Phân lập và nuôi sinh khối một số loài vi tảo từ biển Nha Trang sử dụng cho động vật thân mềm hai mảnh vỏ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRẦN THỊ HIỀN PHÂN LẬP VÀ NUÔI SINH KHỐI MỘT SỐ LOÀI VI TẢO TỪ BIỂN NHA TRANG SỬ DỤNG CHO ĐỘNG VẬT THÂN MỀM HAI MẢNH VỎ LUẬN VĂN THẠC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

TRẦN THỊ HIỀN

PHÂN LẬP VÀ NUÔI SINH KHỐI MỘT SỐ LOÀI

VI TẢO TỪ BIỂN NHA TRANG SỬ DỤNG CHO ĐỘNG VẬT THÂN MỀM HAI MẢNH VỎ

LUẬN VĂN THẠC SỸ

Khánh Hoà - 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

TRẦN THỊ HIỀN

PHÂN LẬP VÀ NUÔI SINH KHỐI MỘT SỐ LOÀI

VI TẢO TỪ BIỂN NHA TRANG SỬ DỤNG CHO ĐỘNG VẬT THÂN MỀM HAI MẢNH VỎ

LUẬN VĂN THẠC SỸ Ngành : Nuôi trồng thuỷ sản

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu do chính bản thân tôi thực hiện, các

số liệu trong luận văn là hoàn toàn chính xác, trung thực và chưa từng có ai công bố Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những kết quả đã nêu trong luận văn này

Tác giả

Trần Thị Hiền

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản III, đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi hoàn thành khoá học

Đề tài nghiên cứu này nằm trong khuôn khổ Dự án “Đảm bảo cung cấp giống các loài động vật hai mảnh vỏ có giá trị thương mại tại miền Trung Việt Nam bằng cách tối ưu hóa sản xuất ấu trùng” được tài trợ bởi VLIR-UOS (Bỉ) Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Quản lý dự án đã giúp đỡ tôi về kinh phí, tạo điều kiện thuận lợi về

cơ sở vật chất và trang thiết bị, cũng như kỹ thuật chuyên môn trong quá trình thực hiện đề tài luận văn Đặc biệt cảm ơn tiến sĩ Nancy Nevejan đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức trong quá trình nghiên cứu và thạc sĩ Phùng Bảy người đã trực tiếp khuyên bảo và tạo mọi điều kiện để giúp đỡ tôi thực hiện đề tài này Tôi rất cảm ơn sự giúp đỡ chuyên môn kỹ thuật của chuyên gia Annelies Pronker trong thời gian làm việc tại Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo hướng dẫn tiến sĩ Lục Minh Diệp đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài luận văn Xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy, cô giáo trong Viện Nuôi trồng Thuỷ sản - Trường Đại học Nha Trang, các bạn đồng nghiệp, các bạn cùng lớp khoá học 2012 -

2014 đã luôn sẵn lòng giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin cảm ơn gia đình - cha mẹ, anh em và chồng, những người đã nâng đỡ tôi về mặt vật chất và tinh thần từ bao lâu nay, đặc biệt là trong suốt quá trình học tập

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

1.1 Tình hình nghiên cứu vi tảo ngoài nước 3

1.1.1 Phân loại vi tảo 3

1.1.2 Sinh trưởng của tảo 5

1.1.3 Giá trị dinh dưỡng của vi tảo trong nuôi trồng thuỷ sản 8

1.1.4 Sử dụng vi tảo trong nuôi trồng thủy sản 11

1.1.4.1 Sử dụng vi tảo trong nuôi động vật thân mềm 13

1.1.4.2 Sử dụng vi tảo trong nuôi tôm 15

1.1.4.3 Sử dụng vi tảo trong nuôi cá biển 16

1.1.5 Tình hình nghiên cứu về phân lập, lưu giữ và sản xuất vi tảo 16

1.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng vi tảo trong nước 20

CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu 24

2.1.1 Thời gian nghiên cứu 24

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 24

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 24

2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 24

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3.1 Tuyển chọn, phân lập và định tên khoa học một số vi tảo từ vùng biển Nha Trang bằng phương pháp pha loãng và phương pháp cấy trên đĩa agar 25

2.3.2 Lưu giữ và nuôi sinh khối hai loài tảo Isochrysis galbana và Thalassiosira sp.27 2.3.2.1 Lưu giữ hai loài tảo Isochrysis galbana và Thalassiosira sp 27

2.3.2.2 Nuôi sinh khối hai loài Isochrysis galbana và Thalassiosira sp 29

2.3.3 Phương pháp thử nghiệm làm thức ăn cho động vật thân mềm 31

2.3.4 Phương pháp xác định các thông số 32

2.3.4.1 Phương pháp xác định yếu tố môi trường 32

2.3.4.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu 32

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 34

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35

3.1 Tuyển chọn, phân lập và định tên khoa học một số vi tảo phân lập từ vùng biển Nha Trang 35

3.1.1 Loài Isochrysis galbana 35

3.1.2 Loài Thalassiosira sp 36

3.2 Lưu giữ tảo Isochrysis galbana và Thalassiosira sp 37

3.2.1 Lưu giữ tảo Isochrysis galbana 38

3.2.2 Lưu giữ tảo Thalassiosira sp 38

3.3 Nuôi sinh khối tảo Isochrysis galbana và Thalassiosira sp 39

3.3.1 Nuôi sinh khối tảo Isochrysis galbana 39

3.3.1.1 Nuôi sinh khối tảo Isochrysis galbana trong nhà 39

3.3.1.2 Nuôi sinh khối tảo Isochrysis galbana ngoài trời 45

3.3.2 Nuôi sinh khối tảo Thalassiosira sp 46

3.3.2.1 Nuôi sinh khối tảo Thalassiosira sp trong nhà 46

3.4 Thử nghiệm tảo làm thức ăn cho ấu trùng hàu Crassostrea gigas 53

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 56

4.1 Kết luận 56

4.2 Đề xuất ý kiến 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AA Axít arachidonic (20:4n-6)

Ctv Cộng tác viên

DGR Tốc độ sinh trưởng hằng ngày (Daily Growth Rate)

DHA Axít decosahexaenoic (22:6n-3)

ĐVTM Động vật thân mềm

EPA Axít eicosapentaenoic (20:5n-3)

HUFA (Highly unsaturated fatty acids) Axít béo có mức chưa no cao

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại các nhóm ngành tảo [8] 4 Bảng 1.2 Lớp và giống tảo nuôi dùng làm thức ăn cho các đối tượng thủy sản [27] 12 Bảng 1.3 Các loài tảo được sử dụng làm thức ăn cho hàu và ngao [36] 15 Bảng 3.1 Khoảng biến thiên pH của môi trường nuôi sinh khối tảo Isochrysis galbana 39

Bảng 3.2 Sinh trưởng quần thể tảo Isochrysis galbana khi nuôi ở mật độ ban đầu khác

nhau 40

Bảng 3.3 Tốc độ sinh trưởng (µ) quần thể tảo Isochrysis galbana khi nuôi ở mật độ

ban đầu khác nhau 42

Bảng 3.4 Giá trị pH và sinh trưởng quần thể tảo Isochrysis galbana khi nuôi bằng môi

trường f/2 với hoá chất tinh khiết và hoá chất công nghiệp 43

Bảng 3.5 Giá trị pH, nhiệt độ và sinh trưởng quần thể của tảo Isochrysis galbana nuôi

Bảng 3.9 Giá trị pH và sinh trưởng quần thể tảo Thalassiosira sp khi nuôi bằng môi

trường f/2 với hoá chất tinh khiết và công nghiệp 50

Bảng 3.10 Giá trị pH, nhiệt độ và sinh trưởng quần thể của tảo Thalassiosira sp nuôi

ngoài trời 51 Bảng 3.11 Sinh trưởng của ấu trùng hàu với các loại thức ăn khác nhau 53

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Các pha sinh trưởng của một quần thể vi tảo [27] 5

Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 24

Hình 2.2 Sơ đồ khối phân lập vi tảo 25

Hình 2.1 Sơ đồ pha loãng tảo ở các nồng độ khác nhau 27

Hình 2.4 Sơ đố bố trí thí nghiệm xác định thời gian lưu giữ thích hợp 28

Hình 2.5 Quy trình nhân sinh khối tảo 29

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy phù hợp 30

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thức ăn phù hợp cho ấu trùng hàu Thái Bình Dương 31

Hình 3.1 Hình thái tế bào Isochrysis galbana chụp trên kính hiển vi độ phóng đại 400x 36

Hình 3.2 Hình thái tế bào Thalassiosira sp chụp trên kính hiển vi độ phóng đại 400x .37

Hình 3.3 Lưu giữ giống trên môi trường lỏng 37

Hình 3.4 Đường cong sinh trưởng quần thể tảo Isochrysis galbana sau khi lưu giữ với các thời gian khác nhau 38

Hình 3.5 Đường cong sinh trưởng quần thể tảo Thalassiosira sp sau khi lưu giữ ở các thời gian khác nhau 39

Hình 3.6 Sự phát triển của tảo Isochrysis galbana ở các mật độ ban đầu khác nhau 41 Hình 3.7 Đường cong sinh trưởng của tảo Isochrysis sp khi nuôi bằng môi trường f/2 với hoá chất tinh khiết và công nghiệp 44

Hình 3.8 Sự phát triển của tảo Isochrysis galbana nuôi ngoài trời 46

Hình 3.9 Sự phát triển của tảo Thalassiosira sp ở các mật độ ban đầu khác nhau 48

Hình 3.10 Đường cong sinh trưởng của tảo Thalassiosira sp khi nuôi bằng môi trường f/2 với hoá chất tinh khiết và công nghiệp 51

Hình 3.11 Sự phát triển của tảo Thalassiosira sp khi nuôi ngoài trời 52

Hình 3.12 Tỷ lệ sống của ấu trùng hàu với thức ăn khác nhau 54

MỞ ĐẦU

Quá trình sản xuất giống và nuôi thương phẩm các đối tượng thủy sản đều cần đến vi tảo ở các mức độ khác nhau Vi tảo là thức ăn tươi sống đặc biệt quan trọng cho tất cả các giai đoạn phát triển của động vật thân mềm (ĐVTM) hai mảnh vỏ như: hàu, vẹm, điệp, sò…, thức ăn cho ấu trùng của một số loài giáp xác và thức ăn cho một số loài cá ở giai đoạn đầu của quá trình sinh trưởng Mặt khác tảo lại là nguồn thức ăn của động vật phù du và động vật phù du lại là nguồn thức ăn cho ấu trùng của cá và giáp xác giai đoạn ấu trùng và giai đoạn cá hương [27] Ngoài ra, vi tảo còn giúp ích trong việc

ổn định các yếu tố môi trường, biểu hiện trong nuôi trồng thủy sản thông qua môi trường nước xanh Tảo đơn bào có giá trị trong nuôi trồng thủy sản phải có kích thước phù hợp, 1 - 15 µm cho những loài ăn lọc, 10 - 100 µm cho những loài khác, phải được tiêu hóa dễ dàng Chúng cần có tốc độ tăng trưởng nhanh, dễ dàng nuôi sinh khối, có khả năng thích ứng với những thay đổi môi trường như: nhiệt độ, ánh sáng và dinh

dưỡng, cuối cùng chúng cần có thành phần dinh dưỡng tốt, không chứa độc tố [24]

