Nghiên cứu lectin, Proteinaza và chất ức chế Proteinaza ở một số loài rong biển (Rong đỏ, rong lục, rong nâu) thuộc vùng biển Việt Nam

Nhu vày, nhCoig nghièn euru ve lectin, proteinaza va PPI trèn thè giói cùng nhu trong nuóc duqc thuc hièn chù yéu vói càc dèi tuqng dòng vàt, thuc vàt bàc cao va vi sinh vàt, con dèi vói

UÒ ^ C)7 <L

80 GIÀO DUC VA DÀO TAO DAI HOC QUÓC GIÀ HA NÓI

TRIJÒNG DAI HOC KHOA HOC TllNHIÈN

Nguyén Quang Vinh

j ^ r

^«GHIEN ClAJ LECTIN, PROTEINAZA VA CHAT l/C

CHE' PROTEiNAZA Ò MOT SO LOÀI RONG 38EM

•

(RONG DÒ, RONG LUC VA RONG NÀU)

THUÓC VÙNG BIEN VIÈT NAM

Chuyèa ngànb : Hoà sinh Mise : 1 05 10

Luàn àn Phó tien s7 khoa hoc Sinh hoc

Ngìiùi bìióng din khoa hoc :

GS, TS Pham Tbi Tran Chàu

ih&v'^cx^L^^**^»^ H a Nói - 1996 f ^ T ' ^ * " " " ' " ^ ^ ^ ^

BANG CAC CHQ VIET TAT VA Kt HIÉU

CA - 1 : Lectin I dia rong Codium ambicum

CA - i n : Lectin DI eùa rong Codiam arabicum

DEAE-xel : Chat trac dói ion DEAE - xenluloza

EDTA : Etylen Diamino Tetra Axetic axit

GA -1 : Lectin I eùa rcmg chi Gmcilarìa

GA - n : Lectin n eùa rong chi Gracilada

HA : Hoat dò ngung két hóng càu (boat dò lectin)

lU : Don vi UTC che enzim

kDa : Kilo Daìtcm (Don vi khéi luqng phàn tu)

KI : Chat !ìc c h è a - kimotripxin

KIA : Hoat dò tìrc che a - kimotiipxin

PA : Hoat dò phàn giài protein (proteolytic activity)

PIA : Hoat dò tìrc che proteinaza

PPI : Protein urc che proteinaza

pddv : Phàn duói don vi (Subunìt)

SDS - PAGE : Dién di trén gel polyacrylamit co SDS (Sodium Dodecyl Sulphate)

TI : Chat UTC che tripxin

TIA : Hoat dò lic che tripxin

ULC : Lectin eùa rong lue Ulva conglobata

MUCLUC

Trang

Mò dàu 1 Chirong 1 - TÓng quan tài liéu 3

1.1 Dai cuong ve lectin 3

1.1.1 Khài quàt ve tach va tinh sach lectin 3

1.1.2 Mot sé tinh chéft hoà \f eùa lectin 5

1.1.3 Mot sé tình chA sinh hoc eùa lectin 9

1.1.4 iJig dung eùa lectin 13

1.2 Dai cuong ve proteinaza va chat lìe che proteinaza 15

1.2.1 Proteinaza 15 1.2.2 Protein lic che proteinaza 19

1.2.3 Ùhg dung eùa proteinaza va PPI 22

1.3 Lectin, proteinaza va chat ùc che proteinaza ò rong bién 23

1.3.1 Vài net ve phàn loai va nguón lai rong bién 23

Thành phàn hoà hoc eùa rong bién

1.3.2 Lectin ò rong bién 29

1.3.3 Ve proteinaza va chat ùc che proteinaza ò rong bién 31

Chuong 2 D è i tuqng va phuong pfaàp nghièn ciiu 32

2.1.Déituqng 32 2.2 Phucmg phàp nghièn euru 33

2.2.1 Càc phuong phàp xàe dinh hoat dò va dinh luqng protein 33

2.2.2 Tinh sach càc protein co hoat tinh tir rong bién 35

2.2.3 Nghièn culi mot sé tinh chat eùa proteinaza à rong bién 41

2.2.4 Nghièn etili mot sé tinh chtft eùa lectin 42

2.2.5 Nghièn euru mot sé tinh chat eùa chat u'c che proteinaza 44

2.2.6 Nghièn cun tuong tàc eùa proteinaza va lectin 45

ò rong bién vói càc protein khàc

Chuong 3 - Két qua nghièn cthi 46

3.1 Két qua nghièn ciiu diéu tra 46

3.1.1 Lectin à rong bién 46

3.1.2 Càc proteinaza va càc chat ùc che proteinaza ò rong bién 52

3.1.3 Mot sé nhàn xét ve lectin, proteinaza va chat lire che 65

proteinaza à rong bién

3.2 Nghièn ctiru lectin ór mot sé loài rong bién 67

3.2.1 Lectin ò mot sé loài rong càu 67

3.2.2 Tinh sach va nghièn cufu mot sé tinh chat eùa lectin 71

lièn két axit sialic tur rcmg lue Enteromorpha tubolosa,

3.2.3 Lectin dac hièu nhóm màu O tur rong lue Ulva conglobata:, 76

tinh sach va mot sé tinh chat

3.2.4 linh sach va nghièn cthi mot sé tfah chat eùa lectin lièn két 82

N - Axetyl - Galactozamin tir rong lue Codium arabicum

3.3 Nghièn cihi chat tire che proteinaz tir hai loài rong dò 91

Hypnea esperiva Hypnea Japonica

23 A Tinh sach càc chat tire che proteinaza (PPI) 91

3.3.2 Nghièn ciiu mot sé tinh chat eùa PPI tir hai loài rong 95

Hypnea espenwà Hypnea japonica

3.4 Nghièn ciìu mèi lièn quan giiia lectin, proteinaza 100

va PPI ò rong bién

3.4.1 Tuong tàc ciia càc proteinaza vói càc protein khàc 100

3.4.2 Tuong tàc eùa càc lectin tir rong lue Ulva conglobata 103

va Codium arabicum vói càc protein khàc

diirong 4 - Bàn luàn 106

4.1 Ve lectin ò rong bién 106

4.2 Proteinaza ò rong bién 110

4.3 Ve chat lire che proteinaza of rong bién 111

4.4 Mèi lièn quan gifia lectin, proteinaza va chat He che proteinaza 112

Két luàn va de aghi 114

Tài lièu tham khào 117

Fhuluc 133

Dén nay, mot sé luqng lón càc protein co hoat tfnh trèn dà duqc tàch, tinh

sach tir nguón dòng vàt, thuc vàt va vi sinh vàt va da duqc nghièn eùa ve càu trùe,

tinh chat hóa 1^, dac tfnh tàc dung v.v Ò Vièt Nam, khoàng hon 10 nàm trò lai day, huóng ngliièn ctìru lectin, proteinaza va protein tire che proteinaza dà duqc bat dàu tdén khai va xiic tién manh me chù yéu tai Bò mòn Hóa sinh, inròng Dai hoc TÓng hqp, nay là Dai hoc Khoa hoc Tu nhièn thuòc Dai hoc Quèc già Ha Nói

Nhfing eòng trình nghièn eùa da duqc eòng bè de càp dén protein, lectin ò hat lùa,

càm gao; ò eày ho dàu dò [19, 20, 24, 25, 36, 37, 54]; eày ho dàu tàm [8, 23, 27,

29]; ò eày thuèc [33]; trong màu sam [39, 91]; à nhuyén thè [12, 13, 14, 41];

Proteinaza va PPI duqc nghièn ctìru chù yéu trèn dèi tuqng eày ho bau bf [30, 31,

32]; ò dòng vàt [5, 6,40,55]; Ò con trùng [7, 34,35],

Nhu vày, nhCoig nghièn euru ve lectin, proteinaza va PPI trèn thè giói cùng nhu trong nuóc duqc thuc hièn chù yéu vói càc dèi tuqng dòng vàt, thuc vàt bàc cao va vi sinh vàt, con dèi vói rong bién, thi càc nghièn etìfu diéu tra eiing nhu càc eòng trình ve tàch, tinh sach va nghièn cthi tfnh chat eùa càc protein eó hoat tinh

sinh hoc trèn con rat han hep, ò Vièt Nam hàu nhu chua eó eòng tiình nào de càp

dén Ò vilng bién nhiét dói nhu nude ta, rong bién (tao) rat da dang va phong phù

ve thành phàn ehi, loài va tir làu dà duqc biét là nguón nguyén liéu qui già ve càc

chat co hoat tmh sinh hoc Vi vày viéc nghièn cùn càc hqp chat trèn ò nhung dèi

tuqng này là nhOng dàn liéu co so quan trong trong nghièn euru co bàn ve hóa sinh eùa chiing, dóng thòi efing là góp phfo dành già nguón Iqi sinh vàt bién, mot vfe

de dang duqc nhà nuóc ta quan tàm

Trén co so nhOng diéu dà trình bay trén chùng tòi dàt cho mình nhièm vu trong de t ^ là :

- Nghièn cùìx diéu tra ve lectin, proteinaza va PPI ò rong bién vilng bién mién

Bac va mién Trung Vièt Nam;

- Buóc dàu tinh sach va nghièn ciiu tùih chat eùa càc chat trén ò mot sé loài rong dò, rong lue va rong nàu dxxqc lua chon;

- l ì m hiéu mèi lièn quan giiia lectin, proteinaza va PPI ò rong bién

Chuong 1 - TÒNG QUAN TÀI LIÉU

1.1 DAI CUONG VE LECTIN

Mèc khai dàu cho nghièn cuu lectin phài tinh là nàm 1888 khi StiUmark phàt

hièn ra tihh chà't ngung két hóng càu eùa rixin, mot dòc té co bàn chat pioiein tuong tu lectin duqe tàch ra tur hat thàu dàu (Ricinus communis) [111]

Mae dìl lectin dà duqc phàt hièn càch day han mot tram nàm, nhimg ehi txt nhùng nàm 60 tra lai day, khi càii tnie va tinh chat eùa nhiéu lectin da duqc sàng

tò va nhiéu ky thuàt mói duqe àp dung de nghièn ciìu lectin, thi hoat chà^t này mcd duqc quan tàm nghièn cuu sàu ròng va déu khàp Ngày nay lectin duqc dinh nghia

là protein hoac glycoprotein lién két duóng khòng co nguón géc mién dich, co khà nàng ngung két té bào hoac (va) két tua phiirc chat xacarit [98, 152] Tir dinh

nghia này ihày rò hai tinh chat quan trong eùa lectin là khà nàng ngung két càc té

bào, trong dò co té bào hóng càu va khà nàng két tua càc phirc chat xacarit va nguói ta thuóng phàt hièn lectin bang chinh mot trong hai phàn img này,

Theo dinh nghia này, mot sé glycozidaza co the coi là co tinh chat lectin (nhu a -D-Galactozidaza ngung két hóng càu thó duac xù IV bang tripxin hay a -amylaza làm két tua glycogen) [89, 147] Tuy nhièn da sé càc lectin dà biét khòng

co hoat tinh enzim

1.1.1 Khài quàt ve tàch va tinh sach lectin

Trèn thuc téldiòng co nhOng cinén ìuqc chung cho vièc rmh sach cac iectm Vièc chon phuong phàp nào de tàch lectin tìiy tliuòc vào nguón nguyén lièu duac dùng de nghièn cuu

