Nghiên cứu biểu hiện gen NovU tham gia sinh tổng hợp đuờng khử dTDP–L–Noviose thuộc nhóm gen sinh tổng hợp kháng sinh Novobiocin

Cấu trúc hóa học của kháng sinh NovobiocinSơ đồ tổng hợp kháng sinh NovobiocinCon đường chung mô tả cơ chế sinh tổng hợpđuờng deoxy–hexose từ glucose–1–phosphateCấu tạo đường L–Noviose C

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Đại cương về kháng sinh 2

1.1.1 Lịch sử phát triển của kháng sinh 2

1.1.2 Định nghĩa kháng sinh 4

1.1.3 Phân loại kháng sinh 4

1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 5

1.1.5 Ứng dụng của kháng sinh 8

1.2 Novobiocin 10

1.2.1 Kháng sinh Novobiocin 10

1.2.2 Cơ chế tác dụng của Novobiocin 10

1.2.3 Cấu tạo kháng sinh Novobiocin 11

1.2.4 Các nghiên cứu về kháng sinh Novobiocin 11

1.2.5 Ứng dụng của Novobiocin 12

1.3 Đường khử 14

1.3.1 Gốc đường khử trong cấu trúc kháng sinh 14

1.3.2 Một số nghiên cứu về gốc đường khử 14

1.3.3 Con đường sinh tổng hợp gốc đường khử trong tế bào vi sinh vật 15 1.3.4 Đường khử trong cấu trúc Novobiocin 17

1.4 Nghiên cứu về NovU 17

1.4.1 Đường dTDP–L–Noviose 17

1.4.2 Con đường sinh tổng hợp đường dTDP–L–Noviose 18

1.4.3 Gen NovU 19

1.5 Vector pET-32a(+) 20

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Vật liệu nghiên cứu 23

2.1.1 Hóa chất 23

2.1.2 Thiết bị 23

2.1.3 Chủng vi sinh vật 24

2.1.4 Vector và Plasmid tái tổ hợp 24

2.2 Điều kiện nghiên cứu 24

2.2.1 Điều kiện nuôi cấy 24

2.2.2 Môi trường nuôi cấy 25

2.2.2 Chuẩn bị các dung dịch 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Tách chiết DNA plasmid 27

2.3.2 Điện di agarose gel 28

2.3.3 Biểu hiện và thu nhận enzyme 30

2.3.4 Điện di protein 30

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Phân tích trình tự 34

3.1.1 Phân tích trình tự gen NovU 34

3.1.2 Dự đoán chức năng của enzyme NovU 35

3.2 Kiểm tra vector đã được biến nạp trong E.coli BL 21 DE3 37

3.3 Biểu hiện gen NovU 38

3.3.1 Biểu hiện 38

3.3.2 Kết quả biểu hiện 39

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

Ethylen diamin tetra–acetic acid Ethidium bromide

Sodium dodecyl sulphateTris–Acetate–EDTATris–EDTA

Polymerase Thermus aquaticusOptical Density

NucleotidKilo baseBazơ pairsKilo bazơKilo DaltonOpen reading frame (khung đọc mở)Escherichia coli

MarkerNational Center for Biotechnology Information

Cấu trúc hóa học của kháng sinh Novobiocin

Sơ đồ tổng hợp kháng sinh NovobiocinCon đường chung mô tả cơ chế sinh tổng hợpđuờng deoxy–hexose từ glucose–1–phosphateCấu tạo đường L–Noviose

Con đường sinh tổng hợp đường dTDP–L–

Noviose (ring C)

Vị trí gen NovU trong cosmid (9–6G)Vector pET-32a(+)

Trình tự gen NovUKết quả so sánh sự tương đồng của gen NovUvới các gen cùng chức năng trên Genbank

Kết quả so sánh tương đồng axit amin củaenzyme NovU với các enzyme cùng chức năngtrên Genbank

Kết quả chạy điện di sản phẩm NovU được chuyển vào pET-32a(+)

Kết quả điện di các mẫu protein tái tổ hợp ở cácnồng độ IPTG khác nhau

Kết quả điện di các mẫu protein tái tổ hợp ở điềukiện nhiệt độ khác nhau

Kết quả điện di các mẫu protein tái tổ hợp ở cácđiều kiện thời gian khác nhau

111316

18

191922343536

38

39

41

42

MỞ ĐẦU

Công nghệ sinh học đã và đang được ứng dụng vào trong rất nhiều lĩnhvực như: công nghiệp, nông nghiệp, y học, dịch vụ, du lịch… nhằm phục vụcho mọi nhu cầu của cuộc sống như: dinh dưỡng, giải trí, chăm sóc sứckhỏe… Bằng những kiến thức sinh học về thực vật, động vật, nấm, vikhuẩn… và sử dụng “Công nghệ DNA tái tổ hợp” những nhà khoa học đang

cố gắng tạo ra những cây trồng, vật nuôi có năng suất và chất lượng cao,những loại thực phẩm, dược phẩm phục vụ cho việc chữa bệnh con người…Hiện nay, trên thế giới ngành công nghệ hóa dược đã phát triển lên đếnđỉnh cao Các công ty dược, công ty công nghệ sinh học đã, đang sản xuất vàbán các loại thuốc có nguồn gốc là các sản phẩm của ngành công nghệ sinhhọc, công nghệ protein, công nghệ gen nhờ những ứng dụng của công nghệ visinh và sinh học phân tử

