bằng có chức năng cung cấp:

- Các ion vô cơ cần thiết;

- Có ñộ thẩm thấu chuẩn xác;

- Có ñộ pH thích hợp;

- Có nguồn cung cấp năng lượng ở dạng glucose;

- Có chất chỉ thị ño pH – phenol red

 Mặc dù tế bào có thể tồn tại một số giờ trong môi trường muối cân bằng, nhưng ñể chúng có thể phân chia cần bổ sung thêm nhiều thành phần Các chất thường phải bổ sung là các acid amin (Arginin, Cystein, Glutamin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Metionin, Phenylalanin, Treonin, Tryptophan, Tyrosin, Valin); các vitamin (canxi panthotenat, Cholin clorit, acid Folic, Inositol, acid Nicotinic, Pyridoxin, Riboflavin, Thiamin) Chất ñệm thường dùng cho dung dịch nuôi cấy là Bicarbonat natri

 Ngoài các acid amin và vitamin cần bổ sung vào môi trường một lượng huyết thanh chiếm tỉ lệ 5-10% Trong huyết thanh có một số thành phần như globulin, hormon…có hiệu quả rõ rệt trong việc gắn và kích thích sự phân chia tế bào giúp tế bào sinh trưởng và phân chia tốt hơn Nguồn huyết

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 15

thanh dùng trong nuôi cấy mô tế bào ñộng vật tốt nhất từ các thể phôi thai hơn

là từ ñộng vật trưởng thành

Bảng 1.1 Một số loại môi trường phổ biến trong nuôi cấy tế bào ñộng vật

“Nguồn: Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2006 [3]”

BME (Bassal Medium

Eagle)

Là môi trường cơ bản do H Eagle thiết lập, khi dùng phải bổ sung 5-10% huyết thanh và amino acid, vitamin với chủng loại và số lượng tùy loại tế bào Môi trường này thường

sử dụng cho nuôi cấy tế bào Hela, tế bào L

E’MEM (Eagle Medium

Essential Medium)

Còn gọi là môi trường tối thiểu, do H Eagle thiết lập ðây là môi trường BME có chứa nồng ñộ cao các amino acid và vitamin, cũng cần bổ sung 5-10% huyết thanh khi nuôi cấy

tế bào

D’MEM (Dullbecco’s

Modified Eagle Medium)

Là môi trường E’MEM do Dullbecco cải tiến, với thành phần một số amino acid cao gấp 2 lần và một số vitamin cao gấp 4 lần, so với nhiều môi trường khác ñể nuôi ñược nhiều loại tế bào hơn

F10, F12

Là môi trường do R.G Ham thiết lập dùng cho nguyên bào sợi, trong môi trường này huyết thanh thường ñược thay bằng 20 µg/ml albumin huyết thanh hoặc bằng 3x10-7 M linoleic acid

5A Là môi trường do T.A Mc.Coy thiết lập,

ñược dùng cho tế bào bệnh bạch huyết

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 16

RPMI – 1640

Là môi trường do G.E Moore thiết lập tại Viện nghiên cứu Roswell Part Memorial Institute, dùng ñể nuôi tế bào và mô bạch huyết

TCM 199

Là môi trường do R.C Parker thiết lập dùng

ñể nuôi tế bào mô cơ phôi gà trong sản xuất vắc xin phòng bệnh bại liệt ðến nay, môi trường này ñược dùng là môi trường tổng hợp

ñể nuôi phôi, tế bào trong IVF

Việc nuôi cấy tế bào thì phải tiến hành thay môi trường 2 ñến 3 ngày một lần, tránh ñể tình trạng cạn kiệt các chất dinh dưỡng làm ñổi màu môi trường do thay ñổi pH sẽ gây chết tế bào Chất dinh dưỡng giữ vai trò tối cần thiết trong nuôi cấy tế bào, chúng là nhân tố quyết ñịnh thất bại hay thành

công sự phát triển của tế bào in vitro

1.2.4 Kiểm soát nhiễm trong nuôi cấy tế bào

Một vấn ñề khi nuôi cấy tế bào ñộng vật in vitro ñều phải ñối mặt là

hiện tượng nhiễm (contamination)