Mặc dù đã có một số nỗ lực nhằm thay thế thức ăn tươi sống bằng thức ăn nhân tạo nhưng cho tới nay tảo tươi vẫn là thức ăn không thể thay thế được trong nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là trong nuôi động vật thân mềm [30] Động vật thân mềm hai mảnh

vỏ lọc trực tiếp vi tảo, vì vậy sự phát triển của chúng liên quan trực tiếp đến chất lượng

và số lượng của thực vật phù du sản xuất Ương nuôi ĐVTM hai mảnh vỏ phụ thuộc vào sản xuất tảo sống, chi phí sản xuất tảo chiếm 30% chi phí vận hành trại giống [27]

Trong những năm gần đây, nghề nuôi động vật thân mềm ở nước ta phát triển rất mạnh trước yêu cầu của thị trường, tận dụng ưu thế tiềm năng tự nhiên sẵn có và góp phần định hướng phát triển nghề nuôi trồng thủy sản bền vững Một số đối tượng ĐVTM hai mảnh vỏ đã được phát triển nuôi theo hướng hàng hóa tập trung như: nghêu, sò, tu hài, hàu, ngọc trai… Vì con giống tự nhiên không đủ cung cấp nên nhiều trại giống mọc lên ở khắp nơi Tuy nhiên, việc sản xuất giống gặp không ít khó khăn nhất là về khâu giải quyết thức ăn cho ấu trùng Mặc dù kiến thức cũng như quy trình gây vi tảo đã được trang bị cho người dân nhưng đảm bảo cung cấp đủ về số lượng cũng như chất lượng vi tảo cho ấu trùng vẫn còn là khó khăn Nguyên nhân được xác định là các loài tảo nhập nội khó đáp ứng được điều kiện nuôi cấy vi mô sản xuất ở nước ta

Ở Việt Nam đa số các loài tảo hiện nay có nguồn gốc nhập ngoại nên chưa có phương pháp lưu giữ giống thuần cũng như quy trình công nghệ nuôi trồng chúng chưa thích hợp với điều kiện khí hậu Do đó hiệu quả của các loài tảo nhập ngoại đem lại chưa cao, sinh khối đạt được thấp, bị tạp nhiễm nhiều, nguồn giống sơ cấp không chủ động được, đặc biệt là các chủng giống phân lập được từ nước biển địa phương rất

ít nên tính chống chịu với điều kiện như: nhiệt độ, độ mặn cao là rất thấp Vì vậy việc phân lập vi tảo hiện có mặt ở các vùng biển Việt Nam là hết sức cần thiết bởi khả năng phát triển tốt dưới điều kiện môi trường địa phương Sự thuận lợi khác của phân lập tảo từ nước biển là có thể chủ động cung cấp tảo cho các trại sản xuất giống, không phụ thuộc vào nhà cung cấp tảo Đặc biệt phân lập một số vi tảo có giá trị dinh dưỡng

sử dụng cho ĐVTM hai mảnh vỏ tại địa phương là hết sức quan trọng để tối ưu hóa sản xuất giống thương mại Với mong muốn phân lập và nuôi sinh khối một số loài tảo mới từ nước biển tự nhiên để cung cấp cho ĐVTM hai mảnh vỏ, ứng dụng cho nuôi trồng thủy sản (NTTS) và được sự đồng ý của Viện Nuôi trồng Thuỷ sản, Trường Đại học Nha Trang; Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản III, chúng tôi tiến hành nghiên

cứu đề tài: “Phân lập và nuôi sinh khối một số loài vi tảo từ biển Nha Trang sử

dụng cho động vật thân mềm hai mảnh vỏ”

Mục tiêu

Phân lập và nuôi được một số loài vi tảo từ biển Nha Trang có giá trị làm thức

ăn cho động vật thân mềm hai mảnh vỏ

Nội dung nghiên cứu

1 Tuyển chọn, phân lập và định tên khoa học một số vi tảo từ vùng biển Nha Trang

2 Lưu giữ và nuôi sinh khối một số loài vi tảo được tuyển chọn

3 Thử nghiệm làm thức ăn cho ấu trùng hàu Thái Bình Dương

Ý nghĩa của đề tài

- Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu sâu hơn nữa các loài vi tảo và bổ sung cơ sở dữ liệu cho tập đoàn giống vi tảo của Việt Nam

- Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu thu được có ý nghĩa thực tiễn đối với các trại sản xuất giống động vật thân mềm hai mảnh vỏ trong việc chủ động nuôi, lưu giữ và thu sinh khối vi tảo làm thức ăn

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Tình hình nghiên cứu vi tảo ngoài nước

1.1.1 Phân loại vi tảo

Hệ thống phân loại của các nhà nghiên cứu tiếp cận các loài vi tảo từ hình thái hình dạng, màu sắc như hệ thống phân loại của Harvey (1836) chia thành 4 ngành: Tảo Silic, tảo Lục, tảo Đỏ, tảo Nâu Smith (1933, 1950, 1962) dựa vào số lượng tế bào, sắc tố, roi, cấu trúc tế bào đã chia thành 8 ngành: tảo Lục, tảo Mắt, tảo Vàng Ánh, tảo Nâu, tảo Giáp, tảo Lam, tảo Đỏ và Chloromonadophyta Vaden Hock (1980, 1994) dựa vào sắc tố, sản phẩm quang hợp, cấu trúc vách, cấu trúc roi, kiểu phân bào có tơ, màng bọc của lục lạp, sự liên hệ với lưới nội chất (CER) đã chia tảo thành 11 ngành Lee ER (1999) dựa vào tế bào nhân sơ và nhân chuẩn chứa roi, sản phẩm dự trữ, kiểu phân chia tế bào chia tảo thành ngành tảo Lam (nhân sơ), tảo có nhân chuẩn, không có

sự liên hệ lưới nội chất (CER) như: tảo Lục, tảo Đỏ, tảo Glaucophyta, Dinophyta, nhóm tảo nhân thực có CER như: tảo Mắt, Crytophyta, Heterokontophyta, Haptophyta Graham Lee (2000) dựa vào trình tự gen 18S chia thành 9 ngành Có nhiều hệ thống phân loại tảo rất khác nhau Hệ thống các ngành Tảo (bao gồm cả Vi khuẩn lam- Cyanophyta) và các lớp, bộ chủ yếu theo Peter Pancik được chỉ ra ở bảng 1.1 [7] Trong đó, vi tảo chủ yếu thuộc về các chi trong các ngành sau đây:

 Ngành Tảo lục (Chlorophyta): Các chi Closterium, Coelastrum, Dyctyosphaerium, Scenedesmus, Pediastrum, Staurastrum, Dunaliella, Chlamydomonas, Haematococcus, Tetraselmis, Chlorella,

 Ngành Tảo lông roi lệch (Heterokontophyta): Các chi Melosira, Asterionella, Cymatopleurra, Somphonema, Fragilaria, Stephanodiscus, Navicula, Malomonas, Dinobryon, Peridinium, Isochrysis, Chaetoceros, Phaeodactylum, Skeletonema, Nitzschia

 Ngành Tảo mắt (Euglenophyta): Các chi Phacus, Trachelomonas, Ceratium

 Ngành Tảo đỏ (Rhodophyta): Các chi Porphyridium, Rhodella

Bảng 1 1 Phân loại các nhóm ngành tảo [8]

Chroococcales Cyanophyta (ngành vi khuẩn

Prochlorophyta (ngành tảo

Bangiophycidae Rhodophyta (ngành tảo đỏ)

Florideophycidae

Chrysomonadales Rhizochrysidales Chrysocapsales Chrysosphaerales

Chrysophyceae

(tảo vàng ánh)

Phaeothamniales Heterochloridales Rhizochloridales Heterogloeales Mischococcales Heterotrichales

Xanthophyceae (tảo vàng lục)

Botrydiales Coscinodiscales Bacillarophyceae

Isogeneratae Heterogeneratae

Phaeophyceae (tảo nâu)

Cyclosporae

Heterokontophyta

(ngành tảo lông roi lệch)

Raphidophyceae Haptophyta (ngành tảo lông

Eustigmatoph yta (ngành tảo

Cryptophyta (ngành tảo 2

Dinophyta (ngành tảo hai

Prasinophyceae

Volvocales Tetrasporales Chlorococcales Ulotrichales Bryopsidales Chlorophyceae (lớp tảo lục)

Siphonocladales Zygnematales Mesotaeniales

Conjugatoph yceae (lớp tảo tiếp hợp)

Hiện nay, phương pháp phân loại vi tảo vẫn chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái Nhìn chung, các chi đều có các đặc điểm cơ bản về hình thái để tạo dựng khoá phân loại, nhưng một số loài trong cùng một chi nếu chỉ quan sát dưới kính hiển vi thường thì rất khó phân biệt các đặc điểm sai khác vì quá nhỏ và cần phải xác định dưới kính hiển vi điện tử Hơn nữa, nhiều loài hoặc chủng rất giống nhau về mặt hình thái và hình thái của chúng lại có thể bị biến đổi khi điều kiện môi trường thay đổi Sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử đã mở ra một phương pháp nghiên cứu mới là phân loại học phân tử, có thể dựa trên sự nghiên cứu các gen trong hệ gen nhân, hệ gen của các bào quan (ti thể và lục lạp) hoặc các sản phẩm của gen (protein, enzym) Nhìn chung, các kỹ thuật phân tích ADN và protein có đóng góp rất quan trọng vào việc đánh giá chính xác tính đa dạng di truyền cũng như cấu trúc di truyền chủng quần của các loài tảo Đồng thời, các nghiên cứu ADN và protein cũng cho phép đánh giá

về địa lý phân bố chủng loại (loài, loài phụ, quần thể), góp phần vào việc đánh giá tính

đa dạng sinh học của tảo Để tháo gỡ những hạn chế của phương pháp phân loại dựa trên các đặc điểm hình thái, các kỹ thuật sinh học phân tử như đọc và so sánh trình tự nucleotit của các gen bảo thủ như: 18S rRNA, ITS1-5,8S-ITS2, 28S rRNA (LSU)…

đã hỗ trợ tích cực cho việc định tên khoa học một cách chính xác hơn các loài vi tảo [6]

1.1.2 Sinh trưởng của tảo

Theo Coutteau (1996) [27], sự tăng trưởng của các vi tảo được đặc trưng bởi 5 pha được thể hiện qua Hình 1.1

Hình 1 1 Các pha sinh trưởng của một quần thể vi tảo [27]

- Pha ban đầu: Số lượng tế bào tăng dần đều Ở pha này tảo bắt đầu làm quen với môi trường nuôi và bắt đầu hấp thụ chất dinh dưỡng, tiến hành phân cắt tế bào nhưng tốc độ tăng trưởng của quần thể chậm

- Pha logarit (pha gia tốc dương): Số lượng tế bào tăng theo cấp số nhân, hình biểu diễn số lượng tế bảo gần như là đường thẳng Tảo ở giai đoạn này hấp thụ chất dinh dưỡng mạnh

