Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh Proteaza từ tôm nguyên liệu và ứng dụng trong khử protein trong sản xuất chitin

Nghiên cứu thu nhận chế phẩm proteaza có hoạt ñộ cao từ vi sinh vật và ứng dụng vào lĩnh vực sản xuất thực phẩm nhằm nâng cao năng suất, chất lượng, hiệu quả ñã và ñang ñược các nhà khoa

Sự biết ơn sâu sắc nhất em xin gửi tới TS.Nguyễn Minh Trí – người có những ñịnh hướng ñúng ñắn và tận tình hướng dẫn, giúp ñỡ, ñộng viên em ðồng thời, thầy cũng là người ñóng góp nhiều ý kiến thiết thực, quý báu trong suốt thời gian em làm ñề tài

Em cũng xin cảm ơn các thầy cô quản lý phòng thí nghiệm Vi Sinh – Hóa Sinh – Phân tích kiểm nghiệm ñã giúp ñỡ và tạo ñiều kiện thuận lợi cho em trong thời gian thực hiện ñề tài

Xin cảm ơn tất cả những người bạn ñã luôn ở bên cạnh, quan tâm, an ủi, ñộng viên tôi trong suốt thời gian qua

Cuối cùng, con xin kính gửi tới bố mẹ của con và gia ñình lòng biết ơn sâu sắc Cám ơn mọi người ñã cổ vũ, ñộng viên con trong những năm qua

Nha Trang, tháng 6 năm 2009

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Thu

MỤC LỤC

PHẦN 1: TỔNG QUAN 3

1.1.1.2 Công nghệ sản xuất enzyme trên thế giới 3

1.1.2 Tổng quan về enzyme Proteaza 4

1.1.2.1 Giới thiệu chung 4

1.1.2.2 Phân loại Proteaza 5

1.1.3 Nguồn thu nhận enzym proteaza .7

1.1.4 Những yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza từ vi sinh vật 11

1.1.5 Những nghiên cứu về Proteaza 15

1.1.6 Ứng dụng của enzym Proteaza 21

1.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình thủy phân protein bằng enzym 23

1.2 TÌM HIỂU VỀ NGUỒN PHẾ LIỆU TÔM 27

1.2.1 Sản lượng phế liệu tôm .27

1.2.2 Thành phần, tính chất phế liệu tôm 28

1.2.3 Biện pháp sử dụng phế liệu tôm 29

1.3 TÌM HIỂU VỀ CHITIN, ỨNG DỤNG CỦA CHITIN. 32

1.3.1 Tìm hiểu về chitin 32

PHẦN 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 37

2.1.1 Môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp Proteaza 37

2.1.2 Nguyên liệu tôm 37

2.1.3 Nguyên liệu casein 37

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 38

2.2.1 Phương pháp xác ñịnh thành phần hóa học của nguyên liệu 38

2.2.2 Phương pháp phân tích vi sinh vật 38

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .38

2.3.1 Sơ ñồ nội dung nghiên cứu 38

3.2 Xác ñịnh hoạt ñộ proteaza của chủng vi sinh vật sinh proteaza phân lập

ñược. 47

KẾT LUẬN VÀ ðỀ XUẤT Ý KIẾN 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC 57

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.3: Kết quả hàm lượng ñạm NNH3 của chủng P2 trong 3 lần xác ñịnh 48

Bảng 3.4: Kết quả hàm lượng ñạm NNH3 của chủng P3 trong 3 lần xác ñịnh 48

Bảng 3.5: Kết quả hàm lượng ñạm NF của chủng P1 qua 3 lần xác ñịnh 48

Bảng 3.6: Kết quả hàm lượng ñạm NF của chủng P2 qua 3 lần xác ñịnh 49

Bảng 3.7: Kết quả hàm lượng ñạm NF của chủng P3 qua 3 lần xác ñịnh 49

Bảng 3.8: Kết quả hàm lượng ñạm Naa của chủng P1 qua 3 lần xác ñịnh 49

Bảng 3.9: Kết quả hàm lượng ñạm Naa của chủng P2 qua 3 lần xác ñịnh 50

Bảng 3.10: Kết quả hàm lượng ñạm Naa của chủng P3 qua 3 lần xác ñịnh 50

Bảng 3.12: So sánh thành phần hóa học ñầu tôm trước và sau khi ép tách 51

Bảng 3.13: Hàm lượng protein tổng số trong nước rửa và còn lại trong vỏ tôm 52

Bảng 3.13: Kết quả phân tích vi sinh .53

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Mô hình enzyme Proteaza thủy phân phân tử Protein 4

Hình 1.2 Cấu trúc không gian enzyme Proteaza 5

Hình 1.3 Sơ ñồ phân loại proteaza 5

Hình 2.1 Nấm mốc .9

Hình 2.2 Xạ khuẩn 10

Sơ ñồ 1.1: Sơ ñồ quá trình sản xuất Chitin 35

Sơ ñồ 2.1: Nội dung nghiên cứu chính 38

Sơ ñồ 2.2: thí nghiệm phân lập chủng vi sinh vật sinh Proteaza từ tôm 39

Sơ ñồ 2.3: thí nghiệm tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh proteaza từ tôm nguyên liệu 40

Sơ ñồ 2.4: thí nghiệm ñịnh danh vi sinh vật 41

Sơ ñồ 2.5:thí nghiệm thu nhận dịch nuôi cáy chứa enzym Proteaza 42

Sơ ñồ 2.6: Thí nghiệm ñánh giá khả năng sinh Proteaza từ các chủng vi khuẩn phân lập ñược 43

Sơ ñồ 2.7:thí nghiệm ứng dụng khả năng khử protein ñầu tôm của dịch nuôi cấy chứa proteaza 44

TÓM TẮT ðỀ TÀI

Nghiên cứu thu nhận chế phẩm proteaza có hoạt ñộ cao từ vi sinh vật và ứng dụng vào lĩnh vực sản xuất thực phẩm nhằm nâng cao năng suất, chất lượng, hiệu quả ñã và ñang ñược các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm Trong thời gian gần ñây, các nhà khoa học Việt Nam thuộc lĩnh vực hóa sinh thực phẩm ñã ñạt ñược những thành tựu ñáng kể trong nghiên cứu thu nhận các chế phẩm proteaza từ thực vật, ñộng vật, vi sinh vật vào chế biến thực phẩm: sản xuất bia, nước chấm, bánh mì, ñồ hộp thịt, cá v.v Tuy nhiên, việc nghiên cứu thu nhận enzym proteaza

từ vi sinh vật và ứng dụng của chúng cần ñược quan tâm hơn Bởi lẽ ñây là một lĩnh vực còn mới và có rất nhiều triển vọng ở nước ta Ứng dụng enzym proteaza vào công nghệ khử protein trong sản xuất Chitin là một hướng quan trọng ñang ñược các nhà khoa học Việt Nam quan tâm nghiên cứu

ðề tài nhằm phân lập chủng vi sinh vật sinh Proteaza từ tôm nguyên liệu và ứng dụng bổ sung dịch chứa enzym thu nhận ñược từ chủng vi sinh vật phân lập ñược trong khử protein trong sản xuất Chitin với phương pháp nuôi cấy trên những môi trường phù hợp và tìm ra chủng vi sinh vật có khả năng sinh Proteaza cao nhất bằng phương pháp ñánh giá sơ bộ như: xác ñịnh ñường kính vòng ly giải protein của vi sinh vật và xác ñịnh hàm lượng ñạm acid amin tạo thành

Kết quả của ñề tài là ñã phân lập, tuyển chọn ñược chủng vi sinh vật

Pseudomonas aeruginosa có khả năng sinh tổng hợp proteaza, có khả năng ñưa vào sản xuất proteaza ñể khử protein trong sản xuất Chitin

LỜI MỞ ðẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme ñược sản xuất càng nhiều và ñược sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm lượng enzyme ñược sản xuất trên thế giới ñạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, ñược phân phối trong các lĩnh vực khác nhau [4]

Phần lớn enzyme ñược sản xuất ở quy mô công nghiệp ñều thuộc loại enzyme ñơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân ñược sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên

Proteaza là enzyme ñược sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (ñông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ sung

ñể làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp…

Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp proteaza ñã cải thiện ñáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm ñược tạo ra nhiều hơn Tuy nhiên, việc nghiên cứu thu nhận proteaza từ vi sinh vật và ứng dụng của chúng cần ñượ quan tâm hơn nữa Mặt khác, giá thành chế phẩm proteaza còn khá cao, do

ñó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất Trong những năm gần ñây, nhờ sự phát triển mạnh mẽ của các ngành khoa học kỹ thuật, ngành Thủy sản ngày càng phát triển không ngừng nhưng ñi cùng với sự phát triển của ngành vấn ñề phế liệu trong chế biến thủy sản là một ñiểm hạn chế do lượng phế thải ra từ công nghiệp chế biến thủy sản hàng năm là rất lớn, ñặc biệt là phế liệu tôm Như chúng ta ñã biết, phế liệu tôm có thể sử dụng ñể sản xuất Chitin – Chitosan mà trong quá trình sản xuất Chitin – Chitosan hiện nay còn sử dụng một lượng hóa chất lớn gây ra tình trạng ô nhiễm môi trường một cách trầm trong Vì lý do này mà tôi

chọn ñề tài: “ Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh Proteaza từ tôm nguyên liệu và ứng dụng trong khử protein trong sản xuất Chitin”.

