Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh kháng nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam

Mục tiêu của công trình này là điều tra tình trạng nhiễm nấm gây bệnh trên một sô' loại cây trồng phổ biến ở nước ta, phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất khán

Đ Ạ I H Ọ C Q U Ố C G IA H À N Ộ I

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN

NGHIÊN CỨU XẠ KHUÂN SINH CHẤT

Tên để tài:

KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT ở VIỆT NAM

Nguyễn Lê Huyền Trang Cử nhân Viện Khoa học & Công nghệ VN

d Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

Việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học ở diện rộng với sự thiếu hiểu biết về thuốc đã gây thiệt hại lớn về kinh tế, ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi sinh và sức khoẻ cộng đồng Mục tiêu của công trình này là điều tra tình trạng nhiễm nấm gây bệnh trên một sô' loại cây trồng phổ biến ở nước ta, phân lập và tuyển chọn các chủng

xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh kháng n á n , sơ bộ nghiên cứu một số tính chất và hiệu quả diệt nấm của các chất kháng sinh thu được

Từ các mẫu cây và quả bị nhiễm bệnh đã phát hiện các nấm gày bệnh sau: Trên

cây công nghiệp, cây lương thực và cây rau: Rhỉzoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum và các chủng nấm khác như Aspergillus sp., Penicillium sp

M ucor sp., Curvularia sp., Alternaria sp., Syncephalastrum sp., Cỉadosporium sp Monilinia sp., và Acremonium sp Trên các cây ãn quả và quả tươi : Aspergillus sp.

Penicillium sp., ngoài ra còn có Mucor sp., Curvularia sp., Alternaria sp., Syncephalastrum sp., Cladosporium sp., Monilinia sp., và Acremonium sp

Từ 110 chủng xạ khuẩn phân lập được từ đất đó có 14 chủng ức chế Fusarium oxysporum, chiếm (12,73 %) trong đó chọn được hai chủng kháng F oxysporum

mạnh nhất, đó là chủng T - 41 và chủng D - 42 Hai chủng này đều thuộc nhóm xám (Gy) Sơ bộ xác định theo ISP, chủng xạ khuẩn T-41 có nhiều đặc điểm giống với loài

s antimycoticus, chủng D-42 có nhiều đặc điểm giống với loài s viridogenes Nhiệt

độ tối ưu cho sinh trưởng của chủng T-41 là 28-30°C, pH tối ưu từ 6,5 đến 7,5; của chủng D-42 là 26-28°C, pH tối ưu 7,0 -ỉ-7,5

Cả hai chủng T-41 và D-42 đều cho hoạt tính kháng sinh mạnh nhất trên môi trường A-12 Trong đó, hoạt tính kháng sinh của chủng T-41 trên môi trường rắn (xốp) mạnh hơn rất nhiều so với trên môi trường dịch thể Chủng D-42 cho lượng sinh khối lớn nhất đổng thời với lượng chất kháng sinh được tích luỹ nội bào

T-41 và D-42 đều cho hoạt tính kháng sinh mạnh nhất ở nhiệt độ khoảng 30°c, pH trung tính hoặc hơi kiềm Nguồn cacbon thích hợp nhất cho chủng T-41 là tinh bột tan

1 % và D-42 là ri đường Nguồn nitơ thích hợp cho lên men của cả hai chủng là bột đậu tương., ở cả hai chủng, lượng sinh khối tích luỹ lớn nhất và hoạt tính kháng sinh cực đại đạt sau khoảng 96-120 giờ nuôi Trên môi trường lên men xốp, hoạt tính kháng sinh của chủng T-41 đạt hoạt tính nhất vào ngày thứ 12

Chất kháng sinh của cả hai chủng T-41và D-42 đều tan tốt trong etanol, n-butanol, etyl axetat Chất kháng sinh hầu như không thay đổi hoạt tính ngay cả khi đã xử lý nhiệt ở 100°c với thời gian kéo dài 60 phút Chất kháng sinh từ T-41 có phổ hấp phụ

cực đại tại các bước sóng: X = 213; X = 276,5 và X = 326,5.

Kết quả thử nghiệm bước đầu về hiệu quả diột nấm gây bệnh thực vật của các chẻ'

phẩm T-41 và D-42 cho thấy chế phẩm từ s antimycoticus T-41 có tác dụng diệt nấm Sclerotium rolfsii trên cà chua với hiệu lực ngang với Mexyl, ngang với chế phẩm từ Trichoderma viride và cao hơn Rovral còn chế phẩm từ s viridogenes D-42 lại có tác dụng diệt nấm Rhizoctonia solani trên bắp cải với hiệu lực tương đối cao (hơn Rovral

và T-41, nhưng kém valiđamyxin và chế phẩm từ Trichoderma viride).

f Tinh hình kinh phí của đề tài

Tổng kinh phí được cấp : 60.000.000 đồng (Sáu mươi triệu đồng)

Đ ã chi những khoản sau :

- Thuê mướn chuyên gia hợp đổng : 25.000.000 đồng

- Hóa chất và vật liệu : 27.000.000 đồng

a P r ọ ịec t:

Study on production o f antibiotics against phytopathogenic fungi by Actinomycete strains íolated from soil samples in Vietnam

Code num ber: QG-02-12

b Prọịect leader : Assoc Pro Dr Kieu Huu Anh

c Researching staíT:

Pham Van Ty Assoc Pro Dr Hanoi University of Natural SciencesBui Thi Viet Ha M.Sc Hanoi University of Natural SciencesNguyen Thanh Huyen M.Sc Hanoi University of Natural SciencesMai Thi Dam Linh Bachelor Hanoi University of Natural SciencesNguyen Le Huyen Trang Bachelor Institut of Science and Technology

Dinh Xuan Tuan Bachelor Institut of Irrigation Science

Dao Duy Dat Bachelor Institut of Biotechnology, Inst of S&T

Ly Ngoe Oanh Bachelor Hanoi University of Natural Sciences

Do Minh Phuong Technician Hanoi University of Natural SciencesPham Thuy Linh Bachelor Hanoi University of Natural Sciences

d The aim and content of research

Findings published recently by the EPA have made scientists increasingly aware of the drawbacks of many chemical pesticides, in terms of their effect on the environment, as well as on the grovvers & consumers of agricultural Products Biological control is a potent means of reducing the damage caused by plant pathogens The períormance of a biocontrol agent cannot be expected to equal that of

an excellent fungicide; although some biocontrol agents have been reported to be as effective as fungicide control

The goal of this work is to survey and study phytopathogenic fungi írequently found

on some cultivated crops of North Vietnam and to isolate Streptomyces strains capable

of producing antibiotics against the above

On industrial piants, íeeding crops the foỉlowing phytopathogenic fungi were found:

Rhìioctonia solani, Sclerotium roựsìi, Fusarium oxysporum, and others; on vegetables and legumes Aspergillus sp., Penicillium sp., and others 126 phytopathogenic fungus

isolates were identified and classiíied

110 Streptomyces strains were isolateđ from soil samples Isolates initially were selected in vitro for activity against Fusarium oxysporum and 14 strains capable of

producing antibiotics against the above fungal pathogen were found These strains were then screened for activity against other phytopathogenic fungi, including

Sclerotium roựsii and Rhizoctonỉa solani Some morphological, physiological and

color characteristics of two most active strains T-41 and D-42 were investigated based

on the methods of the International Streptomyces Project (ISP) Electron microscopic

spore and aerial mycelium studies were carried out These two strains appeared to

related to Streptomyces antimycoticus and s viridogenes, respectively.

T-41 and D-42 have been indentified having signiíicant antifungal activity in vitro with nophytotoxic effects on plants Optimal conditions for the growth and

antibiotic production of these two isolates were also found

Greenhouse and ground microlot trials with T-41 and D-42 spores were

conducted Streptomyces spores from these two selected isolates applied to soil of tomato and inoculated with Sclerotium roựsii at 30g spores per lot of soil and to soil of cabbage and inoculated with Rhizoctonia solani at 200 ml spore solution per lot of soil

significantly reduced the mortality of plants

MỤC LỤC

Mở đầu

Chương 1 - Tông quan tài liệu

1.1 Vi n ấ m - N g u y ê n n h â n chủ yếu gây ra các b ệ n h h ạ i cây trồ n g

1.1.1 Sự lan tru y ề n và chu kỳ p h á t triển của nâin gây b ệ n h thự c v ậ t

2 2 2 2

15

15

15 151717

2.2.5.1 Lựa ch ọ n m ôi trư ờ n g lên m en thích h ợ p

22.5.2 Ả nh h ư ở n g của các n g u ồ n cacbon, n itơ lên sinh tổ n g h ợ p ch ất

2.2.6.1 Tách ch iết c h ấ t kh á n g sinh từ sinh k h ố i b ằ n g d u n g m ôi h ữ u cơ

2.2.Ô.2 Tách chiết c h ấ t k h á n g sinh từ dịch lên m e n b ằ n g d u n g m ôi

h ữ u cơ

2.2.7 Xác đ ịn h m ộ t s ố tín h chất của c h ất k h á n g sinh

2.2.7.1 Xác đ ịn h k h ả n ă n g bền n h iệt của c h ất k h á n g sinh

2.2.7.2 Xác đ ịn h Rf của chất kháng sinh b ằ n g sắc k ý giấy.

22.7.3 Xác đ ịn h p h ổ tử ngoại của chất k h á n g sinh

3131313131

323232323232333334

của hạt.