- Pha gia tốc âm: Môi trường dinh dưỡng có chiều hướng giảm mạnh cùng với mật độ tảo cao làm tốc độ sinh sản giảm, tuy vậy số lượng tế bào vẫn còn tăng

- Pha cân bằng: Mật độ tảo ở pha này đạt cực đại và số lượng ổn định

- Pha tàn lụi: Tảo sau khi đạt mật độ cực đại, khả năng sinh sản mất dần và số lượng tảo giảm một cách rõ rệt

Theo O’Meley và Daintith (1993) [42], sự sinh trưởng của tảo nuôi chỉ có 4 pha: pha tăng trưởng chậm (lag phase), pha hàm mũ (exponential phase), pha cân bằng (stationary phase) và pha chết (death phase) Bằng việc đo mật độ tế bào theo thể tích,

ví dụ: tế bào/mL ở các khoảng thời gian đều đặn, có thể xây dựng một đường cong sinh trưởng và các giai đoạn sinh trưởng có thể nhận ra từ đường cong sinh trưởng đó Theo Lee và Shen (2004) [38], trong nuôi thu hoạch toàn bộ, tảo trải qua ba pha khác nhau gồm pha tăng trưởng chậm, pha hàm mũ và pha tăng trưởng tuyến tính Các pha phản ánh sự thay đổi về sinh khối và môi trường nuôi của nó Trong tăng trưởng tuyến tính, một khi mật độ tế bào đạt đến cực đại, sinh khối sẽ tích lũy ở một tốc độ không đổi, cho đến khi một số chất trong môi trường nuôi hoặc hóa chất ức chế trở thành yếu

tố hạn chế

Ở các pha khác nhau, tốc độ sinh trưởng của tảo khác nhau Tuy nhiên, sự sinh trưởng của tảo còn tùy thuộc vào từng loài và bị chi phối rất mạnh bởi các yếu tố môi trường Các thông số quan trọng nhất điều hòa sự sinh trưởng của tảo bao gồm các chất dinh dưỡng, nguồn cung cấp năng lượng (ánh sáng cho quang hợp hay các hợp chất hữu

cơ trong trường hợp dị dưỡng), nhiệt độ, độ mặn, pH, mức xáo trộn Mỗi loài tảo đều có khoảng cực thuận và giới hạn chịu đựng nhất định đối với các yếu tố môi trường

Một số yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng của tảo:

- Môi trường nuôi: Mật độ tế bào trong môi trường nuôi thường cao hơn mật độ trong tự nhiên Do đó, môi trường nuôi tảo phải được làm giàu bằng các chất dinh dưỡng

để bù đắp những thiếu hụt trong nước biển là hết sức cần thiết Thành phần đa lượng cần thiết bao gồm nitrat và photphat (xấp xỉ tỷ lệ 6:1) và silicat Silicat đặc biệt dùng cho tảo

khuê vì chúng sử dụng hợp chất này để sản xuất vỏ bên ngoài Thành phần dinh dưỡng vi lượng gồm những nguyên tố kim loại khác nhau (Cu, Fe, Mg, Mo, Mn, Zn, ), các vitamin như thiamin (B1), Cyanocobalamin (B12) và Biotin Hai môi trường làm giàu được sử dụng rộng rãi và thích hợp cho sinh trưởng của hầu hết loại tảo là môi trường Walne và môi trường f/2 Do tính phức tạp và chi phí của các môi trường nuôi nêu trên nên chúng thường không được áp dụng trong hoạt động nuôi ở quy mô lớn Môi trường làm giàu thay thế thích hợp đối với sản xuất hàng loạt các vi tảo trong hệ thống quảng canh quy mô lớn chỉ chứa các chất dinh dưỡng thiết yếu nhất và thường là các phân bón dùng trong nông nghiệp thay vì phân bón dùng trong phòng thí nghiệm [27]

- Ánh sáng: Ánh sáng là nguồn năng lượng chính cho quá trình quang hợp của tảo Yêu cầu cường độ ánh sáng thay đổi rất lớn theo độ sâu của môi trường nuôi và mật độ nuôi tảo Ở độ sâu lớn và mật độ tế bào cao thì cường độ ánh sáng phải tăng để

có thể xuyên qua được môi trường nuôi (1000 lux thích hợp cho bình tam giác và 5000

- 10000 thích hợp cho các dung tích lớn hơn) Có thể là ánh sáng tự nhiên hoặc ánh sáng của đèn huỳnh quang Cường độ ánh sáng quá lớn (ví dụ ánh sáng trực tiếp của mặt trời hoặc các thùng chứa nhỏ để gần ánh sáng nhân tạo) có thể làm ức chế sự quang hợp Tuy nhiên dù là ánh sáng tự nhiên hay ánh sáng nhân tạo cũng tránh làm

nóng quá mức [27]

- Độ pH: Hầu hết các loài tảo sinh trưởng và phát triển pH trong khoảng 7 - 9 và thích hợp nhất từ 8,2 - 8,7 Nhiều khi công việc nuôi bị thất bại hoàn toàn do nhiều tế bào bị phá vỡ và nguyên nhân có thể do không duy trì độ pH thích hợp Điều này có thể khắc phục được bằng cách sục khí môi trường nuôi Trong trường hợp nuôi với mật độ cao việc bổ sung CO2 có thể làm giảm độ pH, mà trong quá trình tảo phát triển, pH có thể tăng tới giá trị giới hạn là 9

- Sục khí (đảo nước): Sục khí là việc làm cần thiết để ngăn ngừa tảo không bị lắng nhằm đảm bảo sao cho tất cả các quần thể đều được tiếp xúc với ánh sáng và các chất dinh dưỡng như nhau và để cải thiện sự trao đổi khí giữa môi trường nuôi với không khí Không khí là yếu tố hàng đầu vì nó chứa nguồn cacbon ở dạng CO2 phục

vụ cho quang hợp Việc bổ sung CO2 có thể làm đệm nước chống lại những thay đổi về

độ pH do sự cân bằng giữa CO2 và HCO3 Tuy nhiên cần lưu ý không phải các loài tảo đều chịu được việc khuấy đảo mạnh

- Nhiệt độ: Nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến cấu trúc tế bào, tốc độ phản ứng trao đổi chất, sinh trưởng, quá trình quang hợp, mật độ phân bố, cường độ hô hấp, kích

thước tế bào và sự thích nghi của loài Phần lớn các loài vi tảo sinh trưởng tốt ở nhiệt

độ 17 - 220C [36] Nhiệt độ thấp 170C sẽ làm giảm tốc độ sinh trưởng của chúng Nếu nhiệt độ cao hơn 350C, tảo có thể chết (kể cả những loài tảo nhiệt đới) Do vậy, khi nuôi tảo ta có thể cho dòng nước lạnh chảy trên bề mặt của bình nuôi để làm mát môi trường nuôi hoặc kiểm soát nhiệt độ không khí bằng thiết bị điều hòa

- Độ mặn: Khả năng chịu đựng sự thay đổi độ mặn của tảo biển rất lớn Hầu hết, các loài tảo đều phát triển rất tốt ở độ mặn thấp hơn độ mặn của môi trường sống một chút và điều này có thể thực hiện được bằng cách pha loãng nước biển bằng nước ngọt Khoảng độ mặn từ 25 - 30‰ thường tốt cho nuôi tảo lông roi, từ 20 - 25‰ tốt cho sinh trưởng tảo silic [36]

1.1.3 Giá trị dinh dưỡng của vi tảo trong nuôi trồng thuỷ sản

Mặc dù có nhiều loài tảo được sử dụng trong nghề nuôi hải sản nhưng không phải tất cả chúng đều mang lại hiệu quả cho sự sinh trưởng của đối tượng nuôi Nguyên nhân

do khả năng tiêu hóa của động vật thủy sản, kích cỡ và đặc biệt là giá trị dinh dưỡng của tảo Giá trị dinh dưỡng của vi tảo dùng làm thức ăn cho động vật thủy sản phụ thuộc cơ bản vào thành phần sinh hóa và nhu cầu dinh dưỡng cụ thể của các đối trượng nuôi [26]

Thành phần sinh hóa của vi tảo gồm: protein, carbohydrate, lipid và khoáng chất, chiếm 90 - 95% khối lượng khô (KLK) của vi tảo Phần còn lại là các axit nucleic chiếm 5 - 10% [26] Qua phân tích 40 loài tảo thuộc 7 lớp (Bacillariophyceae, Chlorophyceae, Prymnesiophyceae, Cryptophyceae, Eustigmatophyceae, Rhodophyceae, Prasinophyceae), Brown và ctv (1997) đã xác định rằng trong tảo đơn bào có hàm lượng protein cao nhất dao động từ 6 - 52 %; carbohydrate từ 5 - 23 % và lipid từ 7 - 23 % [25]

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng thành phần sinh hóa của tảo có thể bị thay đổi khi nuôi ở các điều kiện khác nhau hay thu hoạch ở các pha phát triển khác nhau Ở pha cân

bằng của tảo Pavlova lutheri và Isochrysis sp (T.ISO) có lượng carbohydrate nhiều gấp 2- 4 lần và lượng protein kém hơn 30 - 50% pha logarit Nuôi tảo khuê Thalassiosira pseudonana dưới điều kiện ánh sáng liên tục (50 và 100 µE m-2 s-1) lượng cacbohydrate nhiều hơn 2 - 3 lần nuôi dưới điều kiện 12: 12 (sáng: tối) (100 µE m-2 s-1) [25]

 Protein

Hàm lượng của các acid amin tương tự giống nhau giữa các loài tảo và đặc biệt rất giàu các acid amin thiết yếu Aspartate và glutamate có nồng độ cao nhất (7,1 - 12,9%), cystine, methionine, tryptophan và histidine có nồng độ thấp nhất (0,4 - 3,2%)

và các amino axit khác từ 3,2% đến 13,5% [25]

Bown và ctv (1989) đã thống kê thành phần sinh hóa của các loài tảo thường được sử dụng trong NTTS Kết quả cho thấy hàm lượng protein của lớp

Prymnesilophyceae (I galbana, Isochrysis sp và P lutheri ) dao động từ 41 - 49%, lớp Bacillariophyceae dao động từ 29 - 37%, trong đó Thalassiosira pseudonana

chiếm 29% [26]

Nhu cầu về giá trị dinh dưỡng của protein tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cũng như các giai đoạn phát triển Ở giai đoạn ấu trùng và con non thì nhu cầu protein cao hơn ở giai đoạn trưởng thành Ấu trùng động vật thân mềm (ĐVTM) hai mảnh vỏ yêu cầu 30 - 60 % protein trong chế độ tảo cho sinh trưởng của chúng Theo Webb và

Chu (1983) cho rằng tảo có hàm lượng protein cao thì có giá trị dinh dưỡng tốt Tuy

nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy mối quan hệ đó là không chặt chẽ Ví dụ, I galbana

và P lutheri có hàm lượng protein thấp nhưng lại là thức ăn tốt cho động vật thân mềm Trong khi đó Dunnaliella tertiolecta có hàm lượng protein rất cao nhưng khi

cho ấu trùng ĐVTM sử dụng thì tốc độ tăng trưởng lại thấp [26]