Viéc tach ìectm thuóng bàt dàu bang chiét nit protein tu màu dà duqe nghièn nhò bang dung dich muéi hay dung dich dèm Màu cùng co thè duac xù ly truóc

khi chiét nit bang dung mòi hùu co (nhu con hoac ete) de loai bó ìipit hoac càc lav

chat khae

Két tua chon loc bang amòn sulphat hay con eó thè cho tua lectin vói dò tinh sach nhàt dinh

Viéc tinh sach lectin tiép theo eó thè duqc tién hành bang càc ky thuàt tinh sach protein thòng thuòng nhu sic k^ loc gel, sic k^ hà*p phu, sàc k^ trao dói ion hoac két hqp càc phuong phàp trén Bang càch này rat nhiéu lectin eó nguón gèc thuc vàt d i duqc tàch va tinh sach [89,99]

Khà nàng lién két dac hiéu vói duémg eùa lectin da mò ra trìén vong ling

dung sic k^ ài lue trong tình sach càc lectin loai này Thuc té hièn nay trong càc diéu kìén co thè nguòi ta thién ve xu huidng dùng sic ky ài lue de tinh sach lectin

Bang phuong phàp này co thè thu duqc che phdm vói dò tinh sach cao ma qui

trình tinh sach lai don giàn Già thè khòng tan cho sic k^ ài lue co thè là càc chat

co san trong tu nhién hoac càc chat thu duqc qua bién dÓi hóa hoc nhu chìtin,

arabinogalactan, sephadex, agaroza hay sepharoza

NhQng chat trén dà duqc dimg nhu già thè cho sic k^ ài lue de tinh sach nhiéu lectin lién két dàc hiéu duòng thuòc ho GLucoza / Mannoza tir hat càc loai dàu khàc nhau va nhiéu dèi tuqng khàc [69, 89,99,149],

Già thè cho sic k^ ài lue cùng eó thè là san phim nhàn tao duqc gin thém d??dng dàc hiéu nhu polyacrylamit hay Bio Gel P, hoac két hqp càc chat tu nhién

vói san phim nhàn tao Càc duòng dàc hiéu lectin eó thè eó sSn trén càc già thè

hoac duqc gin vào già thè bang con duòng hóa hoc, Khi sic k^, lectin duqc hàp phu va giti' lai, con dich chiét duqc loc tir tir qua già thè Viéc rùt lectin bàm trén già thè co thè duqc thuc hién bang càch diìng dimg dich duòng dàc hiéu lectin hoac bang càch thay dói bàn chat dich rùt (nhu ha thàp pH, thay dÓi lue ion hoàc thém càc chat gay bién tihh) Diéu quan trong là càc chat dilng de nit lectin k h ^ g duqc làm thay dói tnmg tàm lién két duòng eùa lectin va sau dò phài duqc loai bò khòi lectin tinh sach

Phuong phàp sic k^ ài lue ft khi tàch duqc càc izolectin, vi vày de thu duqc

két qua trong nhiing tnròng hqp này càn két hqp sic k^ ài lue vói sic k^ trao dói ion

Nhu vày, vói bàn chà't là protein, mot che phdm lectin tinh sach co thè nhàn

• duqc klii dùng cac phuang phàp tinh sach protein dà biét va nliùng phucmg phap nhu: sàc ky loc gel, sàc ky trao dói ion vàn tò ra rat co Ixièu qua trong linh vuc này

Cho dén nay hàng tram che phim lectin dà duqc tach va tinh sach tir nhiéu nguón dòng, thuc vàt va sinh vàt khàc nhau va dà duqc nghièn cuu ve tình chat hóa ly cùng nhu mot sé tmh chà't sùih hoc [69, 99, 114, 119, 139, 149]

1-1.2, Mot sé tinh chat hóa 1^ eùa lectiin

1.1.2.1 Thành phàn hóa hoc

Trong thành phàn axit amin eùa càc lectin dà nghièn cuu thi axit amin axit (nhu axit aspactic) va cac hydroxiaminoaxit (nhu xerin treonin hoac hydroxiprolin) ehièm ty le cao, khoàng 30%, con càc axit amin chiìa luu huynh thi rà't it hoac khòng co; diéu này co thè thsfy ró a càc lectin eày ho dàu dò: cho dén nay chi phat

hièn thà'y lién két disulfua b lectin eùa loài dàu duy nhat là dàu lim {Phaseoius Jimensis) [ gg., 159] Tuy nhièn lectin tàch tir mot sé sinh vàt khàc lai eó mot hàm luqng dang ké càc axit amin chua luu huynh nhu a lectin eùa màm lùa mi [Triticum volgare) co tói 32 gòc xistein trèn mot chuòi polypeptit hay à lectin eùa

éc sèn àn duqc {Heiixpomatia) co 18 géc xistein (duói dang bàn xistin) va 10 géc

metionin trén mot phàn tu protein [99 100] Mac dù vày, xét ve thành phàn axit amin cùng nhu trình tu eùa chùng trong chuòi polypeptit eùa lectin, nguòi ta nhàn thay nhùng lectin tàch tir cac loài cùng chi hoac cùng nhóm co thành phan va trình tu axit amin gióng nhau ahiéu han là nhùag loài Idiac chi khàc nhóm [89 159J 69] Tuyèt dai da sé cac lectin dà biét trong thành phàn eùa mình, ngoài a?ut amin, con ehùa thành phàn ducmg (xacarit) Cac duòng tìm thay trong lectin thuòng là mannoza, glucoza, galactoza, galactozamin, con càc duòng khàc nhu xyloza, arabinoza dòi khi cùng gap nhung voi ty le thàp [89, 99, 1Ó9] Tuy nhien cùng co mot sé lectin khòng co thanh phàn duòng trong càu trùe nhu

eoncanavalin (Con A), lectin eùa màm lùa mi, hoàc eó vói hàm luqng khòng dàng

ké (-0,5%) nhu lectin dàu Ha Lan (Pisum sativum) [89, 99]

Nguòi ta cùng tìm thày trong phàn tu eùa mot sé lectin càc ion kim loai nhu

Mg***^, Ca ^, Mn ^ Càc ion kim loai này càn thiét cho su tuong tàc giura càc géc

duòng va lectin [89,99, 159]

1.1.2.2 Khóibxangphàn tu

Khèi luqng phàn tu eùa protein - lectin eó thè duqc xàe dinh bang nhiéu phuong phàp khàc nhau, nhimg phó bién là bang phuong phàp SDS - PAGE két hqp vói phuong phàp sàc k^ loc gel hoàc do tèe dò lang trong K tàm sièu tèe

Khèi luqng phàn tu eùa càc lectin khàc nhau thi rat khàc nhau Tuy nhièn, khèi luqng phàn tu eùa da sé càc phàn tu lectin eó hoat tinh (native protein) dà nghièn eùu dao dòng trong khoàng tir 32 kDa dén - 120 kDa [99]; su khàc biét là càc lectin lién két axit sialic: phàn tu eó hoat tfnh eùa chùng là nhùng tàp hqp (aggregate) vói khèi luqng vào khoàng 200 - 500 kDa [74,99, 123}

Dac trung nói bàt eùa hàu hét càc lectin dà nghièn cùru là càu trùe phàn tu góm càc phàn duòi don vi (pddv) Phàn tu lectin eó hoat tinh eó thè là dimer, tetramer, hexomer hoàc cao hon nhu càc lectin lién kéì; axit sialic góm tir 10 tói 24 pddv, càc phàn duòi don vi co thè là gióng hét nhau hoac khàc nhau, két hqp vói nhau thành dai phàn tu nhò càc càu disulfua hoàc càc hén két khòng eòng hóa tri Dac trung này thè hién tinh da hóa tri eùa lectin, nhu Con A (lectin Hèn két dàc

hiéu glucoza tàch tir hat dàu Canavalia ensiformis) là mot tetratmer góm 4 pddv

gióng nhau vói Mj = 26500 Dalton két hqp vói nhau bang càc lién két khòng eòng hóa tri va mói pddv déu eó càc trung tàm hèn két duòng, tmng tàm hèn két ion kim loai trong khi dò lectin tir càm gao (lùa) là mot dimer càu tao tir 2 pddv gièng hét nhau eó M^ = 18000 - 19000 Dalton va nei vói nhau bang càc càu

disuifua, con lectin I tir dàu Ulex europaeus lai là mot dimer góm hai pddv khàc

nhau (29 va 32 KDa) két hqp vói nhau bang càc tuong tàc khòng eòng hóa tri

[ 9 9 ] •• •' '

Phàn duói don vi eùa lectin eó thè là mot chuói polypeptit hoàc eó thè góm

* hai hay nhiéu chuói polypeptit thuòng nei vói nhau bang càc càu disulfua nhu pddv eùa lectin tir ée sèn àn duqc {Helixpomada) là mot dimer càu tao tu 2 chuòi

polypeptit (Mj = 13.000) nei vói nhau bang mot càu disulfua [102] hay phàn duói

don vi eùa lectin tàch tir huyèt thanh luon {Anguilla) eó M^ = 40 kDa góm 4 chuói

polypeptit (Mj = 10 kDa) két hqp vói nhau bang càc càu disuifua [99]

Càu trùe phàn tu kiéu nói trèn eùa lectin eó thè tao nèn hièn tuqng izoleetin Thuc té càc izoleetin dà gap a càc dèi tuqng dà nghièn cùu nhu eó tói 5 izoleetin

tàch duqe tur Phaseoius vulgaris, a dàu Ha Lan eó 2 izoleetin, con ò màm lùa mi eó

4 izoleetin [89, 99, 159]

Càc izoleetin eó thè eó tfnh dàc hièu duòng giéng nhau hoàc khàc nhau nhu

càc lectin I va n tach tir hat dàu Ulex europaeus ky hièu là UEA - I va UEA - n

(UEA I lièn két dàc hièu vói L Fucoza, con UEA U lién két dàc hièu vói N

-Axetyl - Glueozamin) [99, 126], hay càc lectin tàch tur hat dàu chàu Phi [Gaffonia simpUcifoUa) k^ hièu là GS-I va GS-IV (GS-I lién két dac hièu vói D-Galaetoza,

GS-rV lièn két dac hièu vói L-Fueoza) [99, 166]

1.1.2.3 Tinh dac hiéu duòng eùa lectin Phàn nlióni lectin

Khà nàng lièn két duòng là mot trong nhiing tfnh chat quan trong nhàt eùa lectin Theo quan nièm chung, nói ve tinh dàc hièu eùa lectin chinh là nói ve tinh dàc hiéu duòng eùa chùng [97, 151, 152, 158] Tinh dàc hièu này duqe xàe dinh bang càch so sành càc duòng, chù yèù là duòng don (monoxacarit) dira trèn co so nóng dò tèi thiéu eùa duòng càn de ùc che phàn ùng ngung két hóng càu hoàc de

ùc che phàn ùng két tua càc phùc chat duòng (nhu glycohpit, polyxacarit, glycoprotein ) Ò day su ùe che khà nàng ngung két hóng càu hay két tua phùc hqp duòng eùa lectin là do trung tàm lièn két duòng eùa lectin bi duòng duac thu phong tòa nèn khòng tiép xùe duqc vói càc trung tàm thu càm trèn bé mat tè bào hóng càu [79, 118]