22.9.2 Xác đ ịn h ản h h ư ở n g củ a dịch n u ô i cây đ ế n k h ả n ă n g sinh

trư ở n g v à p h á t triển của cây

2.2.10 T h ư n g h iệm c h ế p h ẩ m trê n đ ồ n g ru ộ n g

Chương 3 - Kết quả và thảo luận

3.1 T ình trạ n g nh iễm n ấm gây b ện h trê n cây trồ n g và q u ả tươi

3.1.1 K ết q u ả th u m ẫu

3.1.2 T ình trạ n g nh iễm n ấ m trên cây trồ n g

3.1.3 T ình trạ n g n h iễm nấ m trê n cây ă n q u ả v à q u ả tươi

3.3 Phân lập và tuyên chọn xạ khuân

3.3.1 Sự p h â n bô' và h o ạ t tính k h á n g sin h của các ch ủ n g xạ k h u ẩ n

3.3.2 T u yển chọn các ch ủ n g xạ k h u ẩ n sinh chất k h á n g sin h có h o ạ t

3.5 K hả n ă n g tông h ợ p chất k h á n g sin h của các ch ủ n g T41, D42

và S treptom yces hygroscopicus TC 5-4

3.5.1 Lựa chọn m ôi trư ờ n g lên m en th ích h ợ p

3.5.2 Anh hưởng của các điều kiện nuôi cây

3.7 T ách chiết và tinh c h ế chất k h á n g sinh

3.7.1 Tách chiết c hẫt kháng sinh từ dịch lên m en

3.7.2 Tách ch iêt chât k h á n g sinh từ m ô i trư ờ n g lên m en xốp

3.7.3 Sơ đồ tách chiết và tình c h ế c h ất k h á n g sinh ữ o n g d ịch n u ô i cây

34343437373737404141474748485353555757606165

68

70707373747676788080818384

88

88 8989

MỞ ĐẦU

Hàng nãm trên thế giới bệnh cây trổng đã gây nên những tổn thất to lớn đối với nền sản xuất nỏng nghiệp Chúng phá huỷ 537,3 triệu tấn các loại nông sản, bằng khoảng 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp thế giới; trong số này, chiếm 83% là bệnh

do vi nấm gây ra, và chủ yếu là các bệnh như đạo ôn, khô vằn, thối cổ rễ, mốc sương Việt Nam là một nước nông nghiệp với 8 triệu ha đất canh tác Sản phẩm nông nghiệp chiếm vị trí hàng đầu trong nền kinh tế quốc dân Khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và ẩm, là điều kiện thuận lợi cho vi nấm phát triển, bời vậy bệnh do vi nấm là vần đề không thể tránh khỏi và thực tế đã gây tổn thất nặng nề cho nền nông nghiệp nước ta Việc sử dụng các thuốc bảo vệ thực vật là hoá chất nhằm làm tăng sản lượng nông nghiệp từ lâu đã rất phổ biến và tăng lên không ngừng từ 10.000 tấn/ nãm vào những nãm cuối thập kỷ 80 đến 40.793 tấn/ năm vào năm 1998 Diện tích đất canh tác

có sử dụng thuốc bảo vệ thực vật đã tăng tới khoảng 80 - 90% Chủng loại thuốc bảo vệ thực vật sử dụng ở Việt Nam rất đa dạng, có khoảng 269 hoạt chất với gần 735 tên thương mại Tuy chủng loại nhiều như vậy, song người nông dân thường sử dụng theo thói quen và do hiểu biết hạn chế về mức độ độc hại của thuốc bảo vệ thực vật nên nhiểu loại thuốc cũ và độc như wofatox, lindan, DDT, dichlovos, bassan vẫn được lưu hành Hiện nay trên thị trường thuốc bảo vệ thực vật có tới 28 hoạt chất cấm sử dụng,

19 hoạt chất hạn chế sử dụng Việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật ở diện rộng với số lượng lớn, cùng với những hạn chế hiểu biết về thuốc đã gây ra nhiều thiệt hại lớn về kinh tế cũng như ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi sinh và sức khoẻ cộng đồng Bởi vậy, việc xây dựng một nền nông nghiệp phát triển theo định hướng "nồng nghiệp sạch hơn và bền vững" là rất cần thiết và cấp bách Hội nghị tư vấn khu vực Châu Á - Thái Bình Dương của FAO năm 1992 đã khẳng định đấu tranh sinh học là nến tảng của chương trình quản lý dịch hại tổng hợp (IPM)

Từ những năm 1950, nhiều nước trên thế giới đã đạt được những kết quả hết sức khả quan khi ứng dụng chất kháng sinh vào sản suất nông nghiệp để phòng chống các bệnh do vi sinh vật gây hại Chất kháng sinh có nhiều ưu thế so với hoá chất bảo vệ thực vật như có tác dụng chọn lọc cao, độ độc thấp, thời gian bán huỷ rất ngắn do đó không gây ố nhiễm môi trường Bởi vậy, đây được coi như một biện pháp hữu hiệu

mở ra triển vọng to lớn cho việc phòng trừ các bệnh gâv hại mùa màng và khắc phục những hậu quả do chất hoá học gày ra Vài năm gần đây người dân Việt Nam cũng đã bắt đầu làm quen với một số chế phẩm kháng nấm gây bệnh như valiđamyxin, jinganmyxin nhưng đó đều là các chế phẩm nhập ngoại Do giá thành và tập quán sản xuất chưa phù hợp nên các chế phẩm sinh học chưa được sử dụng rộng rãi Đề tài

"Nghiên cứu xạ khuẩn sinh c h ứ kháng sinh kháng nấm gáy bệnh thực vật ở Việt

N a m " được đặt ra nhằm góp phần phục vụ cho hướng nghiên cứu ứng dụng nói trên.

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 VI NẤM - NGUYÊN NHẤN CHỦ YỂU GÂY RA CÁC BỆNH HẠI CÂY TRồNGHàng nãm thế giới trên thế giới bộnh hại cây trồng do nấm gây ra chiếm khoảng 83% Việt Nam là một nước có khí hậu nhiệt đới, nóng ẩm vì vậy việc nhiễm nấm là không thể tránh khỏi Hàng năm một lượng lớn cây lương thực, cây công nghiệp ngắn ngày bị nhiễm các loại nám mốc gây bệnh tạo ra hàng loạt các dịch bệnh khác nhau ảnh hưởng lớn đến năng suất cây trồng [1]

Vi nấim là sinh vật nhân chuẩn điển hình, phát triển nhanh do bào tử sinh ra dễ lan truyền thông qua gió hoặc không khí từ đó xâm nhập vào cây trổng hoặc hạt giống, ngoài ra nó còn tổn tại ngay trong đất và xâm nhập vào cây thông qua bộ rễ Cây trồng

có thể bị nhiễm bởi một vài loại nấm gồm cả những loại nấm ký sinh vốn không gây hại cây, nhưng phán lớn là các loại nám gây hại Sự nhiễm nấm có thể xẩy ra ở một giai đoạn phát triển nào đó của cây và tuỳ theo chủng nấm gây bênh mà triệu chứng bệnh có thể được biểu hiện ở các mức độ khác nhau

1.1.1 Sự lan truyền và chu kỳ phát triển của nấm gáy bệnh thực vật

1.1.1.1 Sự lan truyền

Phát tán bào tử là hình thức lan truyền quan trọng nhất của hầu hết các loại nấm gây bệnh ở các phần trên mặt đất của cây, nhờ đó nấm lan truyền được từ cây này sang cây khác, từ vùng này sang vùng khác

IU ag ca (bào từ nấm collectotrichum )

Gió th ố i bào từ o ấ m đ l xa Côn tràng m ang tcuyẻa bào từ, tiú dụ

Bào tử đuợc lan truyền bằng cách chủ động hay thụ động là tuỳ thuộc vào đặc điểm sinh học của mỗi loại nấm và ảnh hưởng của yếu tô' môi trường (hình 1).

1.1.1.2 Sự lây nhiễm

Bào tử nấm là nguồn bệnh đầu tiên trong quá trình lây nhiễm của nấm Quá trình lây nhiễm bắt đầu từ giai đoạn bào tử tiếp xúc với bể mặt ký chủ Để lây nhiẻm, trước hết bào tử phải được nảy mầm Nói chung, có hai kiểu nảy mầm : nảy mầm trực tiếp và nảy mầm gián tiếp Nảy mầm trực tiếp sinh ra ống mầm sau phát triển thành sợi nấm, còn trong nảy mầm gián tiếp một bào tử ban đầu sẽ tạo ra nhiều bào tử nhỏ, các bào tử này sau đó sẽ nảy ra nhiều ống mầm [4] Sự nảy mầm của bào tử tuỳ thuộc vào nhiều điều kiện sinh thái như độ ẩm, nhiệt độ, độ pH môi trường, ánh sáng và oxy

Độ ẩm là yếu tô' có tác dụng quyết định trong khi nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp tới tỷ lệ, tốc độ và kiểu nảy mầm của bào tử còn ánh sáng là yếu tô' ít ảnh hưởng nhất đến sự nảy mầm [3] Tuy nhiên các yếu tô' này có quan hệ chặt chẽ với nhau

Sau khi bào tử nảy mầm, ống mầm sẽ xâm nhập vào bên trong mô ký chủ bằng nhiều con đường : qua bể mặt nguyên vẹn, qua vết thương cơ giói hoặc qua khí khổng

trên ký chủ Phytophthora inỷestans có thể xâm nhập qua khí khổng hoặc qua lớp biểu

bì nguyên vẹn của lá, nấm Penicillium spp và Rhiiopus spp là những loại ký sinh yếu

chỉ có thể xâm nhập vào cây qua vết thuơng cơ giới [15]

Sau khi xâm nhập nấm sẽ phân huỷ các cấu trúc tế bào và các chất hữu cơ khó tan thành dễ tan để hấp thụ Vũ khí hoá học của nấm để tấn công vào tế bào ký chủ là các enzym, chất sinh trưởng và độc tố [4] Tác động đầu tiên của nấm là tiết ra các enzym phân giải thành tế bào của cây chủ yếu là xenluỉoza và pectin Sau khi phân giải thành, nấm sử dụng các enzym thuỷ phân để phân giải các thành phần trong tế bào chất

Trong quá trình phân giải và hấp thụ chất dinh dưỡng, nhiều loại n á n còn tiết ra độc tố để tác động tới hoạt động sinh lý của tế bào, đầu độc tế bào, làm cho mô bị suy yếu và chết Lúc này các triệu chứng của bệnh ở trên cây bắt đầu được biểu hiện.Mặc dù nấm có cơ chế xâm nhập chủ động và có hệ thống enzym rất phong phú, song quá trình lây nhiễm của nấm mạnh hay yếu còn tuỳ thuộc vào quan hệ ký sinh -

ký chủ Mối quan hệ ký sinh - ký chủ thường biểu hiện rất phức tạp: một bên vật ký sinh tiến hành gây bệnh, một bèn ký chủ hình thành các cơ chế tự bảo vệ Trong thực

tế hầu hết các loại cày đều có những phản ứng và cơ chế bảo vệ nhất định để kìm hãm hoậc chống lại các hoạt động lây nhiễm của nấm Các vếu tố như độ dày lớp biểu bì lớp sáp, số lượng và kích thước khí khổng có ảnh hường đến sự nảy mầm và xâm nhập qua bể mặt ký chủ của nhiều loại nấm gây bệnh trên cây Ngoài ra, cây còn có cơ chế bảo vệ sinh học, đặc biệt là enzym kitinaza các chất kìm hãm proteaza và chất kìm

hãm amilaza lần lượt phân giải kitin, kìm hãm hoạt tính proteaza và amilaza có trong

tế bào nấm [11]