Nội dung nghiên cứu của ñề tài gồm có:

− Phân lập chủng vi sinh vật sinh Proteaza từ tôm nguyên liệu

− Thu nhận dịch chứa enzym Proteaza từ môi trường nuôi cấy

− Xác ñịnh hoạt ñộ của dịch chứa enzym Proteaza

− Ứng dụng dịch chứa enzym Proteaza trong khử Protein trong sản xuất Chitin

Với sự nỗ lực của bản thân và sự giúp ñỡ của thầy cô, bạn bè và gia ñình ñến nay tôi ñã hoàn thành ñề tài Mặc dù ñã có nhiều cố gắng nhưng vì khả năng có hạn nên không thể tránh ñược những thiếu sót, rất mong ñược sự góp ý, phê bình của quý thầy cô và các bạn

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1.1 TÌM HIỂU VỀ ENZYM PROTEAZA

1.1.1 Tình hình nghiên cứu enzyme

1.1.1.1 Vấn ựề nghiên cứu enzyme ở nước ta

Hầu như mọi phản ứng hoá học trong cơ thể sống ựều cần phải có vai trò xúc tác của enzyme - chất xúc tác sinh học Chắnh vì vậy, các nghiên cứu về enzyme ựã thu hút sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác Các nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có ựộ sạch khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tắnh sinh học của enzyme, khả năng ứng dụng enzyme trong thực tế Nghiên cứu về công nghệ enzyme ựã ựược tiến hành bởi nhiều tác giả như sử dụng phủ tạng của lò mổ ựể sản xuất pancreaza, pepsin, trypsin sử dụng mầm mạ ựể sản xuất amylaza đã có những thử nghiệm công nghệ như sản xuất amino acid từ nhộng tằm bằng proteaza, bột protein thịt bằng bromelain từ ựọt dứa, lên men rượu bằng enzyme cố ựịnh trên cột Cũng ựã có những nghiên cứu sử dụng peroxydaza, cyt-P450 trong chế tạo biosensor và thuốc phát hiện chất ựộc Trong lĩnh vực y dược, việc nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng của một số enzyme nhằm mục ựắch kiến tạo nên một số thuốc dùng ựiều trị một số bệnh ựặc biệt là tạo ra một số chế phẩm thuốc chống suy dinh dưỡng ở trẻ em, ựồng thời ựã tiến hành sản xuất ựại trà đây là một ựóng góp rất thiết thực và kịp thời trong việc phòng chống suy dinh dưỡng ở nước ta

1.1.1.2 Công nghệ sản xuất enzyme trên thế giới

Trong những năm gần ựây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp trên toàn thế giới ựạt khoảng 1 tỷ USD, trong ựó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%), và Proteaza là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (60%) [4]

1.1.2 Tổng quan về enzyme Proteaza

1.1.2.1 Giới thiệu chung

Nhóm enzyme Proteaza (peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit ñến sản phẩm cuối cùng là các axit amin Ngoài ra, nhiều proteaza cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin

Hình 1.1 Mô hình enzyme Proteaza thủy phân phân tử Protein.[17]

Proteaza cần thiết cho các sinh vật sống, rất ña dạng về chức năng từ mức ñộ

tế bào, cơ quan ñến cơ thể nên ñược phân bố rất rộng rãi trên nhiều ñối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) ñến thực vật (ñu ñủ, dứa ) và ñộng vật (gan, dạ dày bê ) So với protease ñộng vật và thực vật, proteaza vi sinh vật có những ñặc ñiểm khác biệt Trước hết hệ proteaza vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể ñồng nhất

Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên proteaza vi sinh vật thường

có tính ñặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt ñể và ña dạng

Hình 1.2 Cấu trúc không gian enzyme Proteaza.[17]

Proteaza (peptidaza) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4)

Exopeptidaza

(E.C 3.4.11-17)

Endopeptidaza (E.C 3.4.21-99)

Proteaza ñược phân chia thành hai loại: endopeptidaza và exopeptidaza.[2]

* Dựa vào vị trí tác ñộng trên mạch polypeptide, exopeptidase ñược phân chia thành hai loại:

+ Aminopeptidaza: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở ñầu N tự do của chuỗi polypeptide ñể giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide

+ Carboxypeptidaza: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở ñầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

* Dựa vào ñộng học của cơ chế xúc tác, endopeptidaza ñược chia thành bốn nhóm:

+ Serin proteinaza: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt ñộng và có vai trò ñặc biệt quan trọng ñối với hoạt ñộng xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme ñộng vật như chymotrypsin, trypsin, elastaza

Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinaza thường hoạt ñộng mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính ñặc hiệu cơ chất tương ñối rộng

+ Cysteine proteinaza: Các proteinaza chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt ñộng Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein ñộng vật và proteinase ký sinh trùng Các cystein proteinase thường hoạt ñộng ở vùng pH trung tính, có tính ñặc hiệu cơ chất rộng

+ Aspartic proteinaza: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinaza có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt ñộng và thường hoạt ñộng mạnh ở pH trung tính

+ Metallo proteinaza: Metallo proteinase là nhóm proteinaza ñược tìm thấy ở

vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinaza

thường hoạt ñộng vùng pH trung tính và hoạt ñộ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

Ngoài ra, proteaza ñược phân loại một cách ñơn giản hơn thành ba nhóm [2]:

Gần ñây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có ñặc tính

renin như ở các loài Eudothia Parasitica và Mucor Purillus

b Nguồn thực vật:[2]

Có 3 loại proteaza thực vật như Bromelain, Papain và Ficin Papain thu ñược

từ nhựa của lá, thân, quả ñu ñủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa,

vỏ dứa (Pineapple plant) Các enzyme này ñược sử dụng ñể chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết tủa protein Những ứng dụng khác của proteaza thực vật này là trong công nghệ làm mềm thịt và trong mục tiêu tiêu hoá Ficin thu ñược từ nhựa cây cọ (Ficus carica) Enzyme ñược sử dụng thuỷ phân protein tự nhiên

c Nguồn vi sinh vật:

Enzyme Proteaza phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm

nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và

một số và một số loại nấm men.[3]

Vi khuẩn

Lượng proteaza sản xuất từ vi khuẩn ñược ước tính vào khoảng 500 tấn,

chiếm 59% lượng enzyme ñược sử dụng [6]

Proteaza của ñộng vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidaza

hoặc exopeptidaza, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do ñó

protease của vi khuẩn có tính ñặc hiệu cơ chất cao Chúng có khả năng phân hủy tới

80% các liên kết peptide trong phân tử protein [6]

Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh proteaza là

Bacillus subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi

Clostridium Trong ñó, B subtilis có khả năng tổng hợp proteaza mạnh nhất

(Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 1998) Các vi khuẩn thường tổng hợp các proteaza hoạt

ñộng thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu

Các proteaza trung tính của vi khuẩn hoạt ñộng ở khoảng pH hẹp (pH= 5÷8)

và có khả năng chịu nhiệt thấp Các proteaza trung tính tạo ra dịch thủy phân

protein thực phẩm ít ñắng hơn so với proteaza ñộng vật và tăng giá trị dinh dưỡng