1.2.4.1 Phát hiện nhiễm

Các tác nhân nhiễm phổ biến thường ñược nhận biết một cách dễ dàng, chúng có thể có hình sợi, hình cầu Một số giống như nấm mốc, có thể quan sát chúng ngay khi không dùng kính hiển vi Vi khuẩn hay nấm men tương ñối nhỏ, quan sát chúng cần dùng kính hiển vi Khi chúng phát triển nhiều trong môi trường sẽ làm môi trường ñục và có tính acid cao bởi sản phẩm chuyển hóa của chúng Do ñó bất kì ñĩa nuôi cấy nào có vẻ ñục hay có các quả cầu, các dây…trong môi trường phải nhanh chóng lấy chúng ra khỏi tủ

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 17

nuôi và quan sát Chú ý không mở nắp ñĩa nuôi tránh phát tán trong không khí, nhiễm cho các ñĩa khác

Nếu sau khi kiểm tra khẳng ñịnh mẫu bị nhiễm, hãy cách ly các ñĩa nuôi ñó và khử trùng Sát trùng kính hiển vi, vị trí ñặt ñĩa nuôi, tay, các dụng

cụ khác bằng cồn 70º

Một tác nhân nhiễm cần chú ý trong nuôi cấy tế bào ñộng vật in vitro

ñó là Mycoplasma Chúng phát triển khá chậm so với vi khuẩn và nấm men, nhưng không phá hủy trực tiếp hay tức thời các tế bào Chúng làm thay ñổi chức năng và làm chuyển hóa tế bào, gây sai hỏng nhiễm sắc thể, ảnh hưởng ñến tính kháng nguyên bề mặt, can thiệp vào trong sự tổng hợp acid nucleic, nhìn chung làm thay ñổi tập tính của tế bào

Mycoplasma quá nhỏ ñể có thể thấy trực tiếp, trừ khi ñánh dấu huỳnh quang và sử dụng kính hiển vi ñiện tử ðây là một nhóm vi khuẩn không có thành tế bào mà chỉ có màng nguyên sinh chất Mycoplasma có cả trong cơ thể vật nuôi, chúng tồn tại song song với tế bào Mycoplasma có thể sinh trưởng và phát triển trên môi trường nhân tạo không có tế bào Cùng với khả năng gây bệnh trên người và ñộng thực vật, mycoplasma còn có mặt trong các chế phẩm sinh học như vắc xin, môi trường nuôi cấy tế bào và gây ra những khó khăn rất lớn trong nghiên cứu cũng như trong công nghệ sinh học sử dụng tế bào nuôi cấy

1.2.4.2 Ngăn ngừa nhiễm

- Phòng thí nghiệm phải ñược lau chùi sạch sẽ, bố trí trang thiết bị hợp

lý, ngăn nắp; mặc áo blouse, găng tay, tất chân ñể hạn chế tối ña các bề mặt của cơ thể tiếp xúc với không khí;

- Phải rửa tay hay thay găng tay liên tục sau mỗi lần thao tác;

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 18

- Các bề mặt nuôi cấy, buồng thao tác, kính hiển vi, tủ nuôi và những bề mặt thao tác khác phải ñược lau chùi ñịnh kì bằng cồn hay các tác nhân diệt khuẩn khác;

- Bên trong tủ lạnh phải luôn sạch sẽ, gọn gàng Không giữ, chứa các ống nghiệm chai lọ trong một thời gian dài Mở nắp chai lọ phải ñúng cách ñúng chỗ;

- Các bồn nước là một nguồn chính của nhiễm Nếu nước ñược sử dụng chứa các tác nhân nhiễm khuẩn nên thay ñổi thường xuyên;

- Tủ ấm vừa là nơi có ñiều kiện tối ưu cho các tác nhân gây nhiễm phát triển Nước tạo ẩm cho tủ phải ñược vô trùng và nên chứa một số tác nhân khử trùng bền;

- Các mâm hay khay trong tủ ấm ñược mang ra ngoài phải ñược khử trùng và giữ trong không gian sạch sẽ cho ñến khi sử dụng;

