Nghiên cứu hệ protein gan của bệnh ung thư gan người

Bằng việc nghiên cứu sự biểu hiện các protein huyết thanh của người bình thường, người nhiễm virus và người bị un 2 tlur san đã chi ra rằng sự tồn tại của từng kháng thê tự miền này có l

(Đe tài từ ngitôn kinh p h í thường xuyên cấp cho PTNTĐ

Công nghệ Enzym và Protein)

C h ủ t r ì đ è t à i : P G S T S T r ị n h H ồ n g T h á i

C á c c á n b ộ t h a m g i a c h í n h :

T h S N g u y ễ n Thị T ú Linh ThS Phạm Thị Bích ThS Lê lan P h ư ơ n g

B S.CK II Phạm K im Bình

TS T rân Văn Tuân

L Ờ I C Ả M O N

Chủnẹ lôi xin trân trọng cam ơn Bộ Khoa học và CômỊ nghệ đã cấp kinh phí cho Phòng thí nghiệm Trọng điêm Công nghệ Enzxm và Protein đê triên khai

đẻ tài nghiên cứu khoa học nàv.

Chúng tôi xin cảm ơn các lãnh đạo thuộc Đại học Quôc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên; Ban Khoa học-Công nghệ, Ban Kê hoạch- Tài chính cua Dại học Quôc gia Hà Nội; Phòng Khoa học-Công nghệ và Phòng

Ké hoạch-Tài vụ cua Trường Đại học Khoa học Tự nhiên; Ban Giám đốc Phòng thí nghiệm Trụng điêm Công nghệ Enzym vờ Protein đã quan tâm và tạo điêu kiện cân thiêt đê thực hiện đê tài.

Chủng tỏi xin gửi lời cảm ơn tới cán bộ, nhân viên thuộc Khoa Giải phãu bênh, Bệnh viện Việt-Đức và Khoa Te bào - Giải phẫu bệnh , Bệnh viện K2 - Tam Hiệp, Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ, cung cắp mau bệnh phẩm sư dụng trong nghiên cứu.

Trong quả trình thực hiện đề tài, chúng tỏi cũng đã nhận được sự giúp đỡ của các cản bộ trong và ngoài Trường Chúng tỏi xin chân thành cảm ơn những

sự giúp đỡ quý báu đó.

Hà Nội, tháng 8 năm 2012

C h ủ trì đ ề tài

P G S T S T r ị n h H ồ n g T h á i

B Á O C Á O T Ó M T Ả T K É T Q U Ả Đ È T À I

1 T ê n đ ề tài: N g h i ê n c ứ u h ệ p r o t e in g a n c u a b ệ n h u n g th ư g a n n g ư ờ i

2 M ã số : K L F P T - 0 9 - 0 2

3 C h u trì đề tài: PGS.TS T rịnh Hong I hái

4 Các cán bộ tham gia đề tài:

ThS Nguvền Thị Tú Linh ThS Phạm Thị Bích ThS Trịnh Thị Thanh Ikrime

1 hS Phạm Anh Tuấn ThS Mai Thị Mồng, ThS Lê Lan Phương CN Đồ Mạnh Hưng CN Ngô Thị Thanh Hoa CN Bùi Phương Thảo CN Trần Thái Thượng,

CN Nguyễn Thị Hương CN Phạm Thị Hường TS Đồ Minh Hà, BS CKII Phạm Kim Bình TS Trần Văn Tuấn.

5 ỈMụe tiêu và nội d u n g nghiên cứu

5 1 M ụ c tiê u :

Phân tích biểu hiện protein khác biệt của mô gan ung thư so với mô gan hình thường sử dụng kỹ thuật phàn tích proteomics.

Xác định được các protein tiềm năng có liên quan đến bệnh ung thư gan

5.2 Nội dung nghiên cứu:

- Thu thập mẫu máu mô gan bình thường và mô gan ung thư

Sư dụng điện đi hai chiều (2D-PAGE) đế phân tách các protein và peptide từ dịch chiết mô gan hình thườne.

Sử dụne điện di hai chiều (2D-PAGE) để phân tách các protein và peptide từ dịch chiết mô gan ung thư.

Phân tíc h ban g e n đ iệ n di hai c h i ề u v à x á c đ ịn h b i ể u h i ệ n p r o t e in k h á c b iệ t

giữa mô gan binh thường và mô gan ung thư.

Phân tích khối phố protein gan bằng khối phô MAI 1)1-1 (>1 MS

Nhận dạng protein san bang phương pháp PMF

X á c đ ịn h m ộ t s o p r o te in b ằ n g p h ư o n g p h á p W e s t e r n blot

6.1 l ) à x á c tlịnh d ư ợ c c á c p r o te in b iê u h iệ n k h á c b iệ t u iừ a m ô g a n c u a c á c

- Protein ty thê: d ã x á c đ ịn h d ư ợ c 4 3 s p o t p r o t e in biểu hiện k h á c b i ệ t v à đ ã

nhận dạng được 18 protein, trong đó có 13 protein dã được định danh và 5 protein giả thiết Đặc biệt trong đó có các protein: MSP 70 MSP 60 ATP synthase biểu hiện tăng, và các protein p53, Mi IC I có biểu hiện giám rõ rệt ờ mô ung thư.

- Protein microsome: đã xác định dược 27 spot protein biểu hiện khác biệt và

đã nhận dạng được 21 protein, trong đó có 16 protein đã được định danh và 5 protein giả thiết Đặc biệt là các protein: HSP 70 MVP, Zinc fineer và Beta-actin đều có biểu hiện tăng ở mô ung thư.

6.3 Phân tích biểu hiện khác biệt của các protein huyết tương trên hản gel điện di 2 chiều đã xác định được 48 spot biểu hiện tăng và 44 spot biểu hiện giảm ở han gel bệnh, 23 spot chỉ có ở bản gel bệnh, 48 spot không có ở bán gel bệnh Đã nhận dạng được 17 protein có biểu hiện khác biệt giữa huyết tương bệnh nhân ung thư gan so với huyết tương người bình thường, trong đó có 16 protein đã được định danh và 1 protein già thuyết.

6.4 Đã xác định được các spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thư và mô gan binh thường của từng bệnh nhân ung thư gan T rong đó có 52 spot khác biệt chung ở các bệnh nhân gồm: 23 spot biểu hiện tăng, 18 spot biểu hiện giám, 6 spot chỉ xuất hiện ờ bản gel mò ung thư 5 spot không xuất hiện ò ban gel

mô ung thư Đã nhận dạne, được 52 spot tương ứng với 38 protein đã được định danh và 12 protein giả thuyêt.

6 5 B ă n e k v thuật th â m tách miền d ịc h W e s t e r n b lo t h a i c h i ề u dã x á c đ ịn h

đ ư ợ c 4 p r o t e in c ó p h a n ứ n e m i e n d ịc h là: p r o t e in S I 71 b i ê u h iệ n l ă n e v à p ro tein

6 C á c kết q u ả c h ín h đã đ ạ t đ u ọ c

Ml 1C' lớp I I1SP27 aldehyde dehydrogenase biểu hiện giám ở mô gan ung thư so

P R O J E C T S U M M A R Y

1 T itle: S tu d } o n p r o t e o m e p r o f i l e o f h u m a n liv e r c a n c e r

2 C o d e : KI [ lv l - 0 9 - 0 2

3 C oo d in ato r/P rin cip le investigator: Assoc Prof I rinh Hong Thai

4 <ev im p lem ento rs:

VI Sc Nguyen Thi 1 11 Linh MSc Pham Thi Bich MSc Trinh Thi Thanh Huong MSc Phạm Anh Tuan MSc Mai Thi Hong MSc Le Lan Phuong BSc

Do Manh Hung BSc Ngo Thi Thanh Hoa BSc Bui Phuong Thao BSc Tran hai Thuong BSc Nguyen Thi Huong BSc Pham Thi Huong Dr Do Minh

Ha MDr Pham Kim Binh MDr Tran Van Tuan.

Collection o f blood, liver tissues (tumors and normal tissues).

I sing two-dimensional electrophoresis (2-DE) to fractionate proteins/ peptides

of normal liver tissues.

I sing two-dimensional electrophoresis (2-DE) to fractionate proteins/ peptides o'tum or liver tissues.

/nalvsis o f 2-DE gel images and determination o f the different expression o f

p oteins between nomal tissues and tumor tissues o f HCC patients.

A iah sis o f proteins using M ALDI-TOF MS

kentification o f the proteins using PMF method.

C e te r m in a tio n o f s o m e p r o t e in s u s i n g 2 - D Í ’ W e s t e r n blot.

6.1 ! tic d if f e r e n t e x p r e s s i o n o f p r o t e in s w a s d e t e r m i n e d in t u m o r t i s s u e s o f H C C in

c o m p a r i s o n w ith n o r m a l t i s s u e s o f n o n - H C C i n c l u d i n g :

- <4 spots o f protein in different expression between n o r m a l and tumor tissues, including: 9 spots only appear obviously in tumor gels 7 spots o n h appear obviously in normal gels, 11 spots were up-reeulated and 17 spots were down- regulated in the tumor tissues.

- '6 p r o t e in s p o t s w e r e i d e n t i f i e d i n c l u d i n g 2 8 n a m e d p r o t e in s a n d 8 h y p o t h e t i c a l

proteins Among them, some important proteins were expressed differently ictween normal and tumor tissues such as: p53 A lpha-1-antitrypsin, iaptoglobin Proliferating cell nuclear antigen.

6.2 [’he different expression o f mitochondrial proteins and microsome proteins vere determined, including:

- The mitochondrial proteins: 43 spots o f protein were expressed diffently among hem 18 proteins were identified (13 named proteins and 5 hypothetical proteins) Some potential proteins were HSP70, HSP60, ATP synthase (up- egulated) and p53 MHC 1 (down-regulated) in tumor tissues.

- The m icro so m e proteins: 27 spots o f protein w ere expressed diffently am ong hem 21 proteins were identified (16 named proteins and 5 hypothetical jroteins) Some potential proteins were HSP70, MVP Zinc finger và Beta-

iC tin ( u p - r e g u l a t e d ) in t u m o r t i s s u e s

6.3 Tie different expression o f plasma proteins were determined, including: 48 spots vere up-regulated and 44 spots were down-regulated in 2-DE gels o f tumor issues 23 spots only appear obviously in 2-DE gels o f tumor tissues, 48 spots oily appear obviously in 2-DE gels o f normal tissues 17 proteins o f different expression were identified (16 named proteins and 1 hypothetical protein).

6.4 The different expression o f proteins were determined in tumor and paired rormal tissues 52 spots o f protein were expressed diferently including: 23

*MSF); ii) s a m p l e p r e - tr e a tm e n t u s i n g a c e t o n (100%) ( 1 : 4 ) at -20°c for 2

lours; separation o f proteins by 2-D gel electrophoresis (1st dimension IEF vith IPG strip pi 14-7 and pi 13-10: 2nd dimension SDS-PAGE with 10% lolvacrylamide): iii) detection o f protein spots and analysis o f 2-DE gel mages using Phoretix; iv) spot cutting, destaining, digesting with trypsin and liptipping with Ziptip C l 8; v) mass spectrometry analysis with MALDI-TOF ising angiotensin II (Mw 1046.5423 Da) and Insulin oxidized B (Mvv 494.6513 Da) as a standard; vi) protein identification via PMF database search using Mascot and NCBInr.

6.7 05 papers were published in domestic journals, 03 abstracts were presented at iitemational symposia.

6.8 Taining: 02 MSc 07 BSc in biological sciences.

7 ludget used

otal invested fund: 460.000.000 VND

Total used fund: 460.000.000 VND

I hu thập mầu máu mô gan bình thường và mô

gan ung thư: 20-50 mẫu

Đạt yêu cầu (đã thu được mẫu máu và mô gan của 42 bệnh nhân ung thư ẹan)

Sư dụng điện di hai chiều (2D-PAGE) để phân

tách các protein và peptide lừ dịch chiết mô

gan bình thường và mô gan ung thư.

Đạt yêu cầu

Phân tích ban gen điện di hai chiều và xác định

biểu hiện protein khác hiệt giữa mô aan hình

thường và mô gan ung thư.

Quy trình xử lý mẫu phân tích và xác định các

protein ean người băng kỹ thuật proteomics

Đạt yêu cầu

ị Danh sách các protein cua mô gan ung thư có

biểu hiện tăng hoặc giảm so với m ô gan bình

thường

Đat yêu câu • J

l) Báo cáo hội nghị: 3 báo cáo tóm tất Đạt vêu cầu

l Đào tạo: 5 cử nhân 2 thạc sỹ Đạt yêu câu đào t ạ o thạc SV

vượt vêu câu sô cử nhân được đào tạo (vượt 2)

B Ả N G K Ý H I Ệ U V À C Á C C H Ữ V I É T T A I

ACS American Cancer Society

ELISa Xét nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme

(Enzyme-linked immunosorbent assay) HBV Virus viêm gan B (Hepatitis B virus)

ỈỈB sA ’ Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (Hepatitis B surface

Antigen) HCC Ung thư tế bào biểu mô gan (Hepatocellular carcinoma)

HCV Virus viêm gan c (Hepatitis c virus)

HLPP Dự án Proteome gan người (Human Liver Proteome Project) HƯPC Tổ chức Proteome người (Human Proteome Organisation)

ỉ ỈRP Horse - radish peroxidase

IEF Điện di phân vùng đăng điện (Isoelectric Focusing)

IPG Gradient pi 1 CO định (Immobilized pH gradient)

1C' - N S / M S S ắ c k ý l ỏ n g k ết n ố i v ớ i k h ố i p h ổ

(Liquid Chromatograph}, coupled with tandem Mass

S p e c i r o m e t r x )

MAI Di - I ()1 Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-llight

MI K Phức hệ phù hợp tô chức/mô chủ yêu

(Mavịor Histocampatihility Complex)

MS Khôi phô (Mass spectrometry)

M\v Khối lượng phân tư (Molecular weight)

PBS Đệm muối phosphate (Phosphate Buffer Saline)

i'M F Đặc trưng khôi peptide (Peptide Mass Fingerprint)

PMS1 Phenylmethanesulfonyl fluoride

PVDF Polyvinvlidene Fluoride

SDS Sodium dodecyl sulfate

SDS - PAGE Điện di trên gel polyacrylamide có SDS

(SDS - Polyacrylamide Gel Electrophoresis) SEREX Phân tích huyết thanh bằng thư viện biểu hiện cDNA tái tô hợp

(Serological Analysis o f Recombinant cDNA Expression Libraries)

TAA Kháng nguyên liên quan đến ung thư (Tumour Associated

Antigen)

TFA Trifluoroacetic acid

TNM Kích thước khối u - Hạch Lympho - Di căn (Tumor Node

Metastasis)

I SA Kháng nguvên đặc hiệu mô (Tissue Specific Antiuen)

TSTA Kháng nguyên chép đặc hiệu ung thư

(Tumour Specific Transplantation Antigen)

M Ở Đ Ầ l { )n g thư g a n hiện là m ộ t tr o n g c á c loại u n g th ư p h ô b iê n nhát trẽn th ê g i ớ i v à

Việt Nam dá\ là bệnh uníỉ thư có tỷ lệ tư vonẹ cao hơn nữa t\ lệ mắc bệnh đang

có xu hướng tăng lên I heo thône kê năm 2008 ước tinh trên thê giới cỏ khoảng 748.300 trường hợp măc ung thư gan và 695.900 ca tử vong do ung thư ean (Jemal

và đn 201 ỉ ) Việt Nam thuộc khu vực Đông Nam Á là nơi có t> lệ mac unti thư gan cao nhất I heo thống kè của bệnh viện K nước ta có tỷ lệ măc ung thư gan nguyên

phát c a o d o n h i ễ m v i r u s v i ê m g a n B v à v i r u s v i ê m e a n c ( W 1 ) D o đ ó v i ệ c n g h i ê n

cứu về tác nhân eây bệnh, cơ chế và phương pháp chân đoán, phát hiện sớm ung thư

g a n c ó v a i trò q u a n tr ọ n g d ố i v ớ i v i ệ c g i ả m tỷ lệ m ắ c v à giảm tỷ lệ tư v o n g ở loại

une thư này.

Hiện nay các phưcmg pháp xét nghiệm lâm sàng như: sinh thiết gan chụp căt lứp vi tính, siêu âm chẩn đoán hình ánh và xác định các chỉ thị sinh học như anpha fetoprotein là các "tiêu chuẩn vàng" để chẩn đoán ung thư ean Tuy nhiên, các xét nghiệm này có nhiều hạn chế do chi phát hiện được bệnh vào giai đoạn muộn làm giảm kha năng sống sót của bệnh nhân une thư gan (Wong và đn 2006) Nhu cầu đặt ra là phải tìm kiếm các chỉ thị sinh học mới giúp chẩn đoán, phát hiện ung thư gan ở giai đoạn sớm.

Trong nhừna năm gần đây, các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu tìm kiếm các chi thị ung thư ean sử dụng công cụ proteomics Phân lớn các protein có trong huyết tương đều được tổng hợp từ ean Mô gan của bệnh nhân ung thư gan cùng có khả năng tổng hợp nhiều protein liên quan đến khối u Do đỏ các tín hiệu protein trong mô gan có thể dùng làm công cụ để chẩn đoán sự tiến triển cùa bệnh gan phát triển chẩn đoán phân tử Hơn nữa nhiều nghiên cứu đã chứng minh răng các protein nội hào có liên quan đèn quá trinh hình thành khối u kích thích đáp ứng miễn dịch sinh ra các tự kháng thê và nhiều kháng nguvên ung thư dã được xác định trong cơ thê bệnh nhân ung thư (Looi và dn 2008: Tan và đn 2009) Vì thế các tự kháng thê cỏ thê dược dùna đê chân đoán lâm sànu un 2 thư và dùng trone phân tích proteomics dê nhận đa nu các kháng neuyên liên quan đến khối u có khả năng liên

quail d en s ự c h u y ê n đạrm á c tính c u a tê h à o I)ã v là hướna n iih iên c ứ u m ớ i n h ă m tim k i ê m c á c c h i thị s in h h ọ c untì th ư liên q u a n đ è n đ á p ửn u m i e n d ịc h

1 rotm d ê tài n à y c h i m e tôi đ ã đặt ra m ụ c tiêu:

P h â n tíc h , đ á n h g i á đ ư ợ c s ự b iê u h iệ n k h á c b iệ t c u a c á c p r o te in ở m ô g a n u n g thư s o v ớ i m ô g a n b ìn h t h ư ờ n s t h ô n g q ua c á c d i ê m p rote in trẽn han g e l đ iệ n

di h a i c h i ê u

N h ậ n d ạ n g đ ư ợ c m ộ t s ô p ro te in đ ặ c trirna p r o te in k h á n g n g u y ê n c u a b ện h

u n g th ư g a n

1.1 [ỎNG QUAN Vi UNG THƯCÌAN

I Jne thư gan là một trong các dạng bệnh lý phô hiên nhát trên thê uiới và t\

lệ lu vong do une thư gan xêp hàng thứ ha trên tông sô các trường hợp tư vong do uig thư l ại Mỹ từ năm 2004 đến 2008 tv lệ mắc mới ung thư gan mỗi năm tăng

Uig thư gan thứ phát là do các tế bào une thư của các cư quan, bộ phận khác trone

cc thô di chuyên theo dòng máu hoặc mạch bạch huyết tới gan và định khu tại đây hìih thành khối u Ung thư di căn ean không mang các đặc trưna của ung thư xuất plát từ gan vì vậy trong đề tài này chúne tôi chỉ đề cập tới ung thư gan nguyên pỉát với dạng phổ biến nhất là une thư tế hào biểu mô san (Hepatocellular Carcinoma - HCC) thường gọi là ung thư gan.

1.1.1 P h â n loại ung t h ư gan nguyên ph át

Dựa vào phân loại mô bệnh học và loại tế bào phát sinh ung thư une thư gan nguyên phát được phân thành các loại chính như sau (Rubin và Hansen 2008):

Ung thư tế bào biểu mô gan là dạne unR thư biêu mô hay gặp nhất trong ung

t h i gan Ung thư bắt nguồn từ các tế bào biểu mô đâv là loại tế bào gan chù yếu do

đc, Ị ICC chiếm 85 - 95% các trường hợp une thư gan nguyên phát.

Ung thư tế bào ống mật, đây là dạng ung thư bắt đầu ở các đườne mật nhỏ trong gan Dạng ung thư này chỉ chiếm khoảng 5 - 15% Nguy cơ mac dạng ung thư này sè tăng cao khi bệnh nhân bị sỏi mật loét dường tiêu hóa hay nhiễm các dạng k\' sinh trùng trong gan.

Ưng thư biểu mô hồn h(Tp dây là dạng ung thư hiếm gặp tê bào une thư gồm

cả tế bào biểu mô gan và tế bào ống mật.

u nguyên bào gan là loại u ean ác tính ở tre em hiếm gặp ở người lớn u nguyên bào gan xuất hiện có thế do các gene hoạt động hàt thường.

Una thư tê bào mạch là loại ung thư rất hiếm gặp nó hăt neuon từ mạch máu

tr cn g izan d o e a n tiê p x ú c v ớ i c á c h ỏ a c h â t c ô n e n g h i ệ p n h ư \ i n \ l chloric! h o ặ c c á c

hóa chât g â\ ung thư.

C h u ô n g í - T Ò N G Q U A N

M ặ c d ù v ẫ n c ò n n h i ề u tranh cãi v ề c ơ c h é c h í n h x á c dẫn dốn u n s thư g a n soniỉ c á c n g h i ê n c ử u đ ề u ch i ra rãnti tác n h â n g â y u n g th ư là đa n h ân tổ v à q uá trình tiên triòn th à n h u n g th ư rất p h ứ c tạ p p hả i trải q u a n h i ê u h ư ớ c ( Y a o v à dn 2 0 0 7 )

Các yêu tỏ nguy cơ chính có thê tiên triên thành HCC bao gôm: các tác nhân gây

bệnh như nhiễm v ir u s v i ê m gan B (Hepatitis B virus - I1BV) virus v i ê m gan c (Hepatitis c virus - HCV) dẫn tới viêm gan mạn tính: xơ gan: các loại hóa chất như: rươu allatoxin B l vinyl chlorid asen hoặc các rối loạn trao đôi chất như nhiễm sắt

c á c a c n e nâv lin e th ư h o ặ c <zâ\ hât hoạt c á c í ie n e ứ c c h ê k h ô i u n h ư T P 5 3 N a o à i ra

c á c san p h â m p r o te in c u a l i B V c ỏ th è g â ỵ rỏi lo ạ n ch u trình tê h à o tạ o đ iê u k iệ n

c h o s ự l i ê n triên cu a c á c tác n h â n ạ â v u n e thư đ ô n g thời ho ạ t h ó a c á c y ê u tô p h iê n

mã và promoter cua các gene cân thiêt cho hoạt độnu sông cua virus (Wong và dn 2006).

Nhiễm virus viêm gan c mạn tính cũng là một yêu tô nguv cơ dẫn đên ung

Aflatoxin ià những chất gây ung thư có độc tính cao dược hình thành khi thực phâm và nước bị nhiễm nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Ở các nước đang phát triển thuộc Châu Phi hay một số nơi ở Châu Á người dàn ăn các thực phâm nhiễm atlatoxin thi nguy cơ mắc ung thư gan cũng tăng Aflatoxin có thể trực tiếp làm tổn thương gene TP53 gây bất hoạt protein p53 Đồng nhiễm aflatoxin B| (A F B 1 ) và HBVsẽ gây ra hiến đổi p53 ở gốc serine 249 HBV làm hoạt hóa các cytochrome P450 gây bất hoạt quá trình trao đối AFB1 tạo ra chất gây đột hiên là A F B l-8,9-epoxide và các hợp chất chứa oxy có khả năng hoạt động hóa học

m ạnh làm tế bào mẫn cảtn với AFB1 (Farombi, 2006).

Ngoài ra các yếu tố khác như tuồi, giới tính và chủng tộc cũng góp phần làm

tăn ^ nguy cơ bị ung thư gan Nam giới có nguy cơ bị ung thư gan cao hơn nữ giới

từ hai đến ha lân Một số nghiên cứu về nội tiết đã chỉ ra rang, thụ the hormone giới tính có biểu hiện thay đôi trong khối u HCC (Mendy và Walton 2009) Ket qua điêu tra dân số Mỹ cho thấy những người gốc Châu Ả có tỷ lệ ung thư cao nhất, người Mỹ da đen cũng có tỷ lệ mắc ung thư cao hơn so với người da trắng.

C ă n c ứ t h e o T iêu c h u â n p h â n k ỳ lủ m .sàn íỉ Ọ u ỏ c tẻ b ệ n h UIÌÍỊ ílỉir (n ă m 1 9 9 3 )

t h o n u q u a c á c ch â n d o á n lãm s à n g , sir d ụ n g kỹ thuật h ìn h ảnh đ ê x á c d ịn h k íc h c ờ

k hỏ i u n g u y ê n phát v à tinh trạng bị x â m làn c á c m ạ c h m á u c á c g i a i đ o ạ n c u a u n g thư g a n đ ư ợ c m ô tả ở B ả n g I ( W8: R u b in v à H a n s e n 2 0 0 8 )

N g o à i c á c h p h â n g ia i đ o ạ n t h e o h ệ t h ố n g T N M u n g th ư g a n c ò n đ ư ợ c phân loại th à n h 4 g ia i đ o ạ n , g o m : g i a i đ o ạ n I 11 I I I A / B / C v à g i a i đ o ạ n IV ( R u b i n v à

1 la n s e n 2 0 0 8 )

1.1.3 C á c giai đoạn của ung th u gan

Báng 1.1 Tiêu chuân phân kỳ lâm sàng bệnh ung thu gan

T b ất k ỳ , N | , Mo

M ị - CÓ đi căn tới vù ng xa G i a i đ o ạ n I V

T h ấ t k ỳ , \ h ấ t k ỳ , M | - — J

1 2 NC , 1 II r N c ứ i ; t i l l n i l S I M I H O C 1 ) 0 ! V Ở Ỉ l ' N ( , T I I U '

C hi thị s in h h ọ c lù c á c p h â n tứ d ư ợ c tìm th a v t r o n g m á u c á c loại d ịc h c ủ a c ơ thô h o ặ c t r o n g 111Ô đ ặ c trưnu c h o m ộ t q u á trình s in h IV h o ặ c c á c g ia i đ o ạ n b ệ n h lv

C h i thị s in h h ọ c c ó th ê đ ư ợ c d ù n g đ ê x e m x é t dúp ứ n g c ủ a c ơ th ê đ ô i v ớ i m ộ t p h á c

đ ồ đ i ề u trị b ệ n h h o ặ c m ộ t trạ ng thái n hất d ịn h ( W8).

1.2.1 C hi thị sinh hợc đối vói un« thu

Ngày nay chi thị sinh học là một trong những công cụ quan trọng nhât đê phát hiện sớm ung thư xác định chính xác sự tiến triển của bệnh, tiên lượng và theo dõi điều trị ung thư nhăm kéo dài thời gian sống, giảm tv lệ tử vong ở bệnh nhân ung thư Các chỉ thị una thư là những đại phân tư xuất hiện ờ một bệnh ung thư có nông độ thay đôi theo chiều hướng tăng lên liên quan đến sự phát sinh và tăng trưởng của nhinia khối u ác tính Chỉ thị ung thư là những chất do các tế bào hoặc mô ung thư tống hợp và tiết ra từ khối u bị phá vỡ hoặc được tạo ra từ các phản ứna của cơ thê dối với khối u gồm hai dạng: chi thị tế bào và chỉ thị thê dịch Chi thị ung thư dạng tê bào hao gồm: các kháng nguvên bề mặt các tế bào, các thụ the hormone và thụ thê yếu tố tăng trưởng, những biến đổi di truyền (biến đổi gene) của tế bào Chi thị ung thư dạng thể dịch hao gồm: các chất được phát hiện ờ những nồng độ không bình thường có mặt trong huyết thanh, nước tiểu, các loại dịch của cơ thể.

Dựa vào khả năng đặc hiệu với bệnh, chi thị ung thư có thè được phân loại

và đánh giá như sau:

Đặc hiệu cao: chì thị ung thư không tìm thấy ờ đối tượng khỏe mạnh hoặc u lành tính.

Độ nhạy cao: chi thị ung thư dễ phát hiện ở giai đoạn sớm khi chỉ có một tê bào ung thư xuất hiện.

Đặc hiệu cơ quan: chi xuất hiện ở cơ quan bị ung thư.

Xuât hiện tương quan với giai đoạn ung thư và kích thước khối u.

Tương quan với tiên lượng về thời gian sống.

Xác nhận chân đoán ung thư ơ nhìrne bệnh nhân có khôi u lớn dã dược phát hiện nhờ chụp X quanu.

1.2.2 Tiếp cận nghiên cứu chí thị sinh học đối vói ung thu

I liện nay có ba cách tiếp cận đang dược áp dụng rộne rãi đê nghiên cứu các chi

thị s in h h ọ c phụ c v ụ c h o v i ệ c ch â n đ o á n phân tư phát h iện s ớ m u n g th ư (Jain 2002).

Sư dụng các kỹ thuật genomics dê xác định, nhận dạng các eene lạ có 1 lẽn quan đến các loại ung thư riêng biệt Tuy nhiên, kết quả của các nghiên cửu này mới chi cung cấp thông tin về kha năng mắc bệnh chứ không the biết dược nguy cơ thực

sự của bệnh.

Phương pháp proteomics xác định được hâu hết các protein có triên vọng trở thành các protein chi thị ung thư Các kỹ thuật proteomics có thể xác định chính xác đặc điểm bệnh học phân tư của khối u tiên lượng bệnh, dự đoán dược các anh hường của việc điều trị và giúp phát triển lĩnh vực y học cá nhân Hạn chế của phương pháp này là một so protein chỉ thị ung thư chỉ được tìm thấy ở trong mô ung tlnr mà không có mật trong máu.

Sứ dụnu các hệ thống dò tìm dựa vào kháng thể để nhận dạng các kháng nguyên ung thư Song do có hiện tượng phản ứng chéo trong phản irne miễn dịch,

do dó kết quả của phương pháp này khône đảm bao tính đặc hiệu.

Sự kết hợp các phương pháp trên sẽ làm tăng độ tin cậy cho các chi thị phân

tử tăng tính chính xác khi chẩn đoán bệnh Kỹ thuật proteomics ở đây có vai trò rất quan trọng, bô sung cho kỹ thuật genomics và dò tìm khánu thê để nhận dạng kháng nguyên khối u Kỹ thuật này đã được áp dụne rộng rãi đê nghiên cứu chỉ thị phân tử của nhiều dạna ung thư khác nhau Sự phát triển của các kỳ thuật genomics, proteomics giúp chúng ta mờ rộng hiểu biết về bàn chất sinh học của ung thư; ngày

c à n g p hát h iệ n v à s ư d ụ n g d ư ợ c n h i ề u p h â n tư ch i thị v ớ i đ ộ n h ạ y v à tín h đ ặ c h iệ u

cao trong chân đoán lâm sàng.

1.2.3 Các loại chỉ thị sinh học đối vói ung thu gan

Đ ố i v ớ i n g h i ê n c ứ u u n g t h ư g a n c á c p h ư ơ n g p h á p trên đ ề u đã đ ư ợ c áp d ụ n g

đè tìm ra các chi thị phân từ bao gôm cả ADN và protein, đặc biệt là các kháng thê đặc hiệu Một trong những hướng nahiên cứu quan trợn 2 nhất là phân tích tìm ra

c á c c h ỉ thị p h â n tư d ê n hậ n d ạ n g k iê u h ìn h ác tính c ù a tê b à o C á c p hâ n tử c h ỉ thị

nàv hao nôm: các phân tử tham gia vào quá trình tăna sinh tê hào eâ> biên đôi ADN: aene T P 5 3 : các p ro tein k h á c th a m Ria diêu k h iê n chu trình tế bao: c á c 2ene

uã\ une thư và các thụ thê cua chúng: các vêu tỏ liên quan dên sự chêt theo chươrm trình cửa tê bào và sự hoại độnu của telomerase Một hướrm nghiên cưu khác la tìm

ra các chi thị phân tử liên quan đến qua trình xâm lấn và di căn của une thư các chi thị phản tư loại nà} gôm các phân tư bám dính (Adhesion), các enzyme thu\ phân protein làm giảm chât gian hào các vêu tô sinh trường tham eia vào sự hình thành mạch giúp khôi u phá vỡ vò học di căn đên các vị tri khác trong cơ thê (Qin và

Bảng 1.2 Các chi thị ung thư gan mói đưọc công bố (20 năm gần đây) ( H o à n g 2 0 11)

I ronti I l l u m e n ă m g à n d â v c á c nhà n g h i ê n c ứ u trên thê tĩiới dà c ô n ti b ô

nhiêu ch 1 thị ung thư nhằm phát hiện sớm sàng lọc chân đoán chính xác và theo

dõi diêu trị í ICC Da sô các chi thị mới này hiện van đang dược nghiên cứu trên lâm

saim I)o đó hướna nghiên cứu chỉ thị sinh học ung thir gan vãn đang được triên

khai và tiếp tục phát triển Hiện nay các nhà khoa học đang tập trung theo hướng

n g h i ê n c ứ u tìm k i ê m c á c p r o te in k h á n g n g u y ê n liê n q u a n đ ê n k h ô i u c á c p r o te in

na\ kích thích sinh ra kháne thê trong huyết thanh, đâv cũng là các dạng chỉ thị une

thư tiềm năng.

được mã hóa và biếu hiện bởi hệ gen của cơ thể sinh vật (Liebler, 2002).

Proteomics là một nhánh của nghiên cứu chức năng hệ gen nó được sinh ra

khi các nhà nghiên cứu về gen đối mặt với câu hỏi “chức năng của tất cả các protein

là gì Proteomics có thê được định nghĩa là những nghiên cứu rộng rãi mọi mặt

protein như là sự biêu hiện, những tu on g tác của protein trong tế bào cũng như việc

mô hình hóa protein Protein là sản phâm cùa ARN thông tin, nó thực hiện phần lớn

các phán ứng của tế bào và nó không có một mối quan hệ tuyến tính nào giữa mức

độ cấu trúc ARN thông tin và protein hay "proteom e'irong tế bào Ngoài ra hầu hết

các dích tác dụne của thuốc là protein; do đó, các phương pháp để nghiên cứu có

hiệu quả phức hựp protein trong tế bào có thể đóna vai trò trực tiếp cho việc phát

triên thuôc.

Ngày nay các nghiên cứu proteomics tập trung vào ba mặt chính là: nhận

dạng protein, mô tả sự biểu hiện protein, mô hình hóa hệ thống và sự cài hiên

protein.

- Nhận dạng p ro te in là n h i ệ m v ụ c ơ ban của p r o t e o m i c s nhăm xác định tât c ả

c á c p ro te in c ó t r o n g m ẫ u n g h i ê n c ứ u M ụ c đ íc h c ủ a v i ệ c n à y là đ ư a ra m ộ t d a n h

s á c h cá c p r o te in h o à n c h ỉn h đ ã đ ư ợ c b i ê u h iệ n t r o n g th ự c te c h ứ k h ỏ n e phai là SUY

ra tư dừ liệu vè biêu hiện gen.

- Mô tá sự b iê u hiện p r o te in là v i ệ c xác định sự biêu hiện của các protein

i r o n e m ộ t th ời d i ê m nhât d ịn h c u a tê b à o m ô M ô ta p ro te in th ự c ch â t là m ộ t tr ư ờ n g

c á c q u á trình tiê u h ó a , trao đ ổ i ch ấ t v à c ũ n g là n ơ i sả n s in h ra n h i ê u loại p r o t e in s in h

chất, là vị trí có hiệu quả nhất để phân giải các chất ngoại sinh, cho quá trình thực

đ íc h , t ư ơ n g lai k h o a h ọ c c ủ a d ự án H L P P và đ ặ c h iệ t n h ấ n m ạ n h c á c m ụ c tiêu k h o a

h ọ c c ủ a d ự án b a o a ồ m : t ạ o đ ư ợ c b ứ c tranh t ổ n g th ể c ủ a p r o t e o m i c s s a n ; x á c đ ịn h

s ự p hâ n b ố v à h ứ c tranh t ô n g th ê c u a c á c p r o t e in ớ m ứ c đ ộ d ư ớ i tế b ào: lậ p han đ ô liên két cu a c á c p r o te in ea n : là m s á n e tỏ c á c b iế n đ ô i t ô n g th ê c ủ a p r o t e o m e g an : liên kôt e i ữ a c á c d ự án p r o t e o m e g a n v à d ự án p r o t e o m e h u v ế t t ư ơ n a d ê phát h iệ n

c á c ch 1 thị s in h h ọ c c u a c á c b ệ n h v ê s a n ( C h o 2 0 0 7 )

I ác hại cua ung thư gan đôi với sức khoe con người và xã hội la vô cùne lớn

Vì nguyên nhân chính của ung thư gan là viêm gan B c nên rất nhiều nghiên cứu đã tập trung vào đổi tượng là bệnh nhân ung thư gan có tiền sử viêm gan Đê tìm hiêu khác biệt trong biểu hiện protein trone mô ung thư gan có tiên sử viêm gan

B nhàm giải thích cơ chế biến đổi của tế bào gan ung thư các nhà khoa học Trung Quốc đã tiến hành phân tích hệ protein các tế bào gan ung thư bằng kĩ thuật điện di

từ 12 bệnh nhân HCC có tiền sử viêm gan lì được phân tích Hàm lượng protein

tương đương từ 12 cặp mẫu (bệnh và bình thường) được trộn lại với nhau làm thành nội chuấn và được đánh dấu hang Cy2 trong khi đó mẫu ung thư và không ung thư được đánh dấu ngẫu nhiên hằng Cy3 hoặc Cy5 Tổng sổ 61 spot được xác định là biểu hiện tăng lên trong các mẫu ung thư trone khi đó 158 spot có biểu hiện giảm

Có 71 sản phẩm của gen đã dược xác dịnh từ những spot này Các thành viên của họ protein sốc nhiệt 70 và 90 có biểu hiện tăng, trong khi các protein chuvển hóa lại giảm ở bệnh nhân HCC Sự giảm các protein ti thể và protein peroxisome trong nghiên cứu này dưa ra cho chúng ta một gợi ý rằng có sự mất đi những chức năng chuyên biệt của cơ quan tử trong te bào ean une thư 4 enzyme chuyển hóa trong chu trình methvl hóa ờ gan biêu hiện giảm ở các mô gan ung thư biêu thị bằng sự thiêu hụt S-adenomethionine trong unti thư gan Hai san phàm của gen là glyeeraldehyde-3-phosphate dehydrogenase và formin') idoyltransfera.se- cycledeaminase dược xác định từ các spot biên dôi nghịch, tìr đó chi ra răng các đôna phân hoặc các dạne cai hiên sau dịch mã cua hai protein này có the clone vai

1.3.3 P rote o m ic s tr o n ịỉ nghiên cứu u ng thu gan

trò khác nhau tronu unti thư gan Níihiên cửu nàv lân dâu tiên ch 1 ra răng sự biêu

h iệ n tãrm c u a protein 1 Isp7()/I Ỉ s p 9 0 v à c á c th ê dị h ợ p r i h o n u c l e o p r o t e i n n h â n C 1 / C 2

trong các mỏ HCC la các chi thị line thư dược khăns dịnh hăng Western blot và kĩ thuật nhuộm hóa miên dịch tê bào ơ 70 mẫu I ICC (Sun và đn 2007).

Ung thư gan là một trong nhữna bệnh ung thư phô biên nhãt trên thê giới, nó tác dộng đến nhiều nước trong những năm nân đây Theo thống kê có khoảng 53% các trường hợp I ICC trên thế giới có liên quan đến HBV Nguy cơ tiên triển thanh IỈCC tư những người mang HBsAg cao gấp 2 5 -3 7 lân so với những người không bị nhiễm (I.upberger 2007) Khi các virus viêm gan xâm nhập vào cơ thê sẽ làm cho

cơ thê sinh ra các kháng thê chống lại chúng Bằng việc nghiên cứu sự biểu hiện các protein huyết thanh của người bình thường, người nhiễm virus và người bị un 2 tlur san đã chi ra rằng sự tồn tại của từng kháng thê tự miền này có liên quan với HCC

và là yếu tố chẩn đoán sớm hiệu qua đối với các trường hợp viêm gan nguy cơ cao Nghiên cứu được thực hiện trên huyết thanh của 37 bệnh nhàn HCC và 31 trường hợp viêm gan B/C không bị HCC Huyết thanh lấy từ các bệnh nhân bị ung thư không phai HCC và 24 trường hợp khỏe mạnh dược dùng làm đối chứng Có 8 loại protein tạo ra đáp ứng thế dịch trong huyết thanh từ 70% trong tổng số 37 bệnh nhân trong nghiên cứu với tỉ lệ biêu hiện của từng protein rièng biệt từ 11-27% Các kháng thê tự miễn kháng p-tobulin, creatine kinase B hspốO và cytokcratin 18 được phát hiện trong huyết thanh của các bệnh nhân viêm gan B/C, trong khi đó, kháng thể kháng calreticulin, cytokeratinK F |-A T P synthase Ị3-subunit và NDPKA chỉ thấy xuất hiện nhiều ở bệnh nhân HCC Calretibulin và một dạng bị cắt của nó (Crt32) đã được xác định là phô biến nhất ở các bệnh nhân HCC với tần suất biểu hiện là 27% (Le Naour và dn 2002).

Việc lựa chọn nguồn bệnh nhân để lấy mẫu và cách lấy mẫu sinh phâm là rất quan trọng, có vai trò quyết định đến kết quả của một nghiên cửu Năm 2003 các nhà khoa học tại Seoul Hàn Quốc tiến hành một phương pháp lấy mẫu độc đáo với 21 cặp mẫu (các mô une thư và các mô không ung thư xung quanh gan) được lấy từ 21 bệnh nhân ung thư gan Các bệnh nhân này dược chia ra làm 3 dạng I ICC hởi các chỉ thị virus: 7 UBsAg dươne tính (HCC dạng B) 7 anti-HCV dươníi tính (HCC dạnẹ C) và 7 HBsAg và anti-HCV âm tính Protein tồng số được phân tích bang điện di 2 chiều và khôi phô MAI 1)1-TOI -MS và những thav đôi trong hệ protein đã được chi ra Ket qua nghiên cứu cho thấv có 60 protein có mức

dộ biêu hiện khác nhau giữa các mầu ung thư và không ung thư trong sô đó 14 protein bị tha\ đôi trong ca 3 dạng HCC trona khi dó 46 protein lại là chi thị đặc

h i ệ u v ê v irus, r ỏ m lại c á c p r o te in đ ã x á c d ịn h đ ư ợ c p hâ n loại t h e o tác n h â n v ir u s

c o liê n q u a n d ê n I1C C d ạ n a H v à c C á c két q u ả n à \ ch 1 ra m ộ t c á c h rõ r à n g răn ti

sự biêu hiện cua hệ protein cua các mỏ trons ỉ ICC liên quan mật thiêt với các yêu

tò uâ\ hệnh và cư chê ung thư gan có thè diễn ra khác nhau do các vêu tô I IBV và

11C V ( K i m v à d n 2 0 0 3 )

C ù n e trên đ ôi t ư ợ n g c á c b ện h n hân u n g th ư aan c ó tiên s ư v i ê m c a n B H e và

đn (2008) công bô kêt qua nghiên cứu phát hiện và xác định NAP-2 như là một chi thị sinh học cua ung thư gan liên quan đến viêm uan B bằng kĩ thuật proteomic

N g h i ê n c ứ u đ ư ợ c tiến hành trên 81 b ệ n h nhân I IC C c ó tiên sử IỈBV v à 33 n g ư ờ i k h ỏ e

mạnh với kĩ thuật SELDI-TOF-MS đã mô ta hệ protein của các mẫu huyết thanh.

Năm 2005, Marrero và đn đã tiến hành phân tích proteomics các glycoprotein huyêt thanh bị fuco hóa trong giai đoạn đàu ung thư gan Các tác giả

dã chi ra răne với sự gia tăng các mức độ fuco hóa có thể dược quan sát qua phân tích polysaccharide với huyết thanh tổng số và có liên quan đến sự tiến triển ỈỈCC Như đã biết AFP là một chi thị sinh học trong ung thư gan (trên 50ng/mL gặp ở

30 -60% trường hợp HCC tại thời điểm chẩn đoán), tuy vậy, AFP thường biểu thị không đầy đủ ở những mô nho Trong nehièn cứu này các nhà khoa học đã tiếp cận phương pháp glycoproteomics đê xác định các glycoprotein huyết thanh liên quan tới tiến triển ung thư và GP73 dã được phát hiện với mức độ gia tăng trong các đổi tượng HCC Protein này đã được phân tích kĩ và được chỉ ra như là một chỉ thị HCC tốt hơn AFP ở người Ngoài ra người ta còn phát hiện ra một dạng đồrm phân khác của AFP khi bị fuco hóa là DCP (Desgamma carboxyprothrombin) cũng liên quan đến 1 ICC.

Năm 2010 Pleguezuelo và đn đã tiến hành nghiên cứu nhận dạng chỉ thị mới của urm thư gan bàng phương pháp proteomics Các bệnh nhân HCC với 3 nguyên

II C C N e h i ê n c ứ u đ ư a ra k ết luận r a n a A p o - A 4 và A p o - A l c ó th ê d ư ợ c s ư d ụ n g

n h ư m ộ t ch 1 thị c ó đ ộ n h ụ \ v à đ ặ c h iệ u c a o v ớ i 1 ICC.

I 'nu thư hiêu mô lê hào Gan là một trong n hờn tỉ nạuyên nhân phô hièn uâv

k h ô i u ác tính <ià\ tư v o n g c a o I V lộ m ă c 1 IC C ơ I lo a KẬ da nil uia tãnu N ă m 2 0 0 9

M a t o s v à W it / m a n n dã tiến h a nh n g h i ê n c ứ u p r o t e o m i c s u n g th ư uan củ a n g ư ờ i M ỹ

khôi u và mỏ từ ba bệnh nhân n c c neười Mỹ bị viêm gan và khône liên quan đen

v i ê m g a n dã d ư ợ c p h â n tích d ê tìm s ự k h á c b iệ t p h ô b iê n tr o n g b iê u h iệ n p rotein

Protein đã được phân tách bởi điện di 2D (gel 10% SDS-PAGE) Gel đã dược cố định và sau đó nhuộm màu với xanh Coomassie s ố hóa và xư lý dược thực hiện băiie cách sử dụng phân mềm PDQuest Sử dụng kiềm định t-student đê phát hiện

sự thay đôi protein giữa khối u mà mô bình thường cua tất cả các cặp mẫu với xác

suât p < 0 0 1 K e t q u ả th u đ ư ợ c v ớ i 19 s p o t s b iể u h iệ n k h á c h iệ t c ó V n g h ĩ a ( > 2 lân) T r o n g s ổ 19 s p o t s 9 s p o t s b i ể u h iệ n t ă n g v à 10 b iê u h iệ n e i ả m ở u C á c p ro te in

biêu hiện tăng hao gồm: beta-5-tubulin beta-actin vimentin carbamov 1-phosphate synthetase-1, methylenetetrahydrofolate dehydrogenase, serum albumin, catalase autoimmune regulator, và transcription factor Các protein biêu hiện giảm bao

g ô m : B i P p r o t e in A - k i n a s e a n c h o r i n g p ro tein 18 g a m m a , i n o r g a n i c

pyrophosphatase, keratin 8 repulsive guidance molecule, butyrophilin superoxide dismutase, TSA heat-shock 70-k.Da protein 9B và hemoglobin alpha-2 Đặc biệt, các protein tự miễn dịch được hiếu hiện cao 14 lần trong mô khối u cho thấy nó có

th ế c ó m ộ t v a i trò t r o n g ỉ I C C X á c n h ậ n v à tiế p tụ c n g h i ê n c ứ u v ề n h ữ n g th a y đ ô i

protein này có thể dẫn đến việc phát hiện ra phân tử chi thị mới.

Trong dự án tin sinh học proteomics Kondo (2008) đã chi ra rằng 23 protein xuất hiện trở lại khi tái phát ung thư gan sau phẫu thuật Hơn nữa khi tập trung vào

1.3.4 Nghiên cứu protein ty thê

T\ thê được xem như là cái đích lý tưởng cho việc phân tích hệ protein vì

hóa các hvdrate cachon và axil héo tham nia tronu nhiêu quá trình dông hóa và dị

h ó a k h á c n h a u V ì v ậ v rỏi lo ạ n c h ứ c n ã n u cu a t\ thê c ó th ê Iiâ\ n h ĩrn c hậu qua nậnti

nê từ n h ừ n e k h u v ế t tật t r o n g c h u y ê n h ó a n ă n e lư ợ n u đ ế n c á c b ệ n h 1\ c ó n e u y ê n

nhàn phức tạp hao gôm cả bệnh Alzheimer Parkinson, ung thư đái tháo đường t\ p

2 tim mạch và viêm khớp xương mạn tính Sự liên quan cua t> thê với các bệnh phát sinh kê trên đã và dans hướng những nghiên cứu thực nghiệm vào xác định hệ protein ty thẻ khám phá những chỉ thị phân tử cho sự phát triên thuôc và can thiệp

\ à o V iệ c c h ừ a b ệ n h

Ty thê là bào quan phô biến trong gan Mồi tế hào gan có hàng nghìn ty thê

1 rong ung thư gan sự rối loạn chức năne ty thể có thể có những mối liên quan trực tiêp đến bệnh Đặc biệt ty thê có một vai trò quan trọng trong con đường hoạt hóa apoptosis nội bào Những sai hỏng trong con đường apoptosis có kha năng cho tê bào được sống sót góp phần gây nên tình trạng ác tính cua u Quan trọng hơn nữa

là sự thay đôi biêu hiện và những đột biến trong quá trình apoptosis liên quan tới các protein có trong các cơ chế quan trọng làm cho các u trở lên khána thuốc Vì vậy vai trò chủ chốt của con đường apoptosis trong sự phát triển ung thư và đáp ứng điều trị cho thấy ràng các protein ty thế có liên quan đến quá trinh này có khả năng như là các chỉ thị sinh học chẩn đoán ung thư.

Các protein có liên quan đen quá trình apoptosis thông qua ti thể thường xuyên được nghiên cứu đê được dánh giá là các chỉ thị sinh học trong ung thư Cụ the là những chất điều hòa chủ chốt của con đường này các phân tư họ Bcl-2 được nghiên cứu thường xuyên như các chỉ thị sinh học apoptosis trone nhiều loại ung thư bao gồm cả ung thư gan.

Những sai hỏng chức năng của ty thể được cho là có vai trò quan trọng trong

sự phát triển của ung thư Hơn 70 năm trước Warburg đã mơ đường cho việc nghiên cứu những biến đổi trong vai trò hô hấp nội bào của ty thể đối với ung thư

và dã đề xuất ra một cơ chế để giai thích quá trình phát sinh ung thư Trong một loạt các bài háo ông đã đưa ra eiả thiết rằng sự kiện chìa khóa trong việc phát sinh ung thư là sự phát triên cùa một "tổn thương" trong bộ máy hô hấp nội bào dẫn dến sự tànu sinh hù lượns ATP alycolvtic Cuôi cùng, các tè hào ác tính sẽ đáp írna nhu càu nănu lượng của mình bang cách sản xuất một phần lớn ATP cua mình thông qua cơ chê ulycolvtic hơn là thông qua phosphoryl hóa oxy hỏa Do sự san sinh

A 1 I’ a h c o l v t i e k e m h iệ u q u a d i ê u n à \ phàn n à o p hả n ánh c ơ c h ê trao đ ô i ch â t d u \

Illicit cua các tê hào ác tính và diêu dỏ sẽ yêu câu tiêu thụ một lưựnu lớn íilucose dê clap ứng nhu câu năng lượng cua tô hao Diêu na\ xay ra trái ngược ờ nhiêu tê hào hình thường, các tê bào sử dụnu phosphors I hóa oxy hỏa như là cách chủ yếu đè tông hợp ATI’ với hiệu suât cao Sự khác biệt trong chuvên hóa năng lượnII giữa các

tô hào ung thư và các tê hào hình thường tạo thành một cơ sơ hóa sinh dể SUN đoán răng các hướng điêu trị có thê được phát triên đê chọn lọc tiêu diệt các tê bào ung thư trong trạng thái tốn thương hô hấp tế hào (Wong và đn 2006).

Kể từ khi ấn phẩm đầu tiên của Warburg được xuất ban hơn nưa thế kỷ trước, một số bệnh ung thư liên quan đến khuyết tật ti thê đã được xác định và được

mô tả trong các tài liệu Những khiếm khuvết bao gồm thay đôi biểu hiện và hoạt động của các tiểu đơn vị chuồi hô hấp và các enzyme glycolytic, giảm quá trình oxv hỏa các chất NADH được liên kết cũng như đột biến ADN ti thể (mtDNA) Trong khi có nhiều báo cáo về các hiện tượng, các cơ chế chịu trách nhiệm về việc bắt đâu

và tiến triển cua đột biến mtDNA vai trò của nó trong sự phát triển của bệnh une thư và tiến triển bệnh vẫn còn chưa được làm sáng tỏ (Carevv và Huanạ 2002).

I Um 300 triệu người đang bị nhiễm mạn tính với virus viêm gan B, và nhiều người trong số này có khả năng phát triển thành ung thư gan HBV mang 7 protein virus, trone đó có protein không có cấu trúc X (nonstructural X) (HBx) Các kết quả nghiên cứu với các tế bào hất tử hay các tế hào chuyển gen và với HBx của chuột biến đổi gen đã chứng minh ràng HBx có thể tương tác với các ty thể Tuy nhiên, chưa có những nghiên cứu mô tả chính xác vị trí HBx trên ty thê hay ảnh hường cùa

nó đến các trạng thái sinh lý của ty thể Clippinger và Bouchard (2008), đã tiến hành nuôi cấy tế hào gan chuột mô hình đặc trưng đê mô tả vị trí của HBx ti thể và anh hưởng của nó về mặt sinh lý học Kết quả đã cho thấy sự định vị của HBx với mật độ cao và liên kết với màng ngoài t v thể Họ đã chứng minh rằng HBx có khả năng điều hòa màng ti thê trong các tế bào san và chức năng này của HBx thay đôi tùy theo tình trạng hoạt động của N F-aB Trong các tế bào gan chuột sơ cấp sự hoạt hóa HBx cùa NF-cxB ngăn cản sự khử cực màng ti thể tuy nhiên, khi hoạt động cua NF-aB bị ức chẻ HBx gâv sự khử cực màng thông qua sự điều khiến tính thấm

lỗ ti thê Tóm lại các kết quả này xác định con đường tiềm năng mà qua đó có thể kích hoạt HBx đê diêu chỉnh quá trình sinh lý của ti thê, do dó làm thay đôi nhiêu hoại độníì tê bào và cuôi cùng góp phân vào sự phát triên các nghiên cứu ung thir uan liên quan đến HBV.

Mierosome là nhừne túi tiết dược hình thành tir mạng lưới nội chát khi các tế hào eukaryote bị phá vỡ ơ diêu kiện bình thườne microsomc không tôn tại tron ti các tê bào soil ti Microsome có thê được tách và thu lav từ những mảnh vỡ tế hào hãne cách ly tâm Các tê bào khône vỡ nhân, và ty thê sẽ bị lăng xuône ở khoảne

I 1 OOOg trone khi các en/ym c hòa tan và lưới nội chât chứa cytochrome P450 van con trong dung dịch Khi sư dụng máy siêu ly tâm tốc độ lên tới lOO.OOOg các microsome bị lang xuông thành cặn còn các enzyme hòa tan thì vẫn nôi trên mặt Băng cách nà) microsome được tách ra Microsome thu được có màu nâu đỏ do sự

có mặt của các cofactor có chứa sất nhân heme trong enzyme P450 có rất nhiều trone gan cua người và động vật.

Microsome là một công cụ có giá trị lớn trong việc điều tra sự trao dôi chất cua các hợp chất và kiểm tra các tương tác thuốc Các nhà nghiên cứu thường chọn microsome dựa trên mức độ hoạt độna đặc trưng cùa các enzyme CYP.

Năm 2008 Nakamura và đn đã tiến hành nghiên cứu proteomic microsome trên mô gan chuột thí nghiệm được thực hiện bằng sự kết hợp các kỹ thuật diện di biên tính 1 chiều và sắc ký lỏng nano kết hợp với khối phố (nano-LC-MS/MS) để nghiên cứu hệ protein màng Hơn 100 protein đã được nhận dạng bàng phân tích khối phô, và hầu hêt các protein trong dó đà được chỉ ra là có liên quan với các protein màng như microsomal glutathione S- transferase 1 cytochrome P-450 và một số ít các protein liên quan đến thụ the lipoprotein.

Trong microsome thì hệ cytochrome P450 (CYP) là hệ protein được quan tâm nhất Hệ protein này tham gia vào sự khử độc và đáp ứng thuốc trong tế bào

Do đó việc nghiên cứu hệ protein microsome siúp chúng ta tiến gần đến việc dự đoán và diều trị thuốc cho các vấn đề bệnh lý.

Năm 2007 Lan và đn đã tiến hành nghiên cứu phân tích proteomics so sánh đáp ứng cua CYP trong mô gan chuột xử lý với 1.4-bis-2- (3,5- dichloropvridyloxybenzene) (TCPOBOP) và mô đối chứng nhằm dự đoán dáp ứng cua thuôc Tron II nghiên cứu nàv họ đã tiến hành phân tích so sánh proteomics P450 của ean chuột dưới tác động của TCPOBOP Phươne pháp nghiên cứu gồm thu microsome hăng ly tâm phân tách các protein microsome bane phươne pháp điện di phân cắt protein hãn a enzyme trypsin, và đánh dấu đồng vị l80 / l60 sau dỏ nhận dạnu các peptide băng kỹ thuật khôi phô nano-I.C-MS/MS và I c -MS 17

1.3.5 N g h iê n cứu p ro te in m icro s o m c

p ro te in tronu h ọ 1*450 dã đ ư ợ c x á c đ ịn h Tât c ả c á c 1*450 phát h iệ n ra d ư ợ c nhận dụriíi m ộ t c á c h rõ r à n e n g o ạ i trừ C Y P 2 A 4 / 2 A 5 I ron u đ ó C Y P 1 A 2 - 2 A 4 / 5 - 2 B 1 0

- 2 B 2 0 - 2 C 2 9 - 2 C 3 7 - 2 C 3 8 - 3 A I 1 v à - 3 9 A 1 c ỏ b iê u h iệ n tă n g và C Y P 2 C 4 0 -

21 I - 3 A 4 1 v à - 2 7 A 1 c ỏ b iê u h iệ n g i ả m s o v ớ i d ôi c h ừ n g S ự b iê u h iệ n k h á c biệt

s ẽ ô e m lại n h ữ n g k ế t q u ả tốt c h o v i ệ c tì m c á c c h ỉ thị c h o b ệ n h v à tiế n đ ế n c h â n đ o á n

phát hiện sớm ung thư đặc biệt là với ung Ihư gan.

1.3.6 Nghiên cứu hệ protein huyết tu o ìig

1.3.6. / Cấu trúc hệ protein huyết tương

Trong một loạt hài báo có tiêu đề “Hệ protein huyết tương” của Putnam (1975-1987) đã xác định chính xác các protein huyết tương khi chúng thực hiện

C á c g l o b u l i n m iễ n d ịc h ( I m m u n o g lo b u lin ) : C á c p hả n tử g i ữ c h ứ c n ă n g là

khána thê điển hình trong huyết tương.

C h á t í’ă n th ụ th ê tr u n g g ia n : C á c h o r m o n e c ỏ ban chát là p rotein v à p e p t i d e

đ ều n ằ m tr o n g n h ó m n à y N h ừ n g p r o te in n ày c ó k íc h t h ư ớ c k h á c n ha u b iê u thị c á c

c a p đ ộ h oạt d ộ n a đ iê u h ò a củ a c h ú n g ( v i ệ c d i ê u c h ỉ n h s è rât n h a n h c h ó n a v ớ i n h ữ n g

h o r m o n e n h ỏ n h ư in s u lin v à c h ậ m v ớ i n h ữ n g h o r m o n e lớ n n h ư e r y th r o p o ie tin )

C lìâ í 1’ă n th ụ th ê đ ịa p h ư ơ n g ' C h ú n ti h a o u õ m c á c c y t o k i n v à c á c ch â t dần

tr u v ê n ơ k h o a n g c á c h n g ă n k h á c tr o n u p ha n ứ n u té hao I h ỏ n g t h ư ờ n g , n h ữ n g

p r o te in n à \ c ỏ k íc h th ư ứ c phân tử n h ỏ hcm m à n g lọ c c u a thận ( d o d ỏ c ó t h ờ i g ia n cư trú t r o n g h u y ê t t ư ơ n a khá n g ă n ) , c h ú n g tạ o ra c á c t ư ơ n g tác c ụ c h ộ g i ữ a c á c tê b à o

và đ ư ợ c p h a l o ã n g t r o n g h u y ê t t ư ơ n g khi k h ô n g c ò n tác d ụ n g N ê u c h ú n g x u â t h iệ n

v ớ i m ứ c d ộ c a o t r o n e h u v ế t tư c m g c ó th è g â \ ra tác đ ộ n g c ó hại c á c h x a n ơ i c h ú n g

d ư ợ c t ô n c h ợ p

N h ữ n g c h ả i liru h à n h tạ m thời' C h ủ n g b a o g ô m c á c p r o te in k h ô n g p h ả i là

h o r m o n e , c h ú n g h o ạ t d ộ n a tạ m th ời t r o n g h u v ế t t ư ơ n g khi đi q u a m á u đ e n vị trí cụ

th ê đ ê b iê u h iệ n c h ứ c n ă n g V í dụ c á c p r o te in đ ư ợ c tiết v à h ấ p th ụ b ởi l y s o s o m e qua c á c th ụ th ê ân.

Hiện nav nhiêu nghiên cứu theo hưởnu phản tích protcomics huyêt urơnu dã dược thực hiện nhăm tim ra các chI thị phân tir giúp chân đoán sớm các bệnh nguy hiẽm như un 2 thư Năm 2006 Ward vá đn đã kiêm tra và xác dịnh các protein đột hiên trona huyết thanh cua các bệnh nhân ung thư đại trực tràng Sư dụng phưcrng pháp SI LDI-TOF/MS họ đã tìm thấy có 9 protein khác biệt rất có V nghĩa, đặc biệt protein C3a-desArg là một chi thị đặc trưng cua una thư đại trực tràng cũng đã dược phát hiện (.lamicki và dn 2010).

Trên dối tượng bệnh nhân ung tlnr gan có tiền sử nhiễm IIBV năm 2008 I ỉe

và đn đã thực hiện một nghiên cứu trên huyết thanh 81 bệnh nhàn UTG nhiễm HBV

và 33 người khóe mạnh sử dụng kĩ thuật SELDI-TOF/MS Kêt quả thu được đã khăng dịnh protein NAP-2 là một chỉ thị sinh học tiêm năng cho UTG.

Năm 2010 Pleguezuelo và đn cũng áp dụng kĩ thuật proteomics đê tìm kiêm các chỉ thị sinh học trên các bệnh nhàn ƯTG có tiền sử nhiễm HBV HCV và sử dụne nhiều chất cồn Ket quả cho thấy có ba apolipoprotein biểu hiện khác biệt đã được xác nhận: APO-A1 APO-A4 và APO-E Nghiên cứu này cũng chỉ ra là APO-A1 APO-A4

có thế được sử dụng như một chỉ thị có độ nhạy và đặc hiệu cao đôi với UTG.

Việc phân tích proteomics không chi dừng lại ở việc xác định các chi thị trong mô hay trong huyết tương mà cần kết hợp hai hướng nghiên cứu này đê tìm ra các chi thị sinh học giúp chẩn đoán ung thư ở giai đoạn sớm một cách chính xác Đặc biệt là đổi với ung thư gan một trone những loại ung thư phô biến và nguy hiểm nhất với tỉ lệ tử vong tới trên 90% Hiện nay, nhiều nghiên cứu proteomics trên các dòng tế bào ung thư phân tích trực tiếp trên huyết tương và mô gan của các bệnh nhân [ ỈCC đã và đang phát triển mạnh trên toàn thế giới với một số kết quả hước đầu rất khả quan (Govekar và Zingde, 2007).

1.3.7 Nghiên cứu proteom ics m iễn dịch ung th ư gan

Ưng thư có thể coi là bệnh về hệ protein, bởi chính những đột hiến di truyền làm sai lệch quá trình truyền tín hiệu, làm tế hào sai hỏng không bị loại bỏ, dôna thời khiến tế bào tăng sinh khône kiểm soát được Hiện nav đa sô các chi thị ung ihư đang được sử dụng là két qua nehiên cứu vê protein \ ì protein là san phâm cuối cùng cua gene và tác dộna trực tiêp đên các quá trình sinh học Hem nữa protein là thành phần phone phú Iihât cua tế bào Do đó các nhà khoa học đang tập trung ứna dụng kỹ thuật proteomies trona imlìièn cứu tỉm kiếm các chi thị ung thư là các protein nhăm chân đoán sớm unu tlnr.

1 3 6 2 C á c n g h i ê n c ử u p r o t e o m i c s h u y ê t t ư ơ n g

Proteomics mm thư là ứng (.lụnti kỳ thuật proteomics dê xác định sự thay dôi ditih tính và dịnh lượng cua protein dược tìm thâ\ trong mò hoặc các dịch cơ thê ci.a ngưừi bị une thu', so sánh \ới người hình thường khỏe mạnh nhăm eiúp cho việc chân doán une thư liên lượng và diêu trị có hiệu quả hơn (Govekar và Zingde 2007).

Proteomics miễn dịch là một khái niệm tương đối mới trong lĩnh vực nghiên

CƯU proteomics Proteomics miễn dịch nghiên cứu vê tập hợp các protein tham gia dap ứng miễn dịch (Tịalsma và dn 2008) Trong quá trình đáp ứng miễn dịch chống une thư trong huyêt thanh của bệnh nhân ung thư có xuất hiện các tự kháng thê đặc hiệu chống lại các kháng nguyên ung thư của chính cơ thê Đâv chính là đối tượng nghiên cứu cúa proteomics miền dịch ung thư.

Hiện nay, nhiều nghiên cứu proteomics miễn dịch trên dòng tê hào ung thư

mô hình động vật phân tích trực tiếp trên huyết tương và mô gan của bệnh nhân ung thư gan đã và đang được tiến hành rộng khắp trên toàn thế giới và đã thu được nhiều kết qua kha quan (Govekar và Zingde 2007).

Đe xác định các tự kháng thể có tiềm năne làm chí thị phân tử trone chân đoán HCC Takashima và đn (2006) dã tiến hành phân tích các tự kháng thể trong huyết thanh cho thấy có phản ứng miễn dịch với các protein trong mô ung thư lấy từ bệnh nhân HCC Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả dã tiến hành phân tách protein của 15 cặp mẫu mô ung thư và mô thường băng kỹ thuật điện di hai chiều, sau đó chuyển lên màng và thực hiện phản ứng miễn dịch với huyết thanh của chính bệnh nhân đó Bằng cách so sánh từng phần, họ đã xác định được 4 spot có phản ứng

tn ễn dịch có độ nhạv với thuốc nhuộm ở mô ung thư mạnh hon so với mô bình th-TỜng Nhừng protein này được nhận dạng bang sắc ký lỏng kết nối với khối phổ (IC -M S/M S) đó là protein sốc nhiệt 70kDa (Hps70) glyceraldehye-3-phosphate dehydrogenase, peroxiredoxin và manganese superoxide dismutase (Mn-SOD) Trong huyết thanh bệnh nhân HCC tần suất của các tự khána the kháng lại các

pn tein lần lượt là 7/15 (46.7%); 5/15 (33.3%); 5/15 (33.3%) và 6/15 (40%) trong khi đó ở mô đối chứng là 2/20 (10%); 7/20 (35%); 0/20 (0%) và 2/20 (10%) riếp tụ: phân tích miền dịch sứ dụng các protein thương mại đã tinh sạch đê khẳng định lirh đặc hiệu của các tự kháng thê kháng lại các protein HSP70 peroxiredoxin và Vh-SOD dã cho thav những phản ứng miễn dịch có độ đặc hiệu cao trong huyết th.inh IICC Ba khána thê dó được cho là đặc hiệu đôi với bệnh I ICC và có thê là cá: chỉ thị sinh học chân đoán bệnh.

' I r ư ớ c dâv n h i ê u n u h i ê n cứu d ã c h ứ n g m in h r ă n e t r o n g q uá t r i n h c h u y ê n

d ạ n g tư x ơ e a n v i ê m c a n th àn h u n u th ư g a n tro n n c ư th ê x u ất h iện c á c k há m :

t m u v ê n liên q u a n đ ên k h ô i u ( t u m o r - a s s o c i a t e d a n t i a e n s - Ỉ A A s ) k íc h thích s i n h ra tự

k h á n g thê C á c tự k h á n g thê n ày c ỏ th ê xu ất h iệ n tr o n g h u y ế t th an h trước khi phát

h iệ n b i ê u h i ệ n c h u y ê n d ạ n s ác tín h D ê đ á n h g i á s ự b iê u h iệ n c ủ a c á c tự k h á n g th ê

k h á n g th ể c ó th ể d ù n g đ ể c h ấ n đ o á n H C C

Khi n g h i ê n c ứ u v ề q u á trình c h u y ế n d ạ n g á c tính c ù a tế b à o g a n c á c nhà

k h o a h ọ c đ ã s ử d ụ n g tự k h á n g th ể tr o n g h u y ế t th an h đ ê x á c đ ịn h k h á n g n g u y ê n liê n quan đ ế n q u á trình n à y N ă m 2 0 0 7 n h ó m n u h iê n c ứ u c ủ a C h e n tại đại h ọ c T e x a s đã tiên h à n h n g h i ê n c ứ u x á c d ịn h c á c k h á n g n g u y ê n liên q u a n đ ế n k h ố i u n h ư n h ữ n g chỉ thị c h o c h ẩ n đ o á n m i ễ n d ịc h u n g t h ư g a n T r o n g n g h i ê n c ứ u n à y , h u y ế t thanh

củ a b ệ n h n h â n H C C đ ư ợ c s ử d ụ n a đ ể s à n g l ọ c m i ễ n d ịc h từ th ư v i ệ n b i ể u h iệ n

c D N A c ủ a tế b à o H e p G 2 K et q u ả s à n g l ọ c th ư v i ệ n b iể u h iệ n c D N A H e p G 2 đ ã c h ỉ

ra 2 7 g e n e b a o g ồ m 21 g e n e dã b iế t v à 6 g e n e c h ư a b iế t T r o n g 21 g e n e đ ã b iế t thì

I ! g e n e liên q u a n đ ến q u á trinh c h ế t t h e o c h ư ơ n g trình, b iệ t h ó a v à tă n g s i n h c ủ a tê

th anh b ă n a I ỉ I S A v à W e s t e r n b lo t ở c á c d iê u k iệ n k h á c nhau V i ệ c x á c đ ịn h h iê n

hiện p r o t e in c u a ca hai k h á n g n g u y ê n đ ư ợ c đ á n h uiá b ă n g h ó a m ò m i ề n d ịc h Kêt qua n u l ì i ẽ n c ứ u n à y dã chứno m in h r ă n g hai I A A d ư ợ c xúc d inh là S u i! v à R a l A từ

th ư V iện b iê u h iệ n c D N A I l e p G 2 c ó p h ả n Írníi m i ề n d ịc h ơ IỈC C c a o h ơ n đ á n g k ê s o

v ớ i v i ê m uan m ạ n tín h, x ơ g a n c ũ n g n h ư ở n g ư ờ i h ình t h ư ờ n g Đ i ê u đ ó k h ă n g đ ịn h

rà n g hai k h á n g n g u y ê n n à y c ó th ê là n h ữ n g ch ỉ thị u n e th ư t r o n e c h â n đ o á n I IC C

Năm 2008 I.i và đn đã tiến hành xác định các kháng nguyên khôi u và tự kháns thể của bệnh nhân HCC sư dụne phương pháp phân tích proteome huyết tương kết hợp với protein microarray Họ tiến hành phân tách protein tông số từ hai dòng tê bào ung thư thực nghiệm HepG2 và HepG2.2.15 bàng điện di 2 chiều Sau

đó chuyên các protein đã được phân tách lên màng Polyvinylidene Fluoride (PVDF) Đầu tiên, protein từ dòng tế bào HepG2 được u với mẫu huyết thanh thu được từ 8 bệnh nhân HCC liên quan đến HBV Huyết thanh bình thườna được sư dụng làm dôi chứng Protein của dỏng tế bào HepG2.2.15 được ù với mẫu trộn từ mẫu huyết thanh của 10 bệnh nhân HCC liên quan đến HBV và 10 bệnh nhân HCC

âm tính với HBV Các nhà nghiên cứu đã phát hiện 6 spot protein kháng nguyên cua dòng tế hào HepG2 có phản ứng với huyết thanh của bệnh nhân HCC mà không phản ứne với huyết thanh của người bình thườns, Trong trường hợp HepG2.2.15

họ cũng đã phát hiện được 10 spot protein kháne nguyên có phán ứng với huyết thanh người bệnh mà không phản ứng với huvết thanh của người bình thường Ket qua trên dã phàn ánh sự khác nhau giữa các tự khána thể của bệnh nhân HCC liên quan đến HBV và bệnh nhân HCC không liên quan đến HBV Các protein trên được nhận dạng bằng phương pháp phân tích khối phô MALDI - TOF và phân mềm Mascot Nhóm nghiên cứu dã xác định được 13 kháng nguyên liên quan đến HCC.

I inh kháng nguyên của các protein này được khẳng định thêm bảng cách sử dụng

kỹ thuật Western blotting và phân tích protein microarray Ket quả chỉ ra răng, tần suât cua các phản ứng dươne tính với DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp), yếu tố kéo dài dịch mă 2 (eEF2)„ AIF heterogeneous nuclear A2 (hnRNP A2) protein liên kết với prostatic (PBP) Triosephosphate isomerase (TIM) ở mẫu ung thư cao hơn đáng kể

so với binh thường và viêm gan mạn tính Phan ửns dương tính với DEAD, eEF2

A ir và PBP là thường xuyên xay ra ơ I ICC hcm bất kỷ bệnh ung thư khác Độ nhạy của tất ca kháne nguyên 1ỈCC từ 50% đốn 85% Vì vậy các nhà nahiên cứu kêt luận ràng \iệ e phát hiện các tự kháng thể kháng lại các kháng nguyên trên có the có siá

trị iron ti V iệ c c h â n đ o á n s ớ m u n u thư e a n

Năm 2008 I.ooi và dn dã dùng phươnti pháp proteomics dê xác dịnh các

I AA liên quan đên IICC Nghiên cứu dược tiên hành trên mầu liuyêt thanh cua 20 bệnh nhân I ICC' 30 bệnh nhân viêm can mạn tính 30 bệnh nhân xơ ean và huyèt thanh cua 10 người bình thường khỏe mạnh và dòng tê bào ung thư gan HepC32.

I rong sỏ 34 spot protein có phan ứng mien dịch được căt ra khoi bản gel điện di hai chiêu, thuy phân protein hàng trvpsin và phân tích I.C-MS/MS các tác già dã nhận dạng được 28 protein 17/28 protein không chì phản ứng với kháng thê trona huvet thanh của bệnh nhân ! ICC mà còn phan ứng với kháng thê trong huvêt tương của bệnh nhân tiền une thư 11/28 protein chỉ phản ứng với kháng thế trong huyết tương cua bệnh nhân HCC nhóm protein này có tiềm năng lớn đê trở thành chi thị sinh học của ung thư gan Ngoài ra đê tìm hiểu mối liên quan của các protein dã nhận dạng với ung thư tác giả đã tra cứu dựa vào cơ sờ dữ liệu protein Theo kết quả tra cứu 18/28 protein dã được tìm thấy có liên quan đến ung thư: 3 protein liên quan ung thư vú; 4 protein liên quan HCC (CÌRP78 HSP70 serotransferrin Mn-SOD);

II protein còn lại liên quan đến các loại uns thư khác.

Gần đây, việc nhận dạng và mô tả đặc diêm của các TAA và dùng làm ' T A A mini-array” để chân đoán miễn dịch ung thư là một hướng tiếp cận để phát hiện ung thư đang được quan tâm Theo hướng nghiên cứu này năm 2010 Chen và đn dã tiến hành nghiên cứu “Sàng lọc miễn dịch ung thư tế hào biểu mô gan thông qua tự kháng thể và kháng nguyên liên quan đến khối u kết hợp với biểu hiện tăng bất thường của A FP’\ Nhóm tác giả đã dùng các tự kháng thể trong huyết thanh của một bệnh nhân HCC làm mẫu dò đế sàng lọc miễn dịch xác dịnh các TAA có liên quan đến quá trình chuyển dạng ác tính của tế bào gan trong thư viện biểu hiện cDNA của dòng tế bào ung thư thực nghiệm HepG2 Theo cách này đã xác định được 2 gen là SUI ỉ và RA1A. Protein tái tổ hợp của 2 gen này là Suil và R a lA được hiểu hiện, tinh sạch và dùrm làm kháng nguyên trong xét nghiệm miễn dịch đế xác định sự có mặt của tự kháng thể trong huyết thanh của 77 bệnh nhân HCC, 30 bệnh nhân viêm gan mạn tính 30 bệnh nhân xơ aan và 82 người bình thường Tỷ lệ xuât hiện kháng thê kháng Sui 1 và Rai A trong huyết thanh bệnh nhân HCC lần lượt

là ỉ 1.7% (9/77) và 19.5% (15/77) tỷ lệ nàv cao hơn đáng kể so với t> lệ xuất hiện khárm thê kháng lại 2 protein này trong huyêt thanh của bệnh nhàn xơ gan (3.3% và 3.3%) và khône xuât hiện kháng thê kháng 2 protein này ở huyêt tươns bệnh nhân viêm can và nuưưi bình thườns Khi bò sung 2 protein nàv vào mini-arrav gôm 8 TAA ( lm p l p62 Koc p53 c-myc Cvclin BI survivin và p 16) (Xhane và dn.

2007) đã dược níihiên cứu tnrớc dỏ thi thây t\ lệ xuâi hiện tự kháim the khcinsz 10

I A A dạt tới 66.2% Ngoài ra klii kết hợp sư dụng lơ I AA tròn đê chân doán Ư nhừníi imười có AI I’ biêu hiện bát thườrm độ nhạy tăng từ 66.2% lên 88.7%.

Hiện nay nhiêu rmhiên cứu vê proteomics miền dịch unu thư dã xác dịnh dược các kháng nauvên liên quan đên khôi u Khi một TAA được xác định, các nhà nghiên cứu sẽ dùng nhiêu phương pháp khác nhau để mô tả một cách toàn diện về

I AA mối liên hệ cua TAA với quá trình chuyên dạne tế bào ác tính và xác nhận tương tác cua TAA với kháng thè kháng TAA nhằm đánh giá tiềm năne trở thành chỉ thị để chân đoán miễn dịch ung thư Theo hướng này năm 2011 Liu và dn đã tập trung nghiên cứu vê hai TAA mới được tìm ra là p62 và p90 đê tìm hiêu vai trò cua chúng trong chân đoán miên dịch.

1.3.8 Nghiên cứu proteom ies un g thu ở Việt Nam

ơ Việt Nam từ năm 2002 đến nay nhà nước đã đầu tư kinh phí để xây dựrm các Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia với một số thiết bị nghiên cứu proteomics Cho đến nay, đã có 3 Phòng thí nghiệm được đưa vào hoạt động tại Viện Công nghệ Sinh học (năm 2002) Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thuộc Đại hục Quốc gia Hà Nội (năm 2004) và Trung tâm Nghiên cứu ứ n g dụng Sinh Y Dược học thuộc Học Viện Quân Y (năm 2Ơ06) Tại các Phòng thí nghiệm này các nghiên cứu proteomics đã được triển khai và đà dạt được những kết quả nhất dịnh Một số đề tài dã được thực hiện theo hướng proteomics ung thư như "Xây dựng cơ

sở dĩr liệu hệ protein huyết thanh người Việt Nam đế phối hợp chẩn đoán bệnh đái tháo đường type 2 và ung thư máu" (đề tài K C 04.14/06-10 (2008-2010) do GS.TS Phan Văn Chi chủ nhiệm), “Minning biomarkers in human sera using proteomic tool" (đề tài Việt Nam-Thụy Điển mã số 46-RF1 (2006-2007) do GS.TS Phan Văn Chi chủ nhiệm), "Phân tích proteomics huyết tưcmg cùa bệnh leukemia” (đề tài cấp Đại học Quốc gia mã số QG-05-24 (2006-2008) do PGS.TS Trịnh Hồng Thái chủ trì) I u\ nhiên, cho đến thời điểm đề tài này được tiến hành, chưa có nghiên cứu nào được thực hiện theo hướng proteomics ung thư gan.

C h ư ơ n g 2 - N G U Y Ê N L I Ệ U V À P H Ư Ơ N G P H Á P

2 1 N G U Y Ê N I II I ỉ

2.1.1 Đối tư ợ n g nghiên cứu

Mầu nghiên cứu là mô gan tại vị trí có khỏi 11 cua bệnh nhân une thư tê bào nan nguvên phát va huyết tươne cua chính bệnh nhân đó Mầu dôi chứne là mô gan cách ít nhất 5cm trên cùng lá gan tại vị trí không có khối u.

Danh sách 40 bệnh nhân ung ihư gan và 2 mẫu gan của người binh thường sư dụng trong nghiên cứu được thống kê tại phụ lục 1.

Mô gan và huvết tương sir dụng trong nghiên cứu này do Khoa Giải phẫu bệnh Bệnh viện Việt-Đức và Khoa Te bào - Giải phẫu bệnh Bệnh viện K2 Tam Hiệp cung cấp Mau mô dựna trong one eppendorf được vận chuyên bang hình chứa nitơ lỏng và bảo quản ơ tủ lạnh sâu -80°c, mầu huyết tương được bảo quan ở

tu lạnh -20°c.

2.1.2 Hóa ch ất

Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê ở bảng 2.1.

Báng 2.1 Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu

T ê n h ó a c h ấ t N h à c u n g c ấ p

IPG strip pH 3 - 10, 17cm

I P G s t r i p p H 4 - 7 , 7 c m

Biorad M ỹ

Ampholytes pH 4 - 7 pH 3 - 10 G E Health Care Mỹ

E C L A d v an ce W estern B lotting D e te c t io n Kit

P r o d u c t B o o k l e t ( R P N 2 1 3 5 )

GE Health Care, Mỹ

Peptide chuân (Insulin B; A n g io te n s in 11) v à chat

Tat ca các hóa chắt khác được sư dụng trong n chi én cửu đêu đạt độ tinh sạch phàn tích.

I iên hành nghiên cứu sử dụnu các dụng cụ thièt hị trong Phonii Pruleomics

va Sinh học câu trúc thuộc Phònu thí nghiệm Trọng diêm Cône nehệ F-’n /ym c và Protein các thiêt bị chính hao gôm:

Máy 1} tâm lạnh 5417R (Eppendorít Đức) má\ ly tâm K30 (Sigma Dírc) Thiết bị điện di đăne điện Protean IFF cell (Biorad My) Ettan IPGphor3 (GE - [ lealthcare My).

Buồng điện di: Protean II xi multi-cell cho phép chav 6 ban gel 17cm cùng một lúc Protean Ỉ! XL cell chạy 2 ban eel kích thước 17cm và Mini-Protean

3 cell (Biorad My) chạy các gel kích thước 7cm.

Nguồn điện di PovverPac1MllC (Biorad Mỹ).

Hệ thống phân tích hình ảnh sử dụng phân mềm chuyên dụng phân tích bản gel diện di hai chiều Phoretix (Shimadzu, Nhật Bản).

Hệ thống phân tích khối phổ AXIMA -CRFPil s (KRATOS ANALYTICAL Anh).

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.2.1 X ử ỉý m ẫu mô gan

Mầu mô gan bình thường và mô gan ưng thư của cùng một bệnh nhân dược cắt nhuyễn trong cối sứ đặt trên đá lạnh, protein mô gan được chiết bằng đệm muôi phosphate (PBS) 0.05M pH 7.4 và đệm phá tế bào (đệm Lysis) có chứa Urea 7M Iris 30mM, CHAPS 4% w/v, DTT 65mM, PMSF lOmM Tiến hành ly tâm thu các phân đoạn dịch chiết và kéo dài thời gian ly tâm lạnh với tốc độ cao để loại bỏ các thành phần phi protein (lipid, ARN ADN ) Quy trình chiết protein từ mô gan được m ô tả trong h ì n h 2 1

Dịch thu được từ các phân đoạn gồm dịch chiết PBS1 PBS2, I.ysisl Lysis2

và I.ysis3 sẽ được điện di trên gel polyacrylamide 10% có SDS để kiểm tra thành phần và độ sạch Các mẫu chưa dạt độ sạch sẽ dược tủa bằng dung dịch Acetone

1 0 0 % t h e o IV l ệ 1 t h ể t í c h m ẫ u v à 4 t h ể t í c h d u n g d ị c h t ủ a ở - 2 0 ° c t r o n g 2 e i ờ

Protein lẳng tủa được hỏa lại bàng đệm Lysis Các dịch chiết cua cùne một mẫu dược trộn lại dè chuân bị cho điện di hai chiêu (hình 2.1).

2.1.3 T h i ế t bị

H ình 2.1 Q u y tr ì n h chiết p ro tein t ừ mô gan

M ầ u m ô g a n h ì n h t h ư ờ n g v à b ệ n h đ ư ợ c lấy ra tư t ủ -8 0 °c c â n 2 m ẫ u với

l lư ợ n g t ư ư n g đ ư ơ n g c h o v à o hai cối s ứ r i ê n g b i ệ t ( g ồ m m ộ t m ẫ u b ệ n h và m ộ t m ẫ u

đ o i đ i ứ n a )

0.3 e m ầ u g a n đ ư ợ c c ãt n h ỏ b ă n e k é o s a u đ ó đ ư ợ c n g h i ê n ha n ti c h à \ s ứ c h o

đ ế n khi n h u y ễ n thì c h o 1.5ml đ ệ m p h o s p h a t e 0 0 5 M p[17.4 I ấ \ xi l anh c ó đ â u k i m