Các proteaza trung tính có khả năng ái lực cao ñối với các amino acid ưa béo và

thơm Chúng ñược sinh ra nhiều bởi B subtilis, B mesentericus, B

thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium

Proteaza của Bacillus ưa kiềm có ñiểm ñẳng ñiện bằng 11, khối lượng phân tử

từ 20.000-30.000 Ổn ñịnh trong khoảng pH= 6÷12 và hoạt ñộng trong khoảng pH

rộng từ 7-12

Nấm

Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn proteaza ñược ứng

dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A terricola, A fumigatus, A saitoi, Penicillium chysogenum)… Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính Nấm mốc ñen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3

Một số nấm mốc khác như: A candidatus, P cameberti, P roqueforti… cũng

có khả năng tổng hợp proteaza có khả năng ñông tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho mát

Hình 2.2 Xạ khuẩn [18]

Các chế phẩm proteaza từ xạ khuẩn ñược biết nhiều là pronaza (Nhật) ñược

tách chiết từ S grieus, enzyme này có ñặc tính ñặc hiệu rộng, có khả năng thủy

phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid Ở Liên Xô (cũ), người ta cũng tách ñược chế phẩm tương tự từ S grieus có tên là protelin

Từ S fradiae cũng có thể tách chiết ñược keratinaza thủy phân karetin Ở

Mỹ, chế phẩm ñược sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da Protease từ S fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do ñó chúng ñược dùng trong công nghiệp chế biến thịt

Hầu hết các proteaza phân cắt protein ở các liên kết ñặc hiệu, vì thế có thể sử dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp ñể tổng hợp các liên kết peptide ñịnh trước Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm carboxyl hoặc nhóm amine ñược lựa chọn ñể bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm, phản ứng trong hệ hai pha lỏng

Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất ñể sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và ñời sống Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi ích chính như sau:

• Chủ ñộng về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật

• Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16÷ 100 giờ nên có thể thu hoặc nhiều lần quanh năm

• Có thể ñiều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (ñịnh hướng sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi)

• Giá thành tương ñối thấp vì môi trường tương ñối rẻ, ñơn giản, dể tổ chức sản xuất

Tuy nhiên trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh ñộc tố (gây ñộc, gây bệnh) ñể có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp

ðể sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh vật có trong tự nhiên hoặc các giống ñột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng hợp ưu thế một loại enzyme nhất ñịnh cần thiết nào ñó

1.1.4 Những yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza từ

vi sinh vật

a Môi trường nuôi cấy

.Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh

hưởng trực tiếp ñến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật Trong thành phần môi trường phải có ñủ các chất ñảm bảo ñược sự sinh trưởng bình thường của

vi sinh vật và tổng hợp enzyme

ðặc biệt lưu ý là ñể tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng cảm ứng Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất ñó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả của chất kìm hãm nhằm bảo ñảm khả năng sinh tổng hợp enzyme ñã cho không bị cản trở Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp

Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O Ngoài ra các chất vô cơ: Mn,

Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác

A Nguồn cacbon

Thường là hợp chất hữu cơ trong ñó chủ yếu là gluxit, tùy thuộc vào ñặc tính của enzyme và nòi vi sinh vật mà người ta lựa chọn cho thích hợp

Có nhiều chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn cacbon thích hợp ñối với nấm mốc sinh ra enzyme proteaza có hoạt lực cao Các nguồn cacbon có tác dụng ñến sinh tổng hợp proteinase của nấm mốc có thể theo thứ tự:

ðối với Asp flavus 74: fructoza→ glucoza→ sacaroza→ ramnoza→ manoza→ galactoza→ arabinora→ lactoza

ðối với Asp awamori 200: fructoza→ manit→ sacaroza→ arabinoza→ manoza→ galactoza→ lactoza

ðối với Asp oryzae 79: fructoza→ sacaroza→ maltoza→ glucoza→ manit→ arabinoza→ galactoza

Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme

Proteaza Ví dụ: Vi khuẩn Bac Subtilis có khả năng sinh tổng hợp Proteaza ở môi

trường tinh bột >8%

Nhiều xạ khuẩn ưa nhiệt, trong ñó Micromonospora vulgaris 42, mọc tốt và

sinh tổng hợp proteaza cao ở môi trường có tinh bột Tăng nồng ñộ tinh bột từ 0,25- 1,5% sinh khối cũng tăng ñồng thời với hiệu xuất tổng hợp enzyme.Nếu tăng nồng

ñộ tinh bột hơn nữa sẽ không thu ñược kết quả dương tính Tỷ số giữa cacbon và nitơ cần phải là 4: 1 Trên môi trường có maltoza (0,5- 2%) vi sinh vật phát triển bình thường, nhưng tổng hợp proteaza ngoại bào bị ức chế Xạ khuẩn không phát triển ñược ở trên môi trường có các nguồn cacbon duy nhất là sacaroza, lactoza hoặc arabinoza Glucoza, manoza, fructoza, xyloza có trong môi trường (0,2- 5%) làm ức chế sinh trưởng của xạ khuẩn và sinh tổng hợp enzyme

Ngoài ra một số loại hydrocacbon cũng có nguồn cacbon có 125 chủng vi

sinh vật Chẳng hạn chủng Ps Seruginosa có thể ñồng hoá hydrocacbon và có khả

năng sinh tổng hợp proteaza có hoạt lực cao trên môi trường n- parafin với 12, 14

và 16 nguyên tử cacbon, dầu nặng hoặc propylenglycol Chúng không chỉ ñồng hoá ñược cả hydrocacbon béo mà còn ñồng hoá cả hydrocacbon thơm

B Nguồn nito

Nguồn nito sử dụng rất phong phú, bao gồm 2 nhóm: vô cơ và hữu cơ

ðối với một số loài nấm mốc thuộc họ (A oryzae, A awamori, A niger, A

flavus) trên môi trường có các nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp protease axit cao Trên môi trường kzapek NaNO3 ñược thay bằng cả cazein hoạt lực proteaza của nấm mốc ñược tăng lên 3,5 lần, còn khi thay tinh bột bằng glucoza và bổ sung pepton hoạt lực enzyme tăng 6 lần Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy sinh tổng hợp enzyme ñược nâng cao khi trong môi trường có ñồng thời cả nguồn nitơ hữu cơ

và nitơ vô cơ Cho thêm vào môi trường có cám mì, bột ñậu tương ñã tách chất béo, các nguồn nitơ và hữu cơ hoạt lực enzyme proteaza tăng 22- 74% Còn trường hợp dùng các nguồn nitơ vô cơ duy nhất trong môi trường sẽ dẫn ñến ngừng sinh tổng hợp protease nói chung

Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn, trong ñó có B subtilis và B mesentericus,

các hợp chất nitơ vô cơ và hữu cơ ñược dùng phối hợp trong môi trường sẽ tạo ñiều kiện thuận lợi cho sinh tổng hợp protease Trong số các nguồn nitơ vô cơ thì NH4,

H2PO4 là tốt hơn cả Những muối khác NH4Cl, (NH4)2SO4, NH4NO3, NaNO3, KNO3, Ca(NO3)2 làm giảm hoạt lực proteaza tới 30- 50% , còn amylaza giảm 7- 10 lần Còn trong môi trường chỉ có nguồn nitơ hữu cơ hoạt lực proteaza và amylaza cũng thấp hơn trong môi trường ñối chứng (NH4)2HPO4 và nước chiết ñậu tương

ðối với xạ khuẩn ưa nhiệt Actynomyces Vulgaris U2 thì pepton là chất cảm

ứng ñể sinh tổng hợp enzyme protease là tốt nhất

Các axit amin có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme bằng vi sinh vật Glyxin, alanin, metionin và lơxin có tác dụng làm tăng hoạt lực protease của chủng ñột biến A oryzae 251- 90 ñến 6- 9% và nguyên chủng A oryzae 132- 63 tới 7- 24% Nhiều axit amin có tác dụng ức chế ñến sinh tổng hợp enzyme, Valin, axit glutamic, izolơxin và valin ức chế tổng hợp enzyme ở B megaterium 60% Còn ñối

với B subtilis các axit amin ức chế trong quá trình này là glyxin, metionin, axit

glutamic, alanin, lơxin,…

Ngoài ra, các bazơ purin như A (adenin), G (guanin) và các dẫn xuất của chúng, ARN và các sản phẩm thuỷ phân cũng làm tăng ñáng kể sinh tổng hợp proteinza vi sinh vật

C Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố (chất) kích thích sinh trưởng

Muối khoáng rất cần thiết cho hoạt ñộng vi sinh vật

Ion Mg2+ có tác dụng sinh tổng hợp và ổn ñịnh các enzyme có hoạt tính ở nhiệt ñộ cao

ðộ thông khí cũng rất cần thiết cho việc sinh tổng hợp enzyme Vì vậy ở môi trường bề mặt người ta thường thêm chất xốp như trấu vào, còn ở môi trường bề sâu (môi trường dịch thể) , thì người ta thường lắc (nếu enzyme cần lắc thì việc này cực

kỳ quan trọng) ðộ ẩm cũng rất quan trọng (chỉ có tác dụng ở nuôi cấy bề mặt), phụ thuộc vào thành phần môi trường bề mặt

Khi lựa chọn môi trường cần chú ý ñến cả thành phần ñịnh tính và ñịnh lượng sao cho quá trình sinh tổng hợp enzyme mong muốn là cao nhất Muốn vậy người ta có thể sử dụng một số phương pháp:

Phương pháp tối ưu hóa quy hoạch thực nghiệm toàn phần

Phương pháp toán học mô hình hóa thực nghiêm

Có thể chia làm 2 loại: môi trường tổng hợp và môi trường tự nhiên

Môi trường tổng hợp: là môi trường bao gồm các chất với liều lượng xác ñịnh (qua tìm hiểu, nghiên cứu), chẳng hạn nguồn cacbon có thể là tinh bột, xenluloza, ñường, axit, rượu, nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ Loại môi trường này ñược sử dụng cho mục ñích nghiên cứu

Môi trường tự nhiên: thường dùng các loại phế liệu, nguyên liệu có chứa các nguồn cacbon, nitơ, khoáng, các yếu tố sinh tổng hợp trưởng Mặt khác, các nguyên liệu này có sẵn, rẻ tiền nên ñược sử dụng rất nhiều trong công nghiệp sản xuất các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật Các nguyên liệu ñể chuẩn bị làm môi trường tự nhiên bao gồm: cám và bột hạt cốc, nước chiết ngô, dịch ép hoa quả, rau, khô dầu, bã rượu, rĩ ñường, sản phẩm phân huỷ nấm, men bia, trấu, lõi ngô Khi lựa chọn sử dụng môi trường cần chú ý ñến các chất có tác dụng ñiều hoà sinh tổng hợp enzyme, ñặc biệt các chất cảm ứng

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng ñối với môi trường nuôi cấy Nhiệt ñộ nuôi cấy thông thường từ 25 - 300C Trị số pH ban ñầu của môi trường (chủ yếu ở môi trường nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào ñó ñến sự tạo thành enzyme, nhưng khi ñó cũng cần tính ñến khả năng biến ñổi nhanh chóng chỉ số ñó bởi vi sinh vật

b Chất cảm ứng

ðặc biệt lưu ý là ñể tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng cảm ứng Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất ñó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả của chất kìm hãm nhằm bảo ñảm khả năng sinh tổng hợp enzyme ñã cho không bị cản trở Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp

c ðiều kiện nuôi cấy

ðây cũng là một trong nhữn yếu tố ảnh hưởng lớn ñên sự sinh trưởng của vi sinh vật Mỗi loài vi sinh vật thích ứng với một ñiều kiện nuôi cấy nhất ñịnh Bởi ñiều kiện nuôi cấy bao gồm: nhiệt ñộ, ñộ ẩm,… chỉ phù hợp với những loài cụ thể Nếu ñiều kiện nuôi cấy không phù hợp, trường hợp nuôi cấy không thực hiện ñược các yêu cầu vô trùng thì vi sinh vật ñược nuôi cấy trong ñiều kiện ñó rất dễ bị nhiễm khuẩn Như vậy việc sinh trưởng và sinh tổng hợp của enzym ñều bị ảnh hưởng

1.1.5 Những nghiên cứu về Proteaza

Các proteaza ( peptít – hydrolaza ) xúc tác cho quá trình thuỷ phân liên kết peptít ( -CO – NH -) trong phân tử protein

Proteaza ñã ñược nghiên cứu từ lâu trên thế giới, trong ñó proteaza của hệ tiêu hoá ñược nghiên cứu sớm hơn cả Ngay từ cuối thế kỷ 18 ñầu thế kỷ 19 ñã tách ñược chế phẩm pepsin từ dịch vị dạ dày, tripsin từ dịch tụy tạng của ñộng vật ăn thịt [7]

Những dẫn liệu khoa học gần ñây cho biết trong ñộng vật thuỷ sản có ñầy ñủ các laọi proteaza như pepsin, tripsin, chathepsin, erepsin v.v…chúng có tính ñặc

hiệu rộng rãi và ñóng vai trò rất quan trọng trong chể biến và bảo quản các sản phẩm từ thuý sản, như sản xuất nước mắm, bột cá…[8]

Các proteaza của thực vật ñược phát hiện muộn hơn Cuối thế kỷ 19, ñầu thế

kỷ 20, các nhà khoa học mới tách ñược papain từ nhựa ñu ñủ (carica papaya), bromelin trong các phần khác nhau của cây dứa, ureaza từ ñậu tương, v.v…[13] Proteaza của vi sinh vật mới ñược nghiên cứu nhiều từ năm 1950 Tuy nhiên

số công trình nghiên cứu về proteaza của vi sinh vật tăng lên rất nhiều so với các công trình nghiên cứu proteaza của ñộng vật và thực vật.[7]

Những kết quả ñạt ñược trong lĩnh vực nghiên cứu poteaza vi sinh vật ñã góp phần mở rộng quy mô sản xuất các chế phẩm enzym và ứng dụng enzym trong nhiều lĩnh vực của ñời sống kinh tế – xã hội Phần lớn proteaza ñược sản xuất nhờ qúa trình nghiên cưú vi sinh vật ở qui mô công nghiệp.hiện nay hàng năm trên thế giới sản xuất khoảng 600 tấn proteaza tinh khiết từ vi sinh vật: trong ñó khoảng

500 tấn từ vi khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc.[9]

Nhịp ñộ sản xuất enzym ở qui mô công nghiệp tại các nước phát triển tăng trung bình hàng năm từ 5% ÷÷ 15%, và doanh thu từ sản xuấ enzym hang năm ở các nước này khoảng 1,5 tỷ USD.[12]

Những nước có sông nghệ sản xuất và ứng dụng proteaza tiên tiến trên thế giới hiện nay là: Nhật Bản, Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan Trung Quốc, ðan Mạch, ðức,

Ao Các nước này ñã ñầu tư thích ñáng cho công tác nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng chế phẩm proteaza của vi sinh vật – nguồn nguyên liêu rất dồi dào ñể sản xuất enzym nói chung và proteaza nói riêng

Trong thời gian gần ñây, các nhà khoa học trên thế giới ñã ñạt ñược những thành tựu to lớn trong linh vực nghiên cứu về proteaza của vi sinh vật

Một nhóm các nhà khoa học của trường ñại học nông nghiệp Tokyo, Nhật Bản ñã tách ñược enzym X-prolyl ñipeptiyl-aminopeptitdaza từ môi trường nuôi

cấy rắn A.oryzae enzym này ñược tinh chế bằng phương pháp ñiện di trên gen

polyacrylamit (PAGE – PolyAcrylamide Gel Electrophorasis ) ở pH = 9,4 và ở ñiểm ñẳng ñiện Bằng phương pháp lọc gel ñã xác ñinh ñược phân tử lượng của

enzym này là 280.000 ñơn vị Kết quả nghiên cứu cho thấy, enzym này do hai tiểu phần ñồng nhất hợp thành, ñiểm ñẳng ñiện pH = 4,2 và bị ức chế bởi hợp chất diisopropylphosphorofluorit