- Lau chùi sạch sẽ, hấp khử trùng ngay khi thấy các vật dụng nuôi cấy

có chứa các dấu hiệu của nhiễm vi khuẩn hay nấm mốc

1.2.4.3 Loại bỏ nhiễm trong nuôi cấy

Cách tốt nhất ñể loại bỏ nhiễm trong nuôi cấy là bỏ ñi các ñĩa, vật dụng

ñã nhiễm Thậm chí, khi cần thiết sẵn sàng hủy bỏ cả những mẫu thí nghiệm Khi ñó các nguồn tế bào ñông lạnh hay các nơi cung cấp hoặc các dòng tế bào phân lập phải ñược xử lý lại bằng các chất kháng khuẩn và nấm trước khi quyết ñịnh tái sử dụng

Sau khi xử lý, các tế bào nên ñược tái thiết lập dòng bằng phương pháp pha loãng tới hạn Bằng cách này, ngay khi các tế bào còn nhiễm những tác nhân nhiễm ở nồng ñộ quá thấp thì vẫn có thể tìm thấy những giếng chỉ chứa các tế bào (không có tác nhân nhiễm) Sau ñó chúng ñược nuôi và cấy chuyển trong môi trường không có kháng sinh Sau 2 ñến 3 thế hệ, các dòng nên ñược

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 19

thu nhận lại và kiễm tra nhiễm một lần nữa ðiều này rất quan trọng, ñặt biệt với các tác nhân nhiễm khó phát hiện như mycoplasma

1.3 Kỹ thuật ñông lạnh tế bào ñộng vật

cần sử dụng

1.3.2 Mục ñích của kỹ thuật ñông lạnh

- Giảm thiểu sự biến ñổi kiểu gen, biểu hiện gen, ñảm bảo ổn ñịnh di truyền;

- Ngăn ngừa sự lão hoá tế bào;

- Ngăn cản quá trình biệt hoá tế bào;

- Giảm rủi ro nhiễm vi khuẩn và sự chết tế bào;

- Giảm sự nhiễm chéo giữa các dòng tế bào khác nhau trong in vitro;

- Giảm rủi ro biến ñổi cấu trúc và sự thay ñổi hình thái;

- Giảm chi phí nuôi cấy;

- Thuận lợi cho việc phân loại, tạo dòng;

- Thuận lợi cho việc bảo tồn gen;

- Thuận lợi cho vận chuyển;

- Thuận lợi cho việc thương mại hoá;

- Giảm thiểu các thao tác, nuôi cấy không cần thiết nhiều dòng tế bào cùng một lúc, cùng một nơi, tiết kiệm thời gian và công sức

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 20

1.3.3 Các biến ựổi của tế bào trong bảo quản bằng phương pháp ựông lạnh

1.3.3.1 Sự hình thành tinh thể nước ựá

Bên trong tế bào chứa hơn 80% là nước, nồng ựộ này cao hơn bên ngoài Tinh thể ựá chỉ tạo thành tự nhiên ở nhiệt ựộ -10ỨC Trong quá trình ựóng băng, những tinh thể nước ựá ựược tạo thành ựầu tiên ở môi trường bên ngoài tế bào, ựồng thời với nồng ựộ chất hoà tan tăng lên nhanh chóng đáp lại với sự tăng áp suất thẩm thấu này, nước sẽ ựi ra ngoài tế bào, làm dung tắch tế bào bị giảm Sự tạo ựá càng tăng khi nhiệt ựộ càng giảm Những tinh thể nước hình thành bên trong cũng như sát bên ngoài tế bào có khả năng gây tổn thương cơ học lên màng tế bào và các bào quan

Sự hoạt ựộng phối hợp của 4 yếu tố sau ựây quyết ựịnh hình dạng tinh thể nước ựá ựược tạo thành trong quá trình ựông lạnh:

- Nhiệt ựộ ở thời ựiểm biến ựổi giai ựoạn;

- Tốc ựộ làm lạnh;

- Thành phần các chất hòa tan trong dung dịch;