1.1.1.3 Chu kỳ phát triển của nấm

Nhìn chung chu kỳ phát triển của nấm được chia thành hai dạng dựa trên hình thức sinh sản và ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh tới các giai đoạn phát triển của nấm (chu kỳ lây nhiễm) Dạng thứ nhất là chu kỳ phát triển hoàn toàn trong đó nấm trải qua cả hai giai đoạn sinh sản vô tính và hữu tính Ở dạng thứ hai, tức là chu kỳ phát triển không hoàn toàn, nấm không có hoặc bỏ qua giai đoạn sinh sản hữu tính [16] Tuy nhiên ở một sô' ít loại, do ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh mà chủ yếu là nhiệt

độ, chu kỳ phát triển bị thay đổi ít nhiểu Thí dụ Phytopthora inỷestans có chu kỳ phát

triển hoàn toàn nhưng trong điều kiện khí hậu nhiệt đới chưa phát hiện thấy giai đoạn hữu tính [21] Một sô' nấm bất toàn cũng có những thay đổi trong chu kỳ phát triển và khi tìm thấy giai đoạn sinh sản hữu tính, nấm sẽ được sắp xếp lại trong hệ thống phân loại bằng cách chuyển sang lớp nấm khác hoặc được duy trì ở cả hai lóp theo giai đoạn

vô tính và hữu tính Do vậy, khi nghiên cứu chu kỳ phát triển của nấm cần phải tìm hiểu các đặc điểm sinh học cũng như mối quan hộ giữa yếu tố ngoại cảnh với sự phát triển của nấm ở các khu vực địa lý khác nhau

Chu kỳ lây nhiễm hay còn gọi là "chu kỳ bệnh" bao gồm tất cả các giai đoạn ký sinh bên trong ký chủ và thời kỳ không ký sinh

Sơ đồ tổng quát của chu kỳ bệnh được trình bày ở hình 2

Báo tồa tcoag dất, xác cây bệoh vạt chất h.ữu ca đã chét, hạt gióng, cay irổag, k ý ch.0 phụ, aỏag sảa phàm

H ình 2 : Chu kỳ bệnh

Nhìn chung chu kỳ bệnh của nấm là một quá trình hoạt động liên tục dẫn đến việc hình thành bệnh, tuy nhiên giai đoạn ký sinh trong chu kỳ có thể được lập lại nhiều lần tuỳ thuộc vào đặc điểm và tốc độ sinh sản nhiều thế hệ của ký sinh trong vụ mùa Trong những điéu kiện nhất định (nhiệt độ, độ ẩm không thích hợp .) nám sẽ chuyển sang giai đoạn bảo tồn.

Nắm vững chu kỳ bệnh cụ thể có ý nghĩa lớn trong công tác phòng trừ bệnh đạt hiệu quả cao bởi vì nhờ đó có thể tìm được điểm yếu hoặc điểm quyết định hình thành bệnh trong chu kỳ, từ đó chọn các biện pháp phòng trừ thích hợp và dựa vào những thay đổi trong chu kỳ bệnh ở các vùng sinh thái khác nhau có thể điều chỉnh các biện pháp phòng trừ hiệu quả nhất

1.1.2 Các loại nấm gây bệnh thực vật thường gặp

L l.2.1 Rhizoctonia

Đặc điểm chung

Là một trong những đối tượng bệnh hại quan trọng nhất hiện nay, Rhiioctonia

sống trong đất, có sợi màu trắng vàng, sau thành màu vàng nâu Hạch nấm thường tồn tại trên vết bệnh, ban đầu có màu trắng sau chuyển thành màu nâu Nấm có thể tồn tại trong đất hoặc xác cây trồng trong nhiều năm dưới dạng hạch nấm

Rhizoctonia gây bệnh cho rất nhiều loại cây trồng khác nhau, đặc biệt từ khi có

các giống cải tiến thấp cây, cây ngắn ngày, cây sử dụng lượng phân đạm cao được gieo cấy trên diện rộng, thâm canh tăng vụ và phát triển diện tích trồng lúa, trồng rau quanh nãm Nấm có thể gây hại trên cây trổng các mùa vụ, nhưng phổ biến nhất là trong vụ xuân Thời tiết nóng ẩm, mưa nhiều ở Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm bệnh [17] Đặc biệt vào vụ lúa mùa và ngô hè thu ở các tỉnh phía Bắc hay vụ bắp cải đông sớm bệnh thường nặng hơn, ngoài ra hàm lượng phân đạm cao cũng giúp bệnh phát triển sớm và gây thiệt hại nhiều hơn [14]

Các triệu chicng bệnh do Rhixoctonia

Trên các cày trồng khác nhau như bắp cải, cà chua, khoai tây, đậu đỗ, đậu

tương, rau cải, xu hảo, ngô, nấm Rhizoctonia thường gây bệnh ở rễ, phần thân sát mặt

đất của cây con và trên bắp thân lá của cây trưởng thành [18]

Triệu chứng thường gãp do Rhizoctonia gãy ra gồm: thối đen rễ cây hoa màu

(hình 3), lở cò rễ cày con teo thắt gốc thân, khô vần (lúa naô) và thối rữa (bắp cải, xà lách- hình 4, hình 5) Vết bệnh ở cây con thường có màu nâu, úng nước trên phần thân sát mạt đất dẫn tới hiện tượng cây bị héo và đổ rạp trên mặt đất đirợc gọi là lở cổ rễ cây con (phổ biến trên cây con trong giai đoạn vườn ươm) Trẽn những cây già hơn vết bệnh hóa gỗ có màu nâu đậm và thắt lại tại phần thân tiếp giáp với mật đất được gọi là hiện tượng teo thắt thân Cây bị nhiễm bệnh chết nhanh ờ các vùng trồng rau bị bệnh

gây thiệt hại rất nghiêm trọng Chính sự hạn chế trong nhận thức của nông dân về tác hại của bộnh làm cho bệnh lan nhanh Khi những lá ở phần gốc thân tiếp xúc với đất

ẩm có nguổn bệnh thường có hiện tượng thối rữa gọi là bệnh thối gốc Trên lúa và ngô những đám vết chết loang lổ trên phiến lá và bẹ lá đuợc gọi là bệnh khô vằn (hình 6), bệnh thường xuất hiện khi cây đã lớn và đang đóng bắp Bắp cải và xà lách bị nhiễm nấm gọi là bệnh thối ướt Vết bệnh lúc đầu là vết lá chết màu nâu vàng ở các lá ngoài, thông thường chỉ thấy một lớp nấm trắng xám trên bề mật, sau đó vết bệnh lan rất nhanh và gây thối toàn bắp Khi trời ẩm, trên vết bệnh có thể nhìn thấy sợi nấm nằm xen kẽ với hạch nấm Hạch nấm dẹt có màu nâu, trên bề mặt hạch có các lỗ rất nhỏ (hình 7)

Hình 3: Bệnh thối rễ rau cải do Rhizoctonia

Hình 4: Bệnh thối ướt bắp cải do Rhizoctonia

H ình 5: Vườn bắp cải bị bệnh do Rhizoctonia

Hình 6: Bệnh khô vằn ngô do Rhizoctonia

H ình 7: Hạch nấm Rhizoctonia solani trên đất và bã cây trồng

1.1.2.2 Sclerotíum

Đặc điểm chung

Sclerotium có phạm vi phân bô' rộng từ vùng có khí hậu lạnh như Sapa đến các

vùng đất cát ven biển hay vùng có khí hậu nóng và khô đến các vùng đổng bằng

Sclerotium rol/sii gây bệnh sống trong đất, sợi nấm màu trắng đâm tia, các sợi nấm

này sản sinh ra nhiều hạch nhỏ Hạch nấm tồn tại trong đất và có thể xâm nhập trực tiếp vào mô cây và gây bệnh cho cây Nấm gây hại trên nhiều loại cảy trồng như : lạc, lúa, ngô, cây họ đậu, cà chua, khoai tây, dưa hấu, bầu bí, cây làm thuốc (bạch truật, địa

tiền ) [17] Ồ Việt Nam, bệnh do Sclerotium thường gây nguy hiểm cho các cây trồng

cạn, phổ biến nhất là bệnh héo rũ trắng gốc và bệnh tiêm hạch trên lúa Trên lúa bệnh xuất hiện nhiều hơn ở vùng thiếu nước tưới

Nám phát triển và gây bệnh ở nhiệt độ 15 - 37° c, điều kiện thích hợp cho nấm phát triển là khí hậu nóng ấm, ẩm độ không khí và ẩm độ đất cao [22] Bệnh do

Sclerotium có thể gây hại cây trồng quanh nãm nhưng nặng nhất là vào vụ xuàn Nấm

gây hại nặng trên cây cà chua và cây lạc ở miền Bắc Việt Nam vào thời điểm trước khi thu hoạch, lúc đó đất trồng quá ẩm ướt Sau khi thu hoạch, nếu thu dọn ruộng không sạch thì các hạch nhỏ của nấm gây bệnh vẫn có thể tồn tại trong đất và thân cây chết mục rồi tiếp tục gây bệnh cho các cây trồng vụ sau Trên các ruộng đất cát pha bị mất nước thường xuyên cũng thường thấy nấm bệnh xuất hiện [19] s rolỷsii tổn tại nhiều

nám trong đất và xác cây bị bệnh

Các triệu chứng bệnh do Sclerotium roựsii

Lúc đầu lá từ màu xanh chuyển sang màu vàng hoặc màu nâu tối, khi cây mới

bị bệnh có hiện tượng héo vàng phần thân, lá trên mật đất, cây có thể bị đổ rạp xuống

và chết, ở phần cổ rễ, thân ngấm sát mặt đất của cây nhiễm bệnh thường có màu nâu, thối mục khô xác (hình 8 và hình 9) Khi quan sát phần xung quanh gốc cây sẽ thấy nhiều hạt tròn nhỏ như hạt cải màu trắng hoặc nàu trên phần mô bị bệnh đuợc gọi là hạch nấm (hình 10) Hạch còn non có màu trấng, khi già trở thành màu nâu Các hạch nấm này dễ lẫn với trứng của côn trùng nên hay nhầm tác nhân gây chết là do côn trùng Cùng với sự xuất hiện của hạch nấm là các sợi nấm gây bệnh có màu trắng mọc lan trên mật đất [2] (hình 11)