Xu hướng nghiên cứu về hóa dược hiện nay trên thế giới là nghiên cứutạo ra được các thế hệ kháng sinh mới bằng cách thay gốc đường mới vào gốcđường cũ của một số nhóm kháng sinh [1] Vì vậy, các kháng sinh thế hệ mới

có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn, tránh được hiện tượng kháng thuốc của vikhuẩn, đồng thời khả năng thải trừ của thuốc cao hơn

Hiện nay ở Việt Nam quan tâm nhiều đến nghiên cứu, trong đó gồmnghiên cứu cơ bản và nghiên cứu ứng dụng tạo ra kháng sinh thế hệ mới Vìvậy nghiên cứu về gen sinh tổng hợp đường dTDP–L–Noviose có ý nghĩakhoa học và thực tiễn

Nội dung đề tài: " Nghiên cứu biểu hiện gen NovU tham gia sinh tổng hợp đuờng khử dTDP–L–Noviose thuộc nhóm gen sinh tổng hợp kháng sinh Novobiocin"

Mục tiêu đề tài là kiểm tra vector tái tổ hợp có chứa gen NovU và nghiêncứu biểu hiện gen NovU

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đại cương về kháng sinh

1.1.1 Lịch sử phát triển của kháng sinh

1.1.1.1 Lịch sử phát triển kháng sinh trên thế giới

Giữa thế kỉ XVII, một thầy thuốc hoàng gia Anh đã chữa bệnh bằng cáchdùng rêu đắp lên vết thương Đến cuối thế kỉ thứ XIX người ta đã chữa lànhcác vết thương bằng cách sử dụng các mẫu bánh mì mốc

Năm 1928, Alexander Fleming (Bệnh viện Saint Mary, London) pháthiện nấm tiết ra chất có tác dụng diệt khuẩn Với phát hiện này ông được coi

là người mở ra kỉ nguyên sử dụng kháng sinh trong y học Ông được trao giảithưởng Nobel y học năm 1945 cùng với Ernst Boris Chain và Howard WalterFlorey về việc tìm ra và phân tách được penicillin, từ đây penicillin được coi

là loại kháng sinh đầu tiên trong việc điều trị những bệnh nhiễm trùng

Sulfonamid được Gerhard Domard (Đức) tìm ra vào năm 1932.Streptomycin được Selman Waksman và Albert Schatz tìm ra vào năm 1934.Năm 1938, Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey (Đại học Oxford) bắtđầu nghiên cứu tác dụng điều trị của penicillin [2]

Năm 1939, Chain theo Florey nghiên cứu các tác nhân tự nhiên chống vikhuẩn do các vi sinh vật sản xuất gây ra và xem xét lại công trình củaAlexander Fleming – người đã mô tả penicillin từ 9 năm trước đây Từ đóChain và Florey quyết định khám phá tác dụng chữa bệnh của penicillin vàthành phần hóa học của nó Ông cũng tạo ra lý thuyết cấu trúc của penicillin,

và lý thuyết này đã được xác nhận bởi việc xác định cấu trúc trong một tinhthể bằng phương pháp chiếu tia X ba chiều (X–ray crystallography) doDorothy Hodgkin làm Vì thế Chain, Florey và Fleming đã đoạt giải Nobelnăm 1945

Ngày 25/05/1940, thử nghiệm tác dụng của kháng sinh thành công trênchuột Edward Abraham nghiên cứu điều chế penicillin tinh chất.

Năm 1943, dự án sản xuất penicillin được chính phủ Mỹ đặc biệt chú ýnghiên cứu thử nghiệm và bước đầu sản xuất

Đến nay, có hơn 1600 chất kháng sinh được tìm ra nhưng chỉ có khoảng

150 loại được sử dụng rộng rãi (các chất kháng sinh không được sử dụngphần lớn là do: có tính độc, có tác dụng phụ, phổ kháng khuẩn hẹp, giá thànhsản xuất cao…)

1.1.1.2 Lịch sử phát triển kháng sinh ở Việt Nam

Ở nước ta kháng sinh đã đánh đấu một bước ngoặt lớn trong công táccấp cứu, điều trị chiến thương và bảo vệ sức khỏe cộng đồng

Năm 1950 trong kháng chiến chống Pháp, GS Đặng Văn Ngữ đã nuôicấy Penicillin Chryroylum và dùng chiết môi trường nuôi cấy để điều trị vếtthương cho thương binh

Năm 1968, bộ môn công nghệ dược của Đại học Dược Hà Nội đượcthành lập và đào tạo cán bộ chuyên khoa kháng sinh do giáo sư Trương CôngQuyền làm chủ nhiệm được ra đời nhưng sau một thời gian hoạt động khôngthành công nên bộ môn này không được duy trì