Đối với giáp xác, tảo có hàm lượng từ 30 - 60% protein được sử dụng thành công trong nuôi tôm giai đoạn hậu ấu trùng Nhu cầu protein của cá là 40 - 60% trong chế độ ăn của chúng [26]

 Cacbonhydrate

Theo Bown và ctv (1989), hàm lượng carbohydrate của lớp Prymnesilophyceae dao động từ 9 - 31%, lớp Bacillariophyceae dao động từ 17 - 24%, trong đó

Thalassiosira pseudonana chiếm 17% [26]

Hàm lượng carbohydrate trong tảo từ 5 - 30% được coi là tốt cho sinh trưởng

của động vật thân mềm hai mảnh vỏ Mức carbohydrate tối ưu cho ấu trùng tôm P japonicus từ 15 - 25% KLK trong chế độ ăn [25]

 Lipid và axit béo

Chất lượng của lipid được đánh giá dựa vào thành phần và hàm lượng acid béo trong thức ăn Các lớp tảo khác nhau chỉ ra sự khác nhau về hàm lượng acid béo Acid béo no của tảo lục chiếm 15 - 30% tổng số acid béo, tảo silic và Prymnesiophyta chiếm 30 - 40% Ngành tảo silic và Prymnesiophyta có acid béo không no mạch đơn chiếm 20 - 40% và acid béo không no mạch dài (PUFA) chiếm 20 - 50% Còn tảo lục, acid không no mạch đơn chiếm 5 - 20% và acid béo không no mạch dài chiếm 50 - 80% tổng acid béo

Các PUFA có trong tảo như axit docosahecxaenoic (DHA), axit eicosapentaenoic (EPA), axit arachidonic (AA) rất cần thiết đối với động vật thủy sản

Hầu hết các loài tảo đều chứa loại acid béo không no EPA ở mức độ từ trung bình tới cao (7-34%) Lớp tảo Bacillariophyceae, Prymnesiophyceae, Cryptophyceae, Rhodophyceae, Eustigmatophyceae rất giàu một hoặc cả hai loại acid béo không no

DHA và EPA Lớp tảo Prymnesiophyceae (ví dụ Isochrysis sp., và Pavlova spp.) và

Cryptophyceae tương đối giàu DHA (0,2 - 11 %), trong khi đó lớp Eustigmatophyceae

(Nannochloropsis spp.) và tảo silic lại có nhiều AA (0 - 4 %), lớp Prasinophyceae chứa khoảng 4 - 10 % DHA hoặc EPA, ngược lại Chlorophyceae (như Dunaliella spp

và Chlorella spp.) thiếu cả hai DHA và EPA, vì vậy chúng được xem là có giá trị dinh

dưỡng thấp [24] Mỗi một loài tảo đều có thể thiếu ít nhất một thành phần dinh dưỡng

cần thiết, ví dụ I galbana có nhiều DHA ít EPA, ngược lại tảo silic có nhiều EPA và ít

DHA Vi tảo có hàm lượng PUFAs (EPA, DHA) dao động từ 1 - 20 mg/mL tế bào được xem là thích hợp cho sự sinh trưởng của động vật thân mềm, nếu hàm lượng này thấp hơn 0,5 mg/mL tế bào thì được coi là thức ăn nghèo dinh dưỡng Còn đối với giáp xác nhu cầu này đều rất cần thiết và tùy thuộc vào từng loài Ở tôm he Nhật Bản

(Penaeus japonicus), thức ăn chứa khoảng 1% EPA và DHA là phù hợp cho sinh

trưởng và có vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi sinh lý của cơ quan sinh sản và tổng hợp các hormone sinh sản Trong khi nhu cầu này ở cá biển từ 1 - 2% trọng lượng khô thức ăn Vì vậy, việc chọn lựa và sử dụng hỗn hợp các loài vi tảo làm thức ăn cho đối tượng thủy sản sẽ cung cấp đầy đủ các thành phần dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển và đem lại hiệu quả cao hơn [24]

 Vitamin

Vi tảo là nguồn cung cấp vitamin quan trọng cho các đối tượng nuôi thuỷ sản Những loại vitamin chính gồm: thiamin (vitamin B1), riboflavin (vitamin B2), pyridoxine (vitamin B6), cyanocobalamin (vitamin B12), biotin, acid ascorbic (vitamin C), vitamin A, D, E, K [26] Theo thống kê của Brown (2002), hàm lượng vitamin C

trong vi tảo có sự khác nhau rất lớn giữa các loài (16 mg/g trọng lượng khô ở tảo C muelleri; 1,1 mg/g ở tảo T pseudonana) Còn lại các vitamin khác (thiamin, riboflavin,

pyridoxine, cyanocobalamin, biotin,…) chỉ khác nhau từ 2 - 4 lần giữa các loài tảo Điều này chứng tỏ rằng, việc lựa chọn một cách cẩn thận các loại vi tảo kết hợp với nhau sẽ cung cấp đầy đủ vitamin cho chuỗi thức ăn của động vật nuôi thủy sản

Hàm lượng vitamin của tảo khác nhau ở các pha sinh trưởng khác nhau Ở pha

logarit, hàm lượng của Thalassiosira pseudonana là 20 µg/g, Isochrysis sp là 40 µg/g

Ở pha cân bằng, hàm lượng riboflavin tăng lên 2 tới 4 lần ở Chaetoceros muelleri, Thalassiosira pseudonana và Nannochloris atomus [25]

lutein và astaxanthin (có nhiều trong tảo xanh - Tetraselmis spp.) có khả năng chuyển

đổi thành vitamin A trong chuỗi mắt xích thức ăn của động vật nuôi thủy sản [24]

1.1.4 Sử dụng vi tảo trong nuôi trồng thủy sản

Vi tảo sử dụng trong nuôi trồng thủy sản như là nguồn thức ăn cho tất cả các giai đoạn sinh trưởng của động vật hai mảnh vỏ (ngao, hàu, điệp), giai đoạn ấu trùng của một số động vật chân bụng (bào ngư, ốc) và ấu trùng của một số loài cá biển, tôm

he và các động vật phù du [27]

Đến nay đã có khoảng trên 40 loài tảo đã được phân lập và nuôi thuần chủng trong các hệ thống thâm canh phục vụ cho sản xuất giống hoặc làm thức ăn cho các đối tượng nuôi hải sản Hầu hết những loài tảo dùng thường xuyên trong nuôi biển là

tảo khuê Skeletonema costatum, Thalassiosira pseudonana, Chaetoceros gracilis, Chaetoceros calcitrans, tảo roi Isochrysis galbana, Tetraselmis suecica, Monochrysis lutheri và Chorella spp [27] Bảng 1.2 cho biết 8 lớp chính và 32 giống tảo nuôi chủ

yếu đang được dùng để nuôi dưỡng những nhóm động vật nước quan trọng

Bảng 1 2 Lớp và giống tảo nuôi dùng làm thức ăn cho các đối tượng thủy sản [27]

PL, Ấu trùng tôm biển AL, Ấu trùng bào ngư

BL, Ấu trùng nhuyễn thể MR, Luân trùng nước mặn

ML, Ấu trùng tôm nước ngọt BS, Artemia

BP, Hậu ấu trùng nhuyễn thể SC, Copepod nước mặn

FZ, Động vật phù du nước ngọt

1.1.4.1 Sử dụng vi tảo trong nuôi động vật thân mềm

Từ năm 1960, khi kỹ thuật sản xuất giống và nuôi động vật thân mềm phát triển, tảo tươi là nguồn thức ăn quan trọng nhất Mặc dù, nhiều giải pháp đã được nghiên cứu như: dùng men bánh mì, vi khuẩn, tảo dạng sệt, tảo khô… tuy nhiên tảo tươi vẫn là nguồn thức ăn không thể thay thế được [28] Động vật thân mềm lọc trực tiếp thức ăn vì vậy sự phát triển của động vật thân mềm liên quan chặt chẽ tới số lượng và chất lượng của vi tảo

Allen và Nelson, 1910 có thể xem là người đầu tiên sử dụng tảo làm thức ăn cho động vật thủy sản [43] Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để xác định loài tảo nào cung cấp tốt nhất cho sự phát triển và tỷ lệ sống tối ưu của động vật thân mềm Trong một báo cáo của cuộc điều tra quốc tế giữa các nhà điều hành trại giống năm

1991 đã liệt kê 8 loài tảo (Chaetoceros calcitrans, C gracilis, Skeletonema costatum, Thalassiosira pseudonana, I galbana, Isochrysis sp., P lutheri và T suecica) được

sử dụng rộng rãi và đại diện cho trên 90% khối lượng tảo nuôi được sản xuất ở 23 trại giống [41]

Việc lựa chọn vi tảo là nguồn thức ăn tiềm năng cho ĐVTM hai mảnh vỏ trong một trại sản xuất giống phải đảm bảo kích cỡ phù hợp, khả năng tiêu hóa tốt (liên quan đến độ dày thành tế bào), giá trị dinh dưỡng và khả năng sản xuất sinh khối lớn [41]

Trong tự nhiên, hàu Crassostrea virginica có kích cỡ trên 300 µm có thể lọc

được thức ăn trong phạm vi kích cỡ rộng từ 0,2 tới 30 µm [22] Tuy nhiên, khoảng

55% ấu trùng sò (Placopecten magellanicus), vẹm (Mytilus edulis), ngao (Mya arenaria) chứa tế bào thức ăn có kích cỡ 5 - 15 µm trong dạ dày của chúng và chỉ có

3% ấu trùng chứa thức ăn có kích cỡ 15 - 25 µm [28] Khi cho ăn thức ăn tự nhiên có

kích cỡ từ 1 - 10 µm, ấu trùng hàu Crassostrea virginica ưa thích các hạt thức ăn có

kích cỡ từ 2 - 4 µm Khi cho ấu trùng nhỏ (kích thước 109 µm) ăn 4 loài tảo nuôi có kích cỡ từ 1 - 11 µm, quan sát thấy chúng ưa thích thức ăn có kích cỡ 1 µm, trong khi

ấu trùng lớn (kích thước 290 µm) ưa thích thức ăn có kích cỡ 11 µm Điều này nói lên mối quan hệ giữa kích cỡ tảo với kích thước ấu trùng [41] Sinh trưởng của ấu trùng veliger hai mảnh vỏ đạt cao nhất khi ăn tảo có kích cỡ từ 4,7 tới 6,3 µm [46]

Một số tác giả cho rằng, ở một số loài tảo thành tế bào dày đã hạn chế khả năng tiêu hóa của ấu trùng từ đó làm cho tỷ lệ sinh trưởng của ấu trùng thấp như

trường hợp của tảo Chlorella autotrophica [21], Nannochloris atomus và Stichococcus bacillaris [45], khi quan sát trên kính hiển vi cho thấy các loài tảo này

ấu trùng hàu có thể ăn vào nhưng khó để tiêu hóa Ngược lại, ấu trùng hàu

Crassostrea virginica, C gigas có thể ăn và tiêu hóa tốt tảo Pavlova lutheri và Isochrysis galbana [21, 39] Thiếu enzym tiêu hóa thích hợp ở những ấu trùng còn

nhỏ là giả thuyết hiện thời để giải thích tại sao ấu trùng không thể tiêu hóa một số

loài tảo [41]