Một loại proteaza trung tính của A.ozyrae cũng ñã ñược nghiên cứu bởi các

nhà khoa học Nhật Bản, cho thấy ñó là một proteaza – kẽm có 3 liên kết disulfua nội phân tử Enzym này gần như không bền sau 10 phút ở nhiệt ñộ 750C, nhưng ñộ bền nhiệt lai ñựoc phục hồi ở nhiệt ñộ trên 750C cho ñến 1000C Các nghiên cứu tiếp theo ñã giải thích rằng enzym này có tính thuận nghịch trong khoảng nhiệt ñộ

từ 750C cho ñến 1000C Tính thuận nghịch này do các liên kết disulfua trong phân

tử enzym quyết ñịnh

Amyloprotooryzin ñược sản xuất từ chủng A.oryzae 387 là một phức hệ các

enzym và có hoạt tính thuỷ phân protein Amyloprotooryzin làm tăng hàm lượng của các axít amin lên khoảng 108% ÷ 227% tuỳ thuộc vào cơ chất sử dụng.phức hợp enzym này dã xác ñịnh gồm: proteaza, -amylaza, exo-ß-glucanaza, và xylaza, chúng có hoạt tính thuỷ phân protein mạnh nhất ở pH = 4 ÷ 5,5

ðể làm tăng ñộ bền nhiệt của proteaza kiềm từ A.oryzae, các nhà khoa học Nhật Bản ñã nghiên cứu ñưa vào cấu trúc enzym này một liên kết disulfua bằng phương pháp ñột biến gel Kết quả cho thấy, ñối với enzym ban ñầu có hoạt tính mạnh nhất ở 510C, khi làm ñột biên gel ở ñoạn Cys-200 thì hoạt tính của enzym này mạnh nhất ở 560C

Klaus Prommer cho biết các loại proteaza kiềm ñược ứng dụng nhiều trong sản xuất bột giặt vì có những tính chất sau: Bền vững ở nhiệt ñộ cao; Bễn vững trong môi trường kiềm (pH = 9 ÷ 11); Và bền vững khi kết hợp với các yếu tố tạo phức Tuy nhiên các proteaza kiềm không bền với các chất hoạt ñộng bề mặt Các chủng vi sinh vật thường dùng ñể sản xuất proteaza kiềm là vi khuẩn Bacillus như:

B.licheniormic , B.amiloliquefaciens, B.fermus, B.megatetericum, các chủng nấm mốc A.oryzae, A.niger, A.sojae Chế phẩm subtilisin BPN và subtilisin NOVO sản xuất từ vi khuẩn B.amiloliquefaciens có chứa seirin ở trung tâm hoạt ñộng của

phân tử và bị ức chế bởi EDTA (Ethyl – Diamin – Tetraaxetic – Axít), nhưng không bị ức chế bởi DFP ( Diisopropyl – Fluoro – Phosphat).các proteaza trung tính ñược sản xuất từ các chủng vi sinh vật B.subtilic, B.cereus, B.megaterium, Pseudomonas aerugenas, các chủng nấm mốc A.oryzae, A.sojae và Pericularia oryzae Các proteaza trung tính kém bền hơn, cần Ca++ ñể ổn ñịnh và cần Zn++ ñể hoạt hoá Mất hoạt tính nhanh khi tăng nhiệt ñộ và do tác ñộng của proteaza kiềm,

vì vậy chúng ñược sử dụng hạn chế, chủ yếu trong công nghiệp thuộc da và sản xuất bánh mì Các proteaza axít ñược sản xuất từ các chủng nấm mốc Aspergillus, có pH tối ưu từ 2 ÷ 3 Hầu hết ñược sử dụng ñể thuỷ phân gluten trong bánh mì và sản xuất pho-mát

Trong thời gian gần ñây, người ta ñã nghiên cứu ñược các phương pháp thích hợp ñể thu nhận ñược chế phẩm proteaza không tan – proteaza ñược cố ñịnh trên các chất mang như xelluloza, polyacrylamit, agaroza, axít alginic, DAEA- Xelluloza, DAEA- Sephadex Nhờ những kết quả này mà có thể tái sử dụng enzym nhiều lần ñể sản xuất các sản phẩm một cách liên tục và tựu ñộng hoá quá trình sản xuất sản phẩm, do ñó giảm ñược giá thành sản phẩm

Ơ nước ta, những nghiên cứu về enzym nói chung và proteaza nói riêng ñã thu hút ñược sự quan tâm ñông ñảo của các nhà khoa học thuộc lĩnh vực hoá sinh học và vi sinh vật học Các nghiên cứu tập trung theo các hướng: tách, tinh chế enzym từ các cơ quan nội tạng ñộng vật và các mô thực vật, tạo các sản phẩm có ñộ sạch khác nhau Nghiên cứu cấu trúc, tính chất của proteaza, sự liên quan giữa cấu trúc với hoạt tính sinh học của chúng và khả năng ứng dụng proteaza vào các lĩnh vực khác nhau Có thể thấy rõ qua một số công trình nghiên cứu ñã ñược công bố Phan Thị Chân Trâu, và cộng sự (1987), ñã nghiên cứu thành phần và một số tính chất của chế phẩm bromelain tách từ chồi ngọn dứa tây Kết quả nghiên cứu cho thấy bromelain thuộc nhóm proteaza – xystein, có nghĩa là trung tâm hoạt ñộng của nó có chứa nhóm thiol (-SH) Các số liệu thí nghiện còn cho thấy hoạt tính thuy phân của chế phẩm bromelain ñược gia tăng rõ rệt khi có mặt xystein 1.10-2 M và

EDTA 4.10-3 M, ngược lại các hoá chất chứa kim loại nặng như HgCl2 lại có tác dụng ức chế hoạt tính cực ñại trong khoảng nhiệt ñộ từ 500C ÷ 600C, pH thích hợp của chế phẩm khi sử dụng cơ chất cazein là 8,0 ÷ 8,5, còn ñối với azocazein thì dao ñộng trong khoảng 6÷9 Như vậy khả năng thuỷ phân protein của chế phẩm này cũng khác nhau.[11]

Năm 1992, Nguyễn Thị Vĩnh và các cộng sự ñã nghiên cứu một số tính chất của proteinaza của dịch chiết từ thịt rắn hổ mang ?(Naja – Naja).kết quả cho thấy proteinaza P-I có pH tối ưu bàng 7,0, bị kìm hãm dưới tác dụng của EDTA nhưng

có thể phục hồi ñến 71% ( So với lúc chưa xử lý EDTA) dươi tác dụng của Zn++ và

Ca++ Ca++ cũng có khả năng hoạt hoá enzym nhưng ở mức ñọp thấp hơn, như vậy P-I là protea kim loại P-II chiếm 70% hoạt ñộ của dịch chiết P-II ñã ñược tinh sach qua cột SE – Sephadex G-50, ñạt ñộ dồng nhất khi ñiêm di trên gel polyacrylamit có hoạt ñộ riêng gấp 135 lần so với dịch chiết PH tối ưu của P-II vào khoảng 6 Hoạt

ñộ P-II tăng lên dưới tác dụng ñồng thời của xystein và EDTA, mức ñộ hoạt hoá enzyme lớn hơn khi mỗi thứ tác dụng riêng rẽ P-II bị kìm hãm dưới dụng của KCN, H2O2,Hg, Cd++, Zn++ ,Pb++, Cu++, Ba++ Như vậy P-II có nhiều tính chất của proteinaza- thiol.[10]

Phạm Thị Trân Châu và cộng sự (1993), ñã nghiên cứu tính chất proteaza của ñầu tôm biển, cho biết ñầu tôm biển có chứa 2 loại proteaza khác nhau, ký hiệu

là P-I và P-II Khối kượng phân tử của P-II nhỏ hơn P-I hoạt ñộ proteolitic của dịch chiết ñầu tôm ñạt cực ñai ở pH =7,5 và ở nhiệt ñộ bằng 650C ðối với chế phẩm thô thì pH tối ưu bằng 8,5 và nhiệt ñộ tối ưu là 550C xystein –iot và các ion hoá tri 2 như: Ba++, Cu++, Pb++, Ca++, Fe++, Mg++, Cd++, Zn++, Mn++,Hg++ ở nồng ñộ 10-3 M làm giảm hoạt ñộ proteolitic của dịch chiết và chế phẩm thô.[13]