Sau đó Việt Nam được nhiều đối tác nước ngoài như Liên Xô (cũ),Trung Quốc, Tây Ban Nha, Triều Tiên hợp tác và giúp đỡ sản xuất, điều chếkháng sinh nhưng sau đó cũng không thành công do nhiều nguyên nhân [3].Năm 1985 – 1990, một chương trình nghiên cứu Nhà nước 64C – Bộ Y

Tế nghiên cứu sản xuất thử kháng sinh Oxytetracyclin và Tetracyclin nhưngđạt kết quả không cao về cả công nghệ lẫn hiệu suất

Như vậy, trong một thời gian nghiên cứu cộng tác điều chế sản xuấtkháng sinh gặp rất nhiều khó khăn và chưa thành công Hiện nay trên thế giới

có khoảng 800 kháng sinh được tìm thấy có nguồn gốc từ vi sinh vật Và việc

sử dụng kháng sinh không chỉ giới hạn trong lĩnh vực y học mà còn áp dụngrộng rãi trong chăn nuôi, trồng trọt và công nghiệp thực phẩm.

1.1.2 Định nghĩa kháng sinh

Kháng sinh được định nghĩa theo nhiều cách, theo định nghĩa củaWaskman (1942): “Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất tự nhiên đượccác vi sinh vật tạo ra có tác dụng ức chế hay tiêu diệt chọn lọc đối với các visinh vật khác” [4] Trong thời đại ngày nay, định nghĩa này đã bộc lộ nhữnghạn chế, vì chưa nêu ra được những loại kháng sinh bán tổng hợp, kháng sinhthực vật và các hợp chất hóa học có tác dụng tương tự như kháng sinh Vì vậy

có thể định nghĩa kháng sinh rộng hơn: “Kháng sinh là tất cả các hợp chất tựnhiên, tổng hợp và bán tổng hợp có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt chọn lọccác vi sinh vật gây bệnh mà không có hoặc hầu như không tác dụng lênngười, động vật và thực vật” [5]

1.1.3 Phân loại kháng sinh

Phân loại kháng sinh nhằm khái quát một cách có hệ thống danh mục cáckháng sinh ngày càng nhiều thêm, có nhiều cơ sở để phân loại kháng sinh, cóthể dựa vào phổ tác dụng, cơ chế tác dụng, vào nguồn gốc, con đường sinhtổng hợp hay theo cấu trúc hóa học Dưới đây là cách phân loại dựa theo cấutrúc hóa học Theo cách này kháng sinh có 9 nhóm chính [4]:

3 Các kháng sinh quinon và dẫn xuất

Các tetracylin như tetracylinCác antracylin như adriamycin

4 Các kháng sinh peptid và acid amin

Các dẫn xuất axit amin như cycloserinCác kháng sinh β–lactam như penicillin

5 Các kháng sinh dị vòng chứa nitơ

Các kháng sinh nucleotid như polyoxin

6 Các kháng sinh dị vòng chứa oxy

Kháng sinh polyete monenzin

7 Kháng sinh mạch vòng no

Các dẫn xuất alkan cycloheximidKháng sinh steroid như axit fuzidic

8 Các kháng sinh chứa nhân thơm

Các dẫn chất benzen như chloramphenicolCác chất nhân thơm ngưng tụ như griseofulvin Các ete thơm như Novobiocin (kháng sinh được nghiên cứutrong đề tài này)

9 Các kháng sinh mạch thẳng

Các kháng sinh chứa photpho như photphomycin

1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh

Gồm có 6 cơ chế chính:

1 Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp thành tế bào vi khuẩn

Quá trình tổng hợp thành tế bào vi khuẩn gồm rất nhiều phản ứng vớicác bước khác nhau như sau:

- Sự tổng hợp UDP–N–acetyl–muramyl–pentapeptid

- Tổng hợp các đơn vị peptidoglycan (murein)

- Nối các đơn vị peptidoglycan với nhau qua phản ứng xuyên mạchpeptid tạo không gian ba chiều sẽ được một mạng lưới dày đặc, tức màng vikhuẩn Trong quá trình xuyên mạch phải có sự tham gia của enzymetranspeptidase Các thuốc kháng sinh sau khi khuếch tán vào dịch thể tổ chức

mô bào chúng sẽ kết hợp với enzyme transpeptidase tạo phức nhầm với khángsinh bền vững không hồi phục, phức này sẽ cản trở phản ứng xuyên mạchpeptid của vi khuẩn [6] Vi khuẩn lúc này vẫn tiếp tục tổng hợp protein nhưng

vỏ bị dị dạng

2 Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp màng tế bào vi khuẩn

Màng của tế bào vi khuẩn gồm các thành phần chính:

- Murein chủ yếu ở Gram (+) (các đơn vị peptidoglycan)

- Polysaccarid, Protein, Lipoprotein: có chủ yếu ở Gram (–) vàLypopolysaccarid

Các thành phần này gắn kết với nhau hài hòa để tạo nên màng tế bào vikhuẩn đặc biệt chú ý đến Murein đã tạo nên những polymer dạng lưới Cáckháng sinh đã làm cản trở sự hình thành các dạng lưới này Ví dụ:

+ Penicillin, Baxi tranxin vô hiệu hóa enzyme Transpeptidase (làenzyme chuẩn bị Murein để xây dựng nên màng vi khuẩn) làm cho việc tu bổmàng tế bào vi khuẩn bị ngừng trệ

+ Vancomycin đã cản trở quá trình tạo nên màng lưới Mureinpolymer dokháng sinh gắn chặt với Alanindipeptid (là một chất quan trọng trong quátrình này)

+ Chloramphenicol là dày không cân đối, tạo nên những u ở thành vỏ vikhuẩn Gentamycin làm đông đặc biến dạng thành vỏ vi khuẩn [6]

+ Các nhóm kháng sinh ức chế chức năng của màng tế bào gồm có:colistin, polymycin, gentamycin, amphoterricin [4] Kháng sinh sẽ làm mấtchức năng của màng tế bào cho các phân tử có khối lượng lớn và các ion bịthoát ra ngoài

3 Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp Protein của vi khuẩn

Các kháng sinh làm rối loạn và ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn ởmức ribosome Vi khuẩn không tạo nên các chất tham gia vào quá trình phânchia di truyền của tế bào Kháng sinh gắn vào các tiểu phần 30s, 50s và 70s

của ribosome trong tế bào vi khuẩn làm cho quá trình tổng hợp của proteinkhông diễn ra.

Nhóm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phần 30s của robosomelàm cho quá trình dịch mã không chính xác

Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50s của ribosome ức chếenzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗipolypeptide

Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phần 50s của ribosomelàm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên trong chuỗipolypeptide [6]

Nhóm kháng sinh tác dụng lên hệ thống enzyme có chức năng điều hòaquá trình sinh tổng hợp protein Theo cơ chế này, mỗi một loại kháng sinh sẽtác động vào các giai đoạn khác nhau của quá trình sinh tổng hợp đó

Ví dụ như: Tetracycline, Gentamycin đã cản trở vận chuyểnphenylalaline làm giảm ái lực của tRNA với các acid amin Chloramphenicol

và Puromycin lại tác động vào giai đoạn cuối của aminoacetyl–adenul–là chấtgắn vào tRNA, làm cho tRNA không vận chuyển được các acid amin [4]

4 Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp DNA của vi khuẩn

Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic

Nhóm refampin gắn với enzyme polymerase ngăn cản quá trình sao mãtạo thành mRNA (RNA thông tin)

Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho haimạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn, làm ngăn cản quá trình nhân đôicủa DNA

Nhóm Sulfomide có cấu trúc giống PABA (p–aminobenzoic acid) có tácdụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleic

Nhóm trimethoprim tác động vào ezyme xúc tác cho quá trình tạo nhânpurin làm ức chế quá trình tạo acid nucleic

5 Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp axit Folic

Tác động lên tổng hợp Folate coenzyme

Ví dụ: Sulfamethaxozol, Rifamycin…

6 Kháng sinh ức chế một số quá trình sinh tổng hợp khác

1.1.5 Ứng dụng của kháng sinh

a Các penicillin

Các penicillin là nhóm kháng sinh đầu tiên được phát hiện ra Ban đầu

được chiết suất từ nấm Penicillin Hiện nay được tổng hợp từ một số loại hóa

chất khác

Các dòng penicillin gồm có:

- Penicillin G và penicillin V: Hai loại được tổng hợp đầu tiên

- Aminopenicillin: Là penicillin bán tổng hợp gồm có ampicillin,amocillin…

- Các penicillin kháng enzyme penicillinase: Như axacillin, methicillin,chloxacillin…

- Penicillin chuyên dùng để điều trị vi khuẩn nhóm Pseudomonas: như

piperacillin, carbercillin, ficarcillin…

b Các cephalosporin

Gồm 4 thế hệ: I, II, III, IV

Thế hệ I, II chủ yếu điều trị các vi khuẩn Gram (+), thế hệ III, IV chủyếu điều trị vi khuẩn Gram (–)

- Các penicillin kết hợp chất ức chế enzyme β–lactamase

- Nhóm tetracycline gồm: tetracyclin, oxytetracycline,chlorotetracycline, cloxycyclin…

- Nhóm chloramphenicol như: chlocid, chloramphenicol…

- Nhóm macrolide gồm: erythromycin, spiramycin, azthromycin,rovamycin, tylosin…

- Nhóm lincoxinamide: lincoxin

- Nhóm aminoglycosid: streptomycin, neomycin…

- Nhóm quinolon: ciprofloxacin, ciprofloxacin–d8, oxolinic acid,danofloxacin, enrofloxacin, difloxacin, sarafloxacin, ofloxacin, norfloxacin…

c Các aminosid

Có từ nguồn gốc vi sinh, có phổ tác dụng rộng, chủ yếu trên vi khuẩnGram (–), theo nguồn gốc vi sinh có thể chia ra:

- Thuốc chiết xuất từ nấm Streptomyces như: streptomycin,

dihydrostreptomycin, kanacycin, neomycin, paramomycin…

- Thuốc chiết xuất từ Microspora: Gentamycin, Sirimycin…

Sau này, khi thay đổi cấu trúc của các hợp chất tự nhiên nói trên người tathu được các thuốc bán tổng hợp như: Amikacin, Netilmycin, Dibekacin…

d Các chloramphenicol (phenicol)

Nhóm này bao gồm 2 kháng sinh:

- Chloramphenicol: Thường được gọi là Chlorocid, được phân lập từ

nấm Streptomyces venezaclae, nay sản xuất bằng phương pháp tổng hợp toàn

phần Có tác dụng điều trị bệnh thương hàn và sốt phát ban do Rickettsia (làtác nhân truyền bệnh rận, chấy)

- Thiamphenicol: Là dẫn xuất của Chloramphenicol, khi thay thế gốcNitro bằng gốc Metylsulfon, dung nạp tốt hơn Chloramphenicol

e Các tetracycline

Các tetracycline có hoạt phổ rộng (các vi khuẩn Gram (+) và Gram (–),Rickettsia, xoắn khuẩn…) Chỉ định điều trị bằng cách kết hợp với các khángsinh khác để điều trị các bệnh: Brucella, tả, sốt định kỳ, lậu cầu, giang mai,viêm đường tiêu hóa, sốt rét…

Các Macrolide là kháng sinh có hoạt phổ kháng khuẩn rộng, có tác dụngmạnh hơn trên Gram (–), nhóm này hầu hết được thải trừ qua thận Độc tínhtrên thận (gây độc tử ống thận cấp) và thính giác (gây ù tai, điếc) nếu dùngkéo dài các thuốc của nhóm như: gentamycin, novomycin… các thuốc này

hầu hết không hấp thu qua đường tiêu hóa, nếu dùng điều trị nhiễm khuẩntoàn thân thì phải dùng dạng tiêm.

1.2 Novobiocin

1.2.1 Kháng sinh Novobiocin

Novobiocin thuộc nhóm amino caumarin được sinh bởi chủng xạ khuẩn Streptomyces spherodes có tác dụng rất hiệu quả trong điều trị các bệnh bị nhiễm bởi nhóm vi khuẩn Gram (+) như Staphyloccus spp., Streptococus

spp., đồng thời có khái niệm kháng lại với các enzim thuộc nhóm β–lactamase

[7] Hiện nay Novobiocin đang được sử dụng để bào chế kháng sinh dùngđiều trị một số bệnh cho đại gia súc

Novobiocin là loại kháng sinh có thể coi như giữ kỉ lục về số lần pháthiện nhiều nhất Đầu tiên, vào năm 1955, nó được mô tả độc lập dưới cái tên

Cathomycin (Cathocin, Mer) và Streptonivicin (Albamycin, Upjohn) Cùng

lúc đó, hãng dược phẩm Pfizer cũng đã tìm ra và được công nhận qua hai loạithuốc và tên của họ kháng sinh là Novobiocin, đã được chấp thuận vào năm

1956 [8]

Vài tháng sau, một loại kháng sinh được tách ra bởi các nhà khoa học ở

Lepetit, được phát hiện từ Streptimycete trong một mẫu đất lấy ở Rome, cũng

cho kết quả là Novobiocin

Vào năm 1958, Nhật Bản cũng đưa ra bằng chứng về một loại khángsinh chưa được định rõ đặc điểm Griseo Havin, mà họ tìm ra từ vài nămtrước và đã được mô tả vào năm 1953, tại Đại Học Tohoku ở Sendai – Nhật

Bản Loại kháng sinh này là sản phẩm của Streptomyces griseoflavus và kết

luận là có cùng đặc điểm với Novobiocin

1.2.2 Cơ chế tác dụng của Novobiocin

Novobiocin có khái niệm kìm hãm quá trình tổng hợp DNA của vi khuẩnbởi sự tương tác của thuốc với tiểu phần B của E.DNA gyrase (GyrB),enzyme này có tác dụng tham gia quá trình cắt và nối DNA vòng để hình

thành siêu xoắn (suppercoils) hoặc tham gia sửa chữa lỗi sao chép của quátrình tổng hợp DNA của nhóm vi sinh vật có cấu tạo đơn bào đơn giản(prokaryotes) [7].

1.2.3 Cấu tạo kháng sinh Novobiocin

Về cấu tạo, Novobiocin bao gồm 3 tiểu phần, gốc người khử Noviose(ring C), gốc counmarin (ring B) và gốc acid prenylated–4–hydroxylbenzoic(ring A) (Hình 1.1) [9]

(Systematic (IUPAC) name: enyl)benzamido]-8-methylcoumarin-7-yl 3-O-carbamoyl-5,5-di-C-methyl-α-l-

4-Hydroxy-3-[4-hydroxy-3-(3-methylbut-2-lyxofuranoside)

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của kháng sinh Novobiocin

Trong đó gốc đường Noviose có tác dụng tăng tính tan của thuốc và tăng

sự tương tác của thuốc với tác nhân gây bệnh, Ring A và Ring B có vai tròchính trong quá trình gây bắt hoạt chức năng của enzime tại trung tâm hoạtđộng enzyme DNA gyrase [10] (Hình 1.1)