Dinh dưỡng là một trong những yếu tố chính quyết định sinh trưởng và tỷ lệ

sống của động vật thân mềm [40] Đến nay, tất cả các nghiên cứu đều xác định rằng

mỗi loài tảo khác nhau thì chúng có giá trị dinh dưỡng khác nhau, một loài tảo có thể thiếu ít nhất là một thành phần dinh dưỡng cần thiết, trong khi loài khác có thể có thành phần dinh dưỡng này nhưng lại thiếu thành phần khác Động vật thủy sản khi

ăn kết hợp hai hay ba loài tảo bao gồm tảo roi và tảo khuê thì thường sinh trưởng

phát triển tốt hơn cho ăn đơn loài Một số loài như: I galbana, Isochrysis sp., P lutheri, Chaetoceros sp là những loài phổ biến sử dụng làm thức ăn cho ấu trùng,

con giống, bố mẹ của động vật hai mảnh vỏ nhờ khía cạnh dinh dưỡng của chúng [24] Tuy nhiên, việc kết hợp các loài tảo làm thức ăn phải được hợp lý cả về tỷ lệ và thành phần thích ứng với nhu cầu dinh dưỡng của từng đối tượng nuôi cụ thể thì mới đem lại hiệu quả cao Ấu trùng của phần lớn các loài nhuyển thể có thức ăn tương tự

nhau, các loài tảo phù hợp như: C calcitrans, T pseudonana (3H), I galbana, và T suecica (cho ấu trùng có chiều dài > 120 µm) Sự kết hợp của tảo lông roi và tảo silic

cung cấp một chế độ ăn cân bằng làm gia tăng tốc độ phát triển của ấu trùng tới giai

đoạn biến thái so với chế độ ăn đơn loài [27] Tốc độ sinh trưởng của ấu trùng hàu O edulis đạt 9 µm/ngày khi sử dụng đơn loài I galbana, đạt 9,7 µm/ngày khi sử dụng kết hợp I galbana và P lutheri [35], hay 9,8 - 12,6 µm/ngày với I galbana và Tetraselmis suecica [33, 34] Năm 2014, nghiên cứu của Aranda-Burgos và cộng tác

viên trên ấu trùng Ruditapes decussatus cho rằng khi kết hợp C muelleri với I galbana và P luthery cho sinh trưởng và tỷ lệ sống cao hơn sử dụng kết hợp I galbana và P luthery [20]

Một số loài tảo mặc dù có giá trị tốt làm thức ăn nhưng lại không được sử

dụng ở các trại giống bởi vì khó sản xuất ở quy mô lớn ví dụ C calcitrans forma pumilum hiếm khi nuôi tới thể tích 20 lít, hay T suecica bám dính lên thành bể nuôi

gây hôi thối

Nhu cầu sử dụng vi tảo làm thức ăn cho động vật thân mềm thay đổi tùy theo giai đoạn sinh trưởng Giai đoạn ấu trùng đòi hỏi nguồn tảo phải đầy đủ chất lượng cũng như phải sạch khuẩn Giai đoạn hậu ấu trùng có thể đòi hỏi chất lượng tảo thấp

hơn nhưng phải có thành phần sinh hóa đáp ứng được nhu cầu của đối tượng nuôi Giai đoạn bố mẹ đòi hỏi đủ về số lượng cũng như chất lượng Do đó một cơ sở nuôi động vật thân mềm luôn đòi hỏi nhu cầu cao về sản xuất sinh khối tảo [28]

Có nhiều loài tảo sống ở biển, chỉ có một số có thể nuôi và chỉ có một số loài được sử dụng cho hàu, ngao, luân trùng, tôm… một số loài được sử dụng thường xuyên làm thức ăn được liệt kê trong Bảng 1.3 chúng bao gồm 2 nhóm: nhóm tảo lông roi có thể bơi bằng 1 hay nhiều lông bơi và nhóm tảo silic có vỏ cấu thành bởi silicat [36]

Bảng 1 3 Các loài tảo được sử dụng làm thức ăn cho hàu và ngao [36]

1.1.4.2 Sử dụng vi tảo trong nuôi tôm

Vi tảo thường được cho vào bể nuôi ấu trùng tôm he từ giai đoạn noãn hoàng để khi vừa chuyển sang giai đoạn Zoea là có thức ăn ngay Các loài tảo thường dùng

trong nuôi tôm là Chaetoceros sp., Skeletonema costatum, Tetraselmis chuii, Thalasiosira pseudonana Do sở thích ăn thay đổi trong giai đoạn Mysis, từ chỗ chủ

yếu ăn thực vật chuyển sang ăn thịt nên lượng tảo cho ăn giảm dần Tuy nhiên vẫn cần một lượng tảo nhất định cho vào bể nuôi nhằm ổn định chất lượng nước “Phương

pháp nuôi cùng bể” là kỹ thuật trong đó tảo và ấu trùng được nuôi chung, bể nuôi được đặt ngoài trời để tảo phát triển, đến lượt tảo được ấu trùng tôm sử dụng làm thức ăn

Các loài tảo dùng làm thức ăn cho ấu trùng tôm he có kích cỡ từ 5 µm (Isochrysis sp.) tới 10 - 20 µm (Tetraselmis sp.) [1]

1.1.4.3 Sử dụng vi tảo trong nuôi cá biển

Đối với ấu trùng cá biển, cá được cung cấp dinh dưỡng thông qua các đối tượng động vật phù du làm thức ăn như: Copepoda, luân trùng, Artemia Giá trị dinh dưỡng của các đối tượng này phụ thuộc chủ yếu vào nguồn thức ăn chính là vi tảo Ví dụ nuôi

luân trùng bằng Dunaliella tertiolecta (ít PUFA) thì chứa ít hàm lượng PUFA trong cơ thể, ngược lại nếu nuôi bằng Pavlova lutheri (giàu PUFA) thì giàu PUFA trong cơ thể

của chúng Dựa vào cỡ mồi của động vật nuôi mà các loài tảo được lựa chọn nuôi sinh khối làm thức ăn thường có kích thước từ 2 - 20 µm và cho động vật phù du tốt nhất từ

2 - 12 µm [16]

Ngoài yêu cầu về vi tảo để nuôi hoặc làm giàu các sinh vật mồi sống như Artemia và luân trùng, tảo thường được sử dụng trực tiếp trong các bể để nuôi ấu trùng cá biển “Kỹ thuật nuôi nước xanh” là một phần của các kỹ thuật được áp dụng

phổ biến để nuôi ấu trùng cá tráp đầu vàng Sparus aurata (50.000 tế bào/mL tảo Isochrysis sp + 400.000 tế bào/mL tảo Chlorella sp mỗi ngày), cá măng Chanos chanos (từ 500 đến 3.500 tế bào/mL tảo Chlorella sp được bổ sung từ lúc nở đến ngày thứ 21) Cá nục heo Coryphaena hippurus (200.000 tế bào/mL tảo Chaetoceros gracilis , Tetraselmis chuii hoặc Chlorella sp., cá sơn lưỡi bò Hippoglossus hippoglossus (tảo Tetraselmis sp.) và cá bơn sao Scophthalmus maxinus (60.000 tế bào/mL tảo Tetraselmis sp hoặc 130.000 tế bào/mL tảo I galbana [14]

1.1.5 Tình hình nghiên cứu về phân lập, lưu giữ và sản xuất vi tảo

Theo Preisig và Andersen (2005) [43], môi trường nuôi, phương pháp nuôi của

vi tảo được nghiên cứu từ những năm 1800 - 1900

Ferdinand Cohn (1850) đã thành công trong việc lưu giữ tảo lục đơn bào có

roi Hematocaccus ( Chlorophyceae) nhưng ông đã không phân lập được loài tảo này

Famintzin (1871) là người đầu tiên nuôi tảo bằng việc sử dụng dung dịch một số

muối vô cơ để nuôi một số loài tảo xanh, đặc biệt là 2 loài Chlorococcum infusionum

và Protococcus viridis

Người đầu tiên tiến hành phân lập tảo thành công phải kể đến Beijerinck

(1890) với công trình phân lập hai giống tảo Chlorella và Scenedesmus và ông cũng thành công trong việc phân lập loài tảo xanh từ hydrat (Zoochlorella) và địa y (Cystococcus humicola) Sau đó ông cũng tiến hành phân lập các loài tảo khác bao

gồm tảo lam và tảo silic nhưng độ thuần chủng thấp Ông đã đưa ra báo cáo đầu tiên

về nuôi tảo sạch, ông pha dung dịch nước muối hay môi trường dinh dưỡng với gelatin để nuôi tảo, mặc dù sau này Klebs (1896) đã nghi ngờ về thành tựu này [43]

Miquel (Pháp) từ những năm 1890 - 1898 đã phân lập được một số tảo silic nước mặn và nước ngọt bằng phương pháp nhặt tế bào trên kính hiển vi và pha loãng hỗn hợp tảo với môi trường chứa khoáng [19]

Ngoài ra, nhiều nhà khoa học khác cũng có nhiều đóng góp trong nghiên cứu tảo trong những năm cuối thế kỷ 19 như: Germans Noll và Oltmanns (1892), Naegeli (1893)… Có lẽ nghiên cứu có ảnh hưởng nhất vào thời điểm này có thể kể đến là nghiên cứu chuyên sâu của Klebs (1896) thực hiện tại Đại học Basel, Thụy Sĩ Ông đã thành công trong việc nuôi tảo nhưng vẫn chưa thể giữ tảo tránh nhiễm khuẩn, là người đầu tiên phân lập tảo trên agar sử dụng đĩa peptri Gelatin sử dụng ở nghiên cứu của Beijerinck (1890) đã chứng minh không đạt yêu cầu vì vi khuẩn ăn gelatin, chuyển chất rắn thành hỗn hợp lỏng Agar cũng được Tischutkin (1897) ở Belarus sử dụng nuôi thuần chủng vi khuẩn lam nhưng độ thuần chủng vẫn bị nghi ngờ Zumstein

(1900) phân lập loài tảo mắt Euglena gracilis bằng pipet, ông đã tách vi khuẩn khỏi

môi trường phân lập bằng cách axit hóa môi trường đến mức mà không giết chết tảo Richter (1903) đã phát triển phương pháp của Miquel để nuôi một số loài tảo silic và cũng mở rộng với những loài tảo khác Vào năm 1908, Küster đã có những thành công

đầu tiên trong nuôi tảo hai roi Gymnodinium fucorum, mặc dù ông không đạt độ thuần chủng loài tảo này Jacobsen (1910) là người đầu tiên phân lập tảo lục Polytoma uvella, Carteria, Chlamydomonas, Chlorogonium và Spondylomorum [43]

Hai loài Isochrisys galbana và Pyramimonas grossii đầu tiên được Bruce báo

cáo là đã phân lập và nuôi đơn chúng dùng làm thức ăn trong nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là dùng cho nuôi ấu trùng trai, hầu [18] Tiếp theo đó, là kết quả nuôi thành công

tảo khuê như: Chaetoceros constrictum, Skeletonema costatum, Thalassiosira decipiens… cho nhiều loài động vật không xương sống khác nhau của Allen và