Hình 8: Thân và rễ cây cà chua bị nhiễm bệnh do Sclerotium

Hình 11: Hạch nấm Sclerotium roựsỉi trẽn đất và bã căy trồng

I.I.2.3 Fusarium

Đặc điểm chung

Là loài nấm phân bố rộng ở tất cả các vùng địa lý trên thế giới, có khả nãng gây

bệnh cao với nhiều loại cây, Fusarium gây thiệt hại không nhỏ đối với nền sản xuất

nồng nghiệp ở Việt Nam cũng như trên thế giới Mặt khác nó còn sản sinh độc tố gày

nguy hiểm cho động vật hoang dại, vật nuôi và con người Fusarium gây ra nhiều bệnh khác nhau vói cây trổng điển hình là bệnh héo bó mạch, héo vàng cây F oxysporum

ký sinh trên hộ rễ thường gây thối rễ G moniỉỉforme tiết ra giberelin kích thích sinh

trưởng gây nên bệnh lúa von, đặc biệt nó còn tiết ra íumonisin gây bệnh ung thư thực

quản [11] Chỉ tính riềng ở khoai tây thiệt hại do Fusarium spp gây bệnh thối củ trẽn

đồng ruộng và trong bảo quản cũng đã chiếm tới 20% tổng sản lượng thu hoạch [13]

Fusarium oxysporum gây bệnh tổn tại trong đất, thậm chí trong đất nhiễm bệnh

một vài năm Nấm gây bệnh có thể lan truyền qua hạt giống, cây nhiễm bệnh hoặc lan truyền theo nước tưới và nhờ gió Trong nhiều trường hợp người ta cũng gặp trên cây sự

có mật của vi khuẩn Ralstonỉa solanacearum với triệu chứng điển hình giống F oxysporum: chẻ dọc thân cây bị bệnh thấy mạch dẫn màu nảu đen.

Fusarium oxysporum phát triển thuận lợi trong điẻu kiẽn thời tiết ấm và ẩm,

trẻn đất cát pha bạc màu và đất thịt nhẹ Trong điểu kiện thời tiết ấm áp, nhiệt độ trung bình 27 - 30°c, ẩm độ đất tương đối cao bệnh có thể phát triển mạnh, gây thiệt hại không nhỏ đến năng suất cây trồng [12]

Bệnh phát triển nhiều trên đổng ruộng từ tháng 3 trở đi và gây hại mạnh trong khoảng tháng 9 đến tháng 11

Các triệu chứng bệnh do Fusarium

ở những cây bị nhiễm bệnh, lá héo rũ cụp xuống, thường bắt đầu từ các lá chết phía gốc ở một bèn cây, sau đó lan ra toàn cây làm cho lá héo rũ màu vàng (hình 15) Bệnh phá hại trong tất cả các giai đoạn sinh trưởng của cày, nhưng nặng nhát là vào cuối giai đoạn sinh trưởng Cây con bị nấm lây nhiễm sẽ không phát triển được và trờ nên khô héo Còn khi bị nhiễm nấm ở giai đoạn đang phát triển thì triệu chứng của cây thể hiện rỏ hơn Vết bệnh ờ cổ rễ và phần thân sát mặt đất có màu nâu, vết bệnh lan rộng có thể làm khỏ tóp cả phần thân sát mặt đất, rễ phát triển kém và bị thối dần dẫn tới cây héo vàng xẹp xuống rồi chết Khi chẻ dọc thân cây bệnh, bó mạch dẫn có màu nảu, trẽn bề mặt vết bệnh có thể xuất hiện lớp nấm từ màu trắng đến hồng nhat khi trời nóng và ẩm [13]

1.1.3 Thiệt hại về kinh tê của cây trồng do vi nấm

Hàng nãm thế giới thiệt hại khoảng 537,3 triệu tấn các loại nông sản chù yêu (chiếm 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp của thế giới) Riêng lúa chiếm khoảng 9%, ngô 10%, cây rau 12%, cây ãn quả 16,5%, trong đó bệnh do nấm gây ra chiếm khoảng

83% [1] Theo số liệu của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp của Liên Hợp Quốc

(FAO), tổn thất hàng nãm của các sản phẩm nông nghiệp do các tác nhân gây hại khác nhau gây ra là 20% tổng sản luợng toàn cẩu Tính thành tiền tổn thất mỗi nãm là 8 tỷ USD về gạo, 3 tỷ USD về khoai tây, 3 tỷ USD về đường, 2,5 tỷ USD về cà phê, 2 tỷ USD vể lúa mạch, 2 tỷ USD về ngô, 1.5 tỷ USD về lúa mì và 1 tỷ USD về lạc, trong đó riêng tổn thất do nấm chiếm khoảng một nửa (nghĩa là khoảng 12 tỷ USD) Theo Ou (1972) trong số 45 bệnh lúa đã mô tả, có tới 60% do nấm gây ra Theo kết quả nghiên cứu của Viện bảo vệ thực vật (1971- 1976), trong sô' 24 bệnh hại lúa ở Việt Nam có 13 bệnh do nấm gây ra, 34 bệnh ở ngô có 26, 21 bệnh ở khoai tây có 8

Từ năm 1957 đến nay nuớc ta đã trải qua nhiều đợt dịch bệnh hại cây trồng như đạo ôn, khô vằn, héo rũ, thối cổ rễ, mà tác nhân gây bệnh chủ yếu và nghiêm trọng

nhất là vi nấm, phổ biến là Fusarium oxysporum, Rhiioctonia spp., Sclerotium spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Mucor spp., hầu hết là những loài bán ký sinh và

hoại sinh điển hình, có phạm vi ký chủ rộng đã gây nhiều tổn thất lớn về sản lượng thu hoạch và làm mất tính ổn định về nâng suất của nhiều giống cây trổng

Cây bị nhiễm nấm ảnh hưởng rất lớn đến nâng suất và chất lượng cây trồng Khi xâm nhập vào cây, nấm lấy hết các chất dinh dưỡng của cây làm nguyên liệu xây dựng

tế bào cho mình vì vậy làm giảm giá trị của cây Song song với quá trình phát triển, nấm còn sinh ra các độc tô' gây hại cho chính bản thân cây cũng như ảnh hưởng đến những sinh vật tiêu thụ chúng như các động vật ãn thực vật và con người Khi sinh trưởng trên cây, nấm gày ra các bệnh nghiêm trọng, làm giảm khả nâng sinh sản, làm chậm quá trình phát triển của cây, mạnh hon là làm chết cày Hơn nữa tốc độ lây lan của nấm rất nhanh, kéo theo một lượng lớn cây trồng cùng bị nhiễm bệnh Sự nhiễm bệnh được lan truyền từ cây này sang cây khác, từ vùng này sang vùng khác, tạo ra những vùng dịch bệnh lớn rất khó kiểm soát Tinh hình dịch hại do nấm qua các năm khỏng hề giảm mà còn có chiều hướng tâng với các bệnh ngày càng phức tạp cùng với

sự phòng vệ ngày càng cao của chính các loài nấm đó Vì vậy việc nghiên cứu những chế phám nhằm hạn chế những thiệt hại do nấm đang là mối quan tâm hàng đầu được các nhà khoa học đặt ra hết sức cấp bách

1.1.4 Những biện pháp phòng trừ nấm gày bệnh thực vật

1.1.4.1 Biện pháp phòng trừ hoá hoc

Việc sử dụng các chất hoá học làm thuốc bảo vệ thực vật nhằm làm tãng sản lượng nông nghiệp từ lâu đã hết sức phổ biến, từ 10.000 tấn/ năm vào những nãm cuối

thập kỷ 80, đến 40,793 tấn/ năm vào năm 1998, đồng thời diện tích đất canh tác có sử dụng thuốc bảo vệ thực vật cũng tăng lên đến khoảng 80 - 90% Chủng loại thuốc bảo

vệ thực vật sử dụng ở Việt Nam rất đa dạng, có khoảng 269 hoạt chất với gần 735 tên thương mại Tuy chủng loại nhiều như vậy, song người nông dân thường sử dụng theo thói quen và do hiểu biết hạn chế về mức độ độc hại của thuốc bảo vệ thực vật nên đã dẫn đến việc lạm dụng thuốc hoá học trong một thời gian dài Nhiều loại thuốc cũ và độc như: wofatox, lindan, DDT, dichlovos, bassan cùng một lượng lớn các loại thuốc khồng rõ nguồn gốc vẫn được sử dụng Hiện nay trên thị trường thuốc bảo vệ thực vật đang lưu hành có tới 28 hoạt chất c á n sử dụng, 19 hoạt chất hạn chế sử dụng

Việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật ở diện rộng với số lượng lớn, cùng với những hạn chế hiểu biết về thuốc bảo vệ thực vật đã gây ra nhiều thiệt hại to lớn về kinh tế cũng như ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi sinh và sức khoẻ cộng đồng Hoá chất bảo vệ thực vật là các hợp chất độc, rất khó phân huý, chúng tồn tại trong một thời gian dài, tổn đọng trong các sản phẩm nông nghiệp, tích tụ trong đất và trong nguồn nước là nguyên nhân chính gây ra những vụ ngộ độc lớn cho con người cũng như động vật Ngay cả vói cây trồng khi nhiễm một lượng thuốc cao sẽ làm cho tỷ lệ nảy mầm, sức nảy mầm bị giảm sút, cây mọc lên còi cọc, rễ ngắn phát triển không bình thường Nó còn làm giảm tính chống chịu của cây trổng, ảnh hưởng đến phẩm chất nông sản, gây nẻn hiện tượng ngộ độc ở cây trổng như lá khô cháy, quăn queo, rụng hoa trái do ngộ độc cấp tính, giảm sinh trưởng và tính chống chịu do ngộ độc mãn tính