Nguồn enzym proteaza của ñông vật thuỷ sản nói chung và của tôm nói riêng mới ñược nghiên cứu trong khoảng 40 năm trở lại ñây và còn rất ít Các kết quả nghiên cứu cho thấy trong thuỷ sản gồm có các proteaza quan trọng như: pepsin, tripsin, chimotripsin, cathepsin v.v… Các enzym này có tính ñặc hiệu rộng rãi,

chúng không chỉ thuỷ phân liên kết peptít mà còn có thể thuỷ phân cả liên kết este, liên kết amit, và có thể xúc tác cho phản ứng chuyển vị gốc amin Tuy vậy các enzym này khác nhau về một số khả năng và tính chất tác dụng trên protein Một ñặc ñiểm quan trọng nữa là ñộng vật thuỷ sản hầu hết là loài máu lạnh, do ñó ñể duy trì sự sống cần có hệ emzym tương ñối mạnh, hay nói cách khác là hệ enzym proteaza trong ñộng vật thuỷ sản có hoạt tính khá mạnh.[13]

Nguyễn Thị Ngọc Dao, và các cộng sự (1994) nghiên cứu tác dụng thuỷ phân một số loại protein của hỗn hợp enzym trong nhựa ñu ñủ, so sánh với hệ proteaza khác Kết quả cho thấy chế phẩm papain tươi và ñong khô của Việt Nam

có hoạt tính cao hơn từ 2 3 lần so với chế phẩm latex thương mại ñược sấy khô trong hệ ß-alanin co pH = 4,3 cho thấy các chế phẩm trên có thành phần tương tự nhau, gồm 5 tiểu phần trong ñó 1 tiểu phần là papain, 3 tiểu phần là chimopapain,

và 1 tiểu phần là peptidaza

Chế phẩm papain ñược thu nhận từ nhựa ñu ñủ ñã ñược sử dụng tại Việt Nam Các kết quả nghiên cứu của một số nhà khoa học cho thấy các loại enzym có hoạt tính proteaza chứa trong chế phẩm nhựa ñu ñủ (latex) gồm có:

Theo ñánh giá của các nhà khoa học, ở Việt Nam tuy ñã có một số công trình thu nhận proteaza từ vi sinh vật nhưng chưa ñủ khả năng sản xuất các chế phẩm proteaza từ nguồn này Do ñó chủ yếu nguồn proteaza thu nhận ñược từ các cơ quan nội tạng và mô thực vật

Lê ðức Mạnh, và cộng sự (1996) ñã công bố công trình nghiên cứu thu nhận

và bảo quản proteaza từ chế phẩm lên men bề mặt của vi khuẩn Bacillus subtilis Kết quả nghiên cứu cho thấy dùng dung dịch ñệm phosphat co pH = 6,4 với tỷ lệ chế phẩm thô/dung dịch = ¼ là tốt nhất Chế phẩm proteaza bán tinh khiết thu ñược

có nhiệt ñộ thích hợp trong khoảng 480C ÷520C, pH thích hợp trong khoảng 6,4 ÷ 7,0 Ở nhiệt ñộ 500C hoạt ñộ proteaza không giảm sau 6 giờ Chế ñộ bảo quản tốt nhất với môi trường C6H5ONa, ở nhiệt ñộ 50C ÷ 60C

Qua các dẫn liệu ñã nêu ở trên ta thấy rằng proteaza ñược chú ý nghiên cứu

từ rất lâu, tuy nhiên các công trình nghiên cứu chỉ tập trung vào các proteaza cuả ñộng vật và thực vật còn proteaza từ vi sinh vật thì mới ñược nghiên cứu gần ñây ðiều này chỉ cho ta rằng cần chú ý hơn nữa về

Proteaza ñược sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp… Trong công nghiệp chế biến thịt, proteaza ñược dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một ñộ mềm thích hợp và có vị tốt hơn Protease ñược sử dụng ñể làm mềm thịt và tăng hương vị thịt (ngâm thịt vào dinh dưỡng protease ở pH và nhiệt ñộ xác ñịnh- phương pháp này phổ biến và thuận lợi nhất; Tẩm hỗn hợp làm mềm thịt (enzyme, muối, bột ngọt) Tiêm dung dịch enzyme vào thịt; tiêm dung dịch enzyme vào con vật trước khi giết

mổ) Sử dụng proteaza ñể sản xuất dịch ñạm: từ Streptomyces fradiae tách ñược chế

phẩm keratineza thuỷ phân ñược keratin rất có giá trị ñể sản xuất dịch ñạm từ da, lông vũ Nếu dùng axit ñể thuỷ phân sẽ mất ñi hoàn toàn các axit amin chứa lưu huỳnh, nếu dùng kiềm ñể thuỷ phân sẽ bị raxemic hoá (chuyển dạng L sang D làm

giảm giá trị sinh học của axit amin) ðể thuỷ phân sâu sắc và triệt ñể protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền ñạm y tế) cần dùng các proteaza có tính ñặc hiệu cao và tác dụng rộng, muốn vậy người ta thường dùng phối hợp cả 3 loại protease của 3 loài: vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỷ lệ tổng cộng 1- 2% khối lượng protein cần thuỷ phân Ưu ñiểm của việc thuỷ phân proteaza bởi enzyme là bảo toàn ñược vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ phân

Trong chế biến thuỷ sản: Khi sản xuất nước mắm (và một số loài mắm) thường thời gian chế biến thường là dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (ñộ ñạm) lại phụ thuộc rất nhiều ñịa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá Nên hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày ñã ñược hoàn thiện trong ñó sử dụng chế phẩm enzyme thực vật (bromelain và papain) và vi sinh vật ñể rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm Tuy nhiên vẫn còn một số tồn tại cần phải hoàn thiện thêm về công nghệ

Trong công nghiệp sữa, proteaza ñược dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt

tính làm ñông tụ sữa của chúng Proteaza từ một số vi sinh vật như A candidus, P roquerti, B mesentericus,… ñược dùng trong sản xuất pho mát Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy proteaza làm giảm thời gian trộn, tăng ñộ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo ñộ xốp và nở tốt hơn

Trong sản xuất bia, chế phẩm proteaza có ý nghĩa quan trọng trong việc làm

tăng ñộ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc Proteaza của A oryzae ñược dùng ñể

thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo ñiều kiện xử lý bia tốt hơn

Trong công nghiệp da, proteaza ñược sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng Kết quả ñã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có ñộ mềm dẻo nhất ñịnh, tính chất ñó ñược hoàn thiện hơn sau khi thuộc da Trước ñây, ñể làm mềm da người ta dùng protease ñược phân lập từ cơ quan tiêu hóa của ñộng vật Hiện nay,

việc ñưa các protease tách từ vi khuẩn (B mesentericus, B subtilis), nấm mốc (A

oryzae, A flavus ) và xạ khuẩn (S fradiae, S griseus, S rimosus ) vào công nghiệp

thuộc da ñã ñem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng

Trong công nghiêp dệt: Proteinaza vi sinh vật ñược sử dụng ñể làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo ñược bằng các dung dịch cazein, gelatin) ñể sợi ñược ñược bóng, dể nhuộm Proteaza có tác dụng thủy phân lớp protein serisin

ñã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do ñó làm giảm lượng hoá chất ñể tẩy trắng

Ngoài ra, proteaza còn ñược ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác như:

- ðiều chế dịch ñạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng

- Proteaza của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có ñộ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm

- Sản xuất keo ñộng vật, chất giặt tổng hợp ñể giặt tẩy các chất bẩn protein, sản xuất mỹ phẩm,…

1.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình thủy phân protein bằng enzym

Khi nồng ñộ enzym thấp, lượng cơ chất lớn, vận tốc phản ứng thủy phân phụ thuộc tuyến tính vào nồng ñộ enzym Khi nồng ñộ enzym tăng thì vận tốc tăng Khi nồng ñộ enzym bão hòa với nồng ñộ cơ chất thì nồng ñộ enzym tăng vận tốc phản ứng thủy phân rất ít thay ñổi

Khi lượng cơ chất ít, nếu tăng nồng ñộ cơ chất, tốc ñộ phản ứng thủy phân tăng nhưng không tăng vô hạn mà khi nồng ñộ cơ chất tăng quá giới hạn cho phép, vận tốc phản ứng enzym có thể giảm