1.2.4 Các nghiên cứu về kháng sinh Novobiocin

Năm 2000, nhóm gen tham gia vào đường sinh hóa tổng hợp Novobiocin

đã được tách dòng thành công bởi nhóm nghiên cứu M.Steffensky và các

cộng sự Toàn bộ DNA với tổng số 26.5 kb và 23 gen (ORFs) nằm trên hệ gen

của xạ khuẩn Streptomyces spheroides sản phẩm NCBI 11891 [1] đã được

giải trình tự và công bố trên ngân hàng gen (genbank – NCBI)

Bằng cách so sánh trình tự với các gen tương tự trên ngân hàng gen tất

cả chức năng của từng ORF trong nhóm gen đó đã được dự đoán Tuy nhiên

để chứng minh chức năng này cần có các nghiên cứu tiếp theo bằng cácnghiên cứu thực nghiệm [1]

Theo như công bố của nhóm nghiên cứu CTWalsh năm 2008 và cáccộng sự, gốc coumarin là gốc chính tương tác với enzime gyrase của vi khuẩn

và thể hiện hoạt tính kháng khuẩn chỉnh Gốc này được bắt đầu tổng hợp từtyrosin dưới sự xúc tác của các enzime được tạo ra từ NovH, NovJ, NovK vàcuối cùng được kết thúc bằng hoạt tính của enzyme NovH (Hình 1.2)

Các gen này được tác dòng chứng minh hoạt tính bằng phương pháp gâyđột biến, ngoài ra gen tách dòng được biểu hiện trên vật chủ Ecoli các enzymeđược tinh sạch và chứng minh hoạt tính bằng phương pháp khối phổ

Nghiên cứu về nhóm gen tham gia quá trình sinh tổng hợp Novobiocin

từ Streptomyces spheroides sản phẩm được Heide và cộng sự thể hiện năm

1999 và công bố năm 2000 đã xác định được 23 ORFs và hơn 11 ORFs khác

có khả năng đóng vai trò trong quá trình sinh tổng hợp Novobiocin

1.2.5 Ứng dụng của Novobiocin

Novobiocin là một kháng sinh chống lại sự hoạt động của staphy lococus

epidermidis và có thể đã được dùng để nhận biết vi khuẩn Coagulase– Negative Staphylococcus saprophyticus (một vi khuẩn kháng lại được với

Novobiocin) Trong nuôi cấy, Novobiocin được đặt và dùng với cái tênAlbamycin (Pharmacia And Upjpohn) năm 1960 Hậu quả của nó đã đượcchứng minh thử nghiệm trong các thuốc điều trị bệnh Novobiocin có hiệu lực

trong điều trị Methicillin Resistant Staphyloccus Aureus (MRSA).

Hình 1.2 Sơ đồ tổng hợp kháng sinh Novobiocin [1]

1.3 Đường khử

1.3.1 Gốc đường khử trong cấu trúc kháng sinh

Đường khử là gốc đường đặc biệt được tìm thấy rất nhiều trong cấu trúc

tế bào vi khuẩn, trong tế bào nấm, trong cấu trúc của rất nhiều các chất cóhoạt tính sinh học và trong thành phần cấu trúc của rất nhiều thuốc khángsinh hay các chất chống ung thư [2]

Về cấu tạo các chất đường khử là chất mà trong phân tử của chúng cómột hay nhiều hơn một nhóm hydroxyl (–OH) được thay thế bởi nguyên tử Hhay các nhóm chức khác như amino, methyl, alkyl… Các loại đường khử này

có thể tồn tại ở dạng đường đơn hay đường đa hoặc phân nhánh và là dẫn xuấtcủa các sản phẩm trao đổi chất bậc 2 trong các hợp chất tự nhiên [10]

Trong các chất có hoạt tính sinh học đường khử đóng vai trò quan trọngđối với xác định hoạt tính của các chất này, có rất nhiều các nghiên cứu đãchứng minh rằng các chất hoạt tính sinh học sẽ bị mất hoàn toàn hoạt tính nếunhư gốc đường trong cấu trúc bị loại bỏ [12]

Trong cấu trúc tế bào vi sinh vật đường khử tham gia tạo thành cấu trúcpeptidoglycon là thành phần của lớp thành tế bào của rất nhiều loài vi sinh vậtđặc biệt là một số vi khuẩn gram (+) hoặc hình thành lớp lipopolyscharidetrong cấu trúc màng tế bào của nhóm gram (–)

1.3.2 Một số nghiên cứu về gốc đường khử

Theo như nghiên cứu [1] gốc đường khử trong nhóm kháng sinh enedine

có vai trò quyết định hoạt tính kháng khuẩn của chất kháng khuẩn, nghiên cứucho thấy gốc đường rhamnose trong kháng sinh calicheamicin đóng vai tròlàm cầu nối liên kết phân tử kháng sinh với enzyme tham gia vào quá trìnhsao mã hay sinh tổng hợp mRNA

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng gốc đường khử trong nhóm kháng sinhmacrolide như erythromycin, tylosin, pikromycin đóng vai trò trong gắnkháng sinh này với các enzyme tham gia tổng hợp protein của vi khuẩn [13]

Việc nghiên cứu vai trò của gốc đường đã chỉ ra rằng nếu mất đi gốcđường khử trong cấu trúc tế bào của một số vi sinh vật sẽ gây ức chế sự sinhtruởng của tế bào hoặc tiêu diệt vi sinh vật [12].