1.4.2 Biện pháp đấu tranh sinh học

Do những tác động của các thuốc hoá học, hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt nam nhiều hướng nghiên cứu mới đã được hình thành, trong đó được ưu tiên hàng đầu chính là hướng nghiên cứu về các chế phẩm phòng trừ có nguồn gốc sinh học bởi tính ưu thế của chúng so với hoá chất bảo vệ thực vật : có tác dụng chọn lọc cao, thường không độc hoặc độc thấp đối với người, động vật và thực vật, một sò' lớn có tác dụng nội hấp, thời gian bán huỷ ngắn do đó không gây ô nhiễm môi trường Bởi vậy, đây được coi như một biện pháp hữu hiệu mở ra một triển vọng to lớn trong việc phòng trừ các bệnh gây hại mùa màng và khắc phục những hậu quả do chất hoá học gây ra Hiện nhiều hợp chất sinh học kháng nấm đang đuợc sử dụng rộng rãi trong bảo vệ thực vật như blastixidin s, kasugamyxin, polioxin, validamyxin trong đó đáng chú ý là các chế phẩm phòng trừ nấm có nguồn gốc từ xạ khuẩn

1.2 XẠ KHUẨN VÀ CÁC CHẤT KHÁNG SINH CÓ NGUồN G ố c XẠ KHUAN t r o n g

VIỆC PHÒNG TRỪNẤM GÂY HẠI THỰC VẬT

1.2.1 Xạ khuẩn

1.2.1.1 Đặc điểm chung của xạ khuẩn

Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn phân bô' rộng và đóng vai trò quan trọng trong tự nhiên Trung bình trong mỗi gam đất nói chung thường có trên 1 triệu mầm xạ khuẩn [16] Phẩn lớn xạ khuẩn là các tế bào gram dương, có tỷ lệ G+C cao (>70%), hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh (khuẩn ty) 60 - 70% xạ khuẩn phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh Trong sô' 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có trên 80% là do xạ khuẩn sinh ra [17]

Xạ khuẩn thuộc nhóm dị dưỡng, phần lớn ưa khí, ưa ẩm, phát triển tốt ở mòi trường trang tính hoặc hơi kiểm Mặc dẩu thuộc vi khuẩn nhưng xạ khuẩn có cấu tạo hệ sợi như

vi nấm, tiết diện của sợi có kích thước tương tự vi khuẩn Thành tế bào không chứa xenluloza hay kitin, tế bào phân chia theo kiểu phân bào vô ty Khuẩn lạc xạ khuẩn thường

có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ Khuẩn lạc có nhiều màu sắc khác nhau như : đỏ, da cam, vàng, xám, trắng Các loài xạ khuẩn có thể tạo ra các sắc tô' hoà tan trong môi trường nuôi cấy

Hộ sợi của xạ khuẩn gồm khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh Khuẩn ty cơ chất cắm sâu vào môi trường để lấy nước và thức ãn Khuẩn ty cơ chất phát triển một thời gian thì dài ra trong không khí hình thành những khuẩn ty khí sinh Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các cuống sinh bào tử Cuống sinh bào tử có nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, lượn sóng, xoắn, móc Bào tử xạ khuẩn có dạng hình trụ, hình cầu hình que, hình elip, bề mặt của bào tử xạ khuẩn có dạng trơn nhẵn, xù xì, có vảy,

có gai, có lông [18] Các đặc điểm về cuống sinh bào tử, hình dạng và kích thước của bào

tử đóng vai trò quan trọng trong việc định tên xạ khuẩn

1.2.1.2 Phàn loại xạ khuẩn

Phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy

Dựa trên đặc điểm hình thái, xạ khuẩn thường được chia thành 4 nhóm chính:

• Nhóm xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt: sinh sản bằng bào tử và phân hoá thành khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất

• Nhóm xạ khuẩn có các bào tử nang : khuẩn tv phân chia theo các hướng vuông góc với nhau, tạo ra cấu trúc tương tự nang bào tử

• Nhóm xạ khuẩn dạng Nocardia: sinh sản bằng cách phân đốt khuẩn ty.

• Nhóm xạ khuẩn tuơng tự Corynebacterium và cầu khuẩn : tế bào có hình chữ

V, T hoặc dạng cầu, thông thường không có khuẩn ty

Hầu hết các chi xạ khuẩn được mô tả hiện nay đuợc phân chia tùy theo sự khác nhau về đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy như: màu khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty

cơ chất, sắc tố hoà tan, sự có mặt của khuẩn ty cơ chất, hình dạng và kết cấu mặt bào tử, đặc điểm cuống sinh bào tử và sự phân đốt của khuẩn ty Tuy nhiên, do cùng một loài

xạ khuẩn có thể có biểu hiện khác nhau về hình thái hay những loài khác nhau có thể giống nhau về mật hình thái nên trong phân loại xạ khuẩn người ta phải dùng thèm các chỉ tiêu bổ sung khác như các đặc điểm sinh lý, sinh hoá, miễn dịch học hay sinh học phân tử

Phân loại dựa trên đặc điểm sinh lý sinh hoá

Khi phân loại xạ khuẩn đến loài người ta sử dụng hàng loạt các đặc điểm sinh lý sinh hoá như khả năng đổng hoá các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu đối với chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống enzym, mối quan hệ với pH, nhiệt độ, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với các chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính đối kháng và nhạy cảm vói chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn

Tuy nhiên, do tính không ổn định và biến dị cao của xạ khuẩn, ngay nay, để phân loại chính xác và phát hiện loài mới người ta phải sử dụng các đặc điểm này dựa trên phân loại số, hoặc tiến hành so sánh các cao phân tử ADN, ARN, protein hay giải trình tựrARN 16S

Hệ thống phân loại chi Streptomyces dùng trong đê' tài

Đó là hệ thống phân loại và định dạng các loài Streptomyces của ISP [20]] Hệ

thống phân loại của ISP dựa trên các tiêu chuẩn sau:

- Màu sắc khuẩn lạc: Màu sắc khuẩn lạc được chia thành các màu: màu trắng (white - W), màu xám (Gray - Gy), màu đỏ (Red - R), màu vàng (Yellow - Y), màu xanh

lá cây (Green - Gn), màu xanh da trời (Blue - B), màu tím (V) Trong trường hợp mà màu sắc khuẩn lạc rơi vào giữa hai màu thì cả hai màu đó đều được ghi nhận (chẳng hạn, GyW)

- Sắc tố melanin: Xạ khuẩn được chia thành hai nhóm là: nhóm có khả năng sinh melanin và nhóm không có khả nãng sinh meianin

- Sắc tô' khuẩn ty cơ chất: Cũng được chia thành hai nhóm: nhóm xác định đuơc vànhóm không xác định được Trường hợp mà màu sắc nhạt như là: vàng nhạt, vàng dầuhoặc là xám vàng được xếp vào nhóm không xác định

- sắc tố hoà tan: Các loại xạ khuẩn được chia thành hai nhóm, nhóm sinh sắc tô hoà tan vào mổi trường và nhóm không sinh sắc tố hoà tan.

- Hình thái cuống bào từ Các loài trong chi Streptomyces được chia thành ba nhóm: Rectịỷỉexibiles (RF) - cuống bào tử thẳng hay lượn sóng, Retinaculiaperti (RA) - cuống bào tử xoắn đơn hình móc câu, và Spirales (S) - cuống bào tử xoắn.

- Bể mặt bào tử : dựa trên bể mặt bào tử, xạ khuẩn được phân thành các nhóm là: nhán (Smooth - Sm) nhóm bề mậl bào tử dạng nhẩn, gai (Spiny -Sp), nhóm bề mặt bào tử dạng gai, mụn cóc (Warty - Wa), nhóm bể mật bào tử dạng xù xì, và lông (Hairy - Ha) nhóm bề mặt bào tử dạng sợi

- Sử dụng nguồn cacbon: Khả năng sử dụng mỗi nguồn cacbon là positive (+), không có khả năng sử dụng là negative (-), và có thể sử dụng hoặc không sử dụng thì kí hiệu là (±) Ngoài ra khi cần thiết có thể quan tâm đến các đặc điểm sinh lý sinh hóa khác như khả năng khử nitrat, khả năng sinh chất kháng sinh, v.v

1.2.2 Vai trò của các chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn trong phòng trừ nấm gây hại thực vật.

1.2.2.ỉ Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chất kháng sinh trong phòng chống các bệnh thực vật do vi sinh vật gây ra

Từ cuối những năm 1940, khám phá về giá trị to lớn của penixilin và các chất kháng sinh khác đã mở ra một kỷ nguyên mới cho lịch sử y học Những thành tựu đó cũng mở ra xu hướng đầy triển vọng trong sử dụng chất kháng sinh để bảo vệ thực vật

Năm 1954, Trung Quốc đã phân lập được chủng xạ khuẩn Streptomyces.sp

5.406 có khả nâng sinh ra chất kháng sinh trong phòng chống bệnh thối rễ Trung Quốc đã áp dụng trên 6 triệu ha trổng bông và đã thu được những kết quả khả quan Ngoài ra, Trung Quốc còn ứng dụng chế phẩm YIB (yield increasing bacteria) trên 6,7 triệu ha ở 30 tỉnh khác nhau Chế phẩm này không những phòng chống được bệnh do

vi khuẩn mà còn chứa các hormon thực vật như IAA, giberelin làm tãng năng suất cây trổng Sau đó cũng tại Trung Quốc, jinganmyxin, một chất kháng sinh được tách chiết

từ loài xạ khuẩn Streptomyces hygroscopicus, đã được ứng dụng rất thành công trong

phòng chống bệnh thối rễ Hơn 10 nhà máy công nghiệp của Trung Quốc hiện đang sản xuất chế phẩm thương mại này

ở Nhật Bản người ta đã có những chế phẩm chống đạo ôn, khô vằn rất có hiệu quả như blastidin s, kausugamyxin, valiđamyxin

Ở Ấn Độ, người ta đã ứng dụng chế phẩm từ loài nấm Trichoderma viride cũng

như dùng aureofulvin để phòng chống một số mầm bệnh từ đất và bệnh ở rễ như

Rhizoctonia spp và Fusarium spp.