Nelson, 1910 [19] Vischer (1926, 1937, 1960) là một chuyên gia nổi tiếng trong lĩnh

vực nuôi tảo, ông đã thu thập, phân lập được nhiều loài tảo có độ thuần chủng khá cao, đặc biệt là Chlorophyceae và Heterokontae (Xanthophyceae /Eustigmatophyceae)

Năm 1941, Matsue đã phân lập và nuôi cấy tảo thuần loài Skeletonema costatum và dùng làm thức ăn cho ấu trùng tôm Penaeus japonicus ở giai đoạn Zoea và đã nâng tỉ

lệ sống của ấu trùng đến giai đoạn Megalope lên 30%, thay vì 1% so với các kết quả trước đây [37]

Comtois (1997) đã phân lập và nuôi thuần chủng một số loài tảo silic: Navicula sp., Nitzschia sp bằng phương pháp nhặt tế bào bằng micropipette

Mức độ thuần chủng của tảo ngày càng được nâng cao, nhiều loài tảo đã lưu giữ thành công nhờ sử dụng các phương pháp phân lập và môi trường dinh dưỡng thích hợp, góp phần xây dựng ngân hàng tảo giống, tăng hiệu quả nuôi sinh khối trong thực tiễn nghiên cứu và sản xuất Hiện nay có 3 phương pháp phân lập tảo được

sử dụng phổ biến bao gồm: phân lập bằng phương pháp pha loãng, phân lập trên môi trường agar và phân lập bằng phương pháp nhặt tế bào bằng micropipette

Từ những năm 1940, người ta rất quan tâm đến nuôi sinh khối tảo, không phải chỉ dùng cho nghề nuôi thủy sản mà còn vì nhiều mục đích khác như: cải tạo đất, lọc nước thải, nguồn thực phẩm cho con người hay thức ăn tươi sống Beijerinck đã nghiên

cứu nuôi tảo Chlorella vulgaris lần đầu tiên trong ống nghiệm và đĩa petri Nhiều nghiên

cứu tiếp theo được tiến hành và cho đến năm 1950 - 1951 nhà khoa học Cook ở Viện Nghiên cứu Stanford ở California, đã chuyển phương pháp nuôi cấy trong phòng thí

nghiệm ra qui mô sản xuất lớn Chlorella, nghiên cứu nuôi sinh khối được tiếp tục bởi

Little ở Cambridge Tuy nhiên, về sau nuôi đại trà tảo Chlorella phát triển chủ yếu là ở Đông Nam Châu Á, đặc biệt là ở Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan Tại Đài Loan, nuôi sản xuất tảo được hình thành vào năm 1964, đến năm 1977, đã có 30 trại sản xuất với công suất 200 tấn/tháng, sản xuất khoảng 1.000 tấn/năm Các loài tảo khác

như: Dunadiella, Scenedesmus, Spirulina cũng được nghiên cứu và phổ biến ra quy

mô sản xuất Số liệu thống kê cho thấy, tổng sản lượng hàng năm của tảo Spirulina trên

thế giới là 850 tấn, trong đó, Mexico đóng góp 300 tấn, Đài Loan: 300 tấn, Hoa Kỳ: 90 tấn, Thái Lan 60 tấn, Nhật Bản: 40 tấn và Israel: 30 tấn [44]

Để phục vụ cho mục đích nuôi thủy sản, nhiều loài tảo khác cũng được nghiên cứu nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm hoặc ở qui mô sản xuất Wendy và

Kevan (1991) đã tổng kết ở Hoa kỳ, các loài Thalasiossira pseudomonas,

Skeletonema, Chaaaetoceros calcitrans, Chaetoceros mulleri, Nannochloropsis ocula, Chlorella minutissima được nuôi để làm thức ăn cho luân trùng, ấu trùng

ĐVTM hai mảnh vỏ, ấu trùng tôm và cá theo phương pháp từng đợt hoặc bán liên tục trong những bể composite 2.000 - 25.000 lít [18]

Trung Quốc bắt đầu nghiên cứu nuôi tảo từ những năm 1940 Guo và ctv

(1959) phân lập và nuôi hai loài tảo xanh đơn bào Tetraselmis sp và Dunaliella sp [32] Ở Đài Loan, các đối tượng nuôi chính là Nannochloropsis oculata, Tetraselmis, Chlorella sp., dùng cho ương nuôi ấu trùng họ tôm he (Penaeus), loài Isochrysis galbana trong ương nghêu Riêng loài Skeletonema costatum, sản lượng nuôi có thể

đạt tới 9.000 tấn/năm [18]

Nuôi tảo ở Nhật Bản cũng rất quan trọng với nhiều đối tượng nuôi và bằng

phương pháp thu từng đợt hoặc bán liên tục: Chaetoceros sp., Penaeus japonicus và Metapenaues ensis, Isochrysis sp và Pavlova lutheri dùng cho ĐVTM hai mảnh vỏ; Tetraselmis sp., Nanochloropsis oculata, Chlammydomonas sp cho luân trùng Brachionus plicatilis [18]

Nuôi tảo khuê cũng rất phổ biến ở Thái Lan, nhất là loài Skeletonema costatum và Chaetoceros calcitrans dùng cho ấu trùng tôm Bể nuôi thường là bể

thủy tinh có thể tích 1.000 lít hay bể ximăng 4.000 lít Ước đoán năng suất đạt được khoảng 3 x 1012 tb/tháng [18]

Hiện nay, trên thế giới có rất nhiều phương pháp nuôi tảo Tùy vào từng mục đích, nhu cầu và điều kiện nuôi cụ thể mà nên áp dụng phương pháp nào cho phù hợp

để giảm chi phí sản xuất và đem lại hiệu quả cao Nhìn chung, có một số phương pháp nuôi tảo như sau [27]:

 Nuôi theo đợt: Ở hình thức này tảo được cấy vào môi trường nuôi với mật độ ban đầu thấp và khi thu hoạch sẽ thu toàn bộ thể tích nuôi Khi mật độ tảo tăng cao sẽ gây ra giới hạn dinh dưỡng và giới hạn ánh sáng do tự che khuất làm giảm tốc độ sinh trưởng Sự sinh trưởng của tảo được biểu diễn bằng đường cong sinh trưởng dạng sigma Trong sản xuất tảo thường được thu hoạch toàn bộ vào cuối pha logarit

 Nuôi liên tục: Hình thức này được đặc trưng bằng sự cung cấp môi trường dinh dưỡng và thu hoạch liên tục theo một tỷ lệ pha loãng nhất định để duy trì ổn định tình trạng phát triển của tảo tại một tốc độ sinh trưởng tốt nhất Nuôi liên tục

khắc phục được tình trạng giới hạn dinh dưỡng và ánh sáng khi mật độ tảo tăng cao,

có khả năng cung cấp đủ tảo cho quá trình thí nghiệm và sản xuất Nuôi liên tục có thể chia thành các kiểu nuôi:

- Nuôi ổn định hàm lượng phân bón hoặc ổn định hóa học: tảo nuôi được thu hoạch và pha loãng liên tục theo một tỷ lệ không đổi bằng dòng dinh dưỡng chảy vào

và dòng chảy ra để thu tảo, làm cho hàm lượng muối dinh dưỡng luôn ổn định

- Nuôi ổn định mật độ hoặc ổn định độ đục: tương tự như nuôi ổn định hóa học nhưng nhằm duy trì mật độ tảo ổn định để hạn chế sự tự che khuất ánh sáng

 Nuôi bán liên tục: tảo được định kỳ thu hoạch theo một tỷ lệ nhất định và được cấp lại môi trường dinh dưỡng mới để duy trì thể tích nuôi ban đầu Nói chung tảo được nuôi với mật độ ban đầu thấp và được thu hoạch, pha loãng ở cuối pha logarit

1.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng vi tảo trong nước

Các công trình nuôi trồng vi tảo được bắt đầu và cùng với sự phát triển của hoạt động nuôi trồng thủy sản Tuy nhiên các nghiên cứu phân lập và lưu giữ giống tảo thuần chủng lại không nhiều

Từ những năm 1970, Skeletonema costatum do Vũ Dũng phân lập và nhân

giống thành công đã được trường Đại học Thuỷ sản thử nghiệm nuôi trồng tại các cơ

sở sản xuất Năm 1997 với dự án phát triển trai ngọc ở Bến Bèo, Hải Phòng, tảo

Chroomonas sp được đưa vào nuôi thành công ở Trung tâm Quốc gia Hải sản Miền Bắc (trích theo [6]) Sau đó đã có thêm nhiều nghiên cứu về Skeletonema costatum

Năm 1991, Đỗ Văn Khương và Lê Viễn Chí đã phân lập và lưu giữ loài tảo

Skeletonema costatum ứng dụng làm thức ăn cho ấu trùng tôm he và đề xuất quy trình nuôi sinh khối một số loài tảo silic khác như: Chaetoceros gracilis, C calcitrans phục

vụ cho nghề sản xuất giống tôm he [10, 11] Năm 1989, Trung tâm Nghiên cứu Thủy

sản III đã phân lập được S costatum tại vùng biển Nha Trang và nuôi đại trà làm thức

ăn cho tôm sú đạt kết quả tốt [16]

Viện Nghiên cứu NTTS II đã sử dụng thành công một số loài vi tảo

như: Tetraselmis chuii, Chlorella sp., Nannochloropsis oculata, Platymonas sp., Isochrysis galbana trong “qui trình nuôi nước xanh” để ương nuôi ấu trùng cá biển từ

những năm 2000 Để phục vụ cho các đề tài, dự án sản xuất giống một số đối tượng

nuôi, Khoa NTTS - Trường Đại học Nha Trang cũng lưu giữ và nuôi thu sinh khối

được nhiều loài tảo như: Tetraselmis sp., Nanochloropis oculata, Isochrysis gabana,…

làm thức ăn cho Artemia, luân trùng để nuôi ấu trùng cá chẽm [13]

Từ năm 2000 đến nay, Viện Nghiên cứu NTTS III đã lưu giữ và nuôi sinh khối

thành công các loài tảo silic (Chaetoceros calcitrans, Chaetoceros sp., Skeletonema costatum, Navicula sp., Nitzschia sp.), tảo lục (Nanochloris sp., Chlorella sp., Tetraselmis sp.), tảo mắt (Nanochloris oculata), tảo vàng ánh (Isochrysis sp.) [9] Đồng

thời tiến hành thu thập, phân lập theo nhiều phương pháp (pha loãng, nuôi cấy trên môi trường thạch) và lưu giữ trong môi trường (TT3, f/2 ) dạng lỏng, bán lỏng ở nhiệt độ (5

- 60C, 150C, 20 - 250C) để phân lập và lưu giữ lại được nhiều loài tảo nhập từ Trung

Quốc, Đan Mạch, Úc, Philippines… như Tetraselmis suecica, Nannochloropsis atomus, Chaetoceros calcitrans… và một số loài được thu thập ở biển Việt Nam như: Chaetoceros muelleri, Skeletonema costatum, Nitzschia closterium, Navicula sp.…[9] Năm 2009, Phạm Mỹ Dung đã phân lập được hai loài tảo Chaetoceros muelleri và Tetraselmis sp từ vùng biển Nam Định và Cát Bà (Hải Phòng) bằng phương pháp pha

loãng, sử dụng micropipet và cấy trên môi trường thạch [6] Tiếp theo đó năm 2011,