- Nồng ựộ dung dịch

1.3.3.2 độ thẩm thấu của môi trường ựông lạnh

Số lượng phân tử nước có ở dạng dung dịch giảm xuống cùng với nhiệt

ựộ, kết quả trực tiếp là giảm ựộ thẩm thấu của môi trường, môi trường trở nên

ưu trương

Làm lạnh ở nhiệt ựộ xấp xỉ 0ỨC làm giảm sự khuếch tán một chiều của protein màng Ở những nhiệt ựộ thấp hơn, màng tế bào hướng về nồng ựộ muối cao, nhất là trong quá trình ựông lạnh chậm Màng tế bào bị sốc thẩm thấu cùng với sự co thể tắch trong quá trình mất nước Sau ựó, màng tế bào giãn ra, nồng ựộ các ion tăng lên, vì vậy, tế bào trở nên rất nhạy cảm với các stress trong quá trình ựông lạnh khi nhiệt ựộ giảm hoặc khi pha loãng môi trường trong quá trình giải ựông

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 21

1.3.3.3 Tốc ñộ khử nước

Tốc ñộ mất nước của tế bào phụ thuộc vào nhiều yếu tố Các yếu tố này thay ñổi khác nhau tùy theo từng loại tế bào và ñóng vai trò quyết ñịnh trong việc xác ñịnh quá trình bảo quản ñông lạnh ở ñiều kiện tốt nhất Các yếu tố liên quan là tính thấm nước của màng tế bào (Lp), năng lượng hoạt hóa của tính thấm nước (dH*) và tỉ lệ diện tích bề mặt/thể tích của tế bào (SA/V) Diện tích bề mặt càng lớn, tỉ lệ SA/V càng cao thì tính thấm của màng tế bào (Lp) càng lớn và tế bào sẽ khử nước nhanh hơn

Năng lượng hoạt hóa của tính thấm nước (dH*) bằng thực nghiệm ño ñược là 14,5 Kcal/mol Giá trị này tương ñối cao và nói chung, nhiệt ñộ cứ hạ 10ºC thì tốc ñộ khử nước sẽ giảm một nửa

1.3.3.4 Sự giảm thể tích thực của tế bào

Sự thay ñổi thể tích tế bào có thể ño ñược ñể biểu thị quá trình khử nước Quá trình khử nước phụ thuộc vào tính thấm nước màng tế bào (Lp) và năng lượng hoạt hóa tính thấm nước (dH*) của tế bào Dựa trên cơ sở tính toán, phạm vi thể tích giảm có thể xác ñịnh ñược ở các tốc ñộ làm lạnh khác nhau Vì vậy, ở tốc ñộ làm lạnh cao, tế bào không bị mất nước nhiều, và thể tích tế bào không giảm nhiều như ở tốc ñộ làm lạnh thấp

1.3.3.5 Sự giảm tốc ñộ hoạt ñộng của enzym

Nghiên cứu cho thấy khi nhiệt ñộ giảm từ 37ºC xuống còn 7ºC, hoạt ñộng của enzym giảm 8 lần Tốc ñộ phản ứng enzym phụ thuộc vào năng lượng hoạt hóa của các phân tử phản ứng Từ 20ºC, tốc ñộ phản ứng enzym giảm theo nhiệt ñộ một cách ổn ñịnh theo trình tự 2-3 lần với mỗi khoảng giảm 10ºC (Q10) Tuy nhiên, trong một số trường hợp, khi hạ nhiệt ñộ thì sự thay ñổi tốc ñộ phản ứng enzym (ở nhiệt ñộ tương ứng) không còn rõ rệt, dẫn ñến sự biến ñổi cấu trúc và hoạt ñộng của các protein Các chất bảo quản ñông lạnh có thể ñề phòng sự biến ñổi này

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 22

1.3.3.6 ðộ pH của dung dịch

Trong quá trình ñông lạnh, ñộ pH của dung dịch tăng theo sự giảm nhiệt ñộ, sự cân bằng acid - base của môi trường biến ñổi như sau: lực ion tăng lên, sự kết tủa của các hợp chất như các protein hòa tan trong môi trường trở nên dễ dàng Các chất bảo quản ñông lạnh có thể biến ñổi cân bằng acid - base của dung dịch, chẳng hạn như glycerol và các glycol hoạt ñộng như những base yếu, ester hoạt ñộng như base mạnh (DMSO chẳng hạn) Sự biến ñổi ñộ pH của dung dịch theo nhiệt ñộ sẽ khác nhau theo loại chất bảo quản ñược sử dụng