Nhiều nước khác như Hàn Quốc, Malaysia, Thái Lan, Pakistan cũng đã rất thành công trong việc ứng dụng các chất kháng sinh để phòng chống các bệnh do vi sinh vật gây ra ở thục vật.

ơ Việt Nam cũng đã có những công trình nghiên cứu và ứng dụng chất kháng

sinh trong phòng chống các bệnh do vi nấm gày ra ở thực vật Đây đang là một hướnơ

mới nhằm tìm ra một biện pháp hữu hiệu trong phòng trừ các bệnh gày thiệt hại cho mùa màng và khắc phục những hạn chế của hoá chất bảo vệ thực vật

1.2.2.2 Các nhóm chất kháng sinh chính có nguồn gốc xạ khuẩn

Bảng 1 : Các nhóm chất kháng sinh chính có nguồn gốc xạ khuẩn

sở

Đốitượng Cơ chế tác độngNhóm |ỉ - Lactam

Vi khuẩn gram (+)

ức chế tổng hợp peptiđoglican, của thành

Vi khuẩn gram (-), một sô' nấm

Vi khuẩn gram (+),gram (-)

ức chế ngược tổng hợp protein

đường aminosaccaroza

1

Vi khuẩn gram (+) ức chế tổng hợp protein

tuyến trùng.

Tác động lên các thành phần sterol và ergosterol tạo nên các lỗ

Cấu trúc đơn giản hơn ức chế tổng hợp protein

1.2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh ở xạ khuẩn

Thành phần môi trường lên men

• Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Nguồn cacbon thường là các đường đơn: glucoza, fructoza hay các loại đường kép như: saccaroza, maltoza, lactoza hoặc cũng có thể là các loại tinh bột, các chất có thành phần không xác định như ri đường Trong tất cả các nguồn cacbon thì glucoza

là nguồn cacbon dễ tiêu hoá, nhưng nó thường gây nên hiện tượng kiềm chế dị hoá trong tổng hợp chất kháng sinh ở một ngưỡng nồng độ nào đó Tuy nhiên có thể khắc phục đuợc hiện tượng này bằng việc bổ sung liên tục một lượng nhỏ glucoza theo định

kỳ, mà không dẫn đến tích lũy các chất trao đổi ức chế Do đó có thể tiến hành sản xuất chất kháng sinh từ nguồn cacbon là glucoza

• Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nguồn nitơ: tồn tại ở hai dạng vô cơ và hữu cơ Nguồn nitơ hữu cơ gồm cao nấm men, cao thịt, pepton, bột đậu tương Nguồn nitơ vô cơ thường dùng là dạng muối amôn (NH4+) hoặc nitrat (N 0 3 ) Thông thường quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh đòi hỏi cả hai nguồn nitơ trong môi trường

• Ảnh hưởng của nguồn photpho vô cơ

Bên cạnh hai nguồn c và N thì photphat vò cơ được xem như là yếu tô tham gia điều chỉnh sinh tổng hợp chất kháng sinh ở xạ khuẩn [2] Nồng độ photphat thích hợp cho tổng hợp chất kháng sinh thường không vượt quá lOmg/ml [13] Nồng độ photphat cao sẽ làm tăng tổng hợp axit nucleic trong tế bào do đó rút ngắn pha tổng hợp và kéo dài pha dinh dưỡng, hoặc lượng photphat dư thừa sẽ ức chê quá trình tổng hợp các enzym tham giam vào tổng hợp enzym Tuy nhiên cũng có những ngoại lệ như : sinh

tổng hợp nocaxiđin bởi Nocardia uniỷormic đòi hỏi một nồng độ photphat vô cơ cao

• Chất lượng bào tử và giống sinh dưỡng

Thực nghiệm cho thấy sinh tổng hợp chất kháng sinh không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men mà còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng, cụ thể là tuổi và khả nãng đồng đều về mặt di truyền cũng như hoạt tính trao đổi chất của giống

Tuổi của giống cho hiệu suất cao nhất là 24 giờ, tuy nhiên thời gian nuôi còn phụ thuộc vào chủng và tuổi của bào tử giống Lượng giống cấy truyền sang môi trường lên men phụ thuộc vào chủng xạ khuẩn và thành phần môi trường nhân giống (thường là từ 2 - 10%)

1.2.2.4 Tách chiết và tình chế chất kháng sinh

Việc chọn phương pháp tách chiết và tinh chế chất kháng sinh phụ thuộc vào bản chất của chủng sản xuất cũng như tính chất lý hoá của chất kháng sinh

• Tách sinh khối từ dịch nuôi cấy

Dịch nuòi cấy là hệ thống 2 pha: dịch lỏng và tế bào Có chất kháng sinh không hoà tan trong dịch lọc, có loại hoà tan và tích lũy trong môi trường trong quá trình lên men hoặc tích lũy trong tế bào Do vậy trước khi tách các pha cần thiết phải xử lý trước, chủ yếu là điều chỉnh pH dịch nuôi để giữ chất kháng sinh trong sinh khối hay cho nó tiết vào dịch lọc

• Tách chiết chất kháng sinh từ khuẩn ty

Thông thường chất kháng sinh trong sinh khối được chiết bằng các dung mòi hưu cơ như etanol, metanol, n-butanol, etylaxelat, axeton Hiệu quả tách này phụ thuộc vào khả năng hoà tan của chất kháng sinh trong dung môi Axeton là dung mòi

có độ phân cực thấp nhất thường được sử dụng để tách chiết chất kháng sinh có hiệu quả Vói các dung môi này thì phương pháp thử hoạt tính là phương pháp khuếch tán trẻn thạch bằng khoanh giấy lọc

• Tách chiết chất kháng sinh từ dịch lọc

Các chất kháng sinh trong dịch lọc thường được tách chiết bằng các dung môi phân cực Muốn tách có hiệu quả ta phải chọn được dung môi thích hợp và điều kiện môi trường tách (pH) thích hợp mà ở đó chất kháng sinh hoà tan tốt nhất trong dung môi Dung môi có chứa chất kháng sinh được cô chân không ờ nhiệt độ thấp để loại dung môi nhằm thu chất kháng sinh thô [4]

• Tinh c h ế chất kháng sinh

Kết tinh là phương pháp cơ bản nhất để tinh chế chất kháng sinh và tách chiết các sản phẩm phân tích để xác định tính chất hoá lý của chúng Đây là phương pháp quan trọng nhất để tinh chế chất kháng sinh Sự kết tinh có thể thực hiện bằng cách giảm nhiệt độ hay cải biên hệ dung môi Dung môi chứa các vệt kháng sinh cuối cùng của quá trình kết tinh có thể được loại bỏ bằng cách cô chân không Việc bảo đảm tinh chế chất kháng sinh có độ tinh sạch cao có thể được thực hiện bằng sắc ký Đây là phương pháp tinh chế các chất kháng sinh cho hiệu quả cao nhất

ỉ.2.2.5 ứng dụng xạ khuẩn và các chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn trong phòng trừ nấm gày bệnh thực vật

Trong thiên nhiên, các loai vi sinh vật đối kháng ức chế hoạt động hoặc tiêu diệt

vi sinh vật gây bệnh chủ yếu bằng các chất kháng sinh là các sản phẩm trao đổi chất của chúng Sự đối kháng của các vi sinh vật trong đất là cơ sờ cúa biện pháp đấu tranh sinh học phòng chống bệnh cây

Thông thường, một loài xạ khuẩn đối kháng có thể ức chế một hoặc một vài

loại vi nấm Đặc biệt có nhũng loài có hoạt phổ rộng như loài s lavendulae huinansis

có hoạt tính ức chế mạnh cả vi khuẩn gram (+) lẫn gram (-) và nấm gây bệnh Tuy nhiên việc sử dụng các chủng có phổ rộng phải thận trọng đế tránh làm ức chế các vi sinh vật có lợi trong vùng rễ đảm bảo việc cân bằng khu hệ vi sinh vât đất

Xạ khuẩn chống nấm ngoài việc tiết ra các chất kháng sinh, còn tác động lẻn khu

hệ vi sinh vật thòng qua các enzym dung giải [29] Ngoài ra nhiều xạ khuẩn còn tiết ra

các chất kích thích sinh trưởng thực vật cũng như sinh trường của khu hệ vi sinh vật hữu ích trong vùng rễ.

Hầu hết các chất kháng sinh đã được tìm thấy đều có nguồn gốc từ xạ khuẩn Được sử dụng trong bảo vệ thực vật chậm hơn so với việc dùng trong y học và chăn nuôi thú y, song các chất kháng sinh có triến vọng to lớn trong thực tế sán xuất bời ví chúng

có nhiều ưu việt so với các hoá chất bảo vệ thực vật: có tác dụng chọn lọc cao, có thế tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh ngay ờ nồng độ thấp, có tác dụng nhanh, thường không độc hoặc độc thấp đối với người, động vật và thực vật, có khả nãng ức chế vi sinh vật đã kháng thuốc hoá học, một sô' lớn có tác dụng nội hấp, thời gian bán huỷ ngắn do đó không gây ô nhiễm môi trường Chất kháng sinh và dịch lên men các chủng sinh chất kháng sinh được dùng đế xử lý hạt giống hay hổ rễ cây con trước khi gieo trổng nhằm tiẻu diột nguồn bệnh bẻn trong và ngoài hạt, diệt bệnh ở các bộ phận trên mặt đát của cây và làm sạch mầm bệnh trong đất Tuy nhiên, để khấc phục tính chóng nhờn thuốc của vi sinh vật, ngoài việc định kỳ thay thuốc, người ta còn dùng hỗn hợp các chất kháng sinh Bên cạnh đó còn cần chú ý tới việc đảm bảo sự cân bằng của khu hệ vi sinh vật hữu ích trong đất

Ngày nay các chất kháng sinh có hiệu quả trong bảo vệ thực vật thường được sừ dụng dưới dạng các chế phẩm như : thuốc chống nãÌTi blastixidin, kasugamyxin , thuốc chống vi khuán streptomyxin, oxytetraxyđin thuốc trừ sảu avermectin B, milbemctins , thuốc diệt cỏ bilanaíos và các chất điéu hoà sinh trưởng của cây như là giberelin [30] ở Nhật Bản người ta đã có những chế phẩm chống đạo ôn và khỏ vằn rất có hiệu quả như:

blastidin s chiết từ s griseochromogenes, kaugamyxin từ s kavsugaensis, valiđamyxin từ

s hvgroscopicus ở Ân Độ aureofulvin được sử dụng để chống bệnh thối cổ rễ ở Anh và

một sớ nước châu Âu người ta cũng đã sử dụng gnseoíulvin trong nông nghiệp để chống các bệnh ở cây trổng Tại Việt Nam hiện đã sử dụng nhiều loại thuốc như: valiđamyxin chống bệnh khô vằn, polyoxin complex chống bệnh đen lá, ningnamyxin chống bệnh héo

rũ, streptomyxin chống bệnh bạc lá hại lúa Mặc dầu đã thu được những thành tựu nhất định, song việc sử dụng chất kháng sinh trong lĩnh vục bảo vệ thực vật ở nước ta còn ờ phạm vi hẹp, bời tập quán canh tác chi quen dùng một số loại hoá chất bảo vệ thực vật nhất định Bên cạnh đó giá thành của các chế phấm sinh học chưa phù hợp với điều kiện sản xuất cùa bà con Do đó cẩn có sự phối hợp việc nghiên cứu, sản xuất các chế phẩm phòng trị sinh học với việc truyền thông, xây dựng phương pháp canh tác mới nhằm thu được hiệu quá to lớn trong phòng chống dịch bênh, nâne cao năng suất cây trồng và hiệu quá kinh tế, đồng thời bảo vệ mỏi sinh và sức khoé cộng đổng

Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HOÁ CHẤT

2.1.1 Nguyên liệu

2.1.1.1 Mầu cây

Mẫu nghiên cứu là các đối tượng cây trồng bị bệnh khác nhau (cây công nghiệp ngắn ngày, cây lương thực, cây ăn quả, cây rau và các loại quả tươi bị nhiễm mốc tự nhiên) Các mẫu được thu thập tại những địa điểm khác nhau: Hà Tây, Bắc Ninh, Viện Rau Quả, Trường Đại học Nông Nghiệp I, Hà Nội theo thời vụ trong nãm 2003 dựa trên các triệu chứng bệnh điển hình (vết đốm, héo rũ, biến màu, thối hỏng), từ đó đã thu được 85 mẫu bệnh

2.1.1.2 Mẫu đất

19 mẫu đất được lấy từ độ sâu 5 - 10 cm ờ các địa hình khác nhau: đất núi, đất bãi trong và ngoài đê, đất ruộng lúa, đất vườn ở các vùng khác nhau thuộc hai tỉnh Bắc Ninh và Nghệ An Từ đó đã phân lập được 110 chủng xạ khuẩn

2.1.1.3 Vi sinh vật

- Bacillus subtilis, E coli, Aspergillus và chủng xạ khuẩn Streptomvces hygroscopicus (TC 5 - 4 ) nhận được từ Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường

Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quớc Gia Hà Nội

- Staphyloccus aureus nhận được từ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Hà Nội

- Fitsarium oxysporum nhận được từ Bảo tàng Giống chuẩn, Trung tâm Công

nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Pseudomonas solanacearum nhận được từ Viện KHKT Nông Nghiệp.

- Rhiioctonia solani, Sclerotium rolfsii, Penicilium nhận được từ Bộ môn Bệnh

cây và Nông dược Trường Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội

- Các hoá chất khác: KH2P 0 4, KC1, FeS04.7H20 , M gS04.7H20 NaNO,

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị

Cân điện 0,00 lg

Kính hiển vi điện tử truyền qua

Kính lúp điện soi nổi dùng điện

(Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới)

Kính hiển vi quang học OLYMPUS

Tủ thổi khí vô trùng

Máy đo pH Delta 320

Kính hiển vi điện tử quét JEOL

Máy đo quang phổ tử ngoại

Nồi hấp cao áp, tủ khử trùng khô

2.1.4 Các còng thức mỏi trường

Mòi trường phản lập và giữ giống nấm

Mối trường khoai tây (PDA - Potato Dextrose Ạgar) (g/1): Khoai tâv miếng -

200, thạch - 18, đường - 20, nước llit, pH 7 - 7,4

Mối trường CLA (Camation Leaf Agar)

- Các mảnh lá hoa cẩm chướng (1 mảnh/ 2ml = 3 - 4 mảnh/đĩa)

- Môi trường WA (Water Agar): đun 15g WA trong 800ml nước cho tan thạch

Bổ sung nước cho đủ 1000 ml Hấp khử trùng ờ 121°c trong 20 phút, để nguội khoảng 40uc rồi rót ra đĩa Petri

- Đặt 3 - 4 mảnh/ đĩa rót môi trường WA đã khử trùng vào đĩa Petri

Môi trường c z (Czapek - Dox - Ạgar) (g/1): N aN 03 - 2; KH2P 0 4 - 1;

M gS04.7H:0 - 0,5; KC1 - 0,5; FeS04-0,01: thạch - 20; nước máy - 1 lít

Môi trường phán lập, giữ giống và nghiên cứu xa khuẩn:

Mối trường ĨSP - 4 (g/1): tinh bột tan - 10: K;HPOị - 1.0; M gS04.7H:0 - 1,0: NaCl - 1,0; (NH4 )2S 0 4- 2; CaCO;,- 2; nước - 1 lit; dung dịch khoáng - lml; pH 7 - 7,2; thạch - I8g

Thụy Điển Nhật Bản Nhật Bản

Nhật BảnAnhNhậtNhậtNhật

Mỏi trường Gauze I (g/1): tinh bột tan - 20; K2H P 04 - 0,5; M gS04.7H:0 - 0 5' NaCl - 0.5; (NH4)2S 04- 2; KNCV 0,5; FeS04- 0,01; nước - llit; pH 7 - 7.4; thach 18g.Mối trường giữ giống: có thêm (g/1): pepton - 5; cao nấm men - 10.

Mỏi trường Gauze II (g/1): Nước chiết thịt - 30ml: pepton - 5; NaCI - 5: 2lucoza

Mối trường ISP-9 ( g/1): (NH4)2S 0 4 - 2,64; KH2P 0 4 - 2,38; K2HPO, - 5,65;

M gS04- 1; dung dịch muối B - 1 ml; nguồn cacbon - 10; thạch - 20; nước - llit: pH 6,8

Dung dich muối A

- Dung dịch muối cơ sờ (g/1): K2H P04 - 3 ; MgS04 - 3 ; NaCl - 3 ; CaCO-, - 6; nước cất 1000 m l

- Dung dịch muối vệt (g/I): CuS04 - 6,4; FeS04 - 1.1: MnCl2 - 7.9: nước cất 1000

ml.

- Cách làm : Lấy 30ml dung dịch muối cơ sở và 0.1 ml dung dịch muối vệt phản vào bình nón 250ml Bổ sung thèm 20ml nước cất sao cho mỏi bình có 50ml dung dịch hỗn hợp muối (dung dịch muối A) chinh pH 7

Dung dich khoáng có thành phần (g/lOOml nước); FeS04.7H:0 - 0 1'MnCl2.4H20 -0,1; ZnS04.7H20 - 0,1

Các môi trường lên men xốp:

Môi trường: Gạo + Dịch khoáng

Môi trường: Gạo + Nước

Môi trường: Bột gạo + Trấu + Bột đậu tương

Môi trường: Bột đậu tương + Trấu

Môi trường: Bột gạo + Trấu

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.2.1 Thu mẫu bệnh thực vật, phản lập nấm và định tên

22.1.1 Phán lập nấm gây bệnh

Phân lập nấm gây bệnh (từ các mẩu cây trồng):

Chọn mẫu bệnh có triệu chứng điển hình, mới Rửa mẫu bệnh sạch đất cát dưới vòi nước Cắt chọn mảnh mô bệnh thích hợp Khử trùng bề mặt các mảnh mô trên bằng cồn (ethanol 70%) trong vòng 3 phút Rửa lại bằng nước cất vô trùng Thấm khô mảnh

mô bằng giấy thấm vô trùng Dùng dao mổ vô trùng cắt các mảnh mỏ trên thành các mảnh nhỏ 1 - 3 mm (chứa cả phần mô bệnh và mô khoẻ) Dùng panh vô trùng đặt các mảnh mô nhỏ trên vào môi trường PDA, trên đĩa petri Ghi chú cẩn thận bằng bút viết kính: ngày, cây, bệnh Để đĩa môi trường đã đặt mẫu trong tủ ấm (30°c ) Theo dõi sự phát triển của sơị nấm mọc ra từ mô bệnh Khi nấm đã phát triển từ mô bệnh ra môi trường, lấy phần đỉnh sợi nấm chuyển sang môi trường thích hợp: PDA hoặc c z Thu nhân giống thuần khiết: lấy phần đỉnh sợi nấm mọc trên đĩa thạch, cấy truyền sang các ống thạch nghiêng chứa môi trường Czapek khi đã nhận được giống thuần khiết thì bảo quản trong tủ lạnh ở 4°c

Phân lập nấm gã\ thối quả

Để phàn lập chủng thuần khiết, tách một ít khuẩn lạc từ vết bệnh cho vào bình nón chứa 50ml nước vô trùng lắc đều, rồi dùng pipet vô trùng hút dịch pha loãng nấm, nhỏ 1 - 2 giọt lên các đĩa petri chứa môi trường PDA (có bổ sung streptomvxin) gạt đều các giọt dịch Nuôi 2 - 3 ngày ở nhiệt đô 28 - 30°c

Dung dich muối B (%): CuS04 0,64; FeS04 0,11; MgCụ 0.79; nước

-Thu nhận giống thuần khiết: từ các khuẩn lạc mọc trẽn đĩa thạch cày truyền sang các ống thạch nghiêng (chứa môi trường PDA hoặc CZ) Khi đã nhận đươc aiốngthuần khiết thì bảo quản trong tủ lạnh ở 4l’C để định tên và làm các thí nghiệm tiếptheo.

2.2.1.2 Xác định các đặc điểm phàn loại, đặc điểm hình thái và định tẻn.

• Các đặc điểm hình thái nấm được quan sát bằng mắt thường, kích thước của khuẩn lạc nấm đuợc đo bằng thước đo Các chi tiêu cần xác định :

- Hình dạng mặt trước khuẩn lạc

- Hình dạng và màu sắc bào tử

- Hình dạng mặt sau khuẩn lạc

- Sự hình thành sắc tố

• Các đặc điểm phân loại được quan sát dưới kính hiển vi

- Làm tiêu bản, soi dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử, mô tả hìnhdạng kích thước sợi nấm và cơ quan sinh bào tử, định tên sơ bộ tới chi

- Định tên đến loài

- Chụp ảnh khuẩn lạc, sợi nấm và cơ quan sinh bào tử

2.2.2 Phàn lập và tuyển chọn xạ khuẩn

2.2.2.1 Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski

Cân lg đất cho vào bình nón 50ml chứa 9ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc

30 phút Dùng pipet vô trùng hút 0,5ml dịch đất sang ống nghiệm có chứa 4.5ml nước

vô trùng và tiếp tục pha loãng đến 10"\ 10 ’, , 10"6 Từ mỗi nồng độ pha loãng ờ các nồng độ 10'3 đến 10‘6 , nhỏ 0,lm l sang đĩa petri chứa môi trường ISP4 Dùng que gạt vò trùng trang đéu sau đó nuôi ở nhiệt độ phòng từ 4 - 7 ngày Trên mỗi mẫu đất khuẩn lạc của xạ khuẩn được cấy 3 pha sang dĩa petri chứa môi trường ISP4 để làm sạch Sau

đó nuôi ở nhiệt độ phòng từ 4 -7 ngàv, từ các khuẩn lạc được làm sạch cấy truyền sang ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng ISP- 4 và Gauze I tiếp tục nuôi ờ điều kiện trên trong 1 0 - 1 4 ngày Theo ISP màu sắc khuẩn ty khí sinh của các chủng xa khuẩn được chia thành 8 nhóm màu: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh Blue (B) nhóm xanh da trời Violet (V) nhóm tím, và nhóm màu không xác định (X )

22.2.2 Xác định hoạt tính kháng sinh

• Phương pháp thỏi thạch (dùng đ ể sơ tuyển xạ khuần).

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP 4 và Gauze I trong hộp petri sau 7 ngày dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch đặt vào hộp petri đẫ cấy vi sinh vât kiểm định Để vào tủ lạnh 4-5h cho chất kháng sinh khuếch tán vào môi trường thạch sau đó để vào tủ ấm Vi khuấn kiểm định nuôi ở 37"c, nấm men và nấm mốc nuôi ờ 28-30°C, đọc kết quả sau vài ngày Hoạt tính kháng sinh được xác định dựa vào kích thước vòng vô khuẩn ( D - d, mm ), D là kích thước vòng vô khuẩn và d là đường kính thỏi thạch

• Phương pháp đục lỗ ( Xác định hoạt tính kháng sinh trong dịch thể).

Dùng khoan nút chai đục các lỗ trên môi trường thạch đã cấy vi sinh vật kiểm định trong hộp petri Nhỏ vào các lỗ khoan dung dịch cần thử (các bước tiếp theo tiến hành như phương pháp thỏi thạch)

• Phương pháp khoanh giấy lọc (Xác định hoại tính kháng sinh trong dung môi).

Khoanh giấy lọc F8 có đường kính 6mm được tẩm một lượng dịch CKS (lml/10 khoanh giấy lọc) Sau đó sấy khô ở 40°c Đặt khoanh giấy lọc đã tẩm CKS vào hộp petri đã cấy vi sinh vật kiểm định (Các bước tiếp theo giống phương pháp thỏi thạch)

2.2.2.3 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh

Từ ống thạch nghiêng giống đã hoạt hoá đuợc cấy truyền sang các binh nón dung tích 250 ml chúa 100 ml môi trường Gauze I và nuôi lắc 220 vòng/ phút trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng

Giống phát triển tốt được cấy truyền với tỷ lệ 10% sang binh nón dung tích 250

ml chứa 80 ml môi trường Gauze I dịch thể Quá trình lên men kéo dài 96 giờ ở nhịêt

độ phòng trên máy lắc 220 vòng/ phút Sau đó thử hoạt tính kháng sinh trong dịch lọc

2.2.3 Bảo quản giống

Các chủng xạ khuẩn đã lựa chọn được cấy lên mõi trường thạch nghiêng Gauze

I nuôi ở nhiệt độ phòng Sau 10 - 14 ngày khi xạ khuẩn mọc tốt, các ống giống được bảo quản trong tủ lạnh ờ 4 - 6°c Sau 2 - 3 tháng cấy truyền lại một lần

Để bảo quản lâu giống được giũ trong ống cát, trong paraíin lỏng vô trùng giữ lạnh sâu trong glyxerin hoặc đông khô, bảo quản được từ 6 tháng đến 2 năm

2.2.4 Nghiên cứu các đặc đièm sinh học và phàn loại của xạ khuẩn

2.2.4.1 Đặc điểm hình thái

Quan sát hình thái cuống sinh bào tử

Xạ khuẩn được nuôi cấy trẻn môi trường Gauze I có gãm lamen nghiêng trên bề mặt môi trường Sau 7-9 ngày nuôi ở nhiệt độ phòng lấy ra quan sát hình dạng chuỗi sinh bào tử trên lamen dưới kính hiển vi quang học [36] Chuỗi sinh bào tử có các dạng

thẳng hay hơi lượn sóng kí hiệu là RF (Rectusflexibilis), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA (Ratinaculiapert ) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là s (.Spira) [37].

Bề mặt bào tủ

Dùng màng cacbon đặt trực tiếp lên bề mật khuẩn ty khí sinh có bào tử, sau đó quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử quét

Bào tử có hình dạng: tròn, ovan, elip, hình que [38]

Bề mặt bào tử xạ khuẩn có các dạng: Nhẵn ký hiộu là Sm (Smooth), dạng mụn cóc ký hiệu là Wa (Warty), dạng gai ký hiệu là Sp (Spiny) và dạng tóc ký hiệu là Ha (Hairy)

2.2.4.2 Đặc điểm nuôi cấy

Màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và sắc tố tan

Xạ khuẩn đuợc nuôi cấy trên môi trường: Gauze I, Gauze II, ISP-2, ISP-4, 79 và khoai tây (KT) ờ nhiệt độ phòng Sau 7, 14, 21 ngày lấy ra quan sát màu khuẩn ty khí sinh (K TK S), khuẩn ty cơ chất (KTCC) và sắc tố tiết ra môi trường

Sự hình thành sắc tố melanin [40]

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP-6 ở nhiệt độ phòng Bắt đầu quansát màu của môi trường sau 24 giờ cho đến ngày thứ 14 Nếu sinh melanin, màu cùamôi trường sẽ chuyển từ màu vàng nhạt sang màu nâu đậm cho đến màu đen

2.2.4.3 Đặc điểm sinh lý sinh hoá

Nhiệt độ tối ưu

Xạ khuẩn cấy trên môi trường thạch nghiêng Gauze I và nuôi ờ các nhiệt độ: 25°c, 28°c, 37°c Khả năng sinh trưởng được xác định sau 7-10 ngày nuôi

Khả năng sinh enzym ngoại bào

Xác định hoạt tính các enzym ngoại bào bằng cách nuôi xạ khuẩn trên môi trường chứa cơ chất dùng để xác định hoạt tính enzym

- Tinh bột tan (xác định hoạt tính amylaza)

- Cazein (xác định hoạt tính proteaza )

- CMC (xác định hoạt tính xenluloza)

- Gelatin (xác định hoạt tính gelatinaza ).

Khả năng chịu muối

Cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng ISP-I có bổ sung thêm NaCl với

các nồng độ 0,5; 1; 3; 5; 7; 8; 9; 10; 11 và 12 (%), sau 7-10 ngày lấy ra quan sát sự

sinh trưởng

Khả năng sử dụng các nguồn cacbon

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên mổi trường ISP-9 có bổ sung 1% các nguồn

đường: glucoza, manitol, maltoza, raffinoza, arabinoza, inostol, fructoza lactoza sacaroza, xyloza, xitrat natri, rhamnoza

Cách làm: cân lg đường, thanh trùng bằng đèn u v phương pháp rồi bổ sung vào 100 ml môi trường ISP-9 còn nóng Lắc cho tan đường rồi đổ vào đĩa petri và nuôi cấy xạ khuẩn, sau 14 ngày quan sát sự sinh trưởng

Trong đó môi trường có glucoza được coi là đối chứng dương (+) và môi trườngkhông có đường được coi là đối chứng âm (-)

- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh bằng hoặc kém hơn đối chứng dương một ít:

có khả năng sử dụng loại đường đó, kí hiêu là (+)

- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh hơn đối chứng dương, kí hiệu là (++)

- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng bằng đối chứng âm hoặc không mọc: không có khá năng sử dụng loại đường đó , kí hiệu là (-)

- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng tốt hơn đối chứng âm một ít nhưng kém hơn đốichứng dương nhiều, kí hiệu là (±)

2.2.5 Lên men

2.2.5.1 Lựa chọn môi trường lên men thích hợp

Xạ khuẩn được lên men trên các môi trường cơ bản (theo Waưen, Prokop và Grundy, 1995) là: A - 4, A - 4H, A - 9, A -12, ISP - 4 và Gauze I Sau 96 giờ nuôi cấy lấc tròn 220 vòng/phút ở nhiệt độ phòng Xác định hoạt tính kháng sinh trong dịch lên men (phương pháp đục lỗ) và sinh khối (phương pháp khoanh giấy lọc) để chọn ra môitrường cơ bản phù hợp cho những nghiên cứu tiếp theo

22.5.2 Ảnh hưởng của các nguồn cacbon, nitơ lẽn sinh tổng hợp chất kháng sinh

Xạ khuẩn được lên men trên môi trường dịch thể trong bình nón 250ml với thành phần môi trường cơ bản như sau:

Anh hưởng của nguồn cacbon