Trần Thị Tuyết Lan đã phân lập được hai loài Chaetoceros glacilis và Tetraselmis chuii

thu bằng lưới vợt phù du ở vùng biển Hải Phòng và Khánh Hòa bằng phương pháp pha loãng và cấy trên môi trường thạch [12] Sau các công trình phân lập và lưu giữ giống tảo, một số tác giả đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố như: độ mặn, ánh sáng, môi trường dinh dưỡng, mật độ ban đầu… lên sinh trưởng của tảo [7, 15]

Có thể nói rằng cho tới nay, nhiều loài tảo đã được nghiên cứu phân lập, lưu giữ, thử nghiệm nuôi sinh khối làm thức ăn cho động vật nổi (Artemia, luân trùng,…)

và các đối tượng thủy sản (điệp quạt, hàu, tu hài, tôm sú, cá chẽm,…) với nhiều công trình được công bố nhưng rất ít công trình nghiên cứu sâu đến phương pháp phân lập các loài tảo

Vi tảo có vai trò hết sức quan trọng trong các trại sản xuất giống thương mại đối tượng thủy sản như: cá, giáp xác, động vật thân mềm Đặc biệt tảo là thức ăn không thể thay thế được trong sản xuất giống động vật hai mảnh vỏ Sử dụng vi tảo đã mang lại thành công đáng kể cho việc nghiên cứu sản xuất giống cua, cá biển, sò huyết, ốc hương, nghêu, tu hài, hải sâm… Vi tảo đã được sử dụng trong sản xuất

giống hải sản tại Viện Nghiên cứu NTTS III trong nhiều năm qua và đã làm tăng tỷ lệ

sống lên 3,95% của vẹm xanh (Perna viridis) ở giai đoạn ấu trùng chữ D đến con giống 3 - 5 mm khi sử dụng hỗn hợp tảo tươi N oculata, Chaetoceros sp., Isochrysis galbana, Platymonas sp., ốc hương (Babylonia areolata) giai đoạn Verliger lên 60 - 65% với hỗn hợp N oculata, Chaetoceros sp., Isochrysis galbana, Platymonas kết hợp với thức ăn tổng hợp; sò huyết (Anadara granosa) ở giai đoạn ấu trùng nổi lên 70% với N oculata, Chaetoeros sp., Isochrysis sp., Platymonas sp.); tu hài (Lutraria rhynchaena) ấu trùng nổi tới con giống 7 - 10 mm lên 1,42% với N oculata, Chaetoeros, Platymonas so với thức ăn tổng hợp Lansy, Fripak lên 0,34%; điệp quạt (Chlamys nobilis) giai đoạn ấu trùng D tới spat lên 7,5 - 9,5% với hỗn hợp Chaetoeros muelleri, Platymonas, Isochrysis galbana [17] Bên cạnh đó, tại Viện Nghiên cứu Hải

sản Hải Phòng cũng đã thành công trong việc sử dụng một số loài tảo đơn bào như:

Chlamidomonas sp., Chaetoceros calcitran, Dunaliella sp trong ương nuôi ấu trùng

trai ngọc [2, 3]

Hiện nay, ở nước ta tuy việc sản xuất giống các đối tượng thuỷ sản có giá trị kinh tế phát triển manh mẽ, nhưng để chủ động sản xuất thức ăn tươi sống cho các giai đoạn ấu trùng khác nhau còn gặp nhiều khó khăn Hầu hết các cơ sở sản xuất giống đều bị động và phải dùng thức ăn thay thế như thức ăn chế biến, bột đậu nành, tảo khô… Nguồn giống và sinh khối tảo còn phụ thuộc vào thu vớt tự nhiên nên không thuần nhất, khó lưu giữ Nguyên nhân là do chưa có phương pháp phân lập tối ưu, nuôi giữ thuần chủng trong điều kiện phòng thí nghiệm cũng như chưa có quy trình công nghệ nuôi thích hợp đảm bảo nhân nhanh sinh khối vi tảo nhất là giống ban đầu Việc ứng dụng các phương pháp phân lập, lưu giữ giống tảo đang được sử dụng ở nhiều nước trên thế giới vào công nghệ phân lập, lưu giữ cũng như nuôi đại trà vi tảo ở Việt Nam còn chưa phổ biến Vì thế, các loài tảo dùng làm thức ăn cho đối tượng thủy sản

thường được nhập giống thuần từ nước ngoài như: Chaetoceros sp., Chlorella sp., Platymonas sp., Nannochloropsis oculata, Chaetoceros muelleri, Isochrysis galbana… và lưu giữ trong phòng thí nghiệm với chi phí cao, chỉ có một ít loài được phân lập từ biển Việt Nam như: Skeletonema costatum, Nitzschia closterium, Navicula

sp.… [9] Ngoài ra một số loài tảo đã bị nhiễm tạp hoặc đang thoái hóa Do các chủng giống tảo có nguồn gốc nhập ngoại, nên chưa có phương pháp lưu giữ giống thuần

cũng như quy trình công nghệ nuôi trồng chúng chưa thích hợp với điều kiện khí hậu của Việt Nam, nên hiệu quả đem lại chưa cao, sinh khối đạt được thấp, bị tạp nhiễm nhiều, nguồn giống sơ cấp không chủ động được, đặc biệt là không có được các chủng giống phân lập được từ Việt Nam nên tính chống chịu với điều kiện như: nhiệt độ, độ mặn cao là rất thấp Vì vậy việc phân lập vi tảo hiện có mặt ở các vùng biển Việt Nam

là hết sức cần thiết để có thể chủ động nguồn giống cung cấp cho các trại NTTS, phân lập được các loài vi tảo có khả năng thích nghi tốt với điều kiện khí hậu của Việt Nam Đặc biệt phân lập một số vi tảo có giá trị dinh dưỡng sử dụng cho động vật thân mềm hai mảnh vỏ tại địa phương là hết sức quan trọng để tối ưu hóa sản xuất thương mại

CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1 Thời gian nghiên cứu

Từ 16/6/2013 - 16/7/2014

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện tại phòng tảo và trại sản xuất ấu trùng, phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

- Vi tảo có trong nước biển tự nhiên từ vùng biển Nha Trang

- Ấu trùng hàu Thái Bình Dương Crassostrea gigas

Hình 2 2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

Phân lập và nuôi sinh khối một số loài vi tảo từ biển Nha Trang sử dụng cho động vật thân mềm hai mảnh vỏ”

Tuyển chọn, phân lập và định

tên khoa học một số vi tảo từ

vùng biển Nha Trang

Lưu giữ và nuôi sinh khối một số loài tiềm năng

Thử nghiệm làm thức

ăn cho ấu trùng hàu Thái Bình Dương

Kết luận và đề xuất ý kiến

Tạo giống thuần và xác định

tên khoa học

Xác định điều kiện lưu giữ và nuôi sinh khối phù hợp

Xác định mức độ phù hợp làm thức ăn của tảo phân lập được

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tuyển chọn, phân lập và định tên khoa học một số vi tảo từ vùng biển Nha Trang bằng phương pháp pha loãng và phương pháp cấy trên đĩa agar

Hình 2 3 Sơ đồ khối phân lập vi tảo

Nước biển được bơm trực tiếp từ tự nhiên vào 2 bể có thể tích 1 m3/bể sau đó làm giàu với môi trường f/2 để tảo phát triển làm nguồn phân lập: 1 bể bổ sung silic và

1 bể không bổ sung silic Sau vài ngày tảo phát triển với một vài loài tảo khuê và tảo roi Mẫu được lọc qua lưới 200 µm để loại bỏ động vật phù du, các hạt lớn và sau đó được dùng làm nguồn tảo phân lập Tảo được phân lập theo phương pháp của Andersen (2005) [43]

 Phân lập trên môi trường thạch

Chuẩn bị môi trường thạch: Bổ sung agar với nồng độ 1,5% vào nước biển

có độ mặn 30‰, bổ sung môi trường f/2, chia làm 2 bình, một bình có silic, một bình không có silic sau đó hỗn hợp này được khử trùng ở điều kiện nhiệt độ 1210C trong

30 phút và 1atm Sau khi khử trùng để nguội 40 - 500C, hỗn hợp trên được đổ vào các

Tạo giống tảo thuần

đĩa petri đã khử trùng, để nguội và đậy nắp ở điều kiện phòng 1 - 2 ngày sau đó mang

ra cấy phân lập (cần loại bỏ những đĩa thạch có thể bị nhiễm trong quá trình thao tác)

- Khi thạch đông, nguội thì tiến hành cấy tảo Dùng pipet tiệt trùng lấy 0,1 mL hỗn hợp tảo đã làm giàu vào đĩa agar Dùng que cấy tiệt trùng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ, để nguội rồi dùng que cấy dàn tảo lên agar theo các vệt sọc

- Băng mép đĩa petri bằng parafin rồi để trong phòng với nhiệt độ khoảng 24 - 250C

- Để các đĩa thạch dưới điều kiện chiếu ánh sáng đèn neon khoảng 300 lux, nhiệt độ 250C Sau 2 tuần, tiến hành kiểm tra dưới kính hiển vi quang học (thời gian cần thiết cho tảo mọc trên thạch thường là 2 đến 4 tuần sau khi cấy) để phát hiện các quần lạc tảo Nếu phát hiện thấy tảo đã mọc, dùng kính lúp chọn ra các khuẩn lạc riêng

rẽ và tiến hành cấy chuyển sang các đĩa thạch khác nhằm tạo các dòng tế bào thuần Lặp lại quy trình này cho đến khi thu được dòng tế bào thuần Dùng que cấy lấy các quần lạc tảo đem soi dưới kính hiển vi để xác định quần lạc tảo Các quần lạc tảo được chuyển vào ống nghiệm đã có sẵn 9mL nước nuôi tảo bằng que cấy Sau khoảng 3 - 7 ngày, tảo trong ống nghiệm phát triển thì đưa tảo ra nhân sinh khối

* Phân lập theo phương pháp pha loãng

Phương pháp phân lập này dựa vào các mức độ pha loãng tối đa tại đó dung dịch chỉ chứa một tế bào (một cơ thể) và được nuôi trong ống nghiệm Phương pháp nêu trên áp dụng hiệu quả cho việc phân lập các vi tảo chiếm lượng lớn trong mẫu Nếu số lượng tế bào xấp xỉ trong mẫu cần phân lập mà không biết và không thể tính toán được thì tiến hành pha loãng liên tục mẫu theo cấp 10-1, 10-2 tới 10-10 sau khoảng 7 đến 10 lần pha loãng liên tục tùy thuộc vào nồng độ và trạng thái mẫu thì cũng có thể thu được tảo đơn loài

Các bước thực hiện:

- Pha nước biển với môi trường f/2, chia ra 2 mẫu, 1 mẫu có silic và 1 mẫu không có silic Hấp tiệt trùng dung dịch ở nhiệt độ 1210C trong 30 phút