1.3.3.7 Sự hình thành bọt khí

Tế bào có thể chết theo nhiều cách khác nhau do sự hình thành ñá Hơn nữa, tinh thể nước ñá tạo ra các lỗ gây rò rỉ và thể tích nước bị ñông lạnh tăng lên (tỉ trọng của ñá thấp hơn tỉ trọng của nước) Do ñó, bọt khí có thể ñược hình thành khi giải ñông tế bào

Bên cạnh các khí hoà tan theo nồng ñộ, môi trường nuôi cấy tế bào thường dùng CO2 làm hệ ñệm ñể cân bằng ñộ pH trong môi trường Khi làm lạnh, các khí này không còn ở dạng hoà tan nữa mà tách ra thành những bọt khí có khả năng gây hại tế bào Trong quá trình giải ñông, trong vài phút, bọt khí phát triển thành không bào lớn bên trong tế bào, làm tế bào phình to Trong thực tế, bọt khí hình thành rất nhanh, dẫn ñến vỡ tế bào Sự hình thành khí xảy ra nhiều khi sử dụng môi trường ñông lạnh có chứa bicarbonat

1.3.4 Chất bảo quản ñông lạnh

1.3.4.1 Khái niệm

Chất bảo quản ñông lạnh là những chất tan ñược trong nước, có khả năng tạo liên kết hydro với phân tử nước và có khả năng xâm nhập vào bên trong tế bào

Tác dụng của chất bảo quản ñông lạnh bao gồm: thâm nhập và thay chỗ

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 23

cho nước bên trong tế bào; giảm hình thành tinh thể nước ñá bên trong tế bào; giảm tổn thương gây nên do tinh thể nước ñá; hạn chế sự gia tăng nồng ñộ của các chất hoà tan; liên kết với phân tử nước trên màng bào tương ñể bảo vệ cho

tế bào

1.3.4.2 ðặc tính của chất bảo quản ñông lạnh

Chất bảo quản ñông lạnh có thể thấm qua màng tế bào một cách bị ñộng; có khả năng hoạt ñộng thay thế nước; chỉ ñộc với tế bào ở nồng ñộ cao

Hình 1.10 Sự biến ñổi vật lý của tế bào khi ñông lạnh

A Không có chất bảo quản lạnh; B Có chất bảo quản lạnh

“Nguồn: http://www.alcor.org [76]”

1.3.4.3 Chất bảo quản ñông lạnh và thiết bị dùng trong ñông lạnh

Các loại chất bảo quản ñông lạnh thường ñược sử dụng trong trữ tế bào: Glycerol; DMSO (Dimethyl Sulfoxide); 1,2-Propanodiol (Propylene Glycol);

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 24

1,2-Ethalnediol (Ethylene Glycol)

Thiết bị trữ lạnh là những bình chứa nitơ lỏng ñược thiết kế ñặc biệt: bình này ñược gắn nhôm, cô lập hoàn toàn với bên ngoài; cổ bình thường ñược làm bằng nhựa tổng hợp; bình chịu nhiệt và rất rắn chắc

Hình 1.11 Sự phân bố nhiệt ñộ trong bình nitơ lỏng

“Nguồn: Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2006 [3]”

Hai dạng ống ñông lạnh thường ñược sử dụng ñể trữ mẫu: ống ñông lạnh thủy tinh ñược ñóng kín bằng nhiệt (heat-sealable glass ampule) và ống ñông lạnh nhựa có nắp vặn xoắn ốc (thường ñược làm bằng polypropylene) Cũng có thể sử dụng cọng rạ nhựa ñể trữ mẫu phôi và tế bào trong ñông lạnh

1.3.5 Quy trình thu nhận tế bào ñể ñông lạnh

Quy trình thu nhận tế bào khác nhau ñối với các loại tế bào khác nhau, thông thường ñược chia thành hai loại: tế bào bám dính và tế bào không bám dính (tế bào huyền phù) Cụ thể như sau:

Quy trình thu nhận tế bào bám dính: Loại môi trường cũ bằng cách hút

bỏ  Rửa ñĩa tế bào bằng PBS vài lần  Tách toàn bộ tế bào khỏi ñĩa nuôi bằng dung dịch trypsin Sau ñó, bổ sung chất ức chế protease ñể làm ngừng hoạt ñộng của Trypsin  Ly tâm thu cặn tế bào và loại bỏ Trypsin, chất ức chế protease  Rửa tế bào bằng PBS vài lần  Xác ñịnh số lượng tế bào sống  Huyền phù cặn tế bào vào môi trường ñông lạnh  Phân phối dịch tế

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 25

bào vào các ống ựông lạnh  Chuyển các ống ựông lạnh vào thiết bị làm lạnh (tùy theo phương pháp ựông lạnh)

Quy trình thu nhận tế bào huyền phù: Ly tâm thu cặn tế bào và loại bỏ môi trường cũ  Rửa tế bào bằng PBS vài lần  Xác ựịnh số lượng tế bào sống  Huyền phù cặn tế bào vào môi trường ựông lạnh  Phân phối dịch tế bào vào các ống ựông lạnh  Chuyển các ống ựông lạnh vào thiết bị làm lạnh (tùy theo phương pháp ựông lạnh)

1.3.6 Các phương pháp ựông lạnh

Dựa trên nguyên tắc ựông lạnh, người ta ựã thành công trong việc bảo

quản các tế bào sống bằng bốn phương pháp sau ựây:

1.3.6.1 đông lạnh chậm theo chương trình và giải ựông nhanh

đây là quy trình ựông lạnh ựược cải biến và áp dụng từ các nghiên cứu trên phôi và giao tử của người và ựộng vật để tiến hành phương pháp này, phòng thắ nghiệm cần phải ựược trang bị máy làm lạnh theo chương hoá (Programming freezer) Các tube chứa tế bào ựông lạnh trong môi trường thắch hợp ựược ựặt trong buồng làm lạnh, nhiệt ựộ sẽ ựược giảm theo chương trình cài ựặt trước

Hệ thống làm lạnh sẽ sử dụng hơi lạnh từ nitơ lỏng hay ựiện Thông thường, máy làm lạnh này sẽ ựưa mẫu về nhiệt ựộ -80ỨC, sau ựó, mẫu sẽ ựược ựặt vào bình nitơ lỏng Sau khi ựông lạnh, mẫu tế bào chứa trong tube (hay cọng rạ) ựược giải ựông nhanh bằng cách cho vào nước ấm 37ỨC

Sự thành công của ựông lạnh chậm phụ thuộc vào việc ựạt ựược cân bằng tối ưu giữa tốc ựộ nước tách khỏi tế bào và tốc ựộ nước biến ựổi thành

ựá

1.3.6.2 đông lạnh nhanh (3 bước) và giải ựông nhanh

Phương pháp này tiến hành bằng cách ựặt các ống mẫu tế bào (trong môi trường bảo quản lạnh) vào trong tủ lạnh 4ỨC, sau ựó ựặt tiếp vào tủ -20ỨC,

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 26

rồi -80ỨC; cuối cùng ựặt mẫu vào bình chứa nitơ lỏng

Một biến tấu khác cũng hiệu quả của kỹ thuật này là các mẫu ựược ựặt trong một hộp có vách dày cách nhiệt tốt; sau ựó ựặt hộp này vào tủ ựông -80ỨC Nhờ vào lớp dày của hộp cách nhiệt, nhiệt ựộ ựược truyền vào trong tube mẫu chậm dần đặt hộp trong tủ ựông qua ựêm, các ống mẫu ựược ựặt vào bình chứa nitơ lỏng

1.3.6.3 đông lạnh cực nhanh (thủy tinh hoá)

Phương pháp này tiến hành bằng cách ựặt mẫu chứa tế bào trong môi trường ựông lạnh vào trong bình chứa nitơ lỏng đây là kỹ thuật mới, tận dụng hiện tượng ựông ựặc của nước khi giảm nhiệt ựộ thật nhanh Người ta ựặt tế bào vào trong môi trường có áp suất thẩm thấu cao (4000 mOSm)