Trung tàm lièn két duòng nàm à mot domen (domain) nhàt dinh trèn mòi

mot pddv eùa lectin va bao góm mot sé géc axit amin chinh duqe bao boc bòi mot

8

vùng góm càc axit amin khàc; càc axit amin chinh tham già vào trung tàm lién két duòng co thè là (rfiàn cuc nhu axit aspactic trong Con A, xistein trong lectin dàu

lim, hoàc là càc axit anain khàc nhu tyrozin, triptophan ò lectin dàu tuong, dàu Ha

Lan hay lectin màm lùa mi [104,151, 158, 166] Mot sé ion kim loai nhu Ca "*",

2+ 2+

Mg , Mn cQng tham già vào tuong tàc giOa lectin vói duòng; chùng duqc lién

két vói lectin Ò nhfing v^ trf nhàt d^nh goi là càc trung tàm lién két kim loai; càc tnmg tàm này thuòng phàn bè ò vùng gàn trung tàm lién két duòng eùa lectin

Arong khoàng 20A/; viéc loai bò càc ion kim loai trong nhOng truòng hqp này làm

mài hoat tfnh lién két duòng cQng nhu mot sé Unh chat khàc eùa lectin [86, 99,

151,159],

Bang phuong phàp dà nói trén, nguòi ta dà xàe dinh duqc nhOng duòng phó

b i ^ lién két vói lectin là : D - glucoza, D - mannoza, D - galactoza, L - fucoza,

N axetyl glueozamin, glueozamin, N axetyl galaetozamhi, axit N axetyl

-neuranùnic (axit sialic) hoàc nhOng gèc duòng này ò dàu khòng khù eùa phùc

hqp duòng [69, 83., 99, 119, 149] Phài nhàn thày ràng, két qua xàe d^nh duòng dàc hiéu eùa lectin hoàn toàn phu thuòc vào co h^i co càc loai duòng thlch hqp Itnh dàc hiéu duòng eùa mot sé lectin hién nay chua rò hoàc chua xàe dinh duqc,

co thè là do càc nhà nghièn cùu chua eó trong tay càc loai duòng thlch hqp

CO rat ft thòng bào ve lectin dàc hiéu P-D-glucoza, axit uronic, l^galactoza

màc dù càc san phim chùfa càc gèc duòng trén khà phÓ bién, nhàt là ò càc sinh vàt

bàc th^p (nhu vi sinh vàt, nàm, rong tao ) Co thè càc nhà nghièn cùru chua quan tàm xem xét d6i càc lectin dàc hiéu loai này [85],

Màc dù da dang ve càu tiùc va nguón gèc, xét ve tfnh dàc hiéu hén két duòng thi càc lectin da nghièn cùu co thè xép vào m^t trong càc nhóm sau [99] :

- Nhóm lién két glucoza / mannoza

- Nhóm lién két N - axetyl - glueozamin

- Nhóm lién két N - axetyl galactozamin / galactoza

- Nhóm lién két L - fucoza

- Nhóm Hén két axit sialic

Trong sé càc lectin dà nghièn cùru, nhung lectin lién két galactoza hay

N - axetyl - galactozamin ehiém uu thè ve sé luqng cùng nhu su phó bién Dàc biét dàng chù y là càc lectin co tihh dàc hiéu duòng don, nghia là chùng ehi lién két vói mot duòng nhàt dinh Càc lectin này eó thè là nhùng eòng cu eó Iqi trong càc nghièn cùu hóa sinh va hóa mién dich hoc Nhung lectin dàc hiéu duòng don khòng nhiéu, dàc biét ft gap nhiing lectin dàc hiéu L - fucoza hay L - ramnoza Nhu vày, khà nàng lién két duòng eùa lectin mang tfnh chon loc va thuàn nghich va là co so eùa nhiéu tfnh chat sinh hoc va ting dung quan trong eùa lectin

ma chiìng ta sé xem xét tiép theo,

1.1.3 Mot sé tinh chat sinh hoc eùa lectin

1.1.3.1 Sangangk&téhào (agglutJnation)

Thuc té tàt eà càc té bào duqc bao boc bòi duòng thi viéc lectin de dàng ngimg két càc té bào trong dò eó càc té bào hóng càu là diéu khòng gay ngac nhién ChMi phàn tìng ngung két này cho dén ngày nay vàn duqc dilng de phàt hièn su eó mat eùa lectin ò mot nguón sinh vàt nào day

De phàn ùng ngung két eó thè xày ra thi lectin phài hình thành nhiéu càu nei giiìa càc té bào eanh nhau Su ngung két này phu thuòc vào nhiéu yéu tè nhu tfnh chat phàn tu eùa lectin (sé luqng trung tàm lién két duòng), tình chat eùa bé màt

va trang thài sinh 1^ eùa té bào hay càc diéu kién ben ngoài nhu nhiét dò, pH, nóng dò té bào v.v Nhung thay dÓi (bang phuong phàp hóa hoc hay bang enzim) khòng làm màt khà nàng lién két duòng eùa lectin nhu thay dÓi hóa tri hay kfch thuóc phàn tu, eó ành huàng lón dén su ngimg két té bào bòi lectin Thf du, su polyme hóa lectin dàu tuong (qua xù 1^ bang glutaraldehyt) làm tàng khà nàng ngung két hóng càu bài lectin tói 100-200 làn, hay bién dói Con A (tetrameric) thành dang hóa tri hai (dimer) bang càch xucxinyl hóa (succinylatìon) làm giàm hoat tinh ngimg két eùa lectin tói hon 500 làn; su thay dói phàn xacarit trong phàn

tu lectin khòng ành huòng dén khà nàng ngung két nhu truòng hqp lectin dàu tuong [118,121]

10

Su thay dÓi càc thành phàn (nhu duòng) trèn bé màt té bào qua xù 1^ té bào

• bang enzim eó tàc dòng dàng ké dén su ngimg két té bào bòi lectin Thf du dién hình là lectin tàch tir hat lac: lectin này khòng ngung két càc té bào hÓng càu

nguòi chua xù 1^ enzim thàm ehf ò nóng dò 1 mg proteinAnl, nhung khi loai axit

N - axetyl - neuraminic bang càch xù 1^ càc té bào hóng càu vói sialidaza thi lectin eó thè ngung két hóng càu ò nóng dò microgam [118, 121] Nhìn chung, khà nàng ngung két té bào bòi lectin tàng lén khi té bào duqc xù 1^ bang enzim; càc enzim thuòng duqc diìng, ngoài sialidaza, là tripxin, kimotripxin, papain

Da sé càc nghièn cùu ve su ngung két té bào bòi lectin duqc tién hành vói càc té bào dòng vàt, kè eà té bào hóng càu màu nguòL

Nguòi ta thày ràng eó su khàc nhau dàng ké ve su ngung két giOa té bào t^nh thuòng va té bào àc tfnh (nhu ung thu): su ngimg két té bào àc tinh bòi lectin thuòng cao hon so vói té bào tónh thuòng Lectin con eó khà nàng ngung két chon loc mot quàn thè té bào rièng biét trong hòn hqp càc quàn thè té bào; mot sé lectin con eó khà nàng ngung két vinit va càc bào quan nhu nhàn hay ty thè [121]

Lién quan dén té bào hóng càu, nhiéu lectin khòng chi ngung két té bào hóng càu màu nguòi, ma con ngung két eà hÓng càu màu dòng vàt, thàm chi con dac hiéu dèi vói hóng càu eùa mot loài nhàt dinh

Màu nguòi khàc màu dòng vàt là duqc phàn thành nhóm A, B, O, M, N Ò day cùng gap càc lectin eó tinh dàc hiéu trong phàn ùng ngung két té bào hóng càu màu nguòi, nghia là lectin gay ngimg két hÓng càu thuòc mot nhóm màu nhàt dinh trong sé càc nhóm màu ké trén Thàm ehi mot sé lectin con ngung két dac

hièu cao ò mure dò phàn nhóm màu nhu Aj, A^, AjB, A^B [75, 90] Tuy nhién

nhiing lectin dac hiéu nhóm màu nguòi khòng nhiéu Qua thèng kè nghièn cùru thi trong dich chiét eùa 2663 loài thuc vàt trén lanh thó Ucraina eó 711 loài khòng eó tfnh dàc hièu, 90 loài eó tinh dàc hiéu nhóm màu va 227 loài eó khà nàng làm tan huyét [56] Trong sé càc lectin tinh sach dà tiiòng bào eiing ehi eó khoàng 15% sé che phàm eó tfnh dàc hiéu nhóm màu nguòi [56,75, 85]

cùru ve khà nàng này là lectin tir dàu Phaseoius vulgaris (PHA) Khòng phài bàt k^

lectin nào cùng gay kfch thfch phàn bào, nhung nhiéu lectin tir eày ho dàu dd là tàc nhàn gay kfch thfch phàn bào (mitogen) PHA va OHI A là nhung mitogen duqc su dung ròng rai nhàt Da sé càc lectin - mitogen chi kfch thfch phàn bào càc

té bào limpho T va, tuong tu nhu khà nàng ngung két té bào, khà nàng kfch thfch phàn bào eùa lectin eó thè bi thay dÓi khi co su thay dÓi trong càu trùe phàn tu eùa lectin (polyme hóa hay thay dói hóa tri) eiing nhu trong càu trùe eùa bé mat màng

té bào (té bào co hoàc khòng duqc xù ly enzim) [121] Nhiing nghièn cùu mói day [21, 76] cho thày lectin eùa hat mot sé loài mit hoang dai ò Viét Nam cùng bièu hién khà nàng kfch thieh phàn bào dèi vói limpho T eùa nguòL

Su kfch thfch phàn bào bòi mot sé lectin là hièn nhién nhung co che eùa qua tiình này thi dèh nay chua duqc làm sàng tò hoàn toàn Tuy nhién, nguòi ta cho ràng buóc dàu tién là qua trình gan lectin vào duòng trèn bé màt màng té bào Nhung ehi su gin két này khòng thi chua dù vi nhiéu lectin khòng co khà nàng kfch thfch phàn bào cùng lién két manh vói càc té bào limpho Càc nghièn cùru sàu hon cho thày bé màt màng té bào duqc kfch thfch eó nhùng domen tàch biét duqc gqi là domen kfch thfch va domen kim hàm va lectin-mitogen duqc gin vào

"nhOng chat thu càm kfch thfch /càc glycoprotein/* nhài dinh trén domen kfch thfch, con lectin - antimitogen thi lai gan vào domen kim hàm [121]

12

Ngoài su lièn két dàc hiéu trén, lectin - mitogen con phài co khà nàng kfch thfch càc té bào tao nèn va tiét ra ngoài càc polypeptit eó hoat tfnh sinh hoc duqe goi là càc limphokin Su eó màt eùa limphokin là càn thiét de té bào eó thè tiép tue càc giai doan tiéjp theo ciia qua trình phàn bào

Oo che tàc dòng eùa càc lectin - dòc tè nhu rixin, abrin da duqc biét khà rd

nhò chùng eó càu trùe tuong tu càc lectin cimg nguón va chùng tuong tàc vói té bào eiing tuong tu nhu lectin,