Với từng enzym nồng ñộ tới hạn của cơ chất cũng như với từng cơ chất, nồng ñộ tới hạn của từng enzym phụ thuộc vào ñiều kiện của quá trình thủy phân Chính vì vậy, với từng enzym khi dùng ñể thủy phân một cơ chất cụ thể, trong những ñiều kiện cụ thể, cần nghiên cứu ñể xác ñịnh nồng ñọ tới hạn của enzym

Enzym có bản chất protein nên kém bền với nhiệt, chúng chỉ có tác dụng xúc tác trong một khoảng nhiệt ñộ thấp hơn nhiệt ñộ làm chúng bị biến tính Trong khoảng nhiệt ñộ ñó, khi tăng nhiệt ñộ, tốc ñộ phản ứng thủy phân tăng Ảnh hưởng của nhiệt ñộ (trong khoảng giới hạn nhiệt ñộ giới hạn biến tính) ñến tốc ñộ phản ứng thủy phân bằng enzym ñược ñặc trưng bằng hệ số:

Với k t: hằng số tốc ñộ phản ứng tại nhiệt ñộ t

Với k t+10: hằng số tốc dộ phản ứng tại nhiệt ñộ cao hơn 100C

Người ta ñã xác ñịnh ñược hệ số Q10 của các loại enzym trong cơ thể cá trong khoảng 2 ÷ 3, cá biệt có thể ñến 7 như phản ứng thủy phân hemoglobin trong máu cá

Vùng nhiệt ñộ tạo cho enzym có hoạt ñộ cao nhất gọi là vùng nhiệt ñộ thích hợp của enzym, trong ñó có một giá trị nhiệt ñộ mà ở ñó hoạt ñộ của enzym ñạt cực ñại gọi là nhiệt ñộ tối thích Với ña số enzym, vùng nhiệt ñộ thích hợp là 40 ÷ 500C Nhiệt ñộ làm cho enzym mất hoàn toàn hoạt tính gọi là nhiệt ñộ tới hạn ða số enzym có nhiệt ñộ tới hạn khoảng 700C, với các enzym bền nhiệt ( bromelin; papin,

…) nhiệt ñộ thích hợp có thể cao hơn nhiều

Q10 =

kt+10

kt

Tuy nhiên với từng enzym, nhiệt ñộ thíc hợp có thể thay ñổi khi có sự thay ñổi pH, cơ chất, thời gian phản ứng…

pH có ảnh hưởng mạnh mẽ ñến quá trình thủy phân vì nó ảnh hưởng ñến mức ñộ ion hóa cơ chất, ion hóa enzym và ñộ bền của protein – enzym ða số enzym bền trong khoảng pH = 5 ÷ 9 và ñộ bền của chúng tăng lên khi có cơ chất, có ion Ca++

Với nhiều enzym proteaza pH thích hợp ở vùng trung tính, nhưng cũng có một số enzym có pH thích hợp rất thấp (pepsin, proteaza acid của vi sinh vật…)

hoặc khá cao như (Subtilin có pH thích hợp > 10) Với từng enzym, giá trị pH thích

hợp không cố ñịnh mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác: nhiệt ñộ, cơ chất, dung dịch ñệm…

Thời gian thủy phân bởi enzym dài, ngắn khác nhau tùy thuộc vào nồng ñộ các các chất trong nguyên liệu, mức ñộ nghiền nhỏ vật liệu, nồng ñộ dịch hỗn hợp, các ñiều kiện pH, nhiệt ñộ,… thời gian thủy phân cần ñủ dài ñể enzym phân cắt các liên kết trong cơ chất, tạo thành các sản phẩm cần thiết của quá trình thủy phân Khi

cơ chất cần thủy phân ñã hết, quá trình thủy phân kết thúc Thời gian thủy phân phải thích hợp ñể ñảm bảo hiệu suất thủy phân cao ñồng thời ñản bảo chất lượng sản phẩm tốt

Trong thực tế, thời gian thủy phân phải xác ñịn bằng thực nghiệm và kinh nghiệm thực tế cho từng quá trình thủy phân cụ thể

Chất kìm hãm (hay các chất ức chế) là những chất mà khi trong phản ứng có

sự hiện diện của chúng, enzym có thể bị giảm hoặc mất hoạt tính Các chất này có thể là các ion, các phân tử chất vô cơ, hữu cơ Các chất kìm hãm có thể gây biến

tính hoặc không gây biến tính protein, kìm hãm thuận nghịch hoặc không thuận nghịch, cạnh tranh hoặc không cạnh tranh

Người ta xác ñịnh ñược với từng loại enzym, chất kìm hãm là những chất gì,

cơ chế kìm hãm của từng chất, mức ñộ kìm hãm,… Khi sử dụng enzym vào từng quá trình thủy phân cụ thể, ta phải biết rõ các chất kìm hãm của nó ñể ñiều chỉnh phản ứng

Chất hoạt hóa là những chất có tác dụng làm tăng hoạt tính của enzym Các chất này có bản chất hóa học khác nhau, có thể là ion kim loại, anion hoặc các chất hữu cơ Tuy nhiên, các chất hoạt hóa chỉ có tác dụng trong nồng ñộ giới hạn nhất ñịnh Khi dùng qúa nồng ñộ cho phép, hoạt ñộ enzm sẽ giảm Cơ chế của sự kích hoạt có thể là do các chất trên trực tiếp kết hợp với enzym, làm thay ñổi cấu trúc không gian của nó theo hướng có lợi cho hoạt ñộng xúc tác của enzym, hoặc có thể tác ñộng gián tiếp như các yếu tố ức chế ra khỏi môi trường

Với phản ứng thủy phân bởi enzym thì nước vừa là môi trường phân tán enzym và cơ chất, lại vừa trực tiếp tham gia phản ứng Nước có ảnh hưởng ñến tốc

ñộ thủy phân và chiều hướng của phản ứng thủy phân bởi enzym Vì thế, nước là một yếu tố ñiều chỉnh phản ứng thủy phân bởi enzym Nó có thể tăng cường hoặc

ức chế các phản ứng do enzym xúc tác

Trong quá trình thủy phân thường bổ sung muối ăn bởi muối ăn có tác dụng

ức chế hoạt ñộng của vi sinh vật gây thối rữa và các loại vi sinh vật không chịu muối

Nếu bổ sung nồng ñộ muối loãng vào quá trình thủy phân thịt cá thì nó có tác dụng kích thích thúc ñẩy tác dụng của enzym làm cho protein bị thuy phân nhanh hơn Nhưng nếu nồng ñộ muối bổ sung vào quá cao thì sẽ làm tê liệt hoạt ñộng của

enzym, vì bản chất hóa học của enzym cũng là protein nên cũng bị kết tủa bởi các muối trung tính bão hòa trong dung dịch Mặt khác, khi nồng ñộ muối quá cao sẽ ảnh hưởng ñến chất lượng sản phẩm, làm sản phẩm có vị mặn.

1.2 TÌM HIỂU VỀ NGUỒN PHẾ LIỆU TÔM

1.2.1 Sản lượng phế liệu tôm

Thủy sản nước ta ngày càng có vai trò quan trọng trong nền kinh tế quốc dân Ngoài việc cung cấp một lượng lớn ñáng kể làm thực phẩm truyền thống và ña dạng cho nhân dân, một lượng nguyên liệu quan trọng cho một số ngành công nghiệp và thức ăn chăn nuôi, ngành thủy sản còn thu về một lượng ngoại tệ lớn từ xuất khẩu

Trữ lượng thủy sản của nước ta vào khoảng 3 ÷ 3,5 triệu tấn, mỗi năm khai thác ñược 1 ÷ 1,5 triệu tấn trong ñó có 50.000 ÷ 60.000 tấn tôm biển Riêng vùng biển miền Trung có 50 loài tôm thuộc họ tôm he, tôm hùm, tôm rồng, tôm vỏ, tôm gai; ước tính sản lượng khai thác tự nhiên của vùng biển này trong phạm vi 50m nước là khoảng 10.000 tấn / năm (Theo nguồn lợi thủy sản – Bộ thủy sản – 1998) Tôm là một trong những mặt hàng thủy sản có giá trị kinh tế cao, thịt thơm ngon, dễ tiêu hóa Nhu cầu về thực phẩm tôm trên thế giới ngày càng lớn, ñặc biệt

là ở những nước phát triển Cũng như nhiều nươc trong khu vực Châu Á – Thái Bình Dương, nguồn tôm nguyên liệu không chỉ dưa vào khai thác mà phần lớn dựa vào sản lượng tôm nuôi Tôm nuôi càn chiếm tỉ lệ lớn trong lượng tôm nguyên liệu ñưa vào chế biến tôm ñông lạnh Mặt hàng tôm ñông lạnh xuất khẩuc của nước ta hiện nay chủ yếu ở 2 dạng chính: tôm vỏ (vặt ñầu, rút ruột) và tôm thịt (còn gọi là tôm nõn; bỏ ñầu, bỏ vỏ và rút ruột)