Xu hướng nghiên cứu về hoá dược hiện nay trên thế giới đó là nghiêncứu tạo ra được các thế hệ kháng sinh mới bằng cách thay gốc đường mới vàogốc đường cũ của một số nhóm kháng sinh [1]

Vì vậy kháng sinh thế hệ mới này có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn,tránh đựơc hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn đồng thời khả năng thải trừcủa thuốc nhanh hơn

1.3.3 Con đường sinh tổng hợp gốc đường khử trong tế bào vi sinh vật

Hầu hết đường khử trong cấu trúc kháng sinh đựợc sinh ra từ vi sinh vật

là đường 6–deoxyhexose Tiền chất đầu tiên tham gia quá trình sinh tổng hợpcác gốc đường này đều bắt đầu từ glucose–1–phosphate

Qua một chuỗi các phản ứng sinh hoá trong tế bào được xúc tác bởinhóm enzyme và kết quả là tạo ra được gốc đường khử có thể 1 hay nhiềuhơn 1 nhóm OH bằng các nguyên tử H, nhóm –CH3, nhóm =O, hay nhómCHO– (Hình 1.3)

Các vị trí đánh dấu chỉ ra vị trí có thể có các nhóm chức hay các nguyên

tử khác thay thế cho gốc OH của phân tử đường để hình thành nên các cấutrúc đường khác nhau

O HO

HO

OH

OH OPO- 3

O HO

HO

OH

OH OdTDP

O O

HO

OH OdTDP

1.3.4 Đường khử trong cấu trúc Novobiocin

Đường khử là chất trong phân tử của nó có nhiều hơn một nhómhydroxyl (–OH) được thay thế bởi nguyên tử hidro hoặc các nhóm chức:amino, methyl, alkyl… Đường khử tồn tại ở dạng đường đơn hoặc đường đahoặc phân nhánh là dẫn suất bậc hai trong hợp chất tự nhiên Đường khử xácđịnh hoạt tính của các chất có hoạt tính sinh học, nếu mất gốc đường trongcấu trúc thì hoạt tính sinh học cũng mất

Đường khử tham gia vào thành phần cấu trúc peptidoglycon, một số loại

vi sinh vật, đặc biệt vi khuẩn gram dương (+), thành cấu trúclipopolysacharide mành tế bào vi khuẩn gram âm (–) Đường khử trong nhómkháng sinh enedine có vai trò quyết định hoạt tính kháng khuẩn của chấtkháng khuẩn Đường khử trong nhóm kháng sinh macrolide gắn kháng sinhvới enzyme tham gia tổng hợp protein của vi khuẩn

Các nhà khoa học nhận thấy nếu mất đi gốc đường khử trong cấu trúc tếbào gây ức chế sự trưởng thành của tế bào hoặc tiêu diệt vi sinh vật

1.4 Nghiên cứu về NovU

1.4.1 Đường dTDP–L–Noviose

Đường Noviose là một trong ba nhóm cấy trúc kháng sinh Novobiocin.Đường Noviose là đường khử có nhóm –TDP gắn với gốc –O tại vị trí C1, hainhóm –CH3 gắn tại vị trí C5 Còn lại là các nhóm –OH được gắn tại vị trí C2,C3 và C4 (Hình 1.4) Trong các kháng sinh đại phân tử thì gốc đường khử cóvai trò vô cùng quan trọng trong việc tăng tính tan của chúng trong dung môi

và tăng khă năng tương tác của thuốc với tác nhân gây bệnh và đôi khi gốcđường còn có vai trò chính gây bất hoạt khả năng gây bệnh của tác nhân gâybệnh Trong đó gốc đường Noviose (Ring C) có vị trí rất lớn trong việc xácđịnh phổ kháng khuẩn của gốc coumarin bởi ba nhóm methyl trong phân tửđường và chính phân tử Noviose giúp cho gốc coumarin của kháng sinh nàytương tác tốt hơn với enzyme gyrase (GyrB) [9]

Hình 1.4 Cấu tạo đường L–Noviose 1.4.2 Con đường sinh tổng hợp đường dTDP–L–Noviose

Quá trình sinh tổng hợp đường Noviose được bắt đầu từ đường Glucose–1–phosphate dưới sự hoạt động của enzyme dTDP–glucose synthase NovV,

sự xúc tác của enzyme dTDP–D glucose–4,6–dehydeatase NovT để hìnhthành dTDP–4–keto–6 deoxyglucose như một chất trung gian trong conđường sinh tổng hợp phần lớn đường deoxy từ dTDP–D–glucose Quá trìnhđồng phân hóa dTDP–4–keto–6 deoxyglucose 3,5–epimerase được mã hóabởi NovW