Càc lectin trén déu càu tao góm hai chuói polypeptit (chuói nàng P - va chuói nhe a -) nei vói nhau bang càc càu disulfua [123] Chuói p eó trung tàm lién két duòng, con chuói a thi ùrc che sinh tóng hqp protein trong càc he thèng vò bào, thè hién dòc tinh ciia phàn tu Phàn tu nguyén ven (gÓm eà chuòi p va chuói a) khi dà lién két vói gèc galactoza (hoac N - axetyl - galactozamin) trén bé mat màng té bào qua chuòi p, duqc té bào thu nhàn va ò dò chuòi a ùc che sinh tÓng hqp protein bang càch ngàn càn qua trình kéo dai chuói polypeptit trén polyxòm [121], Càch tàc dòng tuong tu cùng phàt hièn thày ò càc lectin dòc tè eùa vi sinh vàL

- Co thè kè dén mot sé tfnh chat sinh hoc khàc nùa eùa lectin uhm làm tàng

su thuc bào eùa càc macrophage, eó càc ành huòng gièng insulin lén càc té bào

mò, ùc che su sinh tiuòng eùa càc té bào ung thu, càm ling giài phóng tièu càu, thùc day su dfnh bàm va lan tmyén té bào, kfch thfch su giài phóng peroxit tir càc dai thuc bào (macrof^iage), ùrc che su sinh truòng eùa nàm [121]

Mot sé lectin co khà nàng tuong tàc vói càc khàng thè eùa nguòi (IgA, IgD) [22,68,110,142], phàn ùng vói tinh dùng ò nguòi [144]

13

1.1-4- tìng dung eùa lectin

Vói nhiing dàc trung va tfnh chat eùa minh, lectin dang duqc ùng dung ròng rai trong hóa sinh hoc, té bào hoc, mién dich hoc, y hoc va càc fình vuc Hèn quan Truòc hét, lectin là nhùng eòng cu hùu hièu de nghièn cùu càc phùc chat duòng nhu càc glycoprotein, glyeolipit, polyxacarit ma nhiéu chat trong sé này

là nhiing phàn tu eó hoat tinh sinh hoc nhu: càc khàng thè mién dich, nhiéu enzhn

eó bàn chat glycoprotein hay glycoprotein là thành phàn eùa bé màt màng té bào [57,60, 86, 112,114,118,157]

Tuong tàc dàc hiéu eùa mot polyme sinh hoc (biopolymer) vói mot lectin nào day eó thè coi là bang chùng ràng polyme dò eó chtia duòng, hon nira néu lectin

co tfnh dàc hièu duòng nhài dinh thi eó thè khàng dinh duòng (hoac càc duòng) lién két dac hiéu vói lectin, eó trong thành phàn xacarit eùa polyme sinh hoc

Mot khi lectin duqe gan vào già thè khòng tan (nhu agaroza hay sepharoza)

sé trò thành phuong tién hùu hiéu trong sic k^ ài lue de tinh sach càc glycoprotein hay càc glycohpiL Thuc té bang sàc k^ ài lue trén còt ehùa lectin nguòi ta dà tinh sach duqc nhiéu glycoprotein eùa màng tébào, nhiéu polyxacarit, oligoxacarit hay glycopeptit va nghièn cùu tfnh chat eùa ehting Lectin duqe dimg ròng rai vói muc

dich này là Con A [85, 120] Lectin tir hat càc loài thuòc ehi Artocarpus duqc

dùng de tinh che protein khàng thè tir huyét thanh nguòi [28,68,142]

Mot ting dung dàng chù y eùa lectin là truòng hqp tàch càc ARN^ eó ehùa bazo nito duqc glycozyl hóa dò là vièc tàch ARN^ ^^ tir gan thò va gan chuòt trén

Tyr

còt Con A - sepharoza hay ARN^ eiing tir càc nguòn dò trén còt sepharoza eó

gan lectin eùa hat thàu dàu {Ricinus communis) [120]

tSig dung quan trong khàc eùa lectin là viéc xàe dinh càu trùe hóa hoc ciia càc yéu tè quyét dinh nhóm màu A, B, O ò nguòi Bang vièc dimg càc lectin dac hiéu nhóm màu / nhu lectin dàc hièu nhóm màu A eùa dàu lim, lectin dac hièu

nhóm màu O eùa dàu Lotus tretragonolobus hay eùa luon {Anguilla anguilla) / két

hqp vói nghièn cùru phàn ùng ùc che HA bòi duòng, dà xàe làp duqc càc loai duòng uu thè mién dich eùa càc khàng nguyén A, B va O (H) tuong ùng là

14

N - axetyl galactozamin, D - galaetozji va L - fucoza [75, 118, 164] Diéu này co nghia là lectin dac lùèu nlióin màu A tliì lièn két dac liièu vói N - axetyl galactoziunui, lectin dac lùèu nlióni màu B tliì co duòng dàc hièu là D- galactoza, con dèi vói lectin dàc hiéu nhóm màu O thi duòng dac hièu là I^ fucozci Nhu vày

là tfnh dac iiiéu duòng eùa lectin lièn quan quan dén tfnh dac liicu nlióm nuìu 1 uy nhién m è i lién quan này kliòng phài lue nào cùng chat che, nghia là lectin dac hièu vói mot nlióm màu Uiì luòn bi ùc che bai mot loài duòng nli^^t diiii», nhung lectin bi ùc c h e bòi duòng dò chua eliae dà dac hièu nhóm uiàu dà bici Mac dù vày, mot sé lectin dac hièu nhóm màu nguòi dà va dang duqc su dung rOng rai de

xàe dinli nhóm màu nhu lectin tàch tu dàu Lotus tertagonolobus, Ulex curopiicus, tir huyét thanh luon {Anguilla anguilla) dà duqc su dung tir làu de xàe dinh nhóm

màu O (H) [118, 120]; mot sé lectin duqc dimg de xàe dinh nhóm màu thuòc hC

thèng Lewis nhu lectin tàch tir dàu chàu Phi {Griffonia simplicifolia) hay lectin eùa rong lue Ulva lac luca [95, 120]

Mot sé lectin tàch tir nguón dòng thuc vàt duqc dùng de xàe dinh nhóm màu

A nhuleetui eùa càc eày ho dàu dò: Dolichos biflorus (xàe dinh màu A^) [90], cac loài thuòc ehi Crotalaria, chi Vida [75]; lectin eùa ée sèn (Helix pomatia) [101 ]

va mot sé loài ée kliàc

D è i vói nhóm màu B tlù hièn nay dura eó Icctm nào duqc su dung ròng rai, tuy nlùèn mot sé lecthi dac hièu nhóm màu B dà duqc Ihòug bào nhu ledili tach

tir dàu Griffonia simplicifolia, eày Ihuéc Aristolaclna galeata, lectin tàch tir \\i\\\} Marasmius oreades, Fomes fomentarins, lectin tàch tu tarng cà, Icctui tu Salino solar (eà hói) [75, 118], tu eua bién [163], tir rong bién [ 136]

Nhu vày, tinh phÓ bién eùa lectin trong sinh giói cho phóp hy vong co nhiéu

lectin dàc hièu nhóm màu se duqc piiàt hicn va sir dung b ngAn liìnig nuui Hong thòi gian tói Nhung lectin dac hièu \^\\6m màu O (II) vii B càn dirqc quan tàm tun

kiém va nghièn cùu ky han

- Ngoài nhùng img dung dà ké trèn, lectin con duqc dùng de phàn hip vi khuàn, nàm cQng nhu nghièn cim cifu trùe màng eùa clulng, de chàn doan bènh do

15

nhiĩm khuăn [85, 157], chăn doăn miĩn dich k^ sinh trùng [26, 84], de tăch căc (juăn thỉ tĩbăo va xăe dinh căc giai doan khăc nhau eùa su biĩt hóa tĩbăo [120] 1.2 DAI CUONG VE PROTEINAZA VA C H X T ÙC CHE

Trong căc proteinaza, enzim tiĩu hóa duqc nghiỉn cùu som hon că

Ngay tir thĩky XVm, nhă tu nhiĩn hoc nguòi Phăp lă Reomur dă phăt hiỉn dich da day eùa ehim ăn thit eó tăc dung tiỉu hóa thit

Năm 1857, Corvisart dă tăch duqc tripxin tu dich tuy, dò lă proteinaza dău

tiĩn nhăn duqe ò dang che phăm Sau dò, vẳ năm 1861, Bmke dă tăch duqc pepxin tur da day ehó Ngoăi ra bay giò nguòi ta eiing dă eó nhiing quan săt dău tiĩn ve căc proteinaza trong mău

Căc proteinzaza ò thuc văt duqc phăt hiĩn muòn hon va Wurtz duqe coi lă nguòi dău tiĩn tach duqc proteinaza ò thuc văt văo năm 1879, dò lă papain eùa eăy

du dù (Caricapapaya)

Tur nùa dău tiiĩ ky XX trò di nhò ăp dung nhùng phucmg phăp mói nguòi ta

dă phăt hiỉn thĩm nhiĩu peptihydrolaza khăc nhu bromelain ò dùa, eatepxin ò mò dòng văt; dac biĩt căc giỉng vi sinh văt BBCÌUUS, Aspergillus, ^eptomyces

thuòng tóng hqp nhiĩu proteinaza khăc nhau [53, 61]

Viĩc phăn loai va goi tỉn enzim xùe tăc cho phăn ùng thùy phăn protein eiing tiiay dói tiieo tiiòi k}^ [71] :

- Theo Grasmann va Dykeihottl (1928) eie enzhn nhóm năy duqc ehia nhu sau :

Peptidaza (Proteaza)

Exopeptidaza

Nàm 1960, Hartley[103] phàn ehia proteinaza thành ben nhóm theo ca che

xùe tàc, nhung do nhiing hiéu biét mói ve mat hóa hoc tmng tàm phàn ùng eùa nhóm này nèn Barrett (1980) dà thay dÓi cho phù hqp va duqc ùy ban danh phàp quéc té eòng nhàn (1984)

Theo Barrett[71] proteinaza duqe ehia thành ben nhóm nhò Tèn eùa càc nhóm này bao gòm tèn eùa axit amin quan trong nhàt eó vai trò xùe tàc trong tnmg tàm hoat dòng:

+ proteinaza - xerin (EC 3 4 2 1 ) -H proteinaza - xistein (E C 3 4 22) + proteinaza - Aspactic (EC 3 4 23) + proteinaza kim loai (EC 3 4 24)

17

-i- Proteinaza - Xerin

Là nhiing proteinaza co nhóm (-OH) eùa géc axit amin xerin trong tmng tàm hoat dòng (TTHD) eó vai trò dac biét quan trong dèi vói hoat dòng xùe tàc eùa enzun

Thuòc nhóm này eó càc enzim nhu tripxin, kimotripxin, kahkrein ; chùng

bi kim hàm manh duói tàc dung eùa DFP (diizopropilfluophotphat) va nhiéu protein dac hièu khàc

Càc proteinaza - xerin thuòng hoat dòng manh ò vimg kiém va chùng eó tinh chat dac hiéu tuong dói ròng Tinh chat dàc hiéu eùa chùng thè hién ve phia gèc axit amin eó ehùa nhóm - CO - eùa Hèn két bi phàn giài Vi du: tripxin thùy phàn càc peptit ehùa nhóm - CO - eùa càc axit amin kiém (Lys, Arg), kimotripxin xùe tàc phàn ùng thùy phàn lièn két peptit co ehùa nhóm - CO - eùa càc axit amin thom

+ Proteinaza - Xistein

Tu làu nguòi ta dà nghièn cùu vai trò eùa nhóm - SH trong phàn tu enzim vi

nò eó khà nàng phàn ùng cao, tham già nhiéu loai bién dÓi hóa hoc nhu oxy hóa,

alidi hóa Vai trò eùa nhóm - SH irong phàn tu enzim thè hièn a nhiéu mat: tao thành hqp chài trung gian enzim - ca chat, su két hqp càc phàn tu co chat va

eofaetor, duy tri càu hình eùa enzim Nhóm - SH eó trong TTHD eùa enzim

Càc proteinaza xistein thuòng hoat dòng manh ò dò pH trung tinh va eó tinh dàc hièu ròng rài Proteinaza xistein chi hoat dòng duqc khi nhóm (- SH) khòng bi

bao vày Do dò càc chat nhu: xistein ,axit aseobic, glutauon khù b nóng dò xàe

dinh thuòng eó tàc dung làm ben, hoat hóa enzim này

Mot sé muéi kim loai nàng dàc biét là càc muéi thùy ngàn nhu: H g Q j ,

p-eloromereuribenzoat ( p - CMB ) va càc chat khàc nhu iodoaxetamit co tàc dung

ùe che càc proteinaza xistein Chùng bi oxy hòa tra nèn bàt hoat duói tàc dung eùa càc chat oxy hóa nhu iot, muéi xianua, H2O2 EDTA eó khà nàng két hqp vói kùn loai trong dung dich \ ì vày thuòng làm tàng dò ben eùa proteinaza xistein

V_ M/^S y , , , : , , « ' * - i v i ' • : * " , 1.»