Trong quá trình chế biến thì các nhà máy thải ra một lượng phế liệu Theo số liệu sở thủy sản Khánh Hòa sản lượng tôm ñông lạnh trong các năm 1995 ÷ 2000 là

3000 ÷ 8000 tấn / năm, phế liệu tôm chiếm gần 40% (khoảng 1200 ÷ 3200 tấn) Tuy nhiên tỉ lệ phế liệu tôm và chất lượng của phế liệu còn phụ thuộc vào từng quy trình, ñối tượng tôm ñược chế biến, sản lượng nguyên liệu…

- Quy trình tôm vỏ bỏ ñầu ñông lạnh: tôm nguyên liệu ñược thu mua về ñem rửa, tách ñầu, rút ruột, làm sạch, phân cỡ, rửa, cân, cấp ñông Tỷ lệ phế liệu chiếm khoảng 30%

- Quy trình tôm thịt ñông lạnh: tôm nguyên liệu ñược thu mua về ñem rửa, bóc vỏ, bỏ ñầu, rút ruột, làm sạch, phân cỡ, xử lý, cân, cấp ñông Tỷ lệ phế liệu chiếm khoảng 45%

- Quy trình tôm thịt luộc ñông lạnh: tôm nguyên liệu ñược thu mua về, ñem rửa, bóc vỏ, bỏ ñầu, rút ruột, làm sạch, phân loại, luộc, cân, cấp ñông Tỷ lệ phế liệu chiếm khoảng 45%

- Quy trình tôm nguyên con ñông lạnh: tôm nguyên liệu ñược thu mua về, ñem rửa, phân cỡ, cân Với loại sản phẩm này, tỷ lệ phế liệu dường như không có Như vây, sản lượng phụ phẩm tôm ngoài việc phụ thuộc vào sản lượng nguyên liệu còn phụ thuộc vào mặt hàng chế biến ðối với dây chuyền chế biến sản xuất tôm thịt thì tỷ lệ phế liệu tôm chiếm khoảng 40 ÷ 50% Còn ñố với sản phẩm tôm luộc ñông lạnh thì tỷ lệ phế liệu chiếm khoảng 20 ÷ 30% ðối với sản phẩm tôm ñông lạng nguyên con thì tỷ lệ phế liệu hầu như không có

1.2.2 Thành phần, tính chất phế liệu tôm

Trong thành phần phế liệu tôm, phần ñầu thường chiếm khoảng 35 ÷ 45% trọng lượng của tôm nguyên liệu, phần vỏ chiếm 10 ÷ 15% Tỷ lệ này cũng còn phụ thuộc vào giống loài, giai ñoạn sinh trưởng, mùa vụ, phương pháp chế biến… Trong phế liệu tôm có chứa những thành phần có giá trị như: protein, chitin, cacbonat canxi, sắc tố,enzym,… tỷ lệ giữa các thành phần này không ổn ñịnh

− Protein trong ñầu tôm tồn tại dưới hai dạng:

o Dạng tự do tồn tại trong nội tạng và các cơ gắn phần vỏ

o Dạng phức hợp: dạng này protein kết hợp với chitin, canxi cacbonat

Hàm lượng protein trong phế liệu tôm khá lớn và như chúng ta ñã biết protein có nhiều ứng dụng trong thực tế Vì vậy song song với quá trình sản xuất chitin – chitosan thì việc thu hồi lượng protein trong quá trình sản xuất này là rất có

− Sắc tố: trong vỏ tôm có nhiều sắc tố nhưng chủ yếu là Astaxanthin Trong

vỏ và ñầu tôm thì astaxanthin kết hợp với protein một cách chặt chẽ Cũng nhờ liên kết này mà thành phần astaxanthin ñược bảo vệ Khi liên kết astaxanthin-protein không còn nữa thì astaxathin dễ dàng bị õy hóa tạo thành astaxin

− Phế liệu tôm cũng chứa một số loại enzym Trong ñầu tôm có chứa enzym tiêu hóa chymotrypsin, nó ñược sử dụng trong ñiều trị bệnh ung thư Một vài loại enzym khác có mặt trong phế liệu tôm gồm alkaline phosphatase, chitinase, -N- acetyl glucosamine cũng ñược ứng dụng trong thực tế

1.2.3 Biện pháp sử dụng phế liệu tôm

a Sử dụng phế liệu tôm ñể sản xuất chitin – chitosan

− Chitin

Chitin là một polysaccharide có ñạm, trong thiên nhiên nó phân bố rất rộng trong vỏ, trong xương của ñộng vật không xương sống, sừng, móng chân, vỏ tế bào của thực vật ñều có ít nhiều chitin ðặc biệt trong vỏ tôm, cua lượng chitin rất cao Chitin khó hòa tan trong các dung môi Chitin ñun nóng trong HCl ñâm ñặc thì thủy phân thành 35,5 D – Glucosamine và 22,5 % acid axetic Chitin ñun nóng trong kiềm ñặc khử gốc acetyl ta ñược chitosan

Với các tính chất trên chitin ñược ứng dụng rộng rãi trong các ngành: công nghiệp dệt, làm chất chống nước, làm màng chitin, làm sợi chitin, sản xuất glucosamine có nhiều ứng dụng trong y học

− Chitosan

Chitosan là một loại bột không màu hoặc màu vàng nhạt, có tính kiềm nhẹ không hòa tan trong nước, trong dung môi không có tính kiềm, chỉ hòa tan trong acid axetic loãng làm thành dung dịch nhớt trong suốt…

Ứng dụng của chitosan:

 Công nghiệp dệt: ñể hồ vải sợi thay cho tinh bột

 Y dược: tạo da nhân tạo, chỉ khâu, nghiên cưứ thuốc trị viêm loét dạ dày,

tá tràng

 Nông nghiệp: dùng ñể bao gói các sản phẩm cao cấp, chống ẩm, mốc, mất nước

 Y học: dùng ñể cố ñịnh tế bào

Theo hướng dẫn này có thể sử dụng 60% phế liệu tôm

b Sử dụng phế liệu tôm ñể tách chiết Astaxanthin

Astaxathin là dẫn xuất của caroten Trong vỏ giáp xác astaxanthin tham gia vào thành phần của lipoprotein, astaxathin tồn tại ở dạng liên kết với protein và dễ

bị tách ra dưới tác dụng của nhiệt

Astaxanthin có màu ñỏ, hòa tan trong các dung môi hữu cơ như: ete, aceton, cồn… và dễ bị tách ra dưới tác dụng của nhiệt, oxy không khí

Astaxanthin ñược dùng làm thức ăn tạo màu cho cá cảnh, làm tăng sắc tố cho lòng ñỏ trứng gà Ngoài ra còn làm thức ăn của cá, tạo màu cần thiết cho một số sản phẩm như cá ướp ñông, cá khô, sản phẩm thủy phân, thịt cá hồi Theo hướng này ñang ñược nghiên cứu

c Sử dụng phế liệu trong chăn nuôi

Do hàm lượng protein trong ñầu tôm cao do ñó nó ñược dùng làm thức ăn cho chăn nuôi

Theo ñặc ñiểm từng vùng mà nguồn nguyên liệu này ñược sử dụng khác nhau Ở Nha Trang: nguồn phế liệu này ñược sử dụng làm thức ăn cho gia súc, gia cầm, ở dạng tươi (phế liệu tôm tươi ñược nghiền nhỏ) và làm thức ăn cho tôm, cá dưới dạng bột ñầu tôm, vỏ tôm nghiền khô (sản xuất tại công ty Long Thao, Long Sinh…) Theo hướng này chiếm 30% lượng phế liệu