Bước tiếp theo trong quá trình sinh tổng hợp Noviose là quá trình methylhóa tại C5 bởi enzyme 5–methyltransferase được mã hóa bởi NovU, sự khửC4 cacbonyl cacbon được thể hiện bởi enzyme 4–ketoreductase được mã hóabởi NovS và enzyme O–methyltransterase được mã hóa bởi NovP Sự gắnđường deoxy vào phân tử coumarin trong kháng sinh coumarin và vàoaglycons trong những kháng sinh khác bởi enzyme glycosyltransterase trướckhi quá trình methyl hóa vào nhóm 4–hydroxyl của vòng pyranose

Những giả thuyết về chức năng của protein được mã hóa bởi NovW,NovS, NovV được đưa ra bởi sự so sánh về độ tương đồng của trình tự acidamin đã biết và được đăng kí trên ngân hàng gen thế giới [11] Tuy nhiên đểchứng minh chức năng của các gen này bằng các nghiên cứu thực nghiệm vàcác phương pháp nghiên cứu khác nhau thì chưa thực hiện được

Để khám phá chức năng của các sản phẩm của gen NovW, NovS, NovUtrong quá trình sinh tổng hợp đường Noviose Chúng tôi đã clined và biểu

hiện những gen này trong E.coli và tiến hành các thí nghiệm kiểm tra những

Hình 1.6 Vị trí gen NovU trong cosmid (9–6G)

Mặc dù đã xác định được trình tự từng gen trong mỗi bước, nhưng chưabiết được chức năng cụ thể của mỗi gen Qua nghiên cứu này sẽ đưa ra được

dự đoán về chức năng của gen NovU trong quá trình sinh tổng hợp đườngNoviose

Gen NovU được tìm thấy trong bộ gen của một số loài xạ khuẩn như:

Streptomyces roseochromogenes sub sp., Streptomyces caeruleus Trong

cosmid (9–6G) được cung cấp, gen NovU có độ dài 1.2 kb

Theo dự đoán con đường sinh tổng hợp đường Noviose thì gen NovU cóthể có chức năng C–Methyltransferase, gắn một nhóm –CH3 vào vị trí C5 củaphân tử đường [1] Vai trò C–Methyltransferase của một số gen thì đã cónhiều nghiên cứu và công bố trên ngân hàng gen, để so sánh gen NovU vớigen có chức năng C–Methyltransferase thì cần tách dòng gen NovU từ cosmid(9–6G) và giải trình tự, sau đó so sánh với các gen được cho là có cùng chứcnăng Nếu tương đồng về trình tự nucleotid và các acid amin thì có thể kếtluận được chức năng gen NovU

1.5 Vector pET-32a(+)

Vector 32a(+) cơ bản là một plasmid có 5899 bp Vector 32a(+) được thiết kế cho nhân dòng vô tính và biểu hiện ở cấp độ cao chuỗitrình tự peptide nối với protein thioredoxin 109aa Trx.Tag™ Vị trí tách dòngđược dùng gắn gen biểu hiện là fusionproteins, bao gồm chuỗi 6xHis.Tagdùng để phát hiện và tinh sạch protein của gen cần biểu hiện Vị trí duy nhất

pET-để chuyển gen được biểu hiện trên vector Vùng biểu hiện hay vùng cloningcủa gen cần biểu hiện được gắn với T7 promotor, đây là promotor mạnh giúpcho điều tiết tăng cường quá trình tổng hợp protein [14]

Trong chức năng của vector pET-32a(+) thì trình tự 6xHis.Tag là trình tựrất đáng chú ý, có ý nghĩa quan trọng trong việc tinh sạch protein biểu hiện.Chuỗi 6xHis.Tag nằm từ vị trí Nu 327 đến 344, gồm 18 nucleotide Sau khichuyển gen cần biểu hiện vào vị trí này, trình tự 18 Nu này sẽ nằm trên liền

kề với phần đầu của gen cần biểu hiện

Chuỗi 6xHis.Tag mã hóa cho 6 acid amin histidin, gen chuyển vào mã

hóa cho protein mong muốn Sau khi chuyển sẽ được sản phẩm: 6-aa-histidin + protein mong muốn Một điều đặc biệt là trình tự 6 acid amin histidin tích

điện (–) và nó gắn với protein sản phẩm của gen cần biều hiện Vì vậy khitinh sạch dựa vào đặc tính này người ta sẽ đưa sản phẩm vào môi trường cóđiện tích (+) để tinh lọc sản phẩm [15] [16].

Bố trí thiết kế vector pET-32a (+) gồm có:

- Promoter T7 : 764–780 (Nu)

- T7 transcription start : 763 (Nu)

- Trình tự coding 6His.Tag : 327–344 (Nu)

(6His.Tag có chứa 6 acid amin histidin được sử dụng để tinh sạch

Protein)

Vị trí chuyển gen

Trình tự coding His.Tag 140–157 (Nu)

Trình tự coding LacI 1171–2250 (Nu)

Trình tự coding bla 4445–5302 (Nu)Điểm khởi đầu fl 5434–5889 (Nu)