18

+ Proteinaza aspactic

Là nhùng proteinaza eó ehùa càc nhóm caeboxil (- COO ) trong TTHD Nhóm caeboxil này thuòc mach ben eùa Asp, Giù hoac cùng eó thè là nhóm caeboxil dàu ( Q eùa chuòi pohpeptit Chùng dóng vai trò xùe tàc trong TTHD eùa enzim

Càc proteinaza aspactic thuòng hoat dòng manh ò pH axit Càc enzim này bi ùrc che bòi diazo axetil norleueine methyl ester (DNME) Chùng co tinh dac hiéu dèi vói càc axit amin ò cà hai phia eùa lièn két bi phàn giài Càc axit amin thuòng

là axit amin thom hoac là axit amin ky nuóe

+ Proteinaza kim loai

Là nhung proteinaza càn kim loai cho hoat dòng xùe tàc eùa chùng Nói chung càc kim loai eó thè tham già trong hoat dòng xùe tàc eùa enzim theo nhiéu càch khàc nhau: là thành phàn càu tao eùa enzim, hoac tao thành lièn két eòng hóa tri vói càc géc axit amin trong phàn tu proteinaza

Ngoài ra mot sé ion kim loai, dàc bièt là Ca thuòng co tàc dung làm ben càu trùe khòng gian eùa phàn tu enzim do dò ành huòng dén hoat dòng xùe tàc eùa chùng

Càc proteinaza kim loai hoat dòng manh nhàt là vtuig pH trung tinh va eó tinh dac hièu ve phia gèc axit amin ehùa nhóm (- NH - ) eùa lièn két peptit Càc

proteinaza eó thè tàc dung lèn càc nhóm (- NH - ) eùa càc axit amin ky nuóc co

kieh thuóc lón hoac càc hèn két peptit duqe tao thành tu càc axit amin phàn tu thàp Hoat dòng eùa càc proteinaza kim loai bi kim hàm duói tàc dung eùa EDTA, o-phenantrolin

Nhiéu proteinaza, dac biét là càc proteinaza dòng vàt duqc tÓng hqp ò dang khòng hoat dòng goi là zimogen hay proenzhn Càc zimogen eó Ùiè chuyén vi càu disulfua

Cùng vói vièc phàt hièn càc proteinaza mói, mòi nhóm proteinaza trèn bao góm càc ho enzim eó thè co nguón géc rat khàc nhau [72]

19

1.2.2, Protein ùc c h e proteinaza

Nhu trèn dà nói proteinaza (endopeptidaza) là nhóm enzim xùe tàc cho qua trình thùy phàn lièn két peptit ben trong phàn tu protein Càc proteinaza tham già trong nhiéu qua trình song quan trong nhu: tièu hóa, dòi mói protein nói bào, dòng màu, thu tinh, này màm Vi vày nghièn cùu diéu hòa hoat dòng eùa càc proteinaza trong co thè eó y nghia quan trong khòng chi ve ly thuyét ma con trong chuàn doàn va diéu tri mot sé bénh

Mot trong nhùng yéu té quan trong kiém tra hoat dòng eùa proteinaza trong

co thè là càc protein ùc che proteinaza viét tàt là PPI (protein proteinaza inhibitor) Càc PPI eó tàc dung làm giàm thuàn nghich hoat dò eùa càc proteinaza [1,

116] Càc PPI phó bién ròng rài a dòng vàt, thuc vàt Tuy nhièn càc PPI a dòng vàt duqc biét som han cà rói dén càc PPI b thuc vàt, con càc PPI b vi sinh vàt duqc

phàt hièn muòn nhàt

Mae dù càc PPI duqe phàt hièn tu cuòi thè ky truóc, nhung mói duqe nghièn cùu nhiéu tu nàm 1936 dén nay Mot trong càc PPI duqe phàt hièn som là hirudin

tàch tir mot loai dia Hirudo medicinahs Bàn chat hóa hoc eùa nò là protein eó tàc

dung ùc che' dàc hièu trombin

Dén nay nguòi ta dà tàch va tinh sach duqc nhiéu PH tir nhiéu nguón khac nhau,

dà nghièn cùu càu tnic, tinh chat hóa ly, dac tinh tac dung [61, ò5,73, 145, 162]

- Mot so tinh chat va cau trucphàn tu PPI

Phàn lón càc PPI, dac bièt là càc PPI thuc vàt co khò'i luqng phàn tu (Mj.) thà'p, it khi lón han 20 kDa PPI eó khò'i luqng phàn tu lón nhàt là ou -macroglobuMn trong huyét thanh nguòi eó (M^ = 725 kDa) [73]

Mot sé PPI là càc glycoprotein nghia là trong phàn tu eùa nò ngoài protein con eó eà xacarit Mot sé truòng hqp hàm luqng xacarit co thè dat dén 25 - 35% Thành phàn axit amin eùa càc PPI cùng eó nhùng net dàc bièt nhu thuòng thiéu triptophan, it axit amin thom, giàu xistein Càc géc xistein eó thè két hqp voi nhau tao thành nhiéu càu disulfua làm cho phàn tu khà vùng ben Do dò càc PPI thuòng

20

khà ben duói tàc dung eùa càc yéu té gay bién tinh protein va khó bi phàn giài duói tàc dòng eùa proteinaza, Tuy nhièn cùng eó nhùng PPI eó hàm luqng xistein rat thàp hoac khòng eó xistein

Trong PPI eó mot phàn tuong tac dac hièu, true tiép vói tmng tàm hoat dòng eùa proteinaza bi nò ùc che goi là tmng tàm phàn ùng (TTPU) Géc axit amin eó vai trò quan trong nhàt trong tuong tàc dac hièu vói enzim goi là axit amin eùa trung tàm phàn ùng k>' hièu là P^, lièn két peptit tuang ùng - Pi - P'i - goi là lièn két peptit eùa trung tàm phàn ùng, Uèn két - Pj - F j - thuòng nàm trèn bé mat eùa phàn tu PPI trong vilng eó càu disulfua Bàn chat géc P^ phàn ành tinh dac hièu eùa PPL Axit amin P^ trong càc TI thuòng là lizui hoac aeginin, con eùa KI thuòng là methionin hoac loxin Ngoài axit amin P^, axit amin làn càn cùng eó àrdi huòng quan trong dén tinh dac hièu eùa chat ùc che

Phàn tu PPI eó thè eó 1, 2, 3 hay nhiéu trung tàm phàn ùng Néu chi eó mot

T I P I / thi goi là chat ùc che mot dàu hay dàu don, Néu eó hai T I P I / thi goi là chat

ùe che hai dàu hay dàu kép, va néu eó nhiéu TTPU* thi goi là chat ùc che nhiéu dàu Càc PPI hai dàu hay nhiéu dàu eó thè két hqp dòng thòi vói hai hay nhiéu phàn tu proteinaza (càc enzim này eó thè co tfnh dac hièu giò'ng nhau hoac khàc nhau)

Mói PPI thuòng eó tàc dung ùe che dac hièu vói mot hoac mot sé proteinaza Càc proteinaza bi ùe che bòi mot PPI thuòng thuòc mot trong ben nhóm proteinaza (theo phàn loai proteinaza eùa Hartley) Vi vày càc PPI cùng duqc phàn thành ben nhóm tuong ùng :

1 - Protein ùc che proteinaza - Xerin

2 - Protein ùe che proteinaza - Thiol

3 - Protein ùe che proteinaza - Aspactic

4 - Protein ùe che' proteinaza - Kim loai

Trong sé càc PPI dà biét, càc protein ùe che proteinaza - Xerin duqc nghièn cùu ky hon eà Nhiéu PPI thuòc nhóm này dà duqe xàe dinh càu trùe bàc mot, càu

21

trùe khòng gian phàn tu, càu trùe vùng TTPU*, su dinh vi eùa càu disulfua Trèn co

so này Laskowski va Kato [116] dà xép càc protein ùc che proteinaza tàc dung theo co che chuàn thành 9 ho nhu sau:

1 - Ho protein mò tuy ùe che tripxin (TI Kunitz)

2 - Ho protein dich tuy ùe che tripxin (TI Kazal)

3 - Ho protein eùa streptomyces ùe che subtilizin

4 - Ho protein eùa dàu tuong ùe che tripxin (TI Kunitz)

5 - Ho protein eùa dàu tuong ùe che proteinaza (ho Bowman Biik)

6 - Ho PPI - I eùa khoai tày

7 - Ho PPI-n eùa khoai tày

8 - Ho protein Asearis ùe che tripxin

9 - Càc ho khàc

Thuc té danh muc "càc ho khàc" này eó thè kéo dai it nhàt tói 16 ho [78] trong dò eó sièu ho Serpins [134,146J

- Ca chétixcmg tàc ghìa càc PPI vói càc proteinzaza

Càc két qua nghièn cùru cho thày phàn lón càc PPI eùa proteinaza-xerin tuong tàc vói enzhn bi nò ùc che theo cùng mot co che chuàn [116] PPI két hqp vói enzim theo càch tuong tu nhu co chat két hqp vói enzim, nghia là eó su tuong ùng ve càu trùe khòng gian eùa TTPU* (PPI) va TTHD (enzim) theo kiéu "ó khóa

va ehia khóa" Khi proteinaza két hqp vói PPI tao thành phùc proteinaza-PPI (k^ hièu là EI) thi enzhn bàt hoat Trong phùc này hèn két - P^ - P^ - eùa T I P I / eó thè vàn con nguyén ven hoac eiing eó thè bi thùy phàn rat chàm bòi chinh proteinaza trong phùc ày Dang chat ùe che eó hèn két - P^ - F^ - eùa TTPLT bi thùy phàn goi

là dang hiéu chinh (thuòng k^ hiéu là I*) Phùc EI bi phàn ly thành enzun tu do va

chat ùc che (dang tu nhién va dang hièu chinh) Co thè bièu dién ca che tuong tàc

dà néu mot càch don giàn nhu sau:

E + I ^ • E I < • E + I*

22

Khi lién két peptit (CONH) Pj P i bi càt dùt sé tao thành mot nhóm

-e o o ' va mot nhóm -NHj"*" Nhu vày phàn tu PPI mói -eó thém mot dàu C va mot dàu N, hai mach peptit này khòng bi tàch ròi nhau là nhò càc càu disulDua hoac càc tuong tàc yéu

Phùc EI khà ben ò pH trung tinh nhung de bi phàn ly ò pH axit Ò pH tiiich hqp cho hoat dòng eùa proteinaza trong phùc EI, enzim lai eó thè xùe tàc cho su tài tóng hqp lièn két - P^ - F j Co thè dilng càc phuong phàp dàc hiéu de xàe dinh bàn chat axit amin dàu C va dàu N, tir dò biét duqc bàn chat axit amin Pj eùa PPI Màt khàc eó thè thay thè axit amin Pj trong I* bang axit amin khàc hoàc thay dÓi nhóm chùrc eùa nò va nghièn cùu su thay dÓi tihh dàc hiéu eùa PPI de xàe dinh duqc su lién két giiia axit amin Pj vói tihh dac hiéu eùa nò

Ngoài co che "chuàn" trèn, con eó co che ùc che gièng san phàm bòi chat ùfe che cacboxypeptidaza, Nhiing nghièn cùu gàn day cho biét càu trùe eùa phùrc xistatin / stefin - papain va phùc himdin - thrombin chùng tò su tuong tàc mói khòng gièng co chat : chùng (PPI) lién két chù yéu vói càc vi trf gàn ké càc gèc axit amin thuòc TTHD eùa enzim [78, 145]

1.2.3 tJhg dung eùa proteinaza va PPI

- Trén thuc té eó hai càch chù yéu [+] trong su dung proteinaza: 1) Diéu hòa dinh huóng tàc dung eùa enzim trong chinh nguyén hèu ehùa nò va 2) tàch enzim

ra khòi nguyén hèu ò dang che phàm va su dung trong càc qua trình san xuàt va nghièn cùu

Su dung enzim theo càch thù nhàt trong nhiéu truòng hqp eó thè don giàn hon làm tàng già tri eùa san phàm VI du eó thè dilng yéu tè nhiét dò de diéu chinh hoat dò eùa mot sé enzim eó trong eà, che, thuèc là làm tàng rò rét vi, huong, màu sàc eùa san phàm Tuy nhién càch su dung này han che pham vi ùng dung eùa enzim

[+] Pham Thi Tran Oiàu Proteinaza va tìng dung Bào càc tai HOi thào **Mò ròng khà nàng che bién thuc phàm thòng qua 03ng ngh^ sinh hqc", Ha nói, 10/1991

23

Su dung enztm theo càch thù hai thi pham vi ùng dung ròng rài hon va hièu qua hon Theo càch này, proteinaza duqc dùng vào nhiéu muc dich khàc nhau nhu: trong eòng nghiép thuc phàm de che bién bo, phomat, san xuàt nuóe màm, san xuàt nuóe giài khàt ), trong eòng nghiép dét - de ho to, ru hó lua; trong eòng nghé duqc phàm va y hoc - dilng làm Ùiuèc tàng khà nàng tièu hóa, tàng chat luqng bòt dinh duòng [2], thuèc tièu vièm, De phue vu muc dich trèn ò nhiéu nuóc dà hình thành va phàt trién ngành ky thuàt san xuàt che phàm enzim

- So vói proteinaza thi càc nghièn cùu ùng dung PPI con han che Su tón tai

tu nhién eùa PPI nói lén ràng khi càn bang tónh thuòng giiJa proteinaza - PPI

trong co thè bi phà vò se dàn dèh nhùng bénh dàc trung Nhu vày vói nhùng bénh

này eó thè su dung càc PPI de làm thuèc diéu tri nhu viéc dilng aprotinin de diéu

tri bénh vièm tùy c^p, dilng chat ùc che a^ - proteinaza de diéu tri bénh khi thiing

phói [1] Antilizin, chat ùrc che tripxin tinh sach tir phói bò, dà duqc su dung trong diéu tri vièm tuy càp va bénh thoàt vi (fia còt sèng [5]

Bang eòng nghé sinh hoc nguòi ta dà nhàn duqc mot sé PPI tài tó hqp buóc

d u duqc dùng nhu càc loai thuèc dàc hiéu, dién hlnh là viéc tao ra hirudin tài tó hqp khàng thrombin, chèng dòng màu [145]

Mot sé PPI dà chùng tò eó khà nàng ùc che su vàn dòng eùa tinh trùng dòng vàt co vù [115]; buóc dàu thù khà nàng ùe che sinh san eùa PPI trén chuòt thi nghiém [38] Huóng nghièn cùu này eó nhiéu hùa hen

13. LECTIN, PROTEINAZA VA C H X T ÙC CHE PROTEINAZA

Ò RONG BIÉN

1.3.1 Vài net ve phàn loai va nguón Iqi rong bién Thành phàn hóa hoc

eùa rong bìèn

Càc loài tao nói chung va tao bién (rong bién) nói rièng là nhiing ca thè tu

duòng, chùng eó khà nàng dÓng hóa duqc CO2, nuóe va muéi khoàng duói tàc dòng eùa ành sàng màt tròi de tÓng hqp nèn chat hùu co càn thiét cho co thè

24

Tao vén là thuc vàt bàc thàp va sèng ò moi vùng nuóe khàc nhau; chùng rat

da dang ve giéng va loài va eó nhùng dac diém ve hình thài va màu sae rat phong phù

Khàc vói eày thuc vàt bàc cao, co thè eùa tao khòng phàn hóa thành thàn, rè

là ma ehi là mot té bào eó màu don giàn, sèng tàp doàn hoac là nhùng co thè da bào vói càu tnie dang sol hoac dang bàn

1.3.1.1 Sa luac ve phàn loai tao

Tao duqc phàn ehia ra thành 10 ngành [43, 59] dò là : tao dò (Rhodophyta), tao nàu (Phaeophyta), tao lam (Cyanophyta), tao lue (Chlorophyta), tao vàng (Xanthophyta), tao vàng ành (Chiysophyta), tao mat (Euglenophyta), tao vòng (Charophytà), tao sOie (Bacillariophytà), tao giàp (Pyrophyta)

Càc loài trong càc ngành tao phàn bièt vói nhau ve càu tao co thè, càu trùe té" bào rièng le, ve su sai khàc eùa sàc té, càc chat du trù ben trong té bào cùng nhu eàe dac diém sinh ly eùa chùng

Dua vào dac diém phàn bé ve mòi truòng sèng va lèi sèng, tao duqe xép thành nhiing nhóm sinh thài khàc nhau [42]:

- Tao tròi nói (Fhytoplankton)

- Tao day (Phytobenthos)

- Tao dàt (Phytoedaphon)

- Tao khi sinh (Aerophyt)

- Tao bang tuy et (Cryophyton)

~ Tao nuóe nóng ( Thermophyte)

- Tao uà man (Halophyton)

Dòi khi dua vào kieh thuóc va càu tao hình thài, nguòi ta ehia càc ngành tao tiiành hai nhóm lón [59] là:

1 - Maerophyta - là nhùng tao eó kieh thuóc lón vói càu tao da bào nhu tao

dò, tao nàu, tao lue, tao vàng

2 - Mierophyta - là nhùng loài eó kfch thuóc nhò (gòm nhùng ngành con lai)

25

Dèi tuqng ma chùng tòi quan tàm nghièn cùru hàu hét là tao lón, uà man (rong bién)

1.3.1.2 Nguón lai rong bién

Két qua tóng hqp càc eòng trình nghièn cùru diéu tra [10, 11, 15, 16, 18, 44,

45, 46,47, 49] cho thày ò ven bién nuóc ta dà phàt hién duqc 653 loài rong bién,

24 bién loài (varietas), 20 dang (fonn), chù yéu thuòc 4 ngành rong: Rong dò, Rong nàu, Rong lue va Rong lam, trong dò ngành Rong dò ehiém sé loài lón nhàt (301 loài), ngành Rong nàu va Rong lue ft hon (tuong ùng là 124 va 151 loài); ngành Rong lam it nhàt, chi eó 77 loài

Sé luqng loài trén, tuy chua phàn ành day dù thành phàn loài, nhung cùng da nói lèn su phong phù, da dang eùa khu he rong bién nuóc ta Rong moc tu nhièn ,hoàc duqc tróng hàu nhu ò khàp càc viing ven bién nhung chùng phàn bè chù yéu

ò vilng triéu

Theo qui uóc phàn vilng dia thuc vàt thi he rong bién mién Bac Viét Nam duqc eoi là khu he rong bién càn nhiét dói, con rong bièn Nam Viét Nam duqc xép vào khu he rong bièn nhiét dói [47],

Két qua nghièn cùru diéu tra cho thày hàu hét càc loài rong bièn ò vilng triéu

eó tinh mùa vu ro ràng, chùng sinh san va phàt trién tir thàng 11 dén thàng 6 nàm sau Thàng 11 - 12 là thòi kj^ phàt sinh, thàng 3 - 4 là tiiòi kj^ moc tét nhàt, tién hành sinh san trong thàng 4 - 5 va tàn lui vào eàe thàng he (thàng 6 - 7), trong dàm nuóc Iq rong xàm nhàp tu bièn xuàt hién tu thàng 11 dén thàng 7 - 8 nàm sau [47] Nói ve nguón Iqi rong bièn truóc hét là nói ve nhiing loài rong eó già tri kinh

té ma hàng nàm duqc khai thàc, su dung ò mure dò khàc nhau Ò Viét Nam, dén nay dà thèng ké duqc 90 loài rong bièn co già tri kinh té, ehiém 13,7% tÓng sé loài da duqc phàt hién, trong dò ngành Tao lam eó 1 loài, ngành Rong lue - 11 loài, ngành Rong nàu 27 loài va nhiéu nhàt là ngành Rong dò - 51 loài [48]

Xét ve già tri su dung ta eó thè xép càc loài theo càc nhóm sau:

- Nhóm rong eòng nghiép: nhóm này góm 24 loài (ehiém 26,6% tÓng sé loài kinh té), chùng duqc dilng làm nguyén liéu che bién càc loai keo nhu : aga (nhiéu

26

loài rong càu va rong dò khàc), earagecnan (rong kì làn va mot sé rong dò khàc), alginate (nhiéu loài rong ma); thu nhàn eàe chat nhu ièt, kali cloma (mot sé loài rong mo)

- Nhóm rong duqc liéu: góm eàe loài rong eó thè làm thuèc ginn, thuèc diéu tiét sinh san, càm mao, tri bénh huyét àp, thuèc gay me, ehùa bénh buóu eó v.v Buóc dàu phàt hièn ò ven bièn Vièt Nam eó 18 loài rong duqe Hèu (thuòc 3 ngành rong lue, rong nàu va rong dò), ehiém 20%

- Nhóm rong thuc phàm bao gòm phàn lón eàe loài rong lue va rong dò (30 loài, ehiém 33,3%)

- Nhóm rong làm thùe àn già sue góm 10 loài, ehiém 11,1%, chù yéu thuòc ngành rong nàu va rong lue

- Nhóm rong làm phàn bón góm hàu hét nhùng loài eó san luqng cao nhu rong mo, rong btin, rong long cùng v.v (eó 8 loài, ehiém 9%)