Với ựiều kiện áp suất thẩm thấu này, sự khử nước sẽ xảy ra rất nhanh, sau ựó tế bào ựược ựặt thẳng vào trong bình chứa nitơ lỏng Khi ựó nước không chuyển thành nước ựá (ice) thông qua sự kết tinh (crystallization), mà chuyển thành dạng kắnh hay thủy tinh (glass) Ở dạng thủy tinh, phân tử nước (cũng như các chất hoà tan khác) ựược giữ nguyên vị trắ

Phương pháp thủy tinh hoá ựặc biệt ựược sử dụng ựể ựông lạnh tổ chức

và cơ quan Phương pháp này ựã ựược áp dụng thành công trong việc bảo quản ựông lạnh mô tụy ựảo Langerhans và giác mạc của người hay của ựộng vật

1.3.6.4 đông lạnh in situ

Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng, có thể ựông lạnh tế bào ở trạng thái

mà chúng ựang phát triển trong dụng cụ nuôi (ựông lạnh in situ) Chẳng hạn

có thể ựông lạnh thành công khi thay flask ựang nuôi tế bào (tế bào bám dắnh) bằng môi trường ựông lạnh; sau ựó ựặt flask vào trong hộp xốp cách nhiệt và ựặt vào tủ ựông -80ỨC Với cách bảo quản này, các tế bào có thể sống từ 2-3 tháng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 27

1.4 Kỹ thuật giải ñông tế bào ñộng vật

Các ống ñông lạnh ñược giải ñông nhanh trong ñiều kiện nhiệt ñộ 37ºC Sau khi loại bỏ dung dịch bảo quản lạnh, tế bào ñược huyền phù vào môi trường nuôi mới Thao tác loại bỏ chất bảo quản ñông lạnh ñược thực hiện nhanh và nhẹ nhàng nhằm tránh làm tổn thương tế bào Việc bổ sung nhanh một lượng lớn môi trường mới có thể gây sốc thẩm thấu cho tế bào

Các kỹ thuật ñược thực hiện tùy theo loại chất bảo quản ñông lạnh và ñặc tính của tế bào Phần lớn dịch tế bào giải ñông ñược nuôi ngay vào bình flask và môi trường có chứa chất bảo quản ñông lạnh ñược thay sau khi tế bào

ñã bám vào bề mặt nuôi cấy và tiếp tục thay mỗi 6-8 giờ sau ñó cho ñến khi chất bảo quản ñông lạnh ñược pha loãng ñến mức thấp nhất

ðối với tế bào nhạy cảm với chất bảo quản ñông lạnh, việc loại bỏ hoàn toàn chất này trước khi tái nuôi cấy là rất cần thiết Dịch tế bào sau khi tan ñông ñược bổ sung thêm môi trường mới, hỗn hợp này ñược ly tâm ñể thu cặn

tế bào Môi trường mới ñược thêm vào và số lượng tế bào sống, chết ñược ñếm ñể xác ñịnh hiệu quả ñông lạnh ðồng thời, tế bào ñược ñem nuôi cấy

1.5 Phân lập, nhân nuôi in vitro và bảo quản lạnh tế bào biểu mô ống dẫn

trứng

1.5.1 Lược sử nghiên cứu

Các nghiên cứu tại nhiều nước trong thập kỷ 60 và 70 (thế kỷ XX) cho

thấy các phôi bò và cừu ñược tạo ra trong cơ thể (in vivo), sau ñó thu lấy và

ñem nuôi in vitro thì chúng rất khó có khả năng phát triển vượt qua giai ñoạn 8-16 tế bào Do vậy, các nhà nghiên cứu ñã rất nỗ lực trong việc làm giàu, bổ sung nhiều chất khác nhau vào môi trường nuôi phôi cổ ñiển ñể cải thiện tình hình trên Tuy nhiên kết quả ñạt ñược là không khả quan

Sang ñến thập niên 80 (thế kỷ XX), với sự phát hiện vai trò của tế bào

biểu mô ống dẫn trứng trong nuôi phôi in vitro, tình hình trên ñã ñược cải