- Chuẩn bị các ống nghiệm 10 mL, đánh số thứ tự từ 100, 10-1, 10-2, , 10-10 Hấp tiệt trùng ống nghiệm nhiệt độ 1210C trong 30 phút Đổ 9 mL nước biển vào mỗi ống nghiệm trừ ống 100 Sử dụng 50 ống nghiệm với 5 lần lặp lại để phân lập mẫu tảo làm giàu với môi trường f/2 có silic với độ pha loãng từ 100, 10-1, 10-2, , 10-10 Tương

tự dùng 50 ống nghiệm để phân lập mẫu tảo làm giàu với môi trường f/2 không silic

- Hút 10mL dịch mẫu tảo làm giàu vào ống 100 sau đó hút 1mL dịch tảo này sang ống 10-1, thay đầu pipette và hút 1mL dịch tảo từ ống 10-1 sang ống 10-2, lại thay

đầu pipette và hút 1mL dịch tảo từ ống 10-2 sang ống 10-3, cứ tiếp tục quy trình như vậy cho đến 10-10

- Các ống chứa mẫu pha loãng được nuôi trong điều kiện ánh sáng yếu 300 lux trong phòng nhiệt độ 270C và thường xuyên kiểm tra tảo phát triển

Sau 2 - 4 tuần kiểm tra tảo dưới kính hiển vi bằng cách lấy mẫu từ mỗi ống nghiệm Loài đơn có thể phát triển ở ống nghiệm có độ pha loãng cao từ 10-6 tới 10-10 Nếu ống nghiệm chứa nhiều loài tảo tiếp tục pha loãng để có thể thu được tảo đơn loài

Hình 2 4 Sơ đồ pha loãng tảo ở các nồng độ khác nhau

 Định tên khoa học vi tảo

Chụp ảnh hình thái tế bào vi tảo trên kính hiển vi quang học Tảo được xác định theo miêu tả của Camelo R Tomas (1997) [47]

Gửi mẫu tảo sang Đại học Ghent, Bỉ để xác định chính xác tên vi tảo bằng phương pháp giải trình nucleotit của các gen

2.3.2 Lưu giữ và nuôi sinh khối hai loài tảo Isochrysis galbana và Thalassiosira sp 2.3.2.1 Lưu giữ hai loài tảo Isochrysis galbana và Thalassiosira sp

Tảo giống được lưu giữ trên môi trường lỏng đặt ở phòng thí nghiệm Ưu điểm

của phương pháp này là dễ quan sát mẫu, thuận lợi cho việc nhân nhanh sinh khối trong một thời gian ngắn, dễ tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam Tuy nhiên, phương pháp này còn một số hạn chế như thời gian lưu giữ mẫu ngắn

(từ 3 - 4 tuần), tuỳ thuộc vào chu kỳ sinh trưởng của từng chủng, chiếm diện tích trên giàn nuôi và khả năng lây nhiễm giữa các mẫu là rất lớn do phải cấy chuyển nhiều lần cũng như là tốn sức lực của người quản lý chủng giống Các mẫu vi tảo sẽ được nuôi trên môi trường lỏng phù hợp đến khi tế bào vi tảo ở vào pha sinh trưởng theo hàm số

mũ (ở pha logarit) sẽ tiến hành lấy mẫu và lưu giữ giống

Hút 5 mL môi trường lỏng vào từng ống nghiệm, sau đó bổ sung lượng mẫu với

tỉ lệ là 70: 30 theo thể tích (v/v) Tất cả các công đoạn trên đều thao tác trong điều kiện

vô trùng, tránh bị nhiễm khuẩn Các mẫu vi tảo quang tự dưỡng sẽ được giữ trên 3 ống nghiệm Các ống nghiệm được dán nhãn ghi rõ tên và ngày cấy chuyển Sau đó, chúng

sẽ được nuôi trong điều kiện ánh sáng yếu (300 lux) và nhiệt độ thấp (20 - 240C), 2 - 3 ngày sau khi cấy chuyển cần phải theo dõi và kiểm tra mẫu Lập sổ theo dõi sau khi cấy chuyển và ghi chép lại tình trạng phát triển của mẫu tảo, thời gian cấy chuyển, số lượng mẫu… Tất cả chủng giống phải được giữ ở cả 3 đợt cấy chuyển liên tiếp (3 thế hệ) để tránh mất giống

Thí nghiệm 1 Bố trí thí nghiệm chọn thời gian lưu giữ phù hợp thể hiện qua Hình 2.4

Hình 2 5 Sơ đố bố trí thí nghiệm xác định thời gian lưu giữ thích hợp

Điều kiện lưu giữ: Hai loài vi tảo được giữ trong ống nghiệm ở độ mặn 25‰, môi trưởng f/2, cường độ ánh sáng 300 lux ở môi trường lỏng, nhiệt độ 23 - 240C

4 tuần

Tảo giống Isochrysis galbana và Thalassiosira sp

- Nhân sinh khối

- Kiểm tra và đánh giá tốc độ sinh trưởng Lưu giữ với thời gian khác nhau

Xác định thời gian lưu giữ thích hợp

2.3.2.2 Nuôi sinh khối hai loài Isochrysis galbana và Thalassiosira sp

Tảo sau khi phân lập được nhân dần lên bằng ống nghiệm đã được khử trùng với môi trường nuôi phù hợp Các ống nghiệm được đậy nút bông, chiếu sáng bằng đèn neon, nhiệt độ 23 - 240C Sau một thời gian, tảo được nhân dần qua các bình tam giác 250mL, 500mL, 1 L khi đã đậm màu ở pha logarit Ở bình 1 L tảo bắt đầu được sục khí (sục khí không được tiến hành ở các giai đoạn sớm hơn để tảo hoàn toàn không

bị nhiễm tạp) Sau đó tảo được tiến hành nhân sinh khối ở các bình có thể tích 2 L, nuôi sinh khối tới thể tích 200L trong nhà, thể tích 4m3 ngoài trời được thể hiện qua sơ

đồ Hình 2.5

Hình 2 6 Quy trình nhân sinh khối tảo

a Cấy chuyển tảo giống từ ống nghiệm sang bình tam giác 250 mL

Vi tảo được lưu giữ trong ống nghiệm được cấy chuyển sang bình tam giác 250

mL bằng cách pha loãng mẫu theo tỷ lệ 1/10 trong môi trường f/2, nồng độ muối 30‰, cường độ chiếu sáng 500 lux, nhiệt độ 23 - 240C

b Cấy chuyền từ bình tam giác 250 mL sang bình tam giác 1L hay 2L

Tảo nuôi trong bình tam giác 250 mL được cấy chuyển sang bình tam giác 1L hay 2L bằng cách pha loãng mẫu theo tỷ lệ 1/10 trong môi trường f/2, nồng độ muối 30‰, cường độ chiếu sáng 1500 lux, nhiệt độ 23 - 240C

c Cấy chuyền từ bình tam giác 1L hay 2L sang túi nhựa 200L trong nhà

Giống tảo từ ống nghiệm

Nuôi trong bình tam giác 250 mL

Nuôi trong bình tam giác 1L, 2 L

Nuôi trong túi nilon 200 L(trong nhà)

Nuôi trong bể 4 m3 ngoài trời

Tảo nuôi trong bình tam giác 1L hay 2L được cấy chuyển sang túi nhựa 200L,

tỷ lệ pha loãng 1/100 trong môi trường f/2, nồng độ muối 31 - 33‰, cường độ chiếu sáng 3500 - 4500 lux, nhiệt độ 26 - 270C

Xác định điều kiện nuôi cấy phù hợp của hai loài tảo Isochrysis galbana và Thalassiosira sp

Hình 2 7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy phù hợp

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của mật độ ban đầu (5; 10; 15; 20; 25 vạn tb/mL)

lên tảo Isochrysis galbana

Tảo được đánh giá sinh trưởng khi nuôi với các mật độ ban đầu khác nhau Điều kiện thí nghiệm: Độ mặn 31 - 33‰, cường độ ánh sáng 3500 - 4500 lux, nhiệt độ trong phòng điều hòa 26 - 270C, môi trường f/2, thí nghiệm lặp lại 3 lần

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của môi trường f/2 với 2 loại hoá chất tinh khiết và

hoá chất công nghiệp lên tảo Isochrysis galbana

Tảo Isochrysis galbana được đánh giá sinh trưởng quần thể

Điều kiện thí nghiệm: Độ mặn 31 - 33‰, cường độ ánh sáng 3500 - 4500 lux, nhiệt độ trong phòng điều hòa 26 - 270C, mật độ ban đầu được rút ra từ thí nghiệm 2, thí nghiệm lặp lại 3 lần

Tảo Isochrysis galbana

2,5; 3 vạn tb/mL)

Nuôi với môi trường f/2 hoá chất tinh khiết và hoá chất công nghiệp

Nuôi với môi trường f/2 hoá chất tinh khiết và hoá chất công nghiệp

Đánh giá tốc độ sinh trưởng

Xác định điều kiện nuôi cấy phù hợp

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của mật độ ban đầu (1; 1,5; 2; 2,5; 3 vạn tb/mL) lên

tảo Thalassiosira sp

Tảo được đánh giá sinh trưởng khi nuôi với các mật độ ban đầu khác nhau Điều kiện thí nghiệm: Độ mặn 31 - 33‰, cường độ ánh sáng 3500 - 4500 lux, nhiệt độ trong phòng điều hòa 26 - 270C, môi trường f/2 , thí nghiệm lặp lại 3 lần

Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của môi trường f/2 với 2 loại hoá chất tinh khiết và

hoá chất công nghiệp lên tảo Thalassiosira sp

Tảo Thalassiosira sp được đánh giá sinh trưởng quần thể

Điều kiện thí nghiệm: Độ mặn 31 - 33‰, cường độ ánh sáng 3500 - 4500 lux, nhiệt độ trong phòng điều hòa 26 - 270C, mật độ ban đầu được rút ra từ thí nghiệm 4, thí nghiệm lặp lại 3 lần

d Thử nghiệm nuôi sinh khối ngoài trời

Thí nghiệm 6: Thử nghiệm nuôi sinh khối ngoài trời

Ứng dụng kết quả đạt được từ nuôi sinh khối trong nhà để nuôi tảo ngoài trời Thí nghiệm được tiến hành trong bể composit, thể tích 4 m3 Đánh giá tốc độ sinh trưởng quần thể tảo

2.3.3 Phương pháp thử nghiệm làm thức ăn cho động vật thân mềm

Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của tảo Isochrysis galbana và Thalassiosira sp đến

sinh trưởng và tỷ lệ sống của ấu trùng hàu Thái Bình Dương (Crassostrea gigas) Tảo

được thử nghiệm làm thức ăn cho hàu ương từ ấu trùng chữ D với mật độ ban đầu 5 con/mL Sơ đồ bố trí thí nghiệm được thể hiện qua Hình 2.7

Hình 2 8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thức ăn phù hợp cho ấu trùng hàu

Thái Bình Dương

Ảnh hưởng của tảo Isochrysis galbana và Thalassiosira sp đến sinh trưởng và tỷ

lệ sống của ấu trùng hàu Thái Bình Dương (Crassostrea gigas)

100% Chaetoceros

calcitrans (đối chứng)

100% Isochrysis galbana

50% Isochrysis galbana + 50% Thalassiosira sp

Đánh giá tốc độ sing trưởng của ấu trùng hàu

Tỷ lệ sống của ấu trùng hảu

Xác định thức ăn phù hợp cho ấu trùng hàu Thái

Bình Dương