Trong sé càc loài rong kinh té dang duqe khai thàc va su dung ò Viét Nam, 2

nhóm eó f nghia hon eà là eàe loài rong mo va rong càu: chùng khòng nhùng

phong phù ve sé loài (thè giói eó khoàng 400 loài rong mo va 150 loài rong càu thi

ò Vièt Nam dà phàt hièn duqc tuong ùng là 49 va 19 loài), ma con eó san luqng tu nhièn cao [10, 11, 15, 18,48]

Viéc khai thàc va su dung nguón Iqi rong bién néu ehi dua vào tmyén thèng

va san luqng tu nhién sé bi han che Huóng tich cuc trong Enh vuc này là phài nuòi tróng va qui hoach bào ve eàe nguón rong qui hiém nhu thè giói [127, 135] cùng nhu trong nuóc dà va dang thuc hièn Vi vày nhiing bièn phàp va de xuàt khu bào ve trong phuong huóng phàt trién nguón Iqi rong bièn Vièt Nam eùa PTS Nguyin Vàn Tién là hqp 15^ [48]

Tuy nhièn de khai thàc va su dung nguón Iqi rong bièn vói hiéu qua cao, eó nhiing san phàm dàp ùng duqe yéu càu eùa khoa hoc, kinh té quéc dàn va xuàt khàu, càn phài eó nhiing nghièn cùu diéu tra co bàn sàu sàc ve thành phàn hóa hoc, ve eàe chat eó hoat tfnh sinh hoc ò rong bién va bang eàe ky thuàt eùa eòng nghé sùih hoc, tao ra eàe san phàm eó già tri tu rong bièn

27

1.3.L3 Thành phàn hóa hoc eùa rong bién

# Thành phàn hóa hoc eùa rong duqc nghièn cùru khòng dóng déu dèi vói eàe ngành rong Duqc nghièn cùu nhiéu hon eà là thành phàn hóa hoc eùa tao lam,

rong lue, rong nàu,rong dò

Vói tu càch là co thè tu duòng, rong eó thè tóng hqp tàt eà eàe thành phàn

hùu co thuòng gap trong tébào sèng Tuy nhièn, nhiing thành phàn hóa hoc duqc

nghièn cùru nhiéu hon eà ò rong là : xacarit (duòng) protein, Mpit, sàc tè TÓng hqp eàe két qua nghièn cùru ve thành phàn hóa hoc ò càc ngành rong [58, 59, 127, 135] eó thè rùt ra mot sé nhàn xét duói day

- Ve xacarit Càc loài thuòc mot sé ngành nhu ngành tao lam, rong nàu,rong dò hàu nhu khòng ehùa monoxacarit tu do, trong khi dò ò càc ngành con lai chùng duqc tìm thày vói hàm luqng dàng ké (glucoza, mannoza hay fructoza ehiém tói 7 - 9% trong luqng khò ò tao vàng hay rong lue) Tuy nhièn, xét ve hàm luqng xacarit tÓng sé thi tao lam, rong nàu, rong dò là nhùng ngành ehùca hàm luqng xacarit cao nhàt (tòi 70% trong luqng khò) ma chù yéu là oligo- hay polyxacarit dang du trù hoàc dang càu trùe nhu : axit alginie, aga, caraghenan

- Làpìt Lipit ò tao dat hàm luqng khà cao dao dòng tu 5 dén 25% trong

luqng khò Trong diéu kièn lanh hpit eùa rong vàn ò trang thài long do trong thành phàn hpit càc axit beo khòng no ehiém uu thè

- Protein Càc loài rong, nhàt là rong lue ehùa hàu nhu day dù eàe axit amin thuòng gap trong protein Dac biét, rong ehùa day dù eàe axit amin càn thiét (axit

amin khòng thay thè) dèi vói co thè nguòi va dòng vàt, nhu ò Chiarella càc axit

amin này eó vói hàm luqng nhu sau: valin 2,67%, loxin 1,99%, izoioxin 1,69%, metronin 0,57%, treonin 1,91%, phenylalanin 2,14%, triptophan 0,41%, lizin 2,43% [42, 59] Càc loài rong nàu ehùa hàm luqng dàng ké eàe axit amin it gap hoac khòng gap ò càc loài tao khàc nhu: mono - va di-iòdotyrozin hay thyroxin [59] ^

Hàm luqng protein ò rong dao dòng trong khoàng 20 - 50% tfnh theo trong luqng khò; tao lam, rong dò, rong lue, tao sihe là nhiing nguón giàu protein vói hàm luqng eó thè dat tói 50% trong luqng khò [59] Trong sé càc protein rièng

28

biét ò rong, loai protein duqe nghièn cùru nhiéu hon eà là càc bOiprotein (càc protein eó màu) Nhihig protein này ehi thày ò rong dò, rong lam Nhóm phi protein (prostetic group) eùa eàe protein trèn là eàe sae tè bÓ sung goi là phyeobùin va eàe protein loai này thuòng gap là phyeoeritrin va phyeoxianin Dèi vói eàe protein này, net dàc trung là eó it nhàt hai cuc dai hàp thu phó ành sàng : cuc dai ò 280nm (hàp thu eùa phàn protein) va cuc dai hoàc càc cuc dai / vilng ành sàng nhìn thày (hàp thu eùa eàe sàc tè) / ò 500 - 550nm dèi vói phyeoeritrin hoàc

ò khoàng 610nm dèi vói phyeoxianin [58, 59]

O rong bièn càc protein - sae tè dóng vai trò là nhùng chat càm quang, tiép nhàn nàng luqng ành sàng va eiing vói eàe ehlorophil tham già vào qua trình quang hqp

- Sae tè Sae tè ò eàe loài rong rat da dang, phong phù va ty le giixa eàe loai sàc tè là khàc nhau ò càc loài khàc nhau, nhung tàt eà càc loài rong déu chtira ehlorophil a va p - earoten, hon nùa ò rong lam va rong lue hàm luqng ehlorophil

eó thè ehiém tói 60 - 80% tÓng sé sàc tè [58,59]

Ngoài càc thành phàn hóa hoc da néu trén, trong rong eó ehùa nhiéu loai vhamin va eàe nguyén tè vi luqng va dai luqng khàc nhau Dac biét rong bién ehùa tàt eà eàe nguyén tè vi luqng càn thiét cho co thè nguòi va dòng vàt Ièt duqc

tich lùy vói hàm luqng dàng kè ò rong nàu, sihe là nguyén tè khòng thè thiéu

trong dòi sèng eùa tao siLic Mot sé nguyén tè kim loai hiém va "dòc" nhu coban (Co), stronti (Sr), Rubidi (Rb), thùy ngàn (Hg) duqc tich lùy ò rong vói nóng dò cao hon nóng dò eùa chùng ò nuóc bièn tói 100, 1000 làn [42, 58, 59]

Qjng càn nhàn thà'y ràng thành phàn hóa hoc eùa rong bièn phu thuòc vào càc yéu tè sinh thài mòi truòng va dao dòng theo mùa Vi du, càc hqp chat ehùa nito (axit armn va protein) ò eàe loài rong sèng ò vilng duói thùy triéu eó su thay dói ve hàm luqng nhiéu hon ò eàe loài sèng trong vilng triéu; ò càc loai rong dò va rong nàu dà duqe nghièn cùu, nhàn thày su thay dói gióng nhau ve hàm luqng càc hqp chat ehùa nito: tàng lén vào thàng 4 - 5 , giàm manh vào thàng 7 - 8 , thàng 12

va thàng 1; diéu này eó thè hèn quan dén su ngimg tré qua trình quang hqp, su giàm euòng dò sèng hoàc suchét dàn eùa rong [59]

29

Ò Vièt Nam, vièc nghièn cùu thành phàn hóa hoc eùa rong bièn duqe tién hành ò Vién Hai duong hoc, tìiuòe Trung tàm Khoa hoc Tu nhién va Còng nghé quèc già Càc két qua nghièn cùru dà eòng bè [9, 50, 51, 52] cho thày thành phàn hòa hoc, hàm luqng eàe chat va su thay dÓi eàe hàm luqng này theo mila ò rong bién Vièt Nam cùng tuong tu nhu càc loài rong sèng ò eàe vilng bién tuong tu

khàc trén thè giói Su tich lùy cao nhàt eàe chat ò rong thuòng trùng vói thòi k^

phàt trién manh eùa thòi sinh san

1.3-2- Lectin ò rong bièn

So vói thuc vàt bàc cao, dòng vàt va vi sinh vàt, lectin ò rong bién duqc quan tàm nghièn ethi muòn hon Nhiing thòng bào ve lectin ò rong bièn con ft òi va rài ràc Chi càn diém lai trong sé hàng tram che phàm lectin nhàn duqe tu càc loài sinh vàt khàc nhau, mói eó khoàng vài chue che phàm duqc tàch va nghièn cùu tu rong bièn [85, 99, 139] Nguyén nhàn eùa tình hình này eó le truóc hét là ò bàn thàn dèi tuqng: rong bièn thuòng sèng ò càc vilng nuóc khàc nhau nèn viéc thu màu vàt dòi khi gap khó khan Nhung khó khan lón nh^t eó le là bang eàe phuong phàp da dùng nguòi ta mói phàt hién thày lectin ò mot sé it (25 - 30%) trong sé càc loài rong dà diéu tra, hon nùa nhùng loài eó lectin thi hoat dò ngung két hóng càu thuòng là thàp va da sé khòng eó tfnh dàc hièu nhóm màu nguòi [67,77, 105,

138, 139]

Lectin ò rong bièn duqc nghièn cùu chù yéu vói eàe loài thuòc ngành rong

dò, rong nàu va rong lue Trong sé eàe loài rong dà nghièn cùru, dà phàt hién mot

sé loài ehùa lectin dac hiéu nhóm màu nguòi nhu lectin eùa rong lue Codiam

fragile dàc hiéu nhóm màu A, càc lectin tàch tir càc rong dò Ptilota piumosa^ Laurencia ondulata, hay rong lue Biyopsis hypnoides, dac hiéu nhóm màu B,

lectin eùa rong lue Ulva lactuca dàc hièu nhóm màu O (H), con lectin tir rong lue

Ulva arasakii lai dàc hiéu nhóm màu A + H [105, 139] Nhiing lectin dac hiéu

nhóm màu B, nhóm màu O hoàc A + H là dàc biét dàng chù y vi hién nay rat hiém

càc khàng huyét thanh loai này trong xàe dinh nhóm màu ò nguòi

30

Nghièn cùu tinh dàc hièu duòng eùa eàe lectin tàch tu rong bièn cho thày,

dèi vói nhùng lectin dac hiéu nhóm màu, tuong tu càc lectin dàc hièu dà biét, hoat

dò ngung két hóng càu eùa lectin dac hièu nhóm màu A bi ùe che dac hiéu bòi N-axetyl-galaetozamin, lectin dac hièu nhóm màu B - bi ùc che bòi D-galaetoza

va lectin dac hièu nhóm màu O - bi ùc che bòi L - fucoza [95, 136, 139]

Diém dàc bièt eó thè nhàn thày ò lectin tao là nhiéu lectin eó tinh dàc hièu duòng phùc tap hoàc hièn nay chua rò [105, 108, 139, 154] Hién tuqng này cimg thày ò lectin eùa mot sé dòng vàt bièn [14,39, 67, 85, 97]

Lièn quan dén mèi quan he giùa hoat tfnh lectin va duòng cùng nhu nhùng dàn xuàt eùa chùng, thòng bào gàn day eùa Rogers va eòng su [140] là mot diéu bàt ngò: N - axetyl glueozamin va N - axetyl galactozamin (vói nóng dò 10 - 100

mM) làm tàng hoat dò ngung két eùa lectin tir loài tao dò GhfUtbsia flosculosa

Ve khèi luqng phàn tu, bang phuong phàp loc gel va dién di trèn gel polyacrylamit dà xàe dinh duqe khèi luqng phàn tu eùa eàe lectin khàc nhau tàch

tu rong bièn Khèi luong phàn tu eùa chùng dao dòng trong khoàng lón tir 12.000

Da / ò rong dò Agardhiella tenera hay Cystoclonium purpureum / [108, 154] dén

300000 Da nhu ò tao dò Ptilota piumosa [137] Phàn tu eó hoat tinh eùa eàe lectin

dà nghièn cùu eiing eó càu trùe gÓm eàe phàn duói don vi, thàm ehi nhò nhu

lectin eùa Cystoclonium purpureum vói khèi luqng phàn xix khoàng 12000 Da cùng góm 2 duói don vi vói M^ = 6000 Da, hay lectin tu tao dò P piumosa góm

hai duói don vi khàc nhau vói khèi luqng tuong ùng là 65.000 va 170.000 Da [137]

Da sé càc lectin rong bién, nhàt là lectin tàch tu eàe loài rong dò, khà ben nhiét Chùng ta hàu nhu ehita biét gì ve chùe nàng sinh hoc eùa eàe lectin ò rong bièn, ngoai trir mot sé eó khà nàng ngung két vài loài vi khuàn bién hay nàm mèc

va eó thè dóng vai trò bào ve rong khòi yéu tè gay bènh [105,139]

Ò Viét Nam, cho dén thòi gian gàn day hàu nhu chua eó eòng tiinh nghièn cùu nào ve lectin ò rong bièn

31

1.3.3 Ve protcìna/a va chat ùe che protcina/.n ó rong bìcn

Hnzim nói chung va protcinaz^i nói ricng b tao cium duac (|iinn lAni nj:,hi(^n

cùu nhiéu Nhùng enzim duqc de càp dén chù yèu là càc cn/Jni oxy hóa - khù va / hoìic eàe enzim trao dòi duòng, han nùa càc nghièn cùu mói chi làp tmng d u i yèu

ò ngành rong lam, rong dò va rong lue [58, 591; proteinaza duqc nhAc dén ve hai

kliia canh: enzim chi co nguón gòc nói bào / khòng duqc tic! ra niOi tnròng/ vì\ mot che phàm proteinazii duqc tàch ra lù dich tu Ihùy pliAn eùa rong dò i^jrpliynf tenera, xét ve tnih chat, là mot proteinaz^i dang papain hoac eatepxin |5Q|

Cliàt ùc che protemaza co bàn chat protein (ITI ) phó biCh b thuc vAl bàc cao

va dòng vài, nhung dén nay, hàu nhu chua co thòng bào nào ve loai chat này b rong bién trén thè giói cùng nhu ò Vièt Nam, ngoai trù mot còng (rình mai duqc

thòng bào gàn day [3 ]

Tu nhùng diéu dà truih bay a càc phàii trèn eó Uié thày lectin, proteùia/.u va

PPI là nhùng protein co hoat tinh sinh hoc phó bièn b sinh giói, chiing thant già

vào nhiéu hoat dòng sèng quan trong b smh vàt va eó nhiéu ùng dung quan (rong trong tliuc lién dòi song xa hòL Tuy nhièn, tren thè giói cung nhir a nube ta càc chat trèn mói duqc nghièn cùu chù yéu b càc dèi tuqng thuc vài bàc cat), dòng vM

va vi smh vàt, con rong bién thi chua dirqc quan tàm nghièn ciru day dù Nghièn

ciìxi lectin, proteinaz^i va PPI ò rong hién là g6p phàn bù dap sir Ihiéu hul trèn

trong nghièn ei'ni ca bàn ve hóa sinh hoc eùa chung, mal khàc tao ca so virng chàc

cho vièc khai thàc jnòt càch hqp 1^' va co liicu qua nguuu lai nguyén qui, [ìhung phù va da dang là rong bién ò luróe ta

32

Chirang 2 - BÒI TlTONG VA

PHUONG PHAP NGHIÈiN CÙU

2.LDÓIlXrONG

- Màu nghièn cùu là càc loài rong bién (tao lón) thuòc ba ngành: Rong dò

[Rhodophyta), Rong nàu (Phaeophyta) va Rong lue (Chlorophyta) Cac loài rong bién duqc thu gom b ven bién va ven càc dào vùng Hai Phòng, Quàng Ninh va

mién Trung nhu: Tl^anh Hóa, Nghè An, Thira Thièn Huè', Kliànli Hòa vào thàng 4

- thàng 5 hàng nàm Màu (dang tuoi hoac dang kliò kiiòng khi) duqc dung trong tùi nilòng va bào quàn trong tu lanh truóc Ichi su dung Tèn càc loài rong do PTS Nguyén Vàn Tién (Phàn vièn Hai Duong hoc Hai Phòng) dinh loai

- Chuin bi dich chiét tu rong

Nghièn màu (dà duqc làm sach Ichòi cài sòi va dòng vàt bién) trong coi su co thèm cat thùy tinh (dà xù ly bang H Q va làm sach, Ichò) vói dung dich dèm theo

ry le màu: dich dem là 1 : 1 (w/v) dèi vói màu tuoi va 1 : 10 (w/v) dói vói màu Ichò

Sau khi li tàm 30 phùt b 5000 vòng/phùt trong diéu Idèn lanli, thu ià'y dich trong Dung dich dùng de chiét nit zac leciin tu rong bien là dem photphat muoi (PBS) pH 7,4; mot sé màu rong con duqc chiét rCw bang vài loai dèm khàc de thù

lue Enteromorpha tubolosa va Ulva conglobata', dèm PBS hoac N a O 0,15 M dèi

vói mot so loai rong khàc

MOT SO LOÀI SONG DÒ, RONG LUC THUÒC VÙNG BIÉN VIÈT NAM

- Cac hình ve dUric din theo [11,18,421

33

- Hóa chat

Sephadex G - 75, G - 100, sepharoza 4B, superoza 12 eùa hàng Phannacia (Tliuy Dién); cazein, DEAE - Xel, amido den lOB eùa hàng Merch (Gòng hòa Lièn bang Dire); tripxin, papain, muxin (càc loai), albumin huyèt thanh bò, càc loai duòng (xacarit) eùa hàng Sigma (My); a - Kimotripxin tinh sach eùa phòng thi nghièm Leurquin (Phàp); càc hóa chà't khàc déu eó dò tinh khiét phàn tich Hóng càu eàe nhóm màu A, B, O eùa nguòi do Vién Huyét hoc - Tmyén

màu, bènh vièn Bach Mai, Ha Nói cung cà'p Hong càu truóc khi dùng duqc rua 3

- 6 làn bang nuóe mutìi sinh 15^ (NaQ 0,15 M)

Xù ly hóng càu bang papain duqe tièn hành nhu sau: dung dich hóng càu 5%

(vA^) dà rua nhu trèn duqc ù vói papain 0,1% eó xistein 0,01% b 37°C trong 30

phùt, sau dò duqe rùa tiép 3 làn bang NaCl 0,15M truóc khi thù

2.2 PHUONG PHÀP NGHIÈN CÙU

2.2.1 Càc phucmg phàp xàe dinh hoat dò va dinh luqng protein

2.2.1.1 Xàe dinh hoat dò lectin bang phàn ùng ngung két tébào hóng càu

Phàn uiig ngung két hóng càu duqc tién hành theo phuong phàp eùa Gebauer

[92] : 50 p.1 dich lectin /dich chiét rong hoac che phàm lecùn / duqc pha loàng gà*p dòi lièn tiép bang dung dich dèm tucoig ung, trong càc giéng eùa bàn thù bang nhua (Microtiter system, kieh thuóc 12 x 8 cm, góm 8 hàng mòi hàng 12 giéng)

va 50 ul hóng càu 2% ivjv) eùa càc nhóm màu nguòi (dà rùa 3-6 Un bang N a Q

0,15M) duqc thém vào mòi giéng Két qua phàn ùng ngung két duqc ghi nhàn sau

60 - 90 phùt de yèn bàn nhua à nhiét dò phòng Hoat dò ngung két (hièu già, viét tat là HA) là nghich dào eùa dò pha loàng lón nhà't eùa dich lectin con eó khà nàng ngimg két hoàn toàn luqng hóng càu dà thèm vào

Trong mot so' thi nghiém vói rong Ulva conglobata, phàn img ngung két hóng càu duqc tièn hànii vói hóng càu qua xù ly bang enzim nhu dà tiinh bay b

trèn

34

2.2.1.2 Xàe dinh hoat dò eùa proteinaza va chat tic che proteinaza bang

• phuong phàp khuéch tàn trèn dia thach co ca chat

Hoat dò proteolytic (PA) va hoat dò tire che proteinaza (PIA) eùa dich chiét rong cùng nhu che phim protein sach, duqe xàe dinh bang phucfng phàp khuéch tàn trèn dia thaeh [117] vói cu chà't là cazein 0,1% cr pH 6,5; 7,4 (dèm photphat) va

pH 8,1 (dèm Tris) dùng nóng dò thaeh (agar-agar) 1,5%, tién hành xàe dinh b

nhièt dò phòng trong 15 giò dói vói enzun eùa rong bién va trong 5 giò dói vói tripxin, a - kimotripxin hay papain, sau dò nhuòm dia thaeh bang dimg dich amido den ICE 0,1% Dành già hoat dò theo kieh thuóc vòng phàn giài khòng màu trèn nén xanh dàm

2.2.1.3 Xàe dinh PA va PIA theo phuang phàp Anson cài dèh

PA va PIA cùng duqc xàe dinh theo phuong phàp Anson cài tién [62] dùng cazein 1%, dèm photphat pH 7,4, ù hónhqp phàn ùng 10 phùt b 30*C Ò phàn ùng

xàe dinh PIA, enzim duqc pha ò nóng dò sao cho sau phàn tìng eó 0,2 < AOD < 0,3 (nóng dò ehuii) / tripxin vói nóng dò ehuin là 0,04 mg/mi co AOD = 0,25, a -

kimotripxin vói nóng dò 0,04 mgAnl co AOD = 0,22 /, thay vi 0,5 mi enzim (b

nóng dò chuàn), dùng 0,25 mi dich ehéphdm tròn vói 0,25 mi dich enzim eó nóng

dò gtfp 2 làn nóng dò chuin va hón hqp duqc ù trong 10 phùt of 30''C Tiép theo tién hành xàe dinh hoat dò PA nhu phuofng phàp da nói trèn

Dua trèn già tri A OD eùa phàn ùng enzim khòng bi ùe che va phàn tìng enzun bi tìe che ta tinh duqc so don vi tìe che trèn Imi dung dich chat tìe che theo còng thtìrc sau:

(AODE-AODEI) PIA/ml= a 4 = so don vi (lU)

A ODE

A ODE : A OD eùa enzhn khòng